針對高度保守靶標的包含來自駱駝科之序列的抗體的製作方法

2023-09-19 09:36:25 6

針對高度保守靶標的包含來自駱駝科之序列的抗體的製作方法
【專利摘要】本發明涉及抗原結合多肽，並且特別是來源於駱駝科物種的常規抗體，所述抗體與靶抗原特異性結合，所述靶抗原是自身抗原或者高度保守抗原。本發明還涉及抗獨特型抗原結合肽，其與包含獲得自駱駝科物種的抗體之可變區的靶抗原結合。
【專利說明】針對高度保守靶標的包含來自駱駝科之序列的抗體

【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗原結合多肽，並且特別是來源於駱駝科（camelid)物種的常規抗 體，所述抗體與靶抗原特異性結合，所述靶抗原是自身抗原或高度保守抗原。

【背景技術】
[0002] 單克隆抗體作為研究工具具有許多應用，並且越來越多地作為治療或診斷劑。特 別地，治療性抗體的開發是醫藥行業中增長最快的領域之一。產生針對給定治療靶標的高 質量單克隆抗體是在治療性抗體藥物的開發中成功的關鍵。迄今為止，已經開發了許多可 以生產針對治療目的之靶抗原的單克隆抗體（包括全人或"人源化"抗體）的不同技術平 臺。這些技術平臺可大致分為體內的方法（基於使用經免疫的動物），以及體外的方法，其 中抗體序列是使用技術（例如噬菌體展示）從抗體可變鏈cDNA文庫中選擇的。
[0003] 儘管均可使用用於單克隆抗體開發的體內和體外平臺，但是生產與跨物種"高度 保守的"抗原特異性結合的抗體和生產針對"自身"抗原的抗體仍是特別困難的。Zhuo等， PLoS 0NE，第4卷，第6期，2009年6月討論了由於免疫耐受性，在針對小鼠自身抗原或者在 小鼠與人類之間高度保守抗原的抗體生產中使用基於免疫動物（特別是小鼠）的常規單克 隆抗體方法所出現的特別困難之處。
[0004] 為克服與自身抗原或高度保守抗原相關之免疫耐受性的之前的嘗試已經包括使 用特異性敲除小鼠或者使用具有受損的免疫耐受性的小鼠品系。然而，存在與這些方法中 的每個相關的缺點；產生對於每個保守的目的抗原的敲除小鼠是昂貴且耗時的，而通過免 疫具有受損耐受性的小鼠產生的抗體可能是質量可變的，即可表現出低親和力和/或對靶 抗原的低特異性。
[0005] 在別處已經報導了可以從非免疫人噬菌體展示文庫分離針對人抗原的人抗體 (Griffiths等EMBO J?第12卷.，725-734，1993)。這種方法的潛在缺點是，合成的噬菌體 展示文庫只是接近天然存在於人類種系的功能多樣性，因而多樣性是比較有限的。此外，使 用非免疫文庫產生的抗體不是來源於通過主動免疫體內選擇的⑶R，因而通常必須進行親 和力成熟（affinity maturation)以提高對祀抗原的親和力。親和力成熟是一個冗長的過 程，其可能會大大增加抗體發現過程的時間。此外，在親和力成熟過程中，可能會改變某些 胺基酸殘基，這可能對所得的抗體的結合特異性或可製造性（例如表達水平、溶解性、物理 化學穩定性等）產生負面影響（Wu等，J. Mol. Biol. 368 :652-65 (2007))。


【發明內容】

[0006] 開發用於產生針對高度保守靶抗原的抗體之技術上簡單的平臺仍是本領域中的 一個目標，其不受現有技術方法所遇到的問題（例如，低親和力、低特異性、多樣性差）困 擾。特別地，期望開發用於產生針對高度保守靶抗原之抗體的平臺，其基於通過主動免疫體 內選擇CDR，因而避免了對親和力成熟的需求和與所得抗體的"可製造性"相關的問題。
[0007] 現在已經觀察到可通過駱駝科（Camelidae)物種的主動免疫產生針對自身抗原 和高度保守靶抗原的高親和力免疫特異性抗體。即便使用展示出與最近的駱駝科同源物具 有高於90%，並且高達97%胺基酸序列同一性的人多肽，通過動物的簡單免疫可產生高特 異性、高親和力的抗體，而無需產生敲除或以其他方式操作動物的遺傳背景或其天然免疫 功能。通過駱駝科動物的簡單免疫來打破自身耐受性屏障的能力是非常出乎意料的，並且 提高了產生有用的抗體的機會，所述有用抗體包括具有潛在治療效用的針對一系列高度保 守靶標的抗體，之前認為這是超越已知的單克隆抗體平臺的範圍的。
[0008] 因此，在第一個方面，本發明提供了包含VH結構域和VL結構域之分離的抗原結合 多肽，其中在所述VH結構域或所述VL結構域中的至少一個高變環或互補決定區（CDR)獲 得自駱駝科物種的VH或VL結構域，其特徵在於，所述抗原結合多肽與靶抗原特異性結合， 所述靶抗原是在包括至少所述抗原結合多肽之表位的序列比較窗口表現出與來自所述駱 駝科物種的蛋白質具有至少90 %，或者至少95 %、96 %、97 %或98 %胺基酸序列同一性的 多肽抗原。
[0009]在一個實施方案中，靶抗原是在包括包含抗原結合多肽之表位的靶抗原的至少一 個結構域的序列比較窗口表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%，或者至少 95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0010] 在一個實施方案中，靶抗原是在全長的靶抗原表現出與來自所述駱駝科物種的蛋 白質具有至少90%，或者至少95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0011] 靶抗原可包含與來自所述駱駝科物種的比較物蛋白質中存在的表位具有基本上 相同結構的至少一個表位。在線性表位的情況下，形成所述表位的胺基酸序列在靶抗原與 比較物駱駝科動物蛋白質之間可以是100 %保守的。
[0012] 在一個實施方案中，靶抗原可以是高度保守抗原，其中所述高度保守抗原是來自 所述駱駝科物種之外的物種的多肽，其在包括至少抗原結合多肽之表位的序列比較窗口 表現出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質具有至少90 %，或者至少95 %、96 %、97 %或 98 %的胺基酸序列同一性。
[0013]在一個實施方案中，高度保守抗原是在包括包含抗原結合多肽之表位的靶抗原 的至少一個結構域的序列比較窗口表現出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質具有至少 90%，或者至少95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0014]在一個實施方案中，靶抗原是在全長的靶抗原表現出與來自所述駱駝科物種的同 源蛋白質具有至少90%，或者至少95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的高度保守 抗原。
[0015]在每一個前述實施方案中，所述高度保守抗原可包含與來自所述駱駝科物種的比 較物蛋白質中存在的表位具有基本上相同結構的至少一個表位。
[0016]在一些優選的實施方案中，高度保守抗原可以是來自所述駱駝科物種之外的物種 的多肽，其在如上所定義的序列比較窗口或全長的靶抗原表現出與來自所述駱駝科物種的 同源蛋白質具有至少95%、96%、97%、98%或者甚至至少99%的胺基酸序列同一性。
[0017]在一些特定的實施方案中，高度保守抗原可以來自選自以下之物種的多肽：人、非 人靈長類動物、小鼠、大鼠、豬、狗、豚鼠、兔、羊、牛或雞。在一些特別優選的實施方案中，所 述高度保守抗原是人多肽。
[0018]在一些特定的實施方案中，所述駱駝科物種選自駱駝（camel)、大羊駝（llama)、 單峰騎（dromedary)、胳馬（vicufia )、原騎（guanaco)和羊騎（alpaca)。在一個優選的實 施方案中，所述胳騎科物種是大羊騎（Lama glama)。
[0019] 在一個特別優選的實施方案中，高度保守抗原是人多肽並且所述駱駝科物種是大 羊駝。在該實施方案中，所述高度保守抗原（即，人多肽）在如上所定義的序列比較窗口可 表現出與同源的大羊駝蛋白質具有至少90%，或者至少95%、96%、97%、98%，或者甚至 至少99 %的胺基酸序列同一性。
[0020] 在另一個實施方案中，靶抗原可以是來自駱駝科物種的自身抗原或者駱駝科動物 來源的抗原，其是在包括至少抗原結合多肽之表位的序列比較窗口表現出與駱駝科自身抗 原具有至少90%，或者至少95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0021] 在一個實施方案中，靶抗原是駱駝科動物來源的抗原，其在包括包含抗原結合多 肽之表位的靶抗原的至少一個結構域的序列比較窗口表現出與駱駝科動物自身抗原具有 至少90 %，或者至少95 %、96 %、97 %或98 %的胺基酸序列同一性。
[0022] 在一個實施方案中，靶抗原是駱駝科動物來源的抗原，其在全長的靶抗原表現出 與駱駝科動物自身抗原具有至少90 %，或者至少95 %、96 %、97 %或98 %的胺基酸序列同 一性。
[0023] 所述駱駝科動物來源的抗原可保留其所來源的駱駝科動物自身抗原的表位，或者 其可包含與在該自身抗原中存在的表位具有基本上相同結構的至少一個表位。
[0024] 在一個特定的實施方案中，靶抗原是從所述駱駝科物種獲得之抗體的可變區或者 表現出與其至少90%胺基酸序列同一性的序列變體。在一些特定的實施方案中，序列變 體可表現出與從所述駱駝科物種獲得之抗體的可變區具有至少95%、96%、97%、98%或 99%的胺基酸序列同一性。在駱駝科動物常規抗體的情況下，用於對變體與從所述駱駝科 物種獲得之抗體的可變區進行序列比較的比較窗口可包括全長的VH結構域和全長的VL結 構域。在包含VHH結構域的駱駝科動物之只有重鏈的抗體的情況下，序列比較窗口可以是 全長的VHH結構域。序列變體可保留其所來源的駱駝科動物抗體可變結構域的表位（或獨 特型）。
[0025] 在第二個方面，本發明提供了用於製備與靶抗原特異性結合的重組抗原結合多肽 的方法，所述抗原結合多肽包含VH結構域和VL結構域，其中在所述VH結構域或所述VL 結構域中的至少一個高變環或互補決定區（CDR)獲得自駱駝科物種，所述方法包括以下步 驟：
[0026] (a)免疫駱駝科物種，由此產生針對所述靶抗原的常規抗體；
[0027] (b)分離編碼與所述靶抗原免疫反應的駱駝科常規抗體之VH和/或VL結構域的 至少一個高變環或互補決定區（CDR)的駱駝科核酸；
[0028] (c)製備包含編碼如下高變環或互補決定區之核苷酸序列的多核苷酸，所述高變 環或互補決定區具有與由步驟（a)分離的核酸編碼的高變環或互補決定區一致的胺基酸 序列，所述多核苷酸編碼與所述靶抗原免疫反應（或特異性結合）的包含VH結構域和VL 結構域的抗原結合多肽；以及
[0029] (d)由步驟（c)的重組多核苷酸表達所述抗原結合多肽，其中所述抗原結合多肽 是與所述部分（b)的駱駝科常規抗體不一致的，其特徵在於所述靶抗原是在包括至少抗原 結合多肽之表位的序列比較窗口表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%或 者至少95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0030] 在一個實施方案中，靶抗原是在包括包含抗原結合多肽之表位的靶抗原的至少一 個結構域的序列比較窗口表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%或者至少 95 %胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0031] 在一個實施方案中，靶抗原是在全長的靶抗原表現出與來自所述駱駝科物種的蛋 白質具有至少90%或者至少95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0032] 在該方法的一個優選實施方案中，步驟（a)中產生的抗體所針對的靶抗原是高度 保守抗原，其中所述高度保守抗原是來自所述駱駝科物種之外的物種的多肽，所述多肽在 如上所定義的序列比較窗口表現出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質具有至少90 %或 者至少95 %、96 %、97 %或98 %的胺基酸序列同一性。
[0033] 在所述方法的另一些優選的實施方案中，高度保守抗原可以是來自所述駱駝科物 種之外的物種的多肽，所述多肽在如上所定義的序列比較窗口表現出與來自所述駱駝科物 種的同源蛋白質具有至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的胺基酸序列同一性。
[0034] 在一些特定的實施方案中，所述高度保守抗原可以是來自選自以下物種的多肽： 人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、豬、狗、豚鼠、兔、羊、牛或雞。在一些特別優選的實施方案 中，所述高度保守抗原是人多肽。
[0035] 在一些特定的實施方案中，與靶抗原發生免疫的駱駝科物種是選自：駱駝、大羊 駝、單峰駝、駱馬、原駝和羊駝。在一個優選的實施方案中，所述駱駝科物種是大羊駝。
[0036] 在一個特別優選的實施方案中，高度保守抗原是人多肽並且與所述高度保守抗原 發生免疫的駱駝科物種是大羊駝。在該實施方案中，所述高度保守抗原（即，人多肽）在 如上所定義的序列比較窗口將可表現出與同源的大羊駝蛋白質具有至少90%，或者至少 95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列同一性。
