具備抗血管生成活性的白蛋白變異體及其製備方法

2023-09-19 22:36:50 5

專利名稱：具備抗血管生成活性的白蛋白變異體及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及一種蛋白變異體及其製備方法。
背景技術：
「血管生成」 (angiogenesis) —詞於1787年由英國外科醫生John Hunter首次提 出。由此，人們發現「血管生成」與胚胎發育、組織再生以及慢性炎症有關[1]。直到1971年 Folkmani證明「血管生成」與腫瘤生長有關[2]。從此，「抗血管生成」(anti-angiogenesis) 成為一種新的抗腫瘤治療戰略。血管內皮細胞的生長和分化調控是血管生成的關鍵步驟。已證明前者受酪氨酸蛋 白激酶調節。血管內皮細胞生長因子(VEGF)受體-2(KDR)與VEGF結合，導致其受體酪氨 酸蛋白激酶活性被活化，從而啟動一系列後續細胞信號傳導通路。這一過程對於調控內皮 細胞前體分化以及原始血管網絡的形成至關重要。因此，抑制KDR的活性是抑制血管生成 的關鍵點之一。[3]臨床實驗中，許多小分子化學物質可特異性抑制KDR酪氨酸蛋白激酶活性，從而 有顯著的抗血管生成效應。然而，臨床實驗結果證明這些小分子化學物質毒性副作用較大。 最近，有人用中和抗體技術阻斷KDR的生物學活性，實驗證明這些抗體有有效的抗血管生 成作用。進一步這些抗體已成功用於臨床腫瘤抗血管生成治療[4]。由於噬菌體顯示技術(phage-display technology)的廣泛應用，人們篩選到許多 具有生物學活性的多肽[5]，其中一些具有十分有效的藥物學效應。然而，由於小肽分子在 體內應用的局限性，到目前為止很少有小肽藥物的成功上市。但具有藥物效應小肽分子的 發現，也為進一步藥物的設計和改造提供了非常有用的基本信息。現已發現ATWLPra肽可 以抵抗VEGF在體外刺激血管內皮細胞的增殖，並且可在動物體內完全阻斷VEGF誘導的血 管生成[6]。然而，這一小分子肽在體內半衰期短，用於治療腫瘤效果有限。人白蛋白(人血清白蛋白)是血液中最豐富的蛋白質之一，大約濃度為50mg/ ml (600PM)，其半衰期約為19天[11，12]。白蛋白對於維持血液的PH，膠體滲透壓有著非 常重要的作用，同時它也作為體內許多代謝物和脂肪酸的載體。許多藥物進入體內也利用 白蛋白作為運送載體。最近，有人成功地利用白蛋白結合多肽將小肽藥物附著在白蛋白分 子上，從而大大提高了小肽藥物在體內的半衰期和藥物療效作用[13]。也有人將多肽藥物 分子直接與白蛋白一起表達成融合蛋白，從而利用白蛋白在體內的特性提高其多肽藥物在 體內的半衰期以及生物學療效[14]。但是，直接將白蛋白進行定向化改造使之具有其他的 活性還未見報導。

發明內容
本發明要解決的是現有的ATWLPra肽體內半衰期短，用量大的問題。解決該問題的技術方案是提供一種白蛋白變異體。該白蛋白變異體為白蛋白C末 端的KEQLK肽段突變為WLPra肽段而得。
其中，所述的白蛋白為人白蛋白。進一步的，上述白蛋白變異體的胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。本發明還提供了編碼上述的白蛋白變異體的基因。進一步的，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。同時，本發明提供了含有上述基因的表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞。為了製備上述的白蛋白變異體，本發明還提供了一種製備所述白蛋白變異體的方 法。該方法包括以下步驟a、將白蛋白編碼基因序列中編碼肽段KEQLK序列的核苷酸序列誘變成編碼氨基 酸肽段WLPra序列的核苷酸序列，得到白蛋白變異體編碼基因序列；b、將白蛋白變異體編碼基因序列到連接到表達載體中；C、將表達載體轉入宿主中進行表達得到白蛋白變異體。