魚病多聯抗獨特型單克隆抗體疫苗製劑的製作方法
2023-09-19 09:58:25 2
專利名稱：魚病多聯抗獨特型單克隆抗體疫苗製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域近年隨著我國海水養殖漁業的迅猛發展，魚病特別是細菌性引起的魚病每年均造成養殖海魚大量死亡，已嚴重影響了海水養殖魚業的發展。對魚病的預防，國內外迄今還停留在較經典的滅活疫苗階段。國際上已有8項魚類弧菌滅活疫苗及其製備方法獲得日本、美國專利。我國中科院南海海洋研究所1995年也成功製備了海魚創傷弧菌滅活疫苗。此外未見其它海魚病菌成功製備的報導。在醫學上，疫苗的成功應用已有200多年的歷史，隨著醫學科學技術的發展，疫苗的形成也不斷更新，有減毒及滅活疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗、抗獨特型抗體疫苗及新近發展起來的核酸疫苗。抗獨特型抗體有和病原體的抗原決定簇相類似的結構，它是一種模擬抗原，能誘導自體或異體產生抵抗病原體的抗體，使機體得到部分或全部的保護作用。這一點已被大量的試驗所證實。抗獨特型抗體疫苗還有以下獨特的優點1．它能模擬抗原，但不含有毒抗原的成分，無毒無害，使用安全可靠；2．抗獨特型抗體不存在種系差別，使用時無須考慮種系問題。經國際網際網路終端查新檢索，迄今國內外均未見抗獨特型抗體疫苗應用於養殖魚的報導。
本發明的目的是利用生物技術，生產多種魚病菌抗獨特型單克隆抗體，篩選出β型抗獨特型單克隆抗體，並且模擬病菌誘導機體產生抗病菌的抗體，使機體得到部分或全部保護作用。以上抗獨特型單克隆抗體可製成魚病抗獨特型抗體疫苗，對養殖魚起到很好的免疫保護作用，不汙染環境，不會通過食物鏈對人類造成損害。
本發明的技術方案鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德弧菌菌株(均由青島海洋大學提供)，進行擴增培養，再將培養後的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c小鼠，取免疫後小鼠脾細胞和SP2／0骨髓瘤細胞進行細胞融合，將細胞融合的細胞懸液進行培養，用酶聯免疫反應法(ELISA法)檢測陽性克隆，將確定為陽性的孔以有限稀釋法，進行克隆化，再將陽性克隆的雜交瘤細胞株擴增培養，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠製備出腹水型單抗，將以上腹水型單抗以ELISA法進行效價，亞類及交叉試驗，挑選效價較高的單克隆抗體，對海魚進行保護試驗，挑選對海魚有較高保護率的單抗進行純化，以每隻小鼠10～100μg的量，腹腔注射免疫小鼠。然後進行細胞融合，篩選出能穩定分泌抗獨特型單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將細胞株擴增培養，調整為1×106／ml，以每隻小鼠0．5ml量，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠，製備腹水型抗獨特型單克隆抗體，採用ELISA法，對以上單抗進行亞類、效價及β型抗獨特型單克隆抗體鑑定。結果顯示，鰻弧菌抗獨特型單抗中有4株單抗1D1、1E10、1H5、1H12，創傷弧菌抗獨特型單抗中有2株單抗1C9、4A5，溶藻弧菌抗獨特型單抗中有2株單抗2F4、1B2，遲緩愛德華菌抗獨特型單抗中有2株單抗1E5、1E11，均能特異性地與抗原(病菌)競爭與ab1(腹水型單克隆抗體)結合。用這些單抗免疫小鼠，可從小鼠血液中檢測到抗病菌的抗體，說明以上單抗為β型抗獨特型單克隆抗體。用以上單抗與不完全弗氏佐劑(1∶1～1∶2)混和，腹腔注射免疫海魚，對照組用生理鹽水取代單抗。免疫一個月後，用致死量病菌腹腔注射感染海魚，觀察疫苗對海魚的保護作用。結果顯示，鰻弧菌抗獨特型單抗中有三株單抗1E10、1D1、1H12對海魚的保護率分別為88．7％、82．5％和81．2％；遲緩愛德華菌抗獨特型單抗中有2株單抗1E11和1E5對海魚的保護率分別為60％和20．8％；溶藻弧菌抗獨特型單抗中有2株單抗1B2和2F4對海魚的保護率分別為90％和50％。挑選出保護率較高的抗獨特型單抗以一定比例配製成魚病多聯抗獨特型單抗疫苗製劑。