[0037] 在一個特定的、非限制性實施方案中，靶抗原可以是從所述駱駝科物種獲得之抗 體的可變區或者在如上所定義的序列比較窗口表現出具有與其至少90%胺基酸序列同一 性的序列變體。在一些特定的實施方案中，序列變體在如上所定義的序列比較窗口可表現 出具有與從所述駱駝科物種獲得之抗體的可變區至少95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的氨 基酸序列同一'丨生。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1說明由HMGB1和HMGB2 ELISA所確定之純化的大羊駝來源的Fab的結合特性。
[0039] 圖2說明通過ELISA所測量的由大羊駝來源的Fab 2A1抑制HMGB1/RAGE相互作 用。
[0040] 圖3說明通過ELISA評估大羊駝IgG形式的抗獨特型抗體11E1 (lallEl)與一組 抗體的結合譜（profile)。
[0041] 圖4證明了大羊騎IgG形式的抗獨特型抗體11E1 (lallEl)在食蟹猴（cynomolgus monkey)血楽背景中檢測祀抗體68F2和129D3的能力。
[0042] 圖5示出通過ELISA所測量的與61H7 (mAb)結合之7C6 (Fab)的Log (劑量）-響 應曲線，其中將在620nm處的吸收對7C6 Fab的濃度對數作圖，使得能夠計算EC50。
[0043]圖6說明通過ELISA所測量的抗獨特型mAb與41D12(Fab)的結合。

【具體實施方式】
[0044] 本發明已經從出乎意料的觀察結果得出可通過駱駝科物種的主動免疫產生針對 高度保守靶抗原並且甚至是自身抗原的高親和力、高特異性抗體。因此，在本發明最廣泛的 方面，其提供了駱駝科動物來源的抗原結合多肽（即，包含VH結構域和VL結構域的抗原結 合多肽，其中在所述VH結構域或所述VL結構域中的至少一個高變環或互補決定區（CDR) 獲得自駱駝科物種），其特徵在於與靶抗原特異性結合，所述靶抗原高度類似於駱駝科動物 自身抗原的序列和/或結構。本發明還提供了駱駝科動物來源的抗原結合多肽，其與駱駝 科動物自身抗原特異性結合。
[0045] 在本 申請人:自己早些時候的公開W0 2010/001251和W0 2011/080350中描述了 駱駝科動物來源的常規抗體的一般特徵，所述申請的內容通過引用以其整體併入本文。駱 駝科動物來源的常規抗體的重鏈和輕鏈可變結構域（如區別於駱駝科動物只有重鏈的抗 體）的特徵在於其與人抗體之間特別高的同源性，無論是在重鏈和輕鏈可變結構域之框架 區中的一級胺基酸序列水平上，還是在有助於抗原結合位點之CDR的三維構象上（在W0 2010/001251中廣泛的詳細討論）。此外，駱駝科動物常規抗體的可變結構域可通過"種系 化（germlining) "的簡單方法變得更加人樣化，其中框架區中選定的少量胺基酸被來自人 種系的同源胺基酸所替換（在W02011/080350中廣泛討論）。
[0046] 現在已經觀察到可產生針對一組靶抗原的高親和力高特異性駱駝科動物常規抗 體，之前認為使用已知的抗體開發技術，特別是使用依賴於對宿主動物進行免疫的抗體平 臺是很難靶向所述靶抗原的。這些"難以靶向"抗原的特徵在於其與靶抗體將在其中產生 的系統中（例如，宿主駱駝科動物）天然表達的抗原有非常接近的序列和/或類似結構， 並且包括自身抗原以及多肽抗原兩者，所述自身抗原來自於抗體將在其中產生的駱駝科物 種，所述多肽抗原表現出與來自抗體將在其中產生的同一駱駝科物種之最接近匹配的駱駝 科動物多肽具有至少90%的胺基酸序列相似性。本文提供的抗原結合多肽不僅表現出對 "難以靶向"抗原的高親和力特異性結合，而且保留駱駝科動物常規抗體的特別優點，即，與 人抗體的可變結構域之非常高的序列同源性和結構同源性。
[0047]
[0048] 術語"抗原結合多肽"是指包含VH結構域和VL結構域的任何多肽，其與靶抗原免 疫反應（對靶抗原表現出特異性結合）。如本文別處所討論的，示例性的抗原結合多肽包括 抗體和免疫球蛋白，還包括抗體片段。
[0049] 術語"靶抗原"是指抗原結合多肽針對其免疫反應的抗原。
[0050] 術語"靶抗原"或"抗原物質"還可用來描述在製備與目的靶抗原反應的抗原結合 多肽期間用來免疫動物（例如駱駝科動物）的材料。在本文的上下文中，術語"靶抗原"可 涵蓋抗原的經純化形式，並且還可以是抗原的未處理的或半純化製劑（例如細胞、細胞裂 解物或上清液、細胞級分（例如細胞膜）等），以及與適當載體蛋白綴合的半抗原，或者靶抗 原的截短形式（例如含有免疫原性表位的片段），或者甚至是能夠編碼靶抗原的多核苷酸， 因為將用於"DNA免疫"。用於主動免疫駱駝科動物的"靶抗原"或"抗原物質"的另一些特 徵在本文別處進行描述，並且將是本領域技術人員通常已知的。
[0051] 抗原結合多肽與靶抗原之間的"特異性結合"是指免疫特異性。如果抗原結合多肽 優先於其它表位與靶抗原上的表位結合，則所述抗原結合多肽與其靶抗原"特異性"結合。 "特異性結合"並不排除與其它具有類似抗原表位的抗原發生交叉反應。
[0052] "抗體"（Ab)和"免疫球蛋白"（Ig)是糖蛋白，其表現出與（靶）抗原的特異性結 合。
[0053] 已知駱駝科動物物種具有兩種不同類型的抗體；經典的或"常規"的抗體以及重鏈 抗體。
[0054] 如本文所使用的，術語"常規抗體"是指任何同種型的抗體，包括IgA、IgG、IgD、IgE 或IgM。自然的或天然存在的"常規"駱駝科動物抗體通常是異四聚體糖蛋白，由兩條相同 的輕（L)鏈和兩條相同的重（H)鏈構成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而二 硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中不同。每條重鏈和輕鏈還具有規則間隔的鏈 內二硫橋。每條重鏈在一端（N端）具有可變結構域（VH)，其後是若干恆定結構域。每條輕 鏈在一端（N端）具有可變結構域（VL)而在其另一端具有恆定結構域（CL);輕鏈的恆定結 構域與重鏈的第一恆定結構域對齊（align)，且輕鏈的可變結構域與重鏈的可變結構域對 齊。認為特定胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變結構域之間的界面。
[0055] 術語"重鏈抗體"是指已知在駱駝科動物物種中天然存在的第二種類型的抗體，這 樣的抗體天然缺失輕鏈（Hamers-Casterman等，Nature. 1993 ;363 ;446_8)。重鏈抗體（縮 寫為HCAb)由共價二硫鍵連接的兩條重鏈構成。HCAb中每條重鏈的一端具有可變結構域。 為了將其與"常規"駱駝科動物抗體重鏈的可變結構域（VH)區分開，HCAb的可變結構域被 稱為"VHH"。VHH結構域與VH結構域完全不同，其由駱駝科動物基因組中的不同基因區段 編碼。
[0056] 本發明多肽的VL結構域可以是VX型或Vk型。因此，術語"VL結構域"是指來 自駱駝科的Vk和兩種同種型以及由其改造的變體（相對於駱駝科的VL結構域來說， 所述變體包含一個或更多個胺基酸替換、插入或者缺失）。
[0057] 術語"VH結構域"是指駱駝科任何已知的重鏈同種型的VH結構域，包括Y、e、 8、a或y同種型以及其改造的變體（相對於駱駝科的VH結構域來說，所述變體包含一 個或更多個胺基酸的替換、插入或者缺失）。術語"VH結構域"僅指駱駝科動物常規抗體的 VH結構域，而玉涵蓋駱駝科動物的VHH結構域。
[0058] 術語"可變"是指可變結構域VH和VL的某些部分的序列在抗體之間差異很大的事 實，並且用於每個特定抗體針對其靶抗原的結合及特異性。然而，可變性在抗體的可變結構 域中並非均勻分布。其集中於每個VL結構域和VH結構域中被稱為"高變環（hypervariable loop)"的三個區段中，其形成抗原結合位點的一部分。V A輕鏈結構域的第一、第二和第 三高變環在本文中被稱為LIU)、L2U)和L3U)，並且可定義為包含VL結構域中的 24位至33位（L1(A)，由9個、10個或11個胺基酸殘基組成）、49位至53位（L2(入）， 由3個殘基組成）和90位至96位（L3 ( X )，由5個殘基組成）殘基（Morea等，Methods 20:267-279(2000))。Vk輕鏈結構域的第一、第二和第三高變環在本文中被稱為L1(k)、 L2 (k)和L3 (k)，並且可定義為包含VL結構域中的25位至33位（LI (k)，由6個、7個、8 個、11個、12個或13個殘基組成）、49位至53位（L2 (k)，由3個殘基組成）和90位至97 位（L3(k)，由 6個殘基組成）殘基（Morea等，Methods 20 :267-279(2000))。VH結構域的 第一、第二和第三高變環在本文中被稱為H1、H2和H3,並且可定義為包含VH結構域中的25 位至33位（H1，由7個、8個或9個殘基組成）、52位至56位（H2,由3個或4個殘基組成） 和91位至105位（H3,其長度高度可變）殘基（Morea等，Methods 20 :267-279 (2000))。
[0059] 除非另有說明，否則術語L1、L2和L3分別是指VL結構域的第一、第二和第三高變 環，並且涵蓋獲得自駱駝科的Vk和同種型的高變環。術語H1、H2和H3分別是指VH 結構域的第一、第二和第三高變環，並且涵蓋獲得的自駱駝科的任何已知重鏈同種型（包 括Y、e、S、a或y )的高變環。
[0060] 高變環LI、L2、L3、HI、H2和H3可以各自包括"互補決定區"或"⑶R"的一部分。 術語"高變環"和"互補決定區"不是嚴格意義的同義詞，因為高變環（HV)是基於結構定 義的，而互補決定區（⑶R)是基於序列可變性定義的（Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD.，1983)，並且HV和CDR的界限在一些VH和VL結構域中可以不同。
[0061]VL和VH結構域的⑶R通常定義為包含以下胺基酸：輕鏈可變結構域中的24位至 34位（CDRL1)、50位至56位（CDRL2)和89位至97位（CDRL3)殘基，以及重鏈可變結構域 中的31位至35位或31-35b位（CDRH1)、50位至65位（CDRH2)和95位至102位（CDRH3) 殘基；Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991)。因此，HV 可以 包含在相應的CDR中，並且本文中提及的VH和VL結構域的"高變環"也應解釋為涵蓋相應 的CDR，反之亦然，除非另有說明。
[0062] 可變結構域的保守性較高的部分稱為框架區（framework region, FR)。天然重鏈 和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR(分別為FR1、FR2、FR3和FR4)，主要是採取0片層構 型，通過三個高變環相連接。每條鏈中的高變環通過FR而緊密地合在一起，並與其它鏈中 的高變環一起促進抗體之抗原結合位點的形成。對抗體的結構分析揭示了序列與通過互補 決定區形成的結合位點形狀之間的關係（Chothia等，J.Mol.Biol.227:799-817(1992)); Tramontane)等，J. Mol. Biol，215 :175-182 (1990))。儘管它們具有高序列可變性，但六個 環中有五個只採取了主鏈構象的一小部分庫（repertoire),稱為"規範結構（canonical structure) "。這些構象首先取決於環的長度，其次取決於環和框架區中某些位點關鍵殘基 的存在（通過其包裝、氫鍵或呈現不尋常主鏈構象的能力來確定構象）。
[0063] 恆定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但表現出多種效應功能，例如抗體參 與抗體依賴的細胞毒性（antibody-dependent cellular toxicity,ADCC)或補體依賴的細 胞毒性（complement-dependent cytotoxicity, CDC) 〇
[0064] 在本發明的所有方面和實施方案中，駱駝科（或駱駝科動物）物種（從其獲得本 發明抗原結合多肽的高變環或CDR)可以是駱駝、大羊駝、單峰駝、駱馬、原駝或羊駝，以及 其任何的雜交物種。大羊騎（Lama glama)和羊騎（Lama pacos)是本發明所有方面優選的 駱駝科物種。
[0065] 如果抗原結合多肽包含獲得自駱駝科物種的VH結構域或VL結構域的至少一個高 變環或互補決定區，則認為其是"駱駝科動物來源的"。為了避免疑問，術語"VH結構域"、 "VL結構域"是指來源於駱駝科動物常規抗體的結構域。該定義排除了駱駝科動物只有重 鏈的VHH抗體以及僅包含駱駝科動物VHH結構域之HV或CDR的重組構建體，其玉涵蓋在本 發明的範圍內。
[0066] 所謂"獲得自駱駝科物種的VH結構域或VL結構域的高變環或互補決定區"意指 高變環（HV)或CDR具有的胺基酸序列與由駱駝科免疫球蛋白基因編碼的高變環或CDR的 胺基酸序列一致或基本一致。在本文的上下文中，"免疫球蛋白基因"包括種系基因、已經 歷重排的免疫球蛋白基因以及體細胞突變基因。因此，獲得自駱駝科物種VH或VL結構域 的HV或CDR的胺基酸序列可以與存在於成熟的駱駝科常規抗體中的HV或CDR的胺基酸序 列一致。本文上下文中的術語"獲得自"表明了結構關係，意思是本發明抗原結合多肽的HV 或CDR包含最初由駱駝科免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列（或其略微發生改變的變體）。 然而，對於用於製備本發明抗原結合多肽的生產方法而言，其並不一定意味著特定的關係。 正如下面將要討論的，有若干方法可用來製備包含HV或CDR(其胺基酸序列與最初由駱駝 科免疫球蛋白基因編碼的序列一致（或基本上一致））的抗原結合多肽。