其中，上述的表達載體優選為真核表達載體，宿主細胞優選為真核宿主細胞。其中，上述的將白蛋白編碼基因序列中編碼肽段KEQLK序列的核苷酸序列誘變成 編碼胺基酸肽段WLPra序列的核苷酸序列的誘變方式可以使用定點誘變引物進行PCR完成 定點誘變。本發明要解決的另一個技術問題是提供上述的白蛋白變異體或表達載體在製備 抗血管生成藥物中的用途。同時本發明提供了一種抗血管生成藥物，該抗血管生成藥物由 上述的白蛋白變異體或表達載體添加藥學上可接受的輔助性成分製備而成。具體說來，本發明直接將人白蛋白分子進行突變改造，從而附與產生的白蛋白變 異體具有新的生物學功能。這不同於通過白蛋白結合分子將外源藥物分子與白蛋白結合從 而形成一個「白蛋白藥物」複合物；或藥物分子與白蛋白融合在一起形成一種化學融合蛋白 的現有途徑。本發明主要通過改變白蛋白本身的分子結構，在白蛋白分子中通過胺基酸殘 基置換突變，從而產生一種新自然界不存在的白蛋白分子。即將白蛋白C末端的胺基酸殘 基KEQLK(人白蛋白在第565位至569位)採用分子突變方法變成WLPPR，從而在白蛋白分 子中產生了一個新的ATWLPPR功能結構(人白蛋白C末端的KEQLK殘基的兩端分別相鄰的 殘基分別為T和A)。該白蛋白分子保留有白蛋白分子的基本生物學活性，同時也具有突變 引入的新的功能結構所帶來的新活性。本發明的有益效果在於創造性地將人白蛋白進行定位突變，從而在其分子中產 生出一段ATWLPra序列。這一白蛋白變異體具有ATWLPra多肽的功能，並且保留了白蛋白的 分子結構。這導致本發明白蛋白變異體在體內有與野生型白蛋白一樣較長半衰期，同時可 大劑量在體內應用。這有利於提高ATWLPra的功能作用。實驗結果證明本發明ATWLPPR-白 蛋白變異體具有與ATWLPra在體外相同的抑制血管內皮細胞的增殖作用，且前者具有顯著 更強的體內抗血管生成作用。這一 ATWLPPR-白蛋白變異體為抗血管生成藥物的製備提供 了一種新的有效選擇


圖1為PHIL-D2質粒的結構簡2為人白蛋白變異體分離純化電泳圖譜。Lane 1 :DEAE離子交換層析純化樣品； Lane2 抗白蛋白抗體親和層析純化樣品
圖3為ATWLPI3R肽及白蛋白變異體對VEGF與Huvec細胞結合的抑制作用。VEGF 可與Huvec細胞表面VEGF受體結合。結合在細胞表面的VEGF可用細胞放射結合測定方法 (見材料和方法)用特異性125I-標記的VEGF抗體檢測之。其抗體結合的量(O.D.)可直接 反映出VEGF結合在細胞表面的量。將ATWLPra肽和白蛋白變異體與Huvec細胞溫育，可明 顯抑制後續的VEGF與Huvec細胞的結合作用。圖4為ATWLPI3R肽及白蛋白變異體對VEGF誘導Huvec細胞增殖效應的抑制作用 結果。VEGF在體外明顯誘導Huvec細胞進行細胞增殖作用。其細胞增殖作用可用摻入的 3H TdR量計量之。ATWLPI3R肽和白蛋白變異體可明顯抑制VEGF誘導Huvec細胞中3H_TdR 的摻入量。
圖5為用western-blot結果表明ATWLPPR-白蛋白變異體對VEGF細胞信 號傳導的抑制作用。其中+表示這一道用了這種處理，-表示這一道沒有用這種處 理，1道為ATWLPra多肽預先處理Huvec細胞，然後用VEGF刺激後的樣品；2道為 ATffLPPR-HAS(ATWLPPR-白蛋白變異體)預先處理Huvec細胞，然後用VEGF刺激後的樣品； 3道為ATWLPPR-HAS (ATWLPPR-白蛋白變異體)預先處理Huvec細胞，然後用VEGF刺激的樣 品；4道為沒有加活性物質處理，也沒有用VEGF刺激的對照樣品。Al為用磷酸化的KDR(Try 1054/1059)單克隆抗體與樣品反應的結果，1、2、4道中 反應信號弱，表明磷酸化的KDR少，而第3道信號強，表明KDR被磷酸化。