具體實施例方式(一)材料1．菌種鰻弧菌、外傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌的標準菌株由青島海洋大學生命學院提供。以上菌種用作免疫原產生單克隆抗體。
溶藻弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌、擬態弧菌、少女弧菌、麥氏弧菌的標準菌株購自北京生物製品公司。腸毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、志賀氏菌屬的福氏志賀氏菌、絕氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌，購自中國藥品生物製品鑑定所。以上菌種用作單克隆抗體交叉試驗。
2．細胞胞SP2／0小鼠骨髓瘤細胞株，由第四軍醫大學細胞工程研究中心惠贈。
(二)實驗方法1．免疫原細菌的製備及滅活鰻弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌、遲緩愛德華氏菌以平板劃線培養於細菌培養基上，37℃培養箱中過夜，無菌生理鹽水洗脫菌苔，3000rpm離心20分鐘，棄上清，加入1％的甲醛固定過夜。3000rpm離心20分鐘，棄上清，加無菌生理鹽水，比濁記數後，4℃冰箱保存，以備用作免疫原菌液。
2．Ba／b／c小鼠的免疫8周齡的Ba／b／c雌性小鼠10隻，將以上滅活的細菌菌液(1×108個／ml)以0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠，於第一次免疫後第7、14、28天分別追加免疫，第31天取脾細胞進行細胞融合。
3．細胞融合(1)免疫脾細胞的製備①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養液的平皿中，置於200目的不鏽鋼銅網上。用注射器內芯研磨脾臟，並用平皿內不完全培養液輕輕衝洗鋼網，使脾細胞全部通過網孔擠壓到溶液中。
②將脾細胞懸液轉入50ml離心管中，加不完全培養液至30ml，混勻，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③用不完全培養液將沉澱細胞再離心洗滌一次(重複步驟②)，將細胞垂懸至10ml，混勻，用細胞記數板記數。
(2)SP2／0骨髓瘤細胞懸液的製備①將4瓶擴增培養的骨髓瘤細胞收集到50ml離心管內。
②1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③再加入30ml不完全培養液，重複步驟②再離心洗滌一次，然後將細胞垂懸至10ml，混勻，記數。
(3)細胞融合①分別吸取含1×108個脾細胞和懸液和含2-3×107個骨髓瘤細胞的懸液，加入一支50ml離心管中，補加不完全培養液至30ml，充分混勻。
②1000rpm離心7分鐘，棄去上清。
③加50％的融合劑PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培養液，使PEG稀釋而失去促融作用。
⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
⑥加入20ml HAT培養液，輕輕吹吸沉澱細胞，使其垂懸並混勻。
⑦將細胞懸液加入輔有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培養。
4．抗體檢測--間接ELISA法(1)用已知抗原滅活菌液包被。
(2)加有克隆長生的孔中的培養上清100μl。
(3)加酶標單抗鼠IgG抗體100μl。
(4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘。
(5)判定結果在酶聯免疫檢測儀492nm波長下測定OD值，空白對照調零，若待測孔OD值大於或等於陰性對照孔2．1倍，即為陽性克隆。
5．克隆化--有限稀釋法將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細胞用加樣器反覆吹打均勻後記數，然後採取有限稀釋法進行逐級稀釋，加到96孔板進行培養。觀察克隆生長，記錄單克隆孔，並及時進行陽性檢測。將陽性單克隆的細胞轉到24孔板培養，待其增殖到一定數量後再轉入細胞瓶中擴大培養。