[0067] 術語"駱駝科動物常規抗體的VH結構域"和"獲得自駱駝科物種的VH結構域"可 同義使用，並且涵蓋這樣的VH結構域，其為合成的或經改造之重組基因（包括密碼子優化 的合成基因）的產物，該VH結構域具有的胺基酸序列與駱駝科免疫球蛋白基因（種系的、 重排的或體細胞突變的）編碼之VH結構域的胺基酸序列一致（或基本一致）。類似地，術 語"駱駝科動物常規抗體的VL結構域"和"獲得自駱駝科物種的VL結構域"可同義使用，並 且涵蓋這樣的VL結構域，其為合成的或經改造之重組基因（包括密碼子優化的合成基因） 的產物，該VL結構域具有的胺基酸序列與駱駝科免疫球蛋白基因（種系的、重排的或體細 胞突變的）編碼之VL結構域的胺基酸序列一致（或基本一致）。
[0068] 本文提供的抗原結合多肽通常是重組表達的多肽，並且可以是嵌合多肽。術語"嵌 合多肽"是指通過將不連續存在的兩個或更多個肽片段相鄰而產生的人工（非天然存在） 多肽。此定義中包括"物種"嵌合多肽，其通過將兩個或更多個物種（例如駱駝科動物和人） 編碼的肽片段相鄰而產生。
[0069] 本文提供的抗原結合不是天然存在的人抗體（特別是人類自身抗體），因為需要 來自於駱駝科動物的至少一個高變環（或CDR)。所謂"天然存在的"人抗體意指在人對象內 天然表達的抗體。本發明的範圍排除具有與天然存在人抗體或其片段的胺基酸序列100% 一致的胺基酸序列的抗原結合多肽，其中天然抗體或片段不是嵌合的，並且在胺基酸序列 中也沒有受到任何經改造的變化（排除體細胞突變）。
[0070] 本文提供的抗原結合多肽包含重鏈可變（VH)結構域和輕鏈可變（VL)結構域二 者，並且特徵在於在VH結構域或VL結構域中的至少一個高變環或互補決定區獲得自駱駝 科物種。
[0071] 在一些替代的實施方案中，VH結構域中的H1或H2或者H1和H2二者均可以獲得 自駱駝科物種，並且獨立地，VL結構域中的L1或L2或者L1和L2二者均可以獲得自駱駝 科物種。在另一些實施方案中，VH結構域中的H3或VL結構域中的L3也可以獲得自駱駝 科物種。上述所有可能的排列都是允許的。在一個具體的實施方案中，VH結構域和VL結 構域兩者中的每個高變環HI、H2、H3、LI、L2和L3都可以獲得自駱駝科物種。
[0072] 在一個實施方案中，整個VH結構域和/或整個VL結構域可以獲得自駱駝科物種。 然後，可以對駱駝科的VH結構域和/或駱駝科的VL結構域進行蛋白質改造，其中向駱駝科 序列中引入一個或更多個胺基酸替換、插入或者缺失。這些經改造的變化優選地包括相對 於駱駝科序列而言的胺基酸替換。這樣的變化包括"人源化"或"種系化"，其中駱駝科動物 編碼的VH或VL結構域中的一個或更多個胺基酸殘基被來自於同源的人編碼的VH或VL結 構域中的等效殘基所取代。
[0073] 在某些實施方案中，駱駝科的高變環（或CDR)可以通過使用與期望的目的"靶抗 原"反應能夠誘發抗體的抗原物質對駱駝科物種進行主動免疫而獲得。如本文詳細討論和 舉例的，使用能夠與靶抗原免疫反應誘發抗體的抗原物質來免疫駱駝科（天然動物或者經 改造的轉基因動物以表達駱駝科動物物種免疫球蛋白庫）之後，可以鑑定由B細胞產生的 對期望抗原具有特異性的（常規駱駝科）抗體，並且可以使用已知的技術來分離編碼這樣 的抗體之VH和VL結構域的多核苷酸。
[0074] 因此，在一個特定的實施方案中，本發明提供了與靶抗原免疫反應的重組抗原結 合多肽，所述多肽包含VH結構域和VL結構域，其中VH結構域或VL結構域中的至少一個高 變環或互補決定區獲得自駱駝科物種的VH或VL結構域，並且特徵在於所述抗原結合多肽 與靶抗原特異性結合，所述靶抗原是在包括至少抗原結合多肽之表位的序列比較窗口表現 出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原，所述抗原 結合多肽通過包括以下步驟的方法獲得：
[0075] (a)免疫駱駝科物種並且由此產生針對所述靶抗原的抗體；
[0076] (b)確定核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼與所述靶抗原免疫反應的駱駝科常規 抗體之VH和/或VL結構域的至少一個高變環或互補決定區（CDR);以及
[0077] (c)表達與所述靶抗原免疫反應的抗原結合多肽，所述抗原結合多肽包含VH和VL 結構域，其中VH結構域或VL結構域的至少一個高變環或互補決定區（CDR)具有由部分（a) 所確定的核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
[0078] 分離的通過主動免疫獲得的駱駝科VH和VL結構域可以用作改造根據本發明的 抗原結合多肽的基礎。從完整的駱駝科VH和VL結構域開始，可以進行一個或更多個氨基 酸替換、插入或者缺失的改造，從而與開始的駱駝科序列不同。在某些實施方案中，這樣的 替換、插入或缺失可存在於VH結構域和/或VL結構域的框架區。在一級胺基酸序列中進 行這些變化的目的可以是為了減少推測的不利性質（例如在人宿主中的免疫原性（所謂的 人源化）、為了減少使潛在產物具有異質性和/或不穩定性的位點（糖基化、脫醯胺、異構 化等）或是為了提高分子的一些其它有利性質（例如溶解性、穩定性、生物利用率等）。在 另一些實施方案中，在一級胺基酸序列中的變化可以在通過主動免疫獲得的駱駝科VH和/ 或VL結構域的一個或更多個高變環（或CDR)中進行改造。可以引入這樣的變化從而提高 抗原結合的親和力和/或特異性，或者減少推測的不利性質（例如在人宿主中的免疫原性 (所謂的人源化或種系化）、減少使潛在產物具有異質性和/或不穩定性的位點（糖基化、 脫醯胺、異構化、移除含硫胺基酸例如甲硫氨酸等），或是為了提高分子的一些其它有利性 質（例如溶解性、穩定性、生物利用率、可製造性等）。
[0079] 因此，在一個實施方案中，本發明提供了重組的抗原結合多肽，相比於通過用靶抗 原對駱駝科物種進行主動免疫所獲得的駱駝科VH或VL結構域，其在VH結構域或VL結構 域的至少一個框架區或⑶RR中包含至少一個胺基酸替換，特徵在於所沭抗原結合多肽與 靶抗原特異性結合，所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%氨 基酸序列同一性的多肽抗原。該特定的實施方案排除了通過主動免疫產生的含有天然駱駝 科VH和VL結構域的抗原結合多肽。
[0080] 在另一些實施方案中，本發明涵蓋"嵌合"抗體分子，其包含來自駱駝科的VH和VL 結構域（或其經改造的變體）以及來自非駱駝科動物抗體的一個或更多個恆定結構域，例 如人編碼的恆定結構域（或其經改造的變體）。在這樣的實施方案中，優選的是VH結構域 和VL結構域均獲得自同一駱駝科動物物種，例如，VH和VL可以都來自大羊駝或者VH和VL 可以都來自羊駝（之後引入經改造的胺基酸序列變化）。在這樣的實施方案中，VH和VL結 構域可以都來自於單個動物，尤其是已被主動免疫的單個動物。本發明還延伸至嵌合抗原 結合多肽（例如抗體分子），其中VH或VL結構域之一是經駱駝科動物編碼的，而其它可變 結構域是非駱駝科動物（例如人）的。
[0081] 作為在駱駝科VH和/或VL結構域的一級胺基酸序列中進行改造產生變化的一個 替代方案，可將單個的駱駝科高變環或CDR或者其組合從駱駝科VH/VL結構域中分離出來， 並通過CDR移植將其轉移到替代的（即非駱駝科的）框架（例如人VH/VL框架）。
[0082] 與高度保守抗原結合的抗原結合多狀
[0083] 在本發明一個優選的實施方案中，表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至 少90%胺基酸序列同一性的靶抗原可能是"高度保守"抗原。在由駱駝科動物物種的主動 免疫產生抗原結合多肽的情況下，如果靶抗原與同一駱駝科動物物種（如同在其中產生抗 原結合多肽的駱駝科動物物種）的天然抗原的序列和/或結構極其類似，那麼認為所述靶 抗原是"高度保守的"。例如，在抗原結合多肽是大羊駝來源的情況下，"高度保守"靶抗原 是來自大羊駝之外物種的高度類似於天然大羊駝抗原的多肽。
[0084] 在多肽抗原的情況下，高度保守抗原與天然駱駝科動物多肽（其在結構上最接近 相關的）之間的相似度可表示為胺基酸序列的％相似性。因此，在一些優選的實施方案中， 高度保守抗原是來自所述駱駝科物種之外的物種的多肽，其表現出與來自所述駱駝科物種 的同源蛋白質具有至少90%的胺基酸序列同一性。在另一些優選的實施方案中，高度保守 抗原可以是來自所述駱駝科物種之外的物種的多肽，其表現出與來自所述駱駝科物種的同 源蛋白質具有至少95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列同一性。
[0085] 除非本申請中另外說明，否則兩個胺基酸序列之間的％序列同一性可通過比較這 兩個以最佳方式比對的序列來確定並且其中待比較的兩個胺基酸序列可包含相對於參考 序列的添加或缺失以得到這兩個序列之間的最佳比對。通過測定兩個序列之間相同的氨 基酸殘基的位置數，將該相同的位置數除以所選序列比較窗口中的位置總數並且將所得結 果乘以100從而獲得這兩個序列之間的同一性百分比來計算同一性百分比。例如，可使用 BLAST 程序，可在網站 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/bl2. html 上得到的 "BLAST 2 序列，'（Tatusova 等，"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences" ,FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)，所使用的參數是默認 給出的那些（特別是參數"開放空缺罰分（open gap penalty)"：5,以及"延伸空缺罰分 (extension gap penalty) ":2;選擇的矩陣為例如，由程序建議的矩陣"BL0SUM 62"），由程 序直接計算出待比較的兩個序列之間的同一性百分比。
[0086] 對於任何給定的靶抗原，技術人員還可使用公共可得的搜索和比對工具，例如 BLAST程序，其中靶抗原作為單個查詢序列。從返回的結果，可確定多肽抗原是否表現出與 來自相關駱駝科物種（即抗原結合多肽的高變環和互補決定區來源於其的駱駝科物種）的 蛋白質具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列同一性。
[0087] 在本發明的所有方面和實施方案中，在其將靶抗原與比較物駱駝科動物蛋白質相 比較的"序列比較窗口"必須是包括至少抗原結合多肽之表位的靶抗原的區。所述序列比 較可以是，例如，靶蛋白質的至少20個胺基酸，或至少30個胺基酸，或至少50個胺基酸，或 至少100個胺基酸的連續序列，其包含抗原結合多肽的表位。
[0088] 在某些實施方案中，序列比較窗口可包括包含抗原結合多肽之表位的靶抗原的至 少一個結構域。
[0089] 在另一些實施方案中，序列比較窗口可以是全長的靶抗原，其通過限定將包括抗 原結合多肽的表位，即使表位的確切特徵/位置未知。
[0090] 在每一個前述實施方案中，所述靶抗原可包含與來自所述駱駝科物種的比較物蛋 白質中存在之表位具有基本上相同結構的表位（對於抗原結合多肽）。在線性表位的情況 下，形成表位的胺基酸序列可以是在靶抗原與比較物駱駝科動物蛋白質之間100%保守的。
[0091] 高度保守抗原可以是基本上來自任何物種的多肽，所述物種包括但不限於人、非 人靈長類動物、小鼠、大鼠、豬、狗、豚鼠、兔、牛或雞。然而，在一些特別優選的實施方案中， 所述高度保守抗原可以是人多肽，例如治療靶標或生物標誌物。在一些特別優選的實施方 案中，所述高度保守抗原可以是治療或診斷相關的靶抗原。人多肽的確切性質不是實質問 題；本發明提供了用於產生針對人多肽的抗體的平臺，所述人多肽是"高度保守的"無論人 多肽的確切特徵如何。人多肽（可針對其產生本發明的抗原結合多肽）的特徵在於其與天 然駱駝科動物抗原的相似程度（在胺基酸序列中）。通過非限制性實例的方式，一個可針 對其產生抗體的"高度保守的"人多肽是高遷移率族1(thehighmobilitygroupbox1， HMGB1)蛋白質，其是在人與小鼠之間99%保守的並且在人與大羊駝之間97%保守的。 [0092] 在另一些實施方案中，高度保守抗原可以是非多肽抗原，例如糖類抗原（例如，寡 糖或多糖）或者包含多肽和糖類組分兩者的抗原，例如，糖蛋白。在靶抗原是糖蛋白的情況 下，糖蛋白靶抗原可表現出與同源的駱駝科動物蛋白質的糖基化模式基本上相同的糖基化 模式。抗原結合分子所結合的抗原決定簇可以是糖類表位或者其可以是由多肽決定簇（例 如一個或更多個胺基酸殘基）和糖類決定簇（例如，糖蛋白的寡糖/聚糖側鏈的一個或更 多個糖部分）的組合所形成的表位。
[0093]與駱駝科動物自身抗原和駱駝科動物來源抗原結合的抗原結合多狀
[0094] 在本發明的第二個優選的實施方案中，表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具 有至少90%胺基酸序列同一性的靶抗原可以是駱駝科動物自身抗原或駱駝科動物來源抗 原。在由駱駝科動物物種的主動免疫產生的抗原結合多肽的情況下，術語"自身抗原"是指 天然駱駝科動物抗原，即，天然存在於同一駱駝科動物物種中的抗原。例如，在由大羊駝的 主動免疫產生抗原結合多肽的情況下，術語"自身抗原"是指天然大羊駝抗原，即，天然存在 於大羊駝中的抗原。