A2為用KDR抗體與各樣品反應的結果，表明各道中均有KDR。A的結果表示ATWLPI3R白蛋白變異體明顯抑制KDR (血管內皮生長因子受體2， VEGF受體2)的酪氨酸磷酸化作用。第Bl行為用磷酸化的-Akt(Ser473)單克隆抗體與樣品反應的結果，1、2、4道中反 應信號基本沒有，表明KDR未被磷酸化，而第3道信號強，表明Akt被磷酸化。第B2行為用Akt的抗體與各樣品反應的結果，表明各道中均有Akt。B的結果表明ATWLPra白蛋白變異體完全抑制了活化AKT (蛋白激酶B)的形成；第Cl行為用磷酸化的-MAPK(Thr202/Tyr204)單克隆抗體與樣品反應的結果，1、 2、4道中反應信號基本沒有，表明KDR被磷酸化少，而第3道信號強，表明Akt被磷酸化。第C2行為用MAPK的抗體與各樣品反應的結果，結果表明各道中均有MAPK。C的結果表示ATWLPI3R白蛋白變異體有效地抑制了 MAPK蛋白激酶 (mitogen-activatedprotein kinases促分裂素原活化蛋白激酶)的活化。
具體實施例方式下面通過實施例並結合附圖，進一步說明而不限定本發明。下述實施例中，凡未註明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常 規條件，例如Sambrook, Russell的《分子克隆實驗室手冊》(New York =Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。下述實施例中，所用質粒PCRScript、載體PHIL D2購自於Invitrogen公司，菌株 Pichia Pastoris購自於Invitrogen公司。其餘化學試劑均為市售分析純。下述實施例中，「SEQ ID NO :1」單獨出現時，本領域技術人員可理解1其為「SEQ IDNO 1所示序列」的簡稱。
實施例一本發明ATWLPPR-白蛋白變異體表達載體的構建和蛋白質合成與純化從人肝細胞中分離出mRNA，然後逆轉錄合成cDNA，再用PCR方法在人白蛋白特異 性引物介導下合成人白蛋白cDNA。將PCR產物克隆到PCRScript質粒中。測定插入的人白蛋白cDNA的全長序列，序列為SEQ ID NO. 1所示。進一步進行體 外誘變。先合成寡聚核苷酸引物5，GAGCTTGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAtggctgccaccgcgaGCTGTTATGGATGATTTCGCAG CTTTTGTAGAG 3，(SEQ ID NO :5)。同時合成與之配對的一互補序列引物作為引物對。用前述克隆了人白蛋白cDNA 的PCRScript質粒作為模板，在這兩個引物介導下進行定點誘變。如上述SEQ ID NO. 3中 小寫字母所示，將白蛋白中的原來的編碼序列AAAGAGGCAACTGAA(編碼KEQLK)被突變成了 tggctgccaccgcga (WLPPR) o/^Stratagene ^W] StJ Quick ChangeMutagenesis 試劑盒按照說明書進行。將篩選到含變異體分子的質粒進行序列分析，證明原白蛋白相應 序列已突變成為WLPra的序列，測序確認ATWLPra白蛋白變異體全長cDNA編碼序列如SEQ ID NO 2 所示。