6．雜交瘤細胞的凍存將成對數生長的雜交瘤細胞收集入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml凍存液混勻，然後加到凍存管，在-70℃代溫冰箱過夜後移入液氮罐長期保存。
7．腹水型單克隆抗體製備將培養的雜交瘤細胞吹打下來，1000rpm離心10分鐘，收集上清作亞型試驗，加無血清培養液到沉澱的細胞中，調整細胞數為1×106個／ml。每隻Ba／b／c小鼠注射0．5ml，接種雜交瘤細胞後7～14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水，離心，收集上清，分裝後-20℃凍存備用。
8．單克隆抗體的鑑定抗鰻弧菌單抗篩選到8株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E3和4E12。經亞類鑑定其中2H2、3D2、3B2和4E12為IgG3；4E3為IgG2a；3A3、3C4、4A6為IgG1。經效價測定，這些單抗效價為1×10-5～1×10-7。
抗創傷弧菌單抗篩選到12株能穩定分泌單抗的雜交瘤細胞株，命名為1B12、3E9、3F11、3E3、2G8、3D5、1E11、3H4、2F1、1A1、2F6和1G1。經亞類鑑定，其中2F6為IgG3、1B12、3E3、3H4、1A1為IgG2a；2G8、3D5、2F1為IgG1。經效價測定，以上單抗的效價為1×10-5～1×10-7。
抗溶藻弧菌單抗篩選到8株能穩定分泌單抗的雜交瘤細胞中，命名為2E3、2E4、2G2、2G8、2D11、3A10、3B12和4C7。經亞類鑑定，其中2E3為IgG3，2G2、2D11、3A10為IgG2a；2E4、3B12為IgG2b；2G8、4C7為IgG1。經效價鑑定，以上單抗的效價為1×10-6～1×10-7。
抗遲緩愛德華菌單抗篩選到10株單抗雜交瘤細胞株，分別命名為1B4、4D3、4D5、3F7、5A11、5H5、6B1l、6E1、6E6和6H3。經亞類鑑定，其中1B4、3F7、5A11、5H5、6B11為IgG1，6El為IgG2b；4D3、4D5、6E6、6H3為IgG3。經效價測定，以上單抗的效價為1×10-6～1×10-7。
(三)抗獨特型單抗(ab2)的製備1．動物免疫將以上單抗進行純化，然後以腹腔注射免疫小鼠，第一次免疫500μl／只小鼠(100μg／抗體蛋白／只)。
在第一次免疫後的第2、4、6周及細胞融合前3天，分別以同樣方法各追加免疫一次。
2．細胞融合(1)免疫脾細胞的製備①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全的培養液的平皿中，置於200目的不鏽鋼銅網上。用注射器內芯研磨脾臟，並用平皿內不完全培養液輕輕衝洗鋼網，使脾細胞全部通過網孔擠壓到溶液中。
②將脾細胞懸液轉入50ml離心管中，加不完全培養液至30ml，混勻，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③用不完全培養液將沉澱細胞再離心洗滌一次(重複步驟②)，將細胞垂懸至10ml，混勻，用細胞記數板記數。
(2)SP2／0骨髓瘤細胞懸液的製備①將4瓶擴增培養的骨髓瘤細胞收集到50ml離心管內。
②1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③再加入30ml不完全培養液，重複步驟②再離心洗滌一次，然後將細胞垂懸至10ml，混勻，記數。
(3)細胞融合①分別吸取含1×108個脾細胞和懸液和含2-3×107個骨髓瘤細胞的懸液，加入一支50ml離心管中，補加不完全培養液至30ml，充分混勻。
②1000rpm離心7分鐘，棄去上清。
③加50％的融合劑PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培養液，使PEG稀釋而失去促融作用。
⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
⑥加入20ml HAT培養液，輕輕吹吸沉澱細胞，使其垂懸並混勻。
⑦將細胞懸液加入輔有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培養。