[0095] 駱駝科動物（例如，大羊駝）自身抗原可包括多肽、肽、多糖、糖蛋白、多核苷酸 (例如，DNA)、抗原等，其中多肽自身抗原是特別優選的。"多肽自身抗原"可包括天然駱駝 科動物多肽還有駱駝科動物多肽的合成形式，例如重組表達的多肽。
[0096] 本文所使用的術語"駱駝科動物來源抗原"是指靶抗原，其是來源於天然駱駝科動 物抗原的變體，所述變體在結構/序列上與駱駝科動物抗原高度相似，例如駱駝科動物多 肽的經改造的序列變體。駱駝科來源多肽抗原可具有與其所來源的天然駱駝科動物蛋白 質的胺基酸序列高度類似的胺基酸序列，例如胺基酸序列具有與天然駱駝科動物多肽至少 90 %，或者至少95 %、96 %、97 %或98 %，或者甚至至少99 %的同一性。
[0097] 抗獨特型
[0098] 在一個特別重要的實施方案中，抗原結合多肽可以是抗獨特型抗原結合多肽（例 如，抗獨特型抗體或其抗原結合片段），其與包含獲得自駱駝科物種之抗體的可變區的靶抗 原結合。駱駝科來源抗體（抗獨特型與其結合）可以是常規的駱駝科動物抗體（即，包含 成對的VH和VL結構域的駱駝科動物抗體）或者只有重鏈的抗體（即包含VHH結構域的駱 駝科動物抗體）。在其中產生抗獨特型抗原結合多肽的駱駝科動物物種可與抗體可變區所 來源的駱駝科動物物種相同。因此，通過非限制性實例的方式，一個優選的實施方案是大羊 駝來源的抗獨特型抗原結合多肽（例如，大羊駝抗獨特型抗體），其與大羊駝來源抗體的可 變區中的表位（靶抗原）結合。形成抗獨特型抗體的靶抗原之大羊駝來源的抗體可以是常 規大羊駝抗體或者只有重鏈的大羊駝抗體。
[0099] 抗獨特型抗原結合多肽所結合的駱駝科動物來源的（例如，大羊駝來源的）抗體 之可變區中的表位可位於駱駝科動物來源的（例如，大羊駝來源的）常規抗體的VH結構域 中，或者駱駝科動物來源的（例如，大羊駝來源的）常規抗體的VL中，或者所述表位可由駱 駝科動物來源的（例如，大羊駝來源的）常規抗體的VH結構域和VL結構域兩者中的氨基 酸來形成。抗獨特型抗原結合多肽的"表位"最通常地由其所結合的抗體可變區的CDR來 形成。
[0100] 形成抗獨特型抗原結合多肽之靶向抗原的駱駝科動物來源的（例如，大羊駝來源 的）常規抗體的可變區可來源於天然駱駝科動物（例如，大羊駝）常規抗體，例如通過採用 目的抗原主動免疫駱駝科動物（例如，大羊駝）所產生的抗體，或者實際上其可以是天然駱 駝科動物（例如，大羊駝）常規抗體的合成的或經改造的序列變體。因此，在本文的上下 文中，"常規的駱駝科動物來源抗體的可變區"不僅包括天然駱駝科動物常規抗體的可變區 (即，與駱駝科動物中產生的抗體具有相同序列），而且涵蓋經改造的變體，例如相對於天 然駱駝科動物序列，在相關的框架區和/或CDR中具有胺基酸替換的變體，前提是經改造的 變體仍可保持與天然駱駝科動物來源的常規抗體的可變結構域（VH和/或VL)具有最小至 少90%的胺基酸序列同一性。在這樣的實施方案中，用於評估％胺基酸序列同一性的序列 比較窗口可包括整個VH結構域和整個VL結構域。
[0101] W0 2010/001251描述了駱駝科動物（並且特別是大羊駝）作為用於產生針對一系 列靶抗原的常規、四鏈抗體之平臺的用途，所述靶抗原包括治療目的的人多肽靶標。那個申 請描述的是許多用於產生針對目的靶抗原的常規駱駝科動物抗體的技術。一旦已經分離出 對靶抗原具有適當結合特異性的天然駱駝科動物（例如，大羊駝）常規抗體，通常對在天然 駱駝科動物抗體的可變結構域中的一級胺基酸序列進行一個或更多個改變以提高其特性， 例如使其更適於人類治療用途。這樣的改變可包括在VH結構域和/或VL結構域的框架區 內的胺基酸替換，並且還包括在有助於抗原結合位點的VH和/或VL結構域內的一個或更 多個CDR中的胺基酸替換。如上文所述，抗獨特型抗原結合多肽的"表位"最通常是由其所 結合的抗體可變區的CDR來形成的。因此，還期望將通過用來自同一物種的靶抗體的可變 區來主動免疫（例如，用大羊駝Fab來免疫）駱駝科動物物種（例如，大羊駝）所產生的抗 獨特型抗原結合多肽與那些可變區的種系化變體（例如，大羊駝Fab的種系化形式）相結 合，特別地如果將為了"種系化"目的所引入的胺基酸替換限制於框架區，那麼就使得CDR 在序列和結構構象方面基本保持不變。
[0102] 本發明現在提供了通過其產生高特異性、高親和力的抗獨特型抗原結合多肽的方 法，所述抗獨特型抗原結合多肽具有對常規駱駝科動物來源抗體的可變區的結合特異性， 即使考慮後者可為由於免疫耐受難以靶向的駱駝科動物自身抗原。
[0103]如本文所述的抗獨特型抗原結合多肽的一個主要實際應用是作為對於旨在用作 人治療劑之駱駝科動物來源抗體的藥代動力學研究的工具。
[0104]抗原結合多狀的結構
[0105] 只要VH和VL結構域都存在，那麼本發明的抗原結合多肽就可以採用多種不同的 實施方案。因此，在一些非限制性的實施方案中，抗原結合多肽可以是免疫球蛋白、抗體或 抗體片段。本文的術語"抗體"以最廣義來使用，並涵蓋但不限於單克隆抗體（包括全長的 單克隆抗體）、多克隆抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體），只要它們表現出對靶抗原 具有適當的特異性即可。本文使用的術語"單克隆抗體"是指獲得自基本同源的抗體之群 體的抗體，即包含在該群體中的各個抗體是相同的，除了可以少量存在的可能的天然突變 以外。單克隆抗體針對單個抗原位點具有高度特異性。此外，與常規的（多克隆）抗體制 劑（其通常包含針對抗原上不同決定簇（表位）的不同抗體）不同的是，每個單克隆抗體 針對抗原上的單個決定簇或表位。
[0106]"抗體片段"包含全長抗體的一部分，一般為其抗原結合或可變結構域。抗體片 段的實例包括？&13、？&13'、？(&13')2、雙特異性？ &13'8以及？￥片段、雙抗體（(11&13 〇(^)、 線性抗體、單鏈抗體分子、單鏈可變片段（SCFV)和由抗體片段形成的多特異性抗體（參見 Holliger 和 Hudson，Nature Biotechnol. 23 :1126-36 (2005)，其內容通過引用併入本文）。 [0107]在一些非限制性實施方案中，根據本發明的抗體和抗體片段可包含CH1結構域和 /或CL結構域（其胺基酸序列完全或基本上是人的）。當本發明的抗原結合多肽是旨在用 於人治療用途的抗體時，抗體的整個恆定結構域或者至少其一部分通常具有完全或基本上 為人的胺基酸序列。因此，本發明的抗體必須包含VH和VL結構域，其至少一個包含來源於 駱駝科的至少一個高變環，但CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域和CL結構域（以 及CH4結構域，如果存在的話）中的一個或更多個或者任意組合的胺基酸序列可完全或基 本上是人的。
[0108]有利地，CH1結構域、鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域和CL結構域（以及CH4結構 域，如果存在的話）可以都具有完全或基本上為人的胺基酸序列。就人源化或嵌合抗體或 抗體片段的恆定結構域而言，術語"基本上為人的"是指與人恆定結構域具有至少90%、或 至少95%、或至少97%、或至少99%的胺基酸序列同一性。在本文的上下文中，術語"人的 胺基酸序列"是指由人免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列，其包括種系的、重排的和體細胞 突變的基因。本發明還涵蓋這樣的多肽，其包含已被改變的"人"序列恆定結構域（通過一 個或更多個胺基酸的添加、缺失或者替換來對於人序列進行改變）。
[0109]正如本文別處所討論的，預想到可以在重鏈和/或輕鏈的恆定結構域（特別是 在Fc區內）內進行一個或更多個胺基酸的替換、插入或缺失。胺基酸的替換可導致使用 不同的天然存在胺基酸或者使用非天然的或經修飾的胺基酸來取代被替換的胺基酸。其 它結構修飾也是允許的，例如改變糖基化模式（例如通過添加或缺失N-或0-連接的糖基 化位點）。取決於抗體的預期用途，可以期望修飾本發明抗體對Fc受體的結合特性，例如 用來調節效應功能。例如，可以將半胱氨酸殘基引入Fc區中，從而使該區中形成鏈間二硫 鍵。由此產生的同源二聚體抗體可具有提高的內化能力和/或增強的補體介導之細胞殺 傷和抗體依賴的細胞毒性（ADCC)。參見Caron等，J.Exp. Med. 176:1191-1195(1992)以及 Shopes，B. J. Immunol. 148 :2918-2922(1992)。或者，可以將抗體改造成具有雙Fc區，從而 可具有增強的補體裂解和ADCC的能力。參見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230(1989)。本發明還預期包含本文所述抗體的免疫綴合物，其中所述抗體與細胞毒劑 (例如化療劑、毒素（例如，細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素，或其片段）或放射 性同位素（即放射性綴合物））相綴合。還可以改造Fc區以延長半衰期。
[0110] 在某些實施方案中，本發明可涵蓋與靶抗原特異性結合的嵌合駱駝科/人抗體， 所述靶抗原是來自所述駱駝科物種的自身抗原或者表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白 質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原。一些優選的實施方案包括嵌合抗體，其中 VH和VL結構域完全是駱駝科動物序列（例如大羊駝或羊駝），而抗體的其餘部分完全是人 序列。在一些優選的實施方案中，本發明還涵蓋"種系化"的駱駝科抗體以及駱駝科/人嵌 合抗體，其中VH和VL結構域相比於通過主動免疫獲得的駱駝科VH和VL結構域來說在框 架區中包含一個或更多個胺基酸替換。通過使用在人種系編碼的VH或VL結構域中發現的 等效殘基來取代起始駱駝科VH或VL結構域中的錯配胺基酸殘基，"種系化"方法（如在W0 2010/001251和W0 2011/080350中所述，其通過引用併入本文）提高了與人種系VH或VL 結構域的％序列同一性。
[0111] 本發明還進一步涵蓋CDR移植的抗體，其中將來源於與靶抗原（其是來自所述駱 駝科物種的自身抗原或者表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序 列同一性的多肽抗原）特異性結合的駱駝科抗體（例如通過使用靶抗原進行主動免疫產生 的駱駝科抗體或者由駱駝科動物的基因編碼的抗體）的CDR(或高變環）移植到人VH和VL 框架上，而抗體的其餘部分還是完全人來源的。
[0112] 根據本發明種系化的、嵌合的和CDR移植的抗體（特別是包含來源於使用靶抗原 對駱駝科進行主動免疫獲得之高變環的抗體）可以使用常規的重組DNA操作和表達技術容 易地產生，其利用經改造的原核和真核宿主細胞（包括但不限於細菌細胞、酵母細胞、哺乳 動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞，其中的一些如本文所述並在所附實施例中說明）以產生目 的多肽。
[0113] 本發明還進一步延伸至這樣的抗原結合多肽，其中VH結構域和/或VL結構域的 高變環或CDR獲得自駱駝科，但相對於駱駝科動物編碼的序列來說，其中將至少一個所述 (駱駝科動物來源的）高變環或⑶R已被改造成包含一個或更多個胺基酸替換、添加或者 缺失。這些變化包括高變環/⑶R的"人源化"。已經以這種方式改造的駱駝科動物來源之 HV/CDR仍可以表現出與駱駝科動物編碼的HV/CDR之胺基酸序列"基本一致"的胺基酸序 列。在本文的上下文中，"基本一致"可允許與駱駝科動物編碼的HV/CDR有不超過一個，或 不超過兩個胺基酸序列錯配。
[0114] 根據本發明的抗體可以是任何同種型，所述抗體與靶抗原特異性結合，所述靶抗 原是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原。 用於人類治療用途的抗體通常為IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型，通常是IgG型，在這種情況下， 其可屬於IgG 1、IgG2a和b、I gG3或IgG4四個亞類中的任何。在這些亞類中的每一個中，允 許在Fc部分內進行一個或更多個胺基酸的替換、插入或缺失，或者進行其它結構修飾，從 而例如提高或降低Fc依賴的功能。
[0115] 與靶抗原（其是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序 列同一性的多肽抗原）特異性結合的抗原結合多肽可用於廣泛的應用中，包括在研究中以 及在診斷和/或治療疾病中。由於與天然人抗體的VH和VL結構域具有高度的胺基酸序列 同一性和高度的結構同源性（特別是如在人抗體中發現的正確的典型摺疊的組合），本發 明的抗原結合多肽（特別是以單克隆抗體的形式）將發現作為人治療劑的特別用途。
[0116] 多核苷酸、載體和重糹目表汰
[0117] 本發明還提供了編碼本發明抗原結合多肽的多核苷酸分子、包含與調節序列有效 連接的編碼本發明抗原結合多肽之核苷酸序列的表達載體，以及包含該表達載體的宿主細 胞或無細胞表達系統，所述調節序列允許抗原結合多肽在宿主細胞或無細胞表達系統中表 達。