在完成上述突變實驗後，進一步將編碼該白蛋白變異體的cDNA克隆到酵母表達 載體中去。首先，合成2個寡聚脫氧核苷酸其序列作為引物，其序列分別為上遊引物5，ATCGTTCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC3，(SEQ ID NO 6)；下遊引物5，CGATGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG3，(SEQ ID NO :7)。然後用上述ATWLPra白蛋白變異體cDNA作為模板進行PCR反應。在該合引物對 中分別引進了上遊CSP451酶切點和下遊EcoRI酶切點，將PCR產物進行CSP451和EcoRI 雙酶切，然後將酶切產物克隆到PHIL-D2質粒(結構簡圖見圖1)中。將含有插入序列的PHIL-D2質粒進行序列分析證明PCR方法沒有在ATWLPPR-白 蛋白變異體序列中引入新的突變，確認插入的序列為目標序列(SEQ ID N0:3)。然後按 InVitrogen公司的pichia酵母表達系統試劑盒操作手冊，在酵母中表達ATWLPPR-白蛋白 變異體蛋白。將含有ATWLPPR-白蛋白變異體的酵母裂解物配製於0. IM磷酸鹽緩衝液(PH6. 8)， 置4°C離心(10000gX30分鐘)除去沉澱物，取上清上樣於DEAE-S印hadex A-50柱。用8 倍柱體積的0. IM磷酸鹽緩衝液洗滌DEAE-S印hadex A-50柱。然後用0. IM磷酸鹽緩衝液 含IOOmM至0. 5MNacl鹽梯度洗脫之，收集洗脫樣品。將收集峰樣品上樣於10% SDS-PAGE gel電泳，然後用Western blot方法用白蛋白抗體檢測含白蛋白的蛋白收集峰。將收集 的含白蛋白樣品的洗脫峰樣品匯集在一起，針對TBS緩衝液透析。然後上樣於抗白蛋白抗 體-Si^pharose 4B柱進行親和層析。用8倍柱體積的0. 1 % Tween-TBS緩衝液洗滌該柱，然 後用TBS (含0.2M甘氨酸-HCL(PH2.5))洗脫蛋白，收集蛋白洗脫峰。將親和層析分離純化 的ATWLPra白蛋白變異體進行SDS-PAGE電泳鑑定。結果如圖2所示，該白蛋白變異體的純 度> 95%。實施例二、本發明的ATWLPPR-白蛋白變異體的功效驗證實驗一、實驗設計( 一 ) ATffLPPR 多肽由 Syma-Genosys (Woodland_TX)公司合成。ATWLPPR-白蛋白 變異體由實施例一製備。
(二)HUVEC細胞增殖試驗Huvec細胞購自 Cell Applications Inc. (San Diego, CA)。將Huvec細胞以1500細胞/孔接種於96孔培養板中，將細胞置37°C CO2培養箱中培 養16小時後，加入不同濃度的合成ATWLPra多肽或ATWLPra白蛋白變異體，然後加入2ng/ ml VEGF。繼續培養48小時後，加入3H-TdR。6小時後，收穫細胞，用液閃計數計測定摻入 的3H-TdR量。mH-3T3細胞作為對照。
(三)多肽競爭抑制結合實驗將VEGF受體2(KDR)轉染HEK293細胞，將轉染後 的KDR-293細胞接種於96孔板中(1 X IO4細胞/孔)，置37°C培養過夜。用10%甲醇固定 細胞(20°C15分鐘)。用0.2%甘氨酸PBS處理細胞(室溫15分鐘)一次。再用PBS洗二 次。然後加入不同濃度的ATWLPI3R肽或ATWLPI3R白蛋白變異體，同時加入0. Ing/孔VEGF。 置37°C溫育2小時(Hr)，用PBS洗滌之。用1251-標記的抗VEGF抗體測定結合於細胞上 的VEGF量。(四)VEGF細胞信號傳導的抑制作用將Huvec細胞置IOOmm直徑培養板中培養， 當細胞密度達到75%時，改用無血清RPMI1640培養基培養16小時，然後加入2 X ICT4M的 合成ATWLPI3R肽或ATWLPI3R白蛋白變異體，30分鐘後加入100ng/ml VEGF刺激5分鐘。將 細胞用冷PBS洗2次，加入Iml Lamilli電泳上樣液裂解細胞，收集細胞裂解物，超聲處理 後，再煎沸5分鐘。將細胞裂解物上樣於12% SDS PAGE膠中電泳，然後進行Western Blot 分析試驗。