3．抗獨特型抗體檢測--雙抗夾心ELISA法(1)用純化後的兔抗病菌抗體包被酶標板(2)加有克隆生長的孔中的培養上清100μl(3)加酶標單抗鼠IgG抗體100μl(4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘(5)判定結果在酶聯免疫檢測儀492nm波長下測定OD值，空白對照調零，若待測孔OD值大於或等於陰性對照孔2．1倍，即為陽性克隆。
4．克隆化將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細胞用加樣器反覆吹打均勻後記數，然後採取有限稀釋法進行逐級稀釋，加到96孔板進行培養。觀察克隆生長，記錄單克隆孔，並及時進行陽性檢測。將陽性單克隆的細胞轉到24孔板培養，待其增殖到一定數量後再轉入細胞瓶中擴大培養。
5．雜交瘤細胞的凍存將成對數生長的雜交瘤細胞收集入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml凍存液混勻，然後加到凍存管，是-70℃代溫冰箱過夜的移入液氮罐長期保存。
6．腹水型抗獨特型單克隆抗體的製備將培養的雜交瘤細胞吹打下來，1000rpm離心10分鐘，收集上清作直型試驗，加無血清培養液到沉澱的細胞中，調整細胞數為1×106個／ml。每隻Balb／c小鼠注射0．5ml，接種雜交瘤細胞後7～14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水，離心，收集上清，分裝後-20℃凍存備用。
7．亞型及效價鑑定(1)鰻弧菌抗獨特型單克隆抗體共篩選到7株陽性克隆，分別命名為1E10、1H12、2H12、1H5、1D1、2B12、2F12。經亞型鑑定1E10屬於IgG3，2H12和1H12屬於IgG2a，1H5、1D1、2B12、2F12均為IgG2b。經效價測定，以上抗獨特單抗的效價範圍為1×10-4～1×10-6。
(2)遲緩愛德華菌抗獨特型單克隆抗體共篩選到6株陽性克隆，分別命名為2C8、1E5、2F1、2B3、1E11、1B11。經亞類鑑定2C8、2F1和1B11為IgG2b；1E11、2B3、1E5為IgG3。經效價測定，以上抗獨特型抗體的效價可達1×10-5～1×10-6。
(3)創傷弧菌抗獨特型單抗共篩選到5株陽性克隆，分別命名為1C9、4A5、3A12、1C11、3B7。經亞類鑑定1C9、3A12為IgG2b，4A5為IgG2a、1C11、3B7為IgG3。經效價測定，以上抗體的效價為1×10-4～1×10-5。
(4)溶藻弧菌抗獨特型單抗共篩選到5株陽性克隆，分別命名為1H2、2F4、1D10、1H5、1B2。經亞類鑑定，1H2為IgG2a，2F4為IgG2b，1D10和1B2為IgG3，1H5為IgG1。經效價測定，以上單抗的效價為1×10-4～1×10-5。
8．β型抗獨特型抗體的鑑定(1)經競爭抑制測定顯示，鰻弧菌抗獨特型單克隆抗體1D1、1E10和1H12能有效抑制抗原與Ab1結合，抑制率達70％以上，而且抑制率隨Ab2濃度的下降而降低，說明以上三株單抗與抗原識別相同的Ab1表位，能有效地與抗原競爭Ab1結合位點，說明它們是β型鰻弧菌抗獨特型單克隆抗體。
(2)遲緩愛德華菌抗獨特型單克隆抗體1E5和1E11能較強地抑制抗原與Ab1的結合，抑制率達60％以上，而且抑制率隨其濃度的降低而降低。說明該2株單抗與抗原識別相同的Ab1表位，有效地與抗原競爭Ab1的結合位點。說明它們是β型遲緩愛德華菌抗獨特型單克隆抗體。
9．以抗獨特型單克隆抗體(ab2)為免疫原誘導產生抗病菌的抗體(ab3)(1)以腹水型ab2為免疫原免疫Ba／b／c小鼠，每次免疫量及追加免疫次數同ab2的製備。第四次免疫5天後，摘除小鼠眼球放血，收集抗血清(Ab3)。
(2)ab3的檢測-間接ELISA法，1)用已知抗原滅活菌液包被。
2)加有克隆長生的孔中的培養上清100μ1。
3)加酶標單抗鼠IgG抗體100μl。
4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘。
5)判定結果在酶聯免疫檢測儀492nm波長下測定OD值，空白對照調零，若待測孔OD值大於或等於陰性對照孔2．1倍，即為陽性克隆。