[0118] 編碼本發明抗原結合多肽的多核苷酸分子包括例如重組DNA分子。
[0119] 如本文所使用的術語"核酸"、"多核苷酸"或"多核苷酸分子"可互換使用，其是指 任何DNA或RNA分子，無論是單鏈或雙鏈的，並且如果是單鏈的話，還包括其互補序列的分 子。在討論核酸分子時，本文中可根據以5'至3'方向提供序列的標準慣例來描述特定 核酸分子的序列或結構。在本發明的一些實施方案中，核酸或多核苷酸是"分離"的。當用 於核酸分子時，該術語是指將核酸分子從其來源之生物體的天然存在基因組中與其緊密相 鄰的序列分離出來。例如，"分離的核酸"可以包括插入到載體（如質粒或病毒載體）中的 DNA分子，或者是整合到原核或真核細胞或非人類宿主生物體之基因組DNA中的DNA分子。 當用於RNA時，"分離的多核苷酸"主要是指由上文定義的分離的DNA分子編碼的RNA分子。 或者，該術語可指這樣的RNA分子，其已經被從其它的核酸（在自然狀態下（即在細胞或組 織中）所述RNA分子與其他核酸聯繫（associate)在一起）純化/分離出來。分離的多核 苷酸0NA或RNA)還可表示通過生物或合成手段直接產生，並在其生產過程中與存在的其 它組分分開的分子。
[0120] 在W0 2010/001251和W0 2011/080350中描述了用於根據本發明的抗原結合多肽 之重組生產的標準技術,其內容通過引用整體地併入本文。
[0121] 應注意，術語"宿主細胞"一般是指培養的細胞系。將已經引入編碼根據本發明的 抗原結合多肽之表達載體的完整人類明確地排除在本發明的範圍以外。
[0122] 在一個重要的方面，本發明還提供了生產重組抗原結合多肽的方法，其包括在允 許所述抗原結合多肽表達的條件下，培養包含編碼重組抗原結合多肽之多核苷酸（例如表 達載體）的宿主細胞（或無細胞表達系統），並回收所表達的抗原結合多肽。該重組表達方 法可用於根據本發明抗原結合多肽（包括旨在用於人類治療用途的單克隆抗體）的大規模 生產。用於大規模生產適用於體內治療用途之重組抗體的合適載體、細胞系和生產方法都 是在本領域通常可得的，並為本領域技術人員所公知。
[0123] 本發明的另一些方面涉及測試藥盒，包括診斷藥盒等，其包含根據本發明的抗原 結合多肽，還有包含根據本發明之抗原結合多肽的藥物製劑。
[0124] 當抗原結合多肽旨在用於診斷用途時（例如，當所述抗原結合多肽特異性針對作 為疾病狀態或疾病易感性之生物標誌物的抗原時），然後可方便地提供所述抗原結合多肽 作為測試藥盒的組分。診斷測試通常採用標準的免疫測定形式，如ELISA、放射免疫測定、 Elispot等。這種測試藥盒的組分可取決於測試或測定（其旨在使用本發明的抗原結合多 肽來實施）的性質而有所不同，但通常還包括使用本發明抗原結合多肽進行免疫測定所需 的另外試劑。用作診斷試劑的抗原結合多肽可帶有顯示標記（revealing lable)，如突光部 分、酶促標記或放射性標記。
[0125] 通常將用於體內治療用途的抗原結合多肽與一種或更多種可藥用稀釋劑、載體或 賦形劑一起配製成藥物劑型（Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 版，Osol， A.編，1980)。通常將根據本發明的抗原結合多肽配製成無菌水溶液，以對有此需要的哺乳 動物對象（通常是人患者）靜脈內、或通過肌內、腹膜內、腦脊髓內、腫瘤內、經口、腫瘤周邊 (peritumoral)、皮下、滑膜內（intra-synovial)、鞘內、表面、舌下或吸入途徑施用。為預防 或治療疾病，抗原結合多肽的合適劑量將取決於待治療之疾病的類型、疾病的嚴重程度和 臨床病程，以及患者的年齡、體重和病史，並由主治醫師判斷確定。
[0126] 抗原結合多狀的牛產方法
[0127] 本發明的一個重要方面涉及用於生產針對目的靶抗原具有高親和力的抗原結合 多肽（特別是單克隆抗體）的方法，其中所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋 白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0128] 因此，本發明方法用於製備與靶抗原特異性結合的重組抗原結合多肽，所述抗原 結合多肽包含VH結構域和VL結構域，其中VH結構域或VL結構域中的至少一個高變環或 互補決定區（CDR)獲得自駱駝科物種，所述方法包括以下步驟：
[0129] (a)免疫駱駝科物種（使用靶抗原），從而產生針對所述靶抗原的常規抗體；
[0130] (b)分離駱駝科核酸，其編碼與所述靶抗原免疫反應之駱駝科常規抗體VH和/或 VL結構域的至少一個高變環或互補決定區（CDR);
[0131] (c)製備包含編碼如下高變環或互補決定區之核苷酸序列的多核苷酸，所述高變 環或互補決定區具有與由步驟（a)分離的核酸編碼的高變環或互補決定區一致的胺基酸 序列，所述多核苷酸編碼包含與所述靶抗原免疫反應（或特異性結合）之VH結構域和VL 結構域的抗原結合多肽；以及
[0132] (d)由步驟（c)的重組多核苷酸來表達所述抗原結合多肽，其中所述抗原結合多 肽與部分（b)的駱駝科常規抗體不一致，特徵在於所述靶抗原表現出與來自所述駱駝科物 種的蛋白質具有至少90 %，或者至少95 %、96 %、97 %或98 %的胺基酸序列同一性。
[0133] 該方法的第一步驟包括對駱駝科物種進行主動免疫以引起針對靶抗原的免疫應 答，從而產生與所述靶抗原免疫反應的駱駝科動物常規抗體。對駱駝科動物免疫的方案描 述於所附實施例中。用於免疫的抗原物質可以是靶抗原的純化形式，例如重組表達的多肽 或其免疫原性片段。然而，也可使用靶抗原的未加工製劑（例如表達或編碼所述靶抗原的 分離的細胞或組織製劑、細胞裂解物、細胞上清液或級分（例如細胞膜）等，或脂質顆粒、 珠、小泡或在其表面上含有抗原的其它顆粒）或者使用編碼所述靶抗原的多核苷酸進行免 疫（DNA免疫）。該方法通常涉及駱駝科物種（包括，但不限於，大羊駝和羊駝）動物的免 疫，並且有利的是這些動物屬於完全遠系種群（outbred population)。然而，還預期使用包 含駱駝科動物常規Ig基因座，或至少其一部分的轉基因動物（例如轉基因小鼠）。
[0134] 基於駱駝科動物主動免疫的方法的一個關鍵優勢出於所有駱駝科物種都可以以 大的遠系種群（其中動物個體都有不同的遺傳背景）來維持的事實。因此，可採用主動免 疫來引起針對目的抗原之強的和多樣的免疫應答，並從中可獲得多樣的潛在抗原結合分子 池（pool)。如所附實施例所示，駱駝科動物的主動免疫可產生具有高度免疫多樣性的與高 度保守靶抗原（例如，可與駱駝科動物多肽共享大於90%胺基酸序列同一性的多肽抗原） 結合的Fab片段。
[0135] 在使用靶抗原進行主動免疫後，可從經免疫的動物中分離出外周血淋巴細胞或活 檢樣品（例如淋巴結或脾活檢樣品），並進行篩選用於產生針對靶抗原的常規駱駝科動物 抗體。如實施例中所示，該階段中可使用例如淘選（panning)或FACS分選的富集技術以減 少待篩選的B細胞庫的複雜性。然後，選出抗原特異性B細胞並用於提取總RNA以及隨後 的cDNA合成。編碼天然駱駝科動物VH和VL結構域的核酸（特異性針對靶抗原）可通過 PCR進行分尚。
[0136] 可以將編碼駱駝科動物VH和VL結構域的核酸直接克隆到用於生產根據本發明之 抗原結合多肽的表達載體中。特別地，可以將這些序列克隆到還編碼人抗體恆定區或其一 部分的表達載體中以產生嵌合抗體。然而，通常是在克隆和表達人類恆定區序列之前，對分 離的駱駝科動物VH和VL序列進行進一步操作。
[0137] 第一步，可使用候選的駱駝科動物VH和VL序列（主動免疫後分離的）製備駱駝 科動物文庫（例如Fab文庫，如所附實施例中所述的）。然後可針對與靶抗原的結合來篩選 文庫（例如使用噬菌體展示）。可以對有前景的首選候選物針對與靶抗原的結合進一步進 行測試，例如使用Biacore或合適的生物測定。最後，將最有前景的首選編碼VH和VL結構 域的序列與編碼人抗體恆定區的序列進行框內融合克隆。
[0138] 用來編碼（駱駝科動物來源的）HV/CDR的多核苷酸序列（例如用於本發明抗原結 合多肽的重組表達）不需要與駱駝科動物中天然編碼HV/⑶R的天然多核苷酸序列一致。因 此，本發明涵蓋/允許密碼子優化以及在多核苷酸序列中涉及克隆和/或表達的其它變化， 這不改變所編碼的胺基酸序列。
[0139] 在某些實施方案中，可進行"鏈改組（chain shuffling) "，其中將已知與目的抗原 結合的特定可變結構域與一系列相反類型的可變結構域中的每一個配對（即VH與VL文庫 配對或相反亦然）以產生文庫以及所得到的針對抗原親和力和/或特異性進行測試的VH/ VL組合。或者，VH結構域文庫可隨機或以分級的方式與VL結構域的文庫配對，並測試所得 到的組合（參見Clackson等，Nature,卷352,624-638頁，1991)。在該方法中，所述文庫可 以是來自駱駝科動物（其表現出對目的抗原具有免疫性（包括已被主動免疫的動物））的 重排VH和VL(Vk或VA)的文庫。所述鏈改組過程可增加免疫多樣性並產生具有顯著增 強的親和力的配對。
[0140] 在本發明的方法中，可對"天然的"駱駝科動物來源VH和VL結構域進行蛋白質改 造以引入一個或更多個選擇性的胺基酸替換，通常引入框架區中。將這樣的替換引入"野生 型"駱駝科動物序列的原因可以是（i)框架區的人源化，（ii)穩定性、生物利用率、產物均 一性、組織滲透性的提高等，或者（iii)靶抗原結合的優化。
[0141] 可根據廣泛接受的原則通過框架區中選擇性取代一個或更多個胺基酸殘基來進 行駱駝科動物來源的VH和VL結構域的"種系化"（如在W0 2010/001251和W0 2011/080350 中所說明的，其內容通過引用特定地併入本文）。應當理解，為實現任何給定VH結構域、VL 結構域或其組合的可接受的"種系化"而進行之胺基酸改變的確切特徵將視具體情況而變 化，因為這將取決於來源於駱駝科之框架區的序列以及這些框架區與最對應的人種系（或 體細胞突變的）框架區之間的起始同源性，並且也可能取決於形成抗原結合位點之高變環 的序列和構象。種系化過程的總體目標是產生這樣的分子，當將其引入人對象中時，其中的 VH和VL結構域都表現出最小的免疫原性，而保留了由駱駝科編碼的親本VH和VL結構域 (例如通過主動免疫獲得的駱駝科動物VH/VL)形成的抗原結合位點的特異性和親和力。
[0142] f庫構律的方法
[0143] 在一個相關方面，本發明還涵蓋產生編碼駱駝科常規抗體之VH和VL結構域的表 達載體文庫的方法，所述方法包括以下步驟：
[0144] a)主動免疫駱駝科動物，從而產生針對靶抗原的常規駱駝科動物抗體；
[0145] b)從包含來自所述經免疫駱駝科動物的淋巴組織（例如循環B細胞）的樣品來制 備cDNA或基因組DNA ;
[0146] c)擴增所述cDNA或基因組DNA的區域以獲得這樣的擴增基因區段，每個基因區段 包含編碼駱駝科常規抗體之VH結構域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科常規抗體之VL結構 域的核苷酸序列；以及
[0147] d)將c)中獲得的基因區段克隆到表達載體中，使得每個表達載體都包含編碼VH 結構域的基因區段和編碼VL結構域的基因區段，並且指導包含所述VH結構域和所述VL結 構域的抗原結合多肽的表達，由此得到表達載體文庫，其特徵在於所述靶抗原是表現出與 來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90 %，或者至少95 %、96 %、97 %或98 %胺基酸序 列同一,丨生的多肽抗原。
[0148] 上述"文庫構建"的方法也可構成上述用於生產本發明抗原結合多肽之一般方法 的一部分。因此，被描述為涉及本發明的這一方面優選或有利的任何特徵也可被認為涉及 一般方法是優選或有利的，反之亦然，除非另有說明。
[0149] 在一個實施方案中，步驟a)中被擴增的核酸包括從駱駝科動物淋巴組織製備的 cDNA或基因組DNA，所述淋巴組織包括一種或更多種B細胞、淋巴結、脾細胞、骨髓細胞，或 其組合。循環B細胞是特別優選的。外周血淋巴細胞（PBL)可用作編碼常規駱駝科動物抗 體之VH和VL結構域的核酸的來源，即在PBL樣品中存在足夠量的（表達抗體的）漿細胞以 使得可以進行直接擴增。這是有利的，因為PBL可從動物（駱駝科動物）採集的全血樣品 製備。這就避免了需要使用侵入性程序來獲取組織活檢樣品（例如，來自於脾或淋巴結）， 並且這意味著採樣程序可視需要而經常重複進行，同時對動物的影響最小。例如，可以主動 免疫駱駝科動物，從該動物中抽取第一血樣，並製備PBL，然後使用"加強"劑量的同一抗原 或不同抗原第二次免疫同一動物，然後抽取第二血樣，並製備PBL。
[0150] 因此，該方法的一個特定實施方案可包括：製備來自駱駝科動物之含PBL的樣品， 從PBL製備cDNA或基因組DNA，並利用該cDNA或基因組DNA作為模板來擴增編碼駱駝科動 物常規抗體之VH或VL結構域的基因區段。在一個實施方案中，淋巴組織（例如循環B細 胞）獲得自已經被主動免疫的駱駝科動物，如本文別處所述。總RNA(或mRNA)可從淋巴組 織樣品（例如外周血細胞或組織活檢樣品）中方便地製備，並且通過標準技術轉換為cDNA。 還可使用基因組DNA作為起始材料。
[0151] 本發明的這一方面涵蓋用於構建文庫的多樣性文庫方法和B細胞選擇方法。在一 種多樣性文庫方法中，可從由淋巴組織製備的核酸擴增編碼VH和VL之基因區段的庫，而不 需任何的事先B細胞選擇。在一種B細胞選擇方法中，可在核酸提取和擴增編碼VH和VL 之基因區段之前，選擇展示具有期望抗原結合特性之抗體的B細胞。