用抗磷酸化AKT(Thr 473)抗體(購自Upstate)和抗磷酸化MAPK(Thr218/ Tyr220)抗體(購自SantCruz公司)檢測VEGF刺激AKT和MAKP活化情況。用抗磷酸化 KDR (Tyr 1054/1059)抗體檢測KDR的酪氨酸磷酸化作用。(五)家兔「角膜口袋」血管生成試驗(Corneal pocket assay)將 Hydrogel 水凝膠(1x2mm)置於載玻片上，加入2μ 1 PBS(其中含有25yg BSA),2pmol VEGF和 30nmolATWLPra多肽或ATWLPra白蛋白變異體。將其置入紐西蘭家兔角膜中。12天後直接 用裂隙燈檢測新生血管的形成作用。「 + 」表示新生血管小於Imm長，「++」表示新生血管Imm 長，「+++」表示新生血管1-2_長，「++++」表示新生血管> 2mm長。二、實驗結果( 一 ) ATffLPPR-白蛋白變異體對VEGF與KDR結合的競爭性抑制作用。在KDR轉染的HEK293細胞表面表達有大量的KDR蛋白。作為VEGF的受體，KDR可 特異性與VEGF進行高親和力結合。在加入VEGF之前，如果先用ATWLPra白蛋白變異體處 理KDR轉染的HEK293細胞，則可顯著抑制後續加入的VEGF與KDR的結合。結果如圖3所 示，隨著加入ATWLPPR-白蛋白變異體濃度的增加，其抑制作用相應增強。ATWLPra多肽在抑 制VEGF與其受體KDR結合過程中的作用相似。( 二 ) ATWLPPR-白蛋白變異體對VEGF刺激體外Huvec細胞增殖的抑制作用。Huvec細胞表面表達有特異性KDR分子，VEGF通過與KDR結合從而刺激Huvec細胞 DNA合成和增殖。用3H-TdR摻入方法可定量測定DNA合成及細胞增殖的程度。將ATWLPI3R 肽或ATWLPPR-白蛋白變異體預先處理Huvec細胞，結果VEGF刺激Huvec細胞增殖的程度明 顯被抑制。如圖4所示，其抑制效應與ATWLPra肽和白蛋白變異體濃度成正比，並且ATWLPra 肽與白蛋白變異體對VEGF刺激的Huvec細胞增殖作用的抑制效應非常相似。(三)ATWLPPR白蛋白變異體對VEGF刺激的細胞信號傳導的抑制作用。VEGF與KDR結合後，首先誘導KDR 二聚體化(dimerization)，從而激活其酶氨酸蛋白激酶活性，催化KDR的酪氨酸自身磷酸化(autophosphorylation)以及下遊底物分子 的酪氨酸磷酸化。已證明有二條主要細胞信號傳導通路對VEGF誘導內皮細胞促進血管生 成作用至關重要一是AKT蛋白激酶的活化；另一是MAPK蛋白激酶的活化。二者對於內皮 細胞的移動、分化、抗凋亡(anti-apoptosis)以及細胞增殖調控有著關鍵作用。[7-10]將ATWLPI3R肽或白蛋白變異體預先處理Huvec細胞，然後用VEGF刺激之，其不同 分子的磷酸化程度可用不同的特異性磷酸化抗體分子測定之，結果如圖5所示，VEGF刺激 的KDR酶胺基酸1054和1059 (Tyr 1054和Tyr 1059)的磷酸化作用被明顯抑制。Tyr 1054 和Tyrl059位於KDR的蛋白激酶調控區域，其磷酸化對KDR的活化和蛋白激酶活性至關重 要。其Tyrl054和Tyrl059的磷酸化程度可反映出KDR的酶活性。與此相對應，KDR下遊 的AKT和MAPK蛋白激酶活化也都受到了 ATWLPI3R肽和其白蛋白變異體處理的抑制。AKT蛋 白Thr473的磷酸化是AKT激酶活化必需的一步。AKT的Thr473磷酸化程度是其酶活性的 一個指標。MAPK激酶的活化需要其Thr218和Tyr220磷酸化，這二個胺基酸殘基的磷酸化 程度也直接反映了 MAPK蛋白激酶活性。如圖5所示，在ATWLPra肽和白蛋白變異體處理的 細胞中AKT Thr473和MAPK Thr218/Tyr220磷酸化程度明顯低於未處理的對照組。這表明 這二條信號傳導通路都被肽或白蛋白變異體處理抑制。