(3)由鰻弧菌抗獨特型單克隆抗體1E10、1H5、1D1和2H12誘導產生的鼠血清中含有抗鰻弧菌的抗血(ab3)，OD值分別是對照組2倍以上，其效價為1∶100～1∶1000。
(4)由遲緩愛德華菌抗獨特型單克隆抗體1E5和1E11誘導產生的鼠血清中含有抗遲緩愛德華菌抗體。其效價為1∶10～1∶200。
10．抗獨特型單克隆抗體疫苗對牙鮃的免疫保護作用(1)方法抗獨特型單抗和弗氏不完全佐劑1∶1混和，腹腔注射免疫牙鮃海魚，每尾注射0．05m1(含單抗10～20μg)，免疫一個月後，用致死量的病菌腹腔注射攻擊牙鮃魚，觀察抗獨特型單克隆抗體疫苗對牙鮃的保護作用。
保護率的計算公式免疫保護率=(實驗組存活率-對照組存活率)／對照組死亡率×100％(2)結果①鰻弧菌抗獨特型單抗1D1、1E10、1H12對牙鮃的保護率分別為82．5％、88．7％和81．2％。
②遲緩愛德華菌抗獨特型單抗1E11和1E5對牙鮃的保護率分別60．2％和20．8％。
③溶藻弧菌抗獨特單抗2F4、1B2對牙鮃的保護率分別為50．2％和90．0％。
④創傷弧菌抗獨特型單抗Va1、Va2對牙鮃的保護率分別為31．6％和15．2％。
以上對海魚保護率達60％以上的抗獨特型單克隆抗體，可用作海魚抗獨特型單抗免疫製劑。
11．製備成品將鰻弧菌抗獨特型單抗中的1E10，遲緩愛德華抗獨特型單抗中的1E11，浣藻弧菌抗獨特型單抗中的1B2單抗以1∶2∶1的比例混和，製成魚病多聯抗獨特型單抗疫苗製劑。
本發明的優點本發明魚病多聯抗獨特型單克隆抗體疫苗製劑對海魚的保護率達到60％以上，抗獨特型單抗疫苗除了對海魚有很好的免疫保護外，它還具備以下獨特的優點即不含有毒的抗原成分，不會對海魚造成任何損害，另外抗獨特型抗體不存在種系差別，使用時無須考慮種系問題，適用範圍非常廣，對海魚養殖業的發展十分有益。
權利要求
1．魚病多聯抗獨特型單克隆抗體疫苗製劑，其特徵是將將鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌進行擴增培養，再將培養後的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c，取免疫後小鼠脾細胞和SP2／0骨髓瘤細胞進行細胞融合，將細胞融合的細胞懸液進行培養，用酶聯免疫反應法(ELISA法)檢測陽性克隆，將確定為陽性的孔以有限稀釋法，進行克隆化，再將陽性克隆的雜交瘤細胞株擴增培養，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠製備出腹水型單抗；將以上腹水型單抗以ELISA法進行效價，亞類及交叉試驗，挑選效價較高的單克隆抗體，對海魚進行保護試驗，挑選對海魚有較高保護率的單抗進行純化，以每隻小鼠10～100μg的量，腹腔注射免疫小鼠；然後進行細胞融合，篩選出能穩定分泌抗獨特型單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將細胞擴增培養，調整為1×106／ml，以每隻小鼠0．5ml量，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠，製備腹水型抗獨特型單克隆抗體，採用ELISA法，對以上單抗進行亞類、效價及β型抗獨特型單克隆抗體鑑定；用以上單抗與不完全弗氏佐劑(1∶1～1∶2)混和，腹腔注射免疫海魚，再挑選出對海魚有較高保護率的抗獨特型單抗以一定比例配製成魚病多聯抗獨特型單抗疫苗製劑。
全文摘要
魚病多聯抗獨特型單克隆抗體疫苗製劑,涉及生物技術領域。本發明將鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌免疫小鼠,進行細胞融合,再克隆化,製備出特異性很強,且效價較高的單抗,進行純化,再免疫小鼠,製備抗獨特型單抗,挑選出保護率較高的抗獨特型單抗以一定比例配製成魚病多聯抗獨特型單抗疫苗製劑。對養殖魚起很好的免疫保護作用,不汙染環境,不會通過食物鏈對人類造成損害。
文檔編號A61P43/00GK1293066SQ0011392
公開日2001年5月2日 申請日期2000年9月20日 優先權日2000年9月20日
發明者黃威權, 夏永娟, 李元, 李別虎, 金曉航, 張榮慶 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學