[0152] 可使用多種常規方法來選擇表達具有期望抗原結合特性之抗體的駱駝科動物B 細胞。例如，B細胞可被螢光標記的單克隆抗體（mAb，特異性識別來源於大羊駝或其它駱駝 科動物的常規抗體）和其它螢光染料標記的靶抗原染色以用於常規IgG的細胞表面展示。 然後，可通過FACS分離各雙陽性B細胞，並且從各個細胞中提取總RNA(或基因組DNA)。 或者，可以對細胞進行體外增殖，並可篩選含有分泌的IgG的培養上清液，以及從陽性細胞 提取總RNA(或基因組DNA)。在另一種方法中，各個B細胞可經特定基因進行轉化或與腫 瘤細胞系來融合以產生可以"根據需要（at will)"生長的細胞系，隨後從這些細胞製備總 RNA (或基因組DNA)。
[0153] 除了通過FACS進行分選，還可在固定化的單克隆抗體（針對駱駝科動物常規抗 體）並隨後在固定化的靶抗原上對表達常規IgG的靶標特異性B細胞進行"淘選"。可從抗 原特異性B細胞池提取RNA (或基因組DNA)，或者可轉化這些池並可通過有限稀釋或FACS 克隆出單個細胞。
[0154] B細胞選擇方法可包括陽性選擇或陰性選擇。無論是使用不進行任何B細胞選 擇的多樣性文庫方法或是使用B細胞選擇方法，對從淋巴組織製備的核酸（cDNA或基因組 DNA)進行擴增步驟，從而擴增編碼各VH結構域或VL結構域的基因區段。
[0155] 可將從淋巴組織（例如外周B細胞或組織活檢樣品）提取的總RNA轉化成隨機引 物cDNA，或者寡dT引物，可用於合成cDNA，或者Ig特異性寡核苷酸引物可用於合成cDNA， 或者可在cDNA合成前使用寡dT纖維素從總RNA純化mRNA ( S卩，聚A RNA)。可將從B細胞 分離的基因組DNA用於PCR。
[0156] 可使用於可變區5'端退火的FR1引物組合CH1或Ck/CA區3'端退火的引物進 行編碼至少VH或VL的重鏈和輕鏈（k和A)基因區段的PCR擴增，其優勢在於：就這些恆 定結構域引物而言，每種類型只需要一種引物。該方法使駱駝科動物的Fab得以克隆。或 者，可使用於可變區的3'端退火的一系列FR4引物再次克隆Fab (融合到編碼恆定區的載 體中）或scFv (單鏈Fv,其中重鏈和輕鏈的可變區通過柔性的接頭序列相連）；或者，可在 這樣的表達載體中克隆可變區，所述表達載體允許產生在哺乳動物細胞上展示的全長IgG 分子。
[0157] 通常擴增以兩步進行，在使用非標記引物的第一步中使用大量的cDNA(以保持多 樣性），並且在第二步中，使用經標記的引物（其是延伸引物，在5'端引入了限制性位點以 進行克隆）僅在少數幾個循環中對擴增子進行再次擴增。在第二擴增步驟之前，可將第一 擴增步驟（非標記的引物）中產生的擴增子進行凝膠純化以去除多餘的引物。或者，可引 入啟動子序列，其使得可以轉錄成RNA用於核糖體展示。除了限制性位點以外，還可以引入 重組位點（如Cre-Lox或T0P0位點），其允許定點插入到適當的載體中。
[0158] 然後，可將編碼駱駝科動物常規VH和VL結構域的經擴增基因區段克隆到適合於 表達VH/VL組合為功能性抗原結合多肽的載體中。例如，首先，可將來自B細胞池（或未進 行任何B細胞選擇的其它淋巴組織）的經擴增VHCH1/VKCK/VLCL基因區段分別克隆為單獨 的文庫（最初的文庫），然後在第二步中，可通過切下輕鏈片段並將其連接到編碼重鏈片段 的載體中組裝成Fab或scFv文庫。所述兩步程序支持大型文庫的構建，因為PCR產物的克 隆是相對低效的（由於限制性酶的消化效果欠佳所致）。通過基於擴增子序列中少部分重 疊的重疊剪接延伸PCR(splicing-by-〇verlap extension，SOE)可生成編碼scFv的DNA片 段；在PCR中，通過將編碼VH和VL的擴增子與編碼接頭的小DNA片段混合，由於其重疊序 列而形成單個DNA片段。
[0159] 可以將包含編碼VH和VL之基因區段的擴增子克隆到噬菌體或噬菌粒載體中，其 允許通過使用基於噬菌體展示的選擇方法來選擇靶標特異性抗體片段。或者，可將擴增子 克隆到允許在酵母細胞上（如Fab、scFv或全長IgG)或在哺乳動物細胞上（如IgG)展示 的表達載體中。
[0160] 在另一些實施方案中，可通過使用核糖體展示的擴增子來避免克隆，其中在擴增 引物中包含17(或其它）啟動子序列和核糖體結合位點。在針對結合靶抗原的選擇後，克隆 該池並對各個克隆進行分析。因為文庫的克隆和噬菌體的選擇僅限於1〇 1(1至10 12個克隆， 所以從理論上講，與噬菌體展示文庫方法相比，使用該方法可採樣到更多的免疫庫（immune repertoire)〇
[0161] 當使用B細胞分選時，可將包含單個靶標特異性B細胞之編碼VH或VL的基因區 段的擴增子直接克隆到細菌或哺乳動物表達載體中用於產生抗體片段（scFv或Fab)或甚 至全長的IgG。
[0162] 在"文庫構建"方法的一個特定的非限制性實施方案中，本發明提供了用於生產 編碼駱駝科動物常規抗體之VH和VL結構域的表達載體文庫的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0163] a)主動免疫駱駝科動物，從而產生針對靶抗原的常規駱駝科動物抗體；
[0164] b)從包含來自所述經免疫駱駝科動物（包括但不限於大羊駝或羊駝）的淋巴組織 (例如循環B細胞）的樣品製備cDNA或基因組DNA ;
[0165] c)擴增所述cDNA或基因組DNA的區域以獲得這樣的擴增基因區段，每個基因區段 包含編碼駱駝科動物常規抗體之VH結構域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科動物常規抗體 之VL結構域的核苷酸序列；以及
[0166] d)將c)中獲得的基因區段克隆到表達載體中，使得每個表達載體都包含編碼VH 結構域的基因區段和編碼VL結構域的基因區段，並且指導包含所述VH結構域和所述VL結 構域之抗原結合多肽的表達，由此得到表達載體文庫，其特徵在於所述抗原結合多肽與靶 抗原特異性結合，所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%，或 者至少95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0167] 上述方法可用於製備駱駝科動物編碼之VH和VL結構域（特別是大羊駝和羊駝的 VH和VL結構域）的文庫，其適於將VH/VL組合表達為有功能的抗原結合多肽，例如以scFv、 Fab或全長抗體的形式。
[0168] 根據上述方法製備的編碼駱駝科動物（包括但不限於大羊駝或羊駝）VH和VL結 構域的表達載體文庫也構成了本發明主題的一部分。
[0169] 在一個特定的實施方案中，本發明提供了編碼Fab或scFv分子的噬菌體載體文 庫，其中所述文庫中編碼的每個Fab或scFv均包含駱駝科動物常規抗體的VH結構域和駱 駝科動物常規抗體的VL結構域。
[0170] 在一個實施方案中，文庫是"多樣性"文庫，其中所述文庫中的大部分克隆編碼具 有獨特胺基酸序列的VH結構域和/或具有獨特胺基酸序列的VL結構域，包括駱駝科動物 VH結構域和駱駝科動物VL結構域的多樣性文庫。因此，就VH結構域和/或VL結構域的氨 基酸序列而言，多樣性文庫中的大部分克隆（例如大於90% )編碼的VH/VL對與同一文庫 中編碼的任何其它VH/VL對是不同的。
[0171] 本發明還包括涵蓋編碼VH和VL之基因區段的表達載體，所述基因區段分離自駱 駝科動物（例如大羊駝或羊駝）之單獨選出的B細胞。
[0172] 在另一個方面，本發明還提供了選擇如下表達載體的方法，所述表達載體編碼與 靶抗原免疫反應的抗原結合多肽，所述方法包括以下步驟：
[0173] i)提供表達載體文庫，其中所述文庫中的每個載體都包含編碼VH結構域的基因 區段和編碼VL結構域的基因區段，其中所述VH結構域或所述VL結構域的至少一個來自於 駱駝科動物常規抗體，並且其中所述文庫中的每個載體都指導包含所述VH結構域和VL結 構域之抗原結合多肽的表達；
[0174] ii)就與所述靶抗原的免疫反應性，篩選由所述文庫編碼的抗原結合多肽，並由 此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應的抗原結合多肽的表達載體，其特徵在於所述抗原結合 多肽與靶抗原特異性結合，所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少 90%，或者至少95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0175] 本發明的此方法涵蓋從編碼VH/VL對的克隆文庫篩選/選擇與靶抗原免疫反應的 克隆，所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一 性的多肽抗原。所述方法還可涵蓋文庫構建，其可使用如上所述的文庫構建方法進行。如 下所述，可針對所選克隆進行任選的下遊處理/優化步驟。該選擇和篩選的方法也可構成 上述用於生產本發明抗原結合多肽之一般方法的一部分。因此，被描述為涉及本發明的這 一方面的優選或有利的任何特徵也可被認為涉及一般方法是優選或有利的，反之亦然，除 非另有說明。
[0176] 與靶抗原免疫反應之克降的篩詵和詵擇
[0177] 篩選/選擇通常包括將由文庫中克隆編碼的表達產物（即以抗原結合多肽形式的 VH/VL對，例如Fab、scFv或抗體）與靶抗原接觸，並選擇所編碼的VH/VL對表現出期望的 抗原結合特性（即與靶抗原結合）的一個或更多個克隆，所述靶抗原是表現出與來自所述 駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0178] 噬菌體展示文庫可在固定化的靶抗原或可溶性（通常是生物素化的）的靶抗原上 進行選擇。由於其以單體存在並在噬菌體上以單價展示，所以Fab形式允許親和力驅動的 選擇，這對於scFv (由於聚集並在噬菌體上以多價展示的結果）和IgG(二價形式）是不適 用的。通常需要兩到三輪的選擇才能獲得足夠富集的靶標特異性結合物。
[0179] 親和力驅動的選擇可通過在後續幾輪選擇中降低靶抗原量來進行，而使用非生物 素化靶標進行延長洗滌能夠鑑定出具有極佳親和力的結合物。
[0180] 該選擇程序能讓使用者追蹤（home in on)某些表位；而從固定化祀標上洗脫噬菌 體克隆的經典方法是基於pH休克（其使得抗體片段和/或靶標變性），與針對靶抗原的參 照mAb或可溶性受體或細胞因子的競爭導致展示出與靶標相關表位結合的抗體片段的噬 菌體得以洗脫（這自然也適用於其它展示系統，包括B細胞選擇方法）。
[0181] 使用從細胞或培養上清液製備的周質級分（片段從細胞中"洩漏"入其中），可將 從選擇產物中取得的單個克隆用於小規模抗原結合多肽（例如抗體片段）的生產。表達可 由誘導型啟動子（例如lac啟動子）驅動，這意味著添加誘導劑（IPTG)後，啟動片段的產 生。前導序列確保了片段向周質的轉運，其中將片段適當地摺疊並形成分子內二硫橋。
[0182] 由此產生的粗蛋白級分可用於靶標結合測定，例如ELISA。對於結合研究來說，從 單個克隆製備的噬菌體可用來克服Fab的低表達產量（其通常給出非常低的結合信號）。 還可以使用體外受體-配體結合測定來篩選這些蛋白質級分，以鑑定拮抗抗體；可以使用 基於ELISA的受體-配體結合測定，還可以使用如Alphascreen的高通量測定。也可以在 放射性標記的配體結合測定中進行篩選，其中將過表達受體之細胞系的膜級分固定；後一 測定極其靈敏，因為只需要皮摩爾量的放射性細胞因子，這意味著粗蛋白質級分中存在極 少量的拮抗性Fab就會給出陽性讀數。或者，可應用FACS來篩選抗體，其抑制了螢光標記 的細胞因子與細胞上表達的其受體的結合，而FMAT是該方法的高通量變體。
[0183] 可以將存在於周質級分中的或者通過其六組氨酸標籤上的IMAC部分純化的或者 通過蛋白G(已知與Fab的CH1結構域結合）進行部分純化的Fab直接用於使用細胞的生 物測定（其對細菌雜質不敏感）中；或者，可以在哺乳動物系統中再克隆來自單個大腸桿菌 (E. coli)細胞的Fab以用於Fab或IgG的表達，並隨後在生物測定中進行篩選。
[0184] 在鑑定陽性表達載體克隆（即編碼與期望靶抗原結合的功能性VH/VL組合的克 隆）後，常規地確定該可變區的核苷酸序列，並據此推導出所編碼的VH和VL結構域的氨基 酸序列。
[0185] 如果需要，可將Fab (或scFv)編碼區再克隆到另一表達平臺（例如，細菌表達載 體（除了沒有用於在噬菌體上展示所必需的基因3以外，其與噬菌粒載體相同））中，這實 現更大量的編碼片段的生產和純化。
[0186] 可通過表面胞質基因共振（例如Biacore)或經由其它方法確定純化的Fab (或 scFv)的靶標結合親和力以及使用體外受體-配體結合測定和基於細胞的測定來測試中和 效力。
[0187] 抗原結合的家族（特別是拮抗性Fab (或scFv))可基於序列分析（主要是VH，特 別是VH結構域的CDR3的長度和胺基酸序列）來鑑定。
[0188] 效力優化
[0189] 如有需要，可對通過篩選/選擇鑑定出的編碼對期望靶抗原具有親和力的VH/VL 組合之克隆進行下遊步驟，其中對親和力和/或中和效力進行優化。
[0190] 每個VH家族表現最佳的成員的效力優化可以通過輕鏈改組、重鏈改組或其組合 來實現，從而選出在動物中天然存在的親和力變體。這在一些實施方案中是特別有利的，其 中最初的駱駝科動物VH/VL結構域選自主動免疫的駱駝科動物，因為可使用從同一經免疫 動物製備的原始文庫來進行鏈改組，從而篩選在同一經免疫動物中產生的親和力變體。