(四)ATWLPPR白蛋白變異體在體內的血管生成抑制作用用家兔角膜「口袋」試驗(corneal pocket assay)來檢測ATWLPI3R白蛋白變異體 在體內的血管生成抑制作用。由於置入家兔角膜的膠中含有VEGF，在VEGF的作用下可誘導 角膜形成新生血管。如果膠中同時加入有同劑量的ATWLPra肽或其白蛋白變異體，則VEGF 誘導的血管生成作用被明顯地抑制。這證明了該白蛋白變異體在體內能有效地抑制血管的生成。同時表1顯示，白蛋 白變異體的抑制作用比ATWLPra肽更有效表1 =ATWLPra肽及白蛋白變異體對家兔角膜血管生成的抑制作用 實驗表明本發明新合成的白蛋白變異體具有ATWLPra肽分子相同的血管生成抑 製作用。它可以在體外抑制VEGF與其特異性受體分子KDR的結合。阻斷VEGF-KDR介導的 細胞信號傳導作用，抑制VEGF誘導的血管內皮細胞增殖作用。同時，它在體內家兔角膜血 管生成實驗中可明顯抑制血管的生成。參考文獻UGarmeliet, P =Nature Med. 6 :389_395，20002, Folkman, J :N. Engl. J. Med. 285 1182-1186，19713、Bold, G. et al J. Med. Chem. 43 :2310_2323，20003、Davis, D. W et al =Biotech. 34 1048-1063，2003
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權利要求
白蛋白變異體，其特徵在於由白蛋白C末端的KEQLK肽段突變為WLPPR肽段而成。
2.根據權利要求1所述的白蛋白變異體，其特徵在於所述的白蛋白為人白蛋白。
3.根據權利要求1所述的白蛋白變異體，其特徵在於其胺基酸序列如SEQID NO. 4所 示。
4.編碼權利要求1 3任一項所述的白蛋白變異體的基因。
5.根據權利要求4所述的基因，其特徵在於其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。
6.含有權利要求4或5所述基因的表達載體。
7.含有權利要求6所述表達載體的宿主細胞。
8.製備權利要求1 3任一項所述的白蛋白變異體的方法，其特徵在於包括以下步驟a、使用定點誘變引物將白蛋白編碼基因序列中編碼肽段KEQLK序列的核苷酸序列誘 變成編碼胺基酸肽段WLPra序列的核苷酸序列，得到白蛋白變異體編碼基因序列；b、將白蛋白變異體編碼基因序列到連接到表達載體中； C、將表達載體轉入宿主中進行表達得到白蛋白變異體。
9.權利要求1 3任一項所述的白蛋白變異體或權利要求6所述的表達載體在製備抗 血管生成藥物中的用途。
10.抗血管生成藥物由權利要求1所述的白蛋白變異體或權利要求6所述的表達載體 添加藥學上可接受的輔助性成分製備而成。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體屬於蛋白質藥物技術領域。本發明要解決的技術問題是現有的ATWLPPR肽在體內半衰期短，用量大。解決該問題的技術方案是提供一種白蛋白變異體。該白蛋白變異體將白蛋白C末端的KEQLK肽段突變為WLPPR肽段後得到的變異體。該人白蛋白變異體完全保留有人白蛋白的功能，同時具有了新的ATWLPPR序列功能。體外實驗證明，該白蛋白變異體在體外可明顯抑制VEGF誘導的血管內皮細胞增殖和移動，其效率同小肽相當。然而注射到動物體內其抑制家兔角膜血管生成作用的效率與相同濃度的小肽相比，前者是後者的40-60倍。該人白蛋白變異體可作為一種高效新型的抗血管生成藥物。
文檔編號C12R1/84GK101875693SQ201010300590
公開日2010年11月3日 申請日期2010年1月22日 優先權日2010年1月22日
發明者吳炯, 易興旺, 白敏 申請人:成都正能生物技術有限責任公司