[0191] 對於輕鏈改組而言，可使用編碼具有期望抗原結合特性的VH/VL對（例如拮抗性 Fab)的VH區（或VHCH1)的基因區段來構建文庫，其中該編碼VH的單個基因區段與文庫 (克隆最初從該文庫中選擇）中的輕鏈庫組合。例如，如果編碼VH的區段選自通過進行主 動免疫而引起針對靶抗原的免疫應答之駱駝科動物製備的文庫（例如，Fab文庫），那麼可 通過將該VH編碼區段與同一經免疫駱駝科動物的輕鏈（VL)庫組合來構建"鏈改組"文庫。 然後，可利用所得到的文庫來選擇靶抗原，但要在嚴格的條件（低靶標濃度，使用溶液中非 生物素化的靶標進行徹底洗滌）下，以確保分離出最高親和力的變體。周質級分的解離速 率篩選（off-rate screening)也可有助於鑑定改善的克隆。在經過序列分析並再克隆到 細菌生產載體中後，可對純化的經選擇Fab進行親和力（例如通過表面胞質基因共振）和 效力（例如通過生物測定）的測試。
[0192] 可通過將輕鏈改組後選擇之克隆的編碼輕鏈（VL)的基因區段克隆回來自於同一 動物（原始VH/VL編碼克隆從中選擇）的原始重鏈文庫來進行重鏈改組。或者，可使用CDR3 特異性寡核苷酸引物來擴增VH區家族，其可被克隆為與拮抗性Fab的輕鏈組合的庫。然後 親和力驅動的選擇和解離速率篩選可鑑定該家族內表現最優的VH。
[0193] 應當理解，輕鏈改組和重鏈改組步驟在實際中可以以任一順序進行，即可先進行 輕鏈改組，隨後進行重鏈改組，或可先進行重鏈改組，隨後進行輕鏈改組。這兩種可能性均 涵蓋在本發明的範圍內。在其他情況下，可不必同時進行輕鏈改組和重鏈改組，因此還涵蓋 了僅包括輕鏈改組或僅包括重鏈改組的方法。
[0194] 由具有改善的親和力和效力的VH/VL對（例如Fab)的輕鏈或重鏈，特別地，⑶R的 序列可用於生成經改造的變體（其中組合了單個Fab的突變）。已知突變通常可以疊加，這 意味著將這些突變進行組合可得到甚至更高的親和力。
[0195] 為人類治療用塗而講鬥於的矛中系m口格式什，（formatting)
[0196] 可以使選定的編碼表現出期望的抗原結合特性之VH/VL對的表達克隆（例如編碼 scFv或Fab的噬菌體克隆）的VH和VL編碼基因區段進行下遊處理步驟並再克隆到另外的 表達平臺，例如編碼適合於人類治療用途之抗原結合多肽形式的載體（例如，具有完全人 恆定結構域的全長抗體）中。
[0197] 可將有前景的"首選（lead) "經選擇克隆改造成在編碼VH結構域和/或VL結構域 的核苷酸序列中引入一個或更多個變化，所述變化可改變或可不改變編碼的VH結構域和/ 或VL結構域的胺基酸序列。VH或VL結構域序列中的這些變化可根據本文中別處所述的任 何目的進行改造，包括種系化或人源化、密碼子優化、增強的穩定性和優化的親和力等。
[0198] 本文所述的種系化的一般原則同樣適用於本發明的該實施方案。例如，可以在其 框架區（FR)中通過應用文庫方法來將包含駱駝科動物編碼的VH和VL結構域的首選克隆 種系化。如W0 2010/001251和W0 2011/080350中所述，在與最接近的人種系（針對VH和 VL)以及與具有相同⑶R1和⑶R2典型摺疊的其它人種系比對之後，即可鑑定在FR中被改 變的殘基，並選擇優選的人殘基。雖然種系化可以包括使用來自於最匹配人種系的等效殘 基來取代駱駝科動物編碼的殘基，但是這不是必需的，也可使用來自於其它人種系的殘基。
[0199] 一旦已知首選的VH和VL結構域（需要時，在效力優化後）的胺基酸序列，即可設 計VH和VL的合成基因，其中與人種系不同的殘基被優選的人殘基（來自於最匹配的人種 系，或使用出現在其它人種系中的殘基，或者甚至是駱駝科動物野生型的殘基）取代。在該 階段，可以將編碼可變結構域的基因區段再克隆到表達載體中，其中使其在基因合成中或 通過克隆到合適的展示載體中而與人的Fab恆定區融合。
[0200] 可將所得的VH和VL合成基因重組到Fab文庫中，或者可將經種系化的VH與野生 型VL重組（反之亦然，稱為"雜合"文庫）。親和力驅動的選擇允許分離出表現最優的種系 化形式，就"雜合"文庫而言，可將表現最優的種系化VH與表現最優的種系化VL進行重組。 [0201] 可使用經種系化之Fab的胺基酸和核苷酸序列信息來生成經密碼子優化的合 成基因以產生優選同種型（IgGl (適用於ADCC和CDC)、IgG2 (適用於有限的效應功能）、IgG4(類似於IgG2,但當單價結合時需要））的全長人IgG。對於非長期的應用和快速指示， 也可產生細菌或哺乳動物細胞產生的人Fab。
[0202] 在一個具體的非限制性實施方案中，組合上述方法步驟，本發明提供了生產編碼 與靶抗原免疫反應之嵌合抗原結合多肽的表達載體的方法，所述方法包括以下步驟：
[0203] a)主動免疫駱駝科動物（包括但不限於大羊駝或羊駝），從而產生針對靶抗原的 常規駱駝科動物抗體；
[0204] b)從包含來自於所述經免疫駱駝科動物的淋巴組織（例如循環B細胞）的樣品制 備cDNA或基因組DNA;
[0205] c)擴增所述cDNA或基因組DNA的區域以獲得如下經擴增的基因區段，每個基因區 段包含編碼駱駝科動物常規抗體之VH結構域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科動物常規抗 體之VL結構域的核苷酸序列；
[0206] d)將c)中獲得的基因區段克隆到表達載體中，使得每個表達載體包含編碼VH結 構域的基因區段和編碼VL結構域的基因區段，並且指導包含所述VH結構域和VL結構域的 抗原結合多肽的表達，由此產生了表達載體文庫；
[0207] e)就與所述靶抗原的免疫反應性，篩選由步驟d)中獲得的文庫編碼的抗原結合 多肽，並且由此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應之抗原結合多肽的表達載體；
[0208] f)任選地，進行輕鏈改組步驟和/或重鏈改組步驟以選擇表達載體，所述表達載 體編碼與所述靶抗原免疫反應的經效力優化的抗原結合多肽；
[0209] g)任選地，對編碼步驟e)或步驟f)中所選載體之VH結構域的基因區段和/或編 碼步驟e)或步驟f)中所選載體之VL結構域的基因區段進行種系化和/或密碼子優化；以 及
[0210] h)將編碼部分e)或f)中所選載體之VH結構域的基因區段或步驟g)中產生的經 種系化和/或密碼子優化的VH基因區段以及編碼部分e)或f)中所選載體之VL結構域的 基因區段或步驟g)中產生的經種系化和/或密碼子優化的VL基因區段克隆到另一表達載 體中，並與編碼人抗體的一個或更多個恆定結構域的核苷酸序列進行有效連接，從而產生 編碼包含與人抗體的一個或更多個恆定結構域相融合的所述VH和VL結構域之嵌合抗原結 合多肽的表達載體，其特徵在於所述抗原結合多肽與靶抗原特異性結合，所述靶抗原是表 現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90 %，或者至少95 %、96%、97 %或98 %氨 基酸序列同一'丨生的多肽抗原。
[0211] 本發明還延伸到根據上述方法製備的表達載體，並延伸到產生與靶抗原免疫反應 之抗原結合多肽的方法，所述方法包括以下步驟：
[0212] a)使用上述方法製備編碼與靶抗原免疫反應之抗原結合多肽的表達載體；
[0213] b)在允許所編碼的抗原結合多肽表達的條件下，將所述表達載體引入宿主細胞或 無細胞表達系統中；以及
[0214]c)回收所表達的抗原結合多肽，其特徵還在於所述抗原結合多肽與靶抗原特異 性結合，所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%，或者至少 95%、96%、97%或98%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
[0215] 在一個實施方案中，後一方法涵蓋通過重組表達進行的本發明抗原結合多肽的批 量生產，特別是旨在用作藥學活性劑之治療性抗體的批量生產。在這樣的實施方案中，選擇 步驟a)中製備的表達載體和步驟b)中使用的宿主細胞/表達系統以適於大規模生產旨在 向人患者施用的重組抗體。用於該目的的合適載體和表達系統的一般特徵是本領域公知 的。
[0216] 將參照以下非限制性實驗實施例來進一步理解本發明。
[0217]實駘實施例
[0218]實施例1-針對HMGB1的抗體
[0219] 1. 1靶抗原
[0220] 該實施例的靶抗原是高遷移率族1 (HMGB1)，在幾乎所有細胞類型的細胞核和細胞 質中高度保守的、普遍存在的蛋白質。人和小鼠HMGB1具有215aa的長度和97%的序列同 一性。HMGB1是非組蛋白染色質相關的蛋白質和基因功能調節子，但是其還可作為警報素 (alarmin)〇
[0221] 已將HMGB1與炎性病症相聯繫，例如膿毒症（sepsis)、SLE和RA，以及多種癌症。
[0222] 專注於該靶標的原因之一為其是極度保守的靶標並且由於免疫系統移除自身 抗體而難以通過主動免疫產生抗體。HMGB1是高度保守的，如由在人與小鼠/大鼠蛋 白質之間有97%的胺基酸序列同一性的事實所說明。為了評估人與大羊駝HMGB1之 間的保守度，在來自羊騎（Lama pacos)的全基因組鳥槍序列資料庫（Whole Genome Shotgun sequence database)上用人 HMGB1 序列來進行同源 BLAST 檢索(www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/206581138) 〇這些檢索鑑定了三個基因組序列，其中一個包含前 兩個外顯子（序列ID:ABRR01273630. 1)並且另一個編碼第四個和最後一個外顯子（序 列ID:ABRR01273631.1)，而基因的中間部分是由另一個命中（hit)編碼的（序列ID: ABRR01227803. 1)，表明大羊駝HMGB1基因的組織與人基因組織相同。人與大羊駝HMGB1之 間的總序列同一性是96%，儘管已經強調了來自全基因組鳥槍資料庫的序列不是完全可靠 的並且可包含測序誤差。
[0223]1. 2免疫大羊駝
[0224] 使用弗氏不完全佐劑用重組HMGBl(HMGBiotech，HM114)對四隻大羊駝進行免疫。 在第一次注射期間，給予80 y g的靶蛋白質，隨後進行每兩周施用一次40 y g的靶蛋白質的 四次注射。在最後一次注射之後三天，取400ml血液進行PBL的純化。
[0225]1. 3 構律 Fab t?庫
[0226] 將從用在費氏不完全佐劑中之HMGB1抗原免疫的四隻大羊駝中分離的PBL用於 尺隱提取，使用由〇6他 &^11等，1.81〇1.〇16111.274，1999描述的兩步克隆方案在噬菌粒 (pCB3)中進行Fab的RT-PCR和PCR克隆。對於抗體庫的擴增而言，應用在W0 2010/001251 中所述的擴增引物。
[0227] 使用兩步PCR來構建獨立的VAC入和VkCk文庫，其中用未標記的引物進行25 個循環，接著用這些引物的標記形式（包含用於庫克隆的限制性位點）進行10個循環。使 用同一方法平行建立VHCH1文庫。用於VH、VX和Vk基因擴增的一系列引物可見於TO 2010/001251中。在pCB3中製造初級重鏈和輕鏈文庫，這些文庫的大小範圍為從IX 107個 至 3X 108個克隆（colony)。
[0228] 接著，將來自初級VACX和VkCk文庫的輕鏈編碼插入物分別再克隆到VHCH1 表達載體中以分別產生"A"和" K"Fab文庫。通過PCR常規進行的文庫質量控制觀察具 有全長Fab插入的克隆的百分比。所獲得的Fab文庫是大的，具有2X108至9X108個克隆 的大小。從每個文庫隨機測試的大量克隆包含全長Fab序列，表明文庫的高質量。
[0229]1. 4HMGB1特異件Fab的詵擇
[0230] 使用噬菌體展示來募集（recruit)與直接包被的HMGB1相結合的不同組（panel) 的大羊駝Fab。在四輪選擇之後，通過使用胰蛋白酶洗脫獲得了良好的富集。
[0231] 使來源於這些選擇的各克隆在96深孔板中生長（1ml表達）並且製備噬菌體並在 噬菌體結合 ELISA 中測試。簡言之，在 HMGBl(100ng/100ii 1，Genway (10-663-46237))和 酪蛋白包被的孔上孵育來源於各克隆的噬菌體以測定針對HMGB1的特異性結合。使用抗 M13-HRP 抗體（GE Healthcare，27-9421-01)來檢測噬菌體結合。
[0232] 為了測試與HMGB1特異性結合的克隆的序列多樣性，進行指紋圖譜 (fingerprint)分析。因此，通過標準的PCR技術來擴增這些克隆之編碼Fab的插入物。用 限制性內切酶Haelll和Alul來消化PCR片段並且將所消化的樣品在2. 5%的瓊脂糖凝膠 上跑樣。一些克隆/指紋圖譜出現了多次（結果未示出），但是總體而言，多樣性很高。
[0233] 使具有獨特指紋圖譜的克隆再次在96深孔板中生長（1ml表達）並且製備噬菌 體和周質提取物，其分別在噬菌體ELISA和Fab ELISA中對HMGB1結合再測試（數據未示 出）。在這兩種情況下，大多數克隆的HMGB1結合再次取得了陽性。
[0234] 對於每個克隆，測定了VH和VX二者或Vk片段的序列。基於HCDR3序列總共獲 得了 6個不同VH家族，其包含VH和V A親和力變體，即含有體細胞突變。發現了含有V入 和Vk輕鏈的兩種克隆。
[0235] 表1.所有HMGB1結合克隆之最接近的人種系和％人同一性以及％人同源性。
[0236]

【權利要求】
1. 分離的抗原結合多肽，其包含VH結構域和VL結構域，其中所述VH結構域或所述VL 結構域中的至少一個高變環或互補決定區（CDR)獲得自駱駝科（Camelidae)物種的VH或 VL結構域，其特徵在於所述抗原結合多肽與靶抗原特異性結合，所述靶抗原是在序列比較 窗口表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原， 所述序列比較窗口至少包括所述抗原結合多肽之表位，或者包括包含所述抗原結合多肽之 表位的所述靶抗原的至少一個結構域，或者全長的所述靶抗原。
2. 根據權利要求1所述的分離的抗原結合多肽，其中所述靶抗原是高度保守抗原，其 中所述高度保守抗原是來自所述駱駝科物種之外的物種的多肽，所述多肽在所述序列比較 窗口表現出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質具有至少90 %的胺基酸序列同一性。
3. 根據權利要求2所述的分離的抗原結合多肽，其中所述高度保守抗原在所述序列比 較窗口表現出與來自所述駱駝科物種的同源蛋白質具有至少95 %的胺基酸序列同一性。
4. 根據權利要求2或3所述的分離的抗原結合多肽，其中所述高度保守抗原是來自選 自以下之物種的多肽：人、非人靈長類動物、小鼠、大鼠、豬、狗、豚鼠、兔、羊、牛或雞。
5. 根據權利要求2至4中任一項所述的分離的抗原結合多肽，其中所述高度保守抗原 是人多膚。
6. 根據權利要求1所述的分離的抗原結合多肽，其中所述靶抗原是來自所述駱駝科物 種的自身抗原或者在所述序列比較窗口表現出與所述駱駝科自身抗原具有至少90 %氨基 酸序列同一性的駱駝科動物來源的抗原。
7. 根據權利要求1所述的分離的抗原結合多肽，其中所述靶抗原是獲得自所述駱駝科 物種之抗體的可變區或者在包括所述抗體整個可變區的序列比較窗口表現出與獲得自所 述駱駝科物種之抗體的可變區具有至少90%胺基酸序列同一性的變體。
8. 根據權利要求1至7中任一項所述的分離的抗原結合多肽，其中所述駱駝科物種選 自駱駝、大羊駝、單峰駝、駱馬、原駝和羊駝。
9. 根據權利要求8所述的分離的抗原結合多肽，其中所述駱駝科物種是大羊駝（Lama glama)〇
10. 根據前述權利要求中任一項所述的分離的抗原結合多肽，其中在所述VH結構域和 所述VL結構域兩者中的每個高變環或互補決定區均獲得自駱駝科物種的VH或VL結構域。
11. 根據前述權利要求中任一項所述的分離的抗原結合多肽，其是嵌合多肽，所述嵌合 多肽包含具有由人免疫球蛋白基因編碼的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的氨基 酸序列的至少一個恆定結構域，或者所述嵌合多肽包含人抗體的完整恆定區。
12. 根據前述權利要求中任一項所述的分離的抗原結合多肽，其是與所述靶抗原特異 性結合的嵌合羊駝屬-人抗體，所述抗原結合多肽包含成對的VH和VL結構域，其中所述VH 結構域和所述VL結構域各自與人抗體的一個或更多個IgG恆定結構域配對，並且其中所述 VH和VL結構域包含來源於通過使用所述靶抗原主動免疫所述羊駝屬物種所獲得之常規抗 體的高變環。
13. 多核苷酸分子，其編碼根據權利要求1至12中任一項所述的抗原結合多肽，或者編 碼所述抗原結合多肽的片段，所述片段包含獲得自駱駝科物種之VH或VL結構域的至少一 個高變環或互補決定區（CDR)。
14. 表達載體，其包含與允許所述抗原結合多肽在宿主細胞或無細胞表達系統中表達 的調節序列有效連接的權利要求13所述的多核苷酸分子。
15. 宿主細胞或無細胞表達系統，其包含權利要求14所述的表達載體。
16. 生產重組抗原結合多肽的方法，其包括在允許所述抗原結合多肽表達的條件下培 養權利要求15所述的宿主細胞或無細胞系統並且回收所表達的抗原結合多肽。
17. 藥物製劑，其包含根據權利要求1至12中任一項所述的抗原結合多肽和至少一種 可藥用稀釋劑、賦形劑或載體。
18. 用於製備與靶抗原特異性結合的重組抗原結合多肽的方法，所述抗原結合多肽包 含VH結構域和VL結構域，其中所述VH結構域或所述VL結構域中的至少一個高變環或互 補決定區（CDR)獲得自駱駝科物種，所述方法包括以下步驟： (a) 免疫駱駝科物種，由此產生針對所述靶抗原的常規抗體； (b) 分離駱駝科核酸，其編碼與所述靶抗原免疫反應的駱駝科常規抗體的VH和/或VL 結構域之至少一個高變環或互補決定區（⑶R); (c) 製備包含編碼如下高變環或互補決定區之核苷酸序列的多核苷酸，所述高變環或 互補決定區具有與由步驟（a)分離的核酸編碼的高變環或互補決定區一致的胺基酸序列， 所述多核苷酸編碼與所述靶抗原免疫反應（或特異性結合）之包含VH結構域和VL結構域 的抗原結合多肽；以及 (d) 由步驟（c)的重組多核苷酸表達所述抗原結合多肽，其中所述抗原結合多肽與部 分（b)的駱駝科常規抗體不一致，其特徵在於所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物種 的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
19. 根據權利要求18所述的方法，其中步驟（b)包括分離編碼所述抗體的VH結構域 和/或VL結構域的駱駝科核酸以及改變所述核酸的序列使得其編碼具有一個或更多個氨 基酸替換、缺失或者添加的VH結構域和/或VL結構域。
20. 根據權利要求18或19所述的方法，其中在步驟（c)中製備的所述重組多核苷酸還 包含編碼人抗體的一個或更多個恆定結構域的核苷酸序列。
21. 根據權利要求18至20中任一項所述的方法，其中所述駱駝科物種是駱駝、大羊駝、 單峰駝、駱馬、原駝或羊駝。
22. 用於生產編碼駱駝科常規抗體的VH和VL結構域之表達載體文庫的方法，所述方法 包括以下步驟： a) 主動免疫駱駝科動物，從而產生針對靶抗原的常規駱駝科動物抗體； b) 由包含來自所述經免疫駱駝科動物的淋巴組織（例如循環B細胞）的樣品製備cDNA 或基因組DNA ; c) 擴增所述cDNA或基因組DNA的區域以獲得這樣的經擴增基因區段，每個基因區段包 含編碼駱駝科常規抗體之VH結構域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科常規抗體之VL結構域 的核苷酸序列；以及 d) 將c)中獲得的所述基因區段克隆到表達載體中，使得每個表達載體都包含編碼VH 結構域的基因區段和編碼VL結構域的基因區段，並且指導包含所述VH結構域和所述VL結 構域的抗原結合多肽的表達，由此得到表達載體文庫，其特徵在於所述靶抗原是表現出與 來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
23. 用於製備編碼與靶抗原免疫反應的抗原結合多肽之表達載體的方法，所述方法包 括以下步驟： i) 使用權利要求22所述的方法製備表達載體文庫； ii) 就與所述靶抗原的免疫反應性，篩選由所述文庫編碼的抗原結合多肽，並由此選擇 編碼與所述靶抗原免疫反應之抗原結合多肽的表達載體，其特徵在於所述靶抗原是表現出 與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
24. 根據權利要求23所述的方法，其包括另外的步驟iii)，在所述步驟iii)中將編碼 部分（ii)中所選載體之VH結構域的基因區段和編碼部分（ii)中所選載體之VL結構域的 基因區段克隆到另外的表達載體中，與編碼人抗體的一個或更多個恆定結構域的核苷酸序 列有效連接，由此產生編碼包含與人抗體的一個或更多個恆定結構域相融合的步驟ii)中 所選VH和VL結構域之嵌合抗原結合多肽的表達載體。
25. 根據權利要求24所述的方法，其中在克隆到所述另外的表達載體之前，改造編碼 部分（ii)中所選載體之所述VH結構域的基因區段和/或編碼部分（ii)中所選載體之所 述VL結構域的基因區段以在編碼所述VH和/或所述VL結構域的核苷酸序列中引入一個 或更多個變化。
26. 根據權利要求23所述的方法，其還包括輕鏈改組方法，所述輕鏈改組方法包括以 下步驟： iii) 製備表達載體的第二文庫，其中所述文庫中的每個載體包含編碼VL結構域的基 因區段和編碼步驟ii)中所選表達載體之VH結構域的基因區段； iv) 就與所述靶抗原的免疫反應性，篩選由所述第二文庫編碼的抗原結合多肽，並且由 此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應之抗原結合多肽的表達載體。
27. 根據權利要求26所述的方法，其包括另外的步驟V)，在所述步驟V)中將編碼部分 (iv)中所選載體之VH結構域的基因區段和編碼部分（iv)中所選載體之VL結構域的基因 區段克隆到另外的表達載體中，與編碼人抗體的一個或更多個恆定結構域的核苷酸序列有 效連接，由此產生編碼包含與人抗體的一個或更多個恆定結構域相融合的步驟iv)中所選 VH和VL結構域之嵌合抗原結合多肽的表達載體。
28. 根據權利要求27所述的方法，其中在克隆到所述另外的表達載體之前，改造編碼 部分（iv)中所選載體之所述VH結構域的基因區段和/或編碼部分（iv)中所選載體之所 述VL結構域的基因區段以在編碼所述VH和/或所述VL結構域的核苷酸序列中引入一個 或更多個變化。
29. 根據權利要求26所述的方法，其還包括重鏈改組方法，所述重鏈改組方法包括以 下步驟： V)製備表達載體的第三文庫，其中所述文庫中的每個載體包含編碼VH結構域的基因 區段和編碼步驟iv)中所選表達載體之所述VL結構域的基因區段； vi)就與所述靶抗原的免疫反應性，篩選由所述第三文庫編碼的抗原結合多肽，並且由 此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應之抗原結合多肽的表達載體。
30. 根據權利要求29所述的方法，其包括另外的步驟vii)，在所述步驟vii)中將編碼 部分（vi)中所選載體之所述VH結構域的基因區段和編碼部分（vi)中所選載體之所述VL 結構域的基因區段克隆到另外的表達載體中，與編碼人抗體的一個或更多個恆定結構域的 核苷酸序列有效連接，由此產生編碼包含與人抗體的一個或更多個恆定結構域相融合的步 驟Vi)中所選載體的VH和VL結構域之嵌合抗原結合多肽的表達載體。
31. 根據權利要求30所述的方法，其中在克隆到所述另外的表達載體之前，改造編碼 部分（vi)中所選載體之所述VH結構域的基因區段和/或編碼部分（vi)中所選載體之所 述VL結構域的基因區段以在編碼所述VH和/或所述VL結構域的核苷酸序列中引入一個 或更多個變化。
32. 用於生產編碼與靶抗原免疫反應之嵌合抗原結合多肽的表達載體的方法，所述方 法包括以下步驟： a) 主動免疫駱駝科動物（大羊駝或羊駝），從而產生針對靶抗原的常規駱駝科動物抗 體； b) 從包含來自於所述經免疫駱駝科動物的淋巴組織（例如循環B細胞）的樣品製備 cDNA或基因組DNA ; c) 擴增所述cDNA或基因組DNA的區域以獲得這樣的經擴增基因區段，每個基因區段包 含編碼駱駝科動物常規抗體之VH結構域的核苷酸序列或包含編碼駱駝科動物常規抗體之 VL結構域的核苷酸序列； d) 將c)中獲得的所述基因區段克隆到表達載體中，以使得每個表達載體包含編碼VH 結構域的基因區段和編碼VL結構域的基因區段，並且指導包含所述VH結構域和所述VL結 構域的抗原結合多肽的表達，由此產生表達載體文庫； e) 就與所述靶抗原的免疫反應性，篩選由步驟d)中獲得的所述文庫編碼的抗原結合 多肽，並且由此選擇編碼與所述靶抗原免疫反應之抗原結合多肽的表達載體； f) 任選地，進行輕鏈改組步驟和/或重鏈改組步驟以選擇表達載體，所述表達載體編 碼與所述靶抗原免疫反應之經效力優化的抗原結合多肽； g) 任選地，對編碼步驟e)或步驟f)中所選載體之VH結構域的基因區段和/或編碼步 驟e)或步驟f)中所選載體之VL結構域的基因區段進行種系化和/或密碼子優化；以及 h) 將編碼部分e)或f)中所選載體之VH結構域的基因區段或者步驟g)中產生的經種 系化和/或密碼子優化的VH基因區段以及編碼部分e)或f)中所選載體之VL結構域的基 因區段或者步驟g)中產生的經種系化和/或密碼子優化的VL基因區段克隆到另外的表達 載體中，與編碼人抗體的一個或更多個恆定結構域的核苷酸序列有效連接，從而產生編碼 包含與人抗體的一個或更多個恆定結構域相融合的所述VH和VL結構域之嵌合抗原結合多 肽的表達載體，其特徵在於所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物種的蛋白質具有至少 90 %胺基酸序列同一性的多肽抗原。
33. 用於生產與靶抗原免疫反應之抗原結合多肽的方法，所述方法包括以下步驟： a) 使用權利要求23至32中任一項所述的方法製備編碼與靶抗原免疫反應之抗原結合 多肽的表達載體； b) 在允許所編碼的抗原結合多肽表達的條件下，將所述表達載體引入宿主細胞或無細 胞表達系統中；以及 c) 回收所表達的抗原結合多肽，其特徵在於所述靶抗原是表現出與來自所述駱駝科物 種的蛋白質具有至少90%胺基酸序列同一性的多肽抗原。
34. 根據權利要求18至33中任一項所述的方法，其中所述靶抗原如權利要求1至7中 任一項所限定。
【文檔編號】B01D15/18GK104520317SQ201380038485
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年7月19日 優先權日:2012年7月20日
【發明者】約翰內斯·約斯夫·威廉默斯·德哈德, 克裡斯託夫·弗雷德裡克·傑羅姆·布朗什託 申請人:阿爾金-X公司