抗膽鹼能m3型受體抗體測定在乾燥症候群診斷中的應用的製作方法
2023-09-20 02:27:05 4
專利名稱：抗膽鹼能m3型受體抗體測定在乾燥症候群診斷中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗抗膽鹼能M3型受體抗體作為抗原在檢測乾燥症候群及其它疾病中的應用。
一、技術背景乾燥症候群(Sjgren’s Syndrome，SS)是一種以侵及淚腺和唾液腺等外分泌腺為特徵的全身性自身免疫疾病。該病最常見的臨床表現為眼乾、口乾，並可累及肺、腎臟、淋巴系統、血管及肝臟等器官。此病無明顯的地區分布差異，可發生於任何年齡，以40-60歲，特別是絕經後的女性居多，男女之比為1∶9。在我國的患病率為0.77％，在老年人群中的患病率高達4％，全國有近1000萬患者。
近年來，人們對乾燥症候群的病因及發病機理進行了大量研究，但至今無突破性進展。目前在臨床上尚未發現理想的血清學診斷方法，除臨床症狀外，主要靠唇腺活檢及腮腺造影等有創檢查明確診斷，由於患者的醫從性差，常常延誤診斷，並喪失最佳的治療時機。因此，尋找一種敏感性強、特異性高而又簡便易行的檢測方法，對乾燥症候群的診斷及治療具有重要意義。為此，本發明人經過多年研究發現了可以用於乾燥症候群診斷的血清學特異性抗原——抗膽鹼能M3型受體，該蛋白可以特異性的識別乾燥症候群患者血清中的特異性抗體——抗膽鹼能M3型受體抗體，該抗體可通過一些較為簡便的免疫學檢測方法(如免疫印跡法)檢測出來，並且具有很高的敏感性和特異性。
二、發明概述本發明目的是提供有效檢測乾燥症候群特異性抗原的檢測方法，並應用於乾燥症候群的診斷。
膽鹼能M3型受體是一種主要分布於外分泌腺及平滑肌的膽鹼能受體，也是一種G-蛋白偶聯受體。它結合膽鹼能神經釋放的神經遞質——乙醯膽鹼，激活磷脂酶C、A2、D通路，電壓依賴性鈣通道開放，使鈣內流增加，細胞內鈣的濃度升高，cAMP增加，引起腺體分泌和平滑肌收縮。近年來的研究發現SS患者血清中的抗膽鹼能M3型受體抗體可以識別並激活M3型受體，該抗體與M3型受體的長期結合，不僅降低膽鹼能M3型受體對乙醯膽鹼的敏感性，還造成M3型受體的進行性破壞，導致受體的降解，進而影響信號傳導通路、幹擾水通道蛋白的分布，致使SS患者出現腺體分泌減少、膀胱逼尿肌收縮力減弱等膽鹼能神經功能異常的臨床表現。
1996年，Bacman等報導[1]了SS患者血清中存在著抗膽鹼能M3型受體抗體，並進一步指出該抗體對於SS的診斷具有較高的特異性。但是至今為止，國內尚沒有開展抗膽鹼能M3型受體抗體與乾燥症候群關係的研究，國外也沒有這方面大樣本的臨床研究，而且國內、外都沒有建立切實可行的該抗體的臨床檢測方法。
以往人們認為膽鹼能M3型受體的抗原表位位於其細胞外第二環，但是，發現使用M3型受體細胞外第二環多肽檢測SS患者血清中抗膽鹼能M3型受體抗體方法的重複性不佳[2]。一些研究提出膽鹼能M3型受體可能為構象型抗原表位[3]，因而提示抗膽鹼能M3型受體抗體很可能識別的是M3型受體蛋白質的空間結構。因而本研究選擇真核表達的重組膽鹼能M3型受體蛋白作為抗原基質，通過免疫印跡(Western Blot)的方法檢測SS患者血清中的抗膽鹼能M3型受體抗體。該蛋白是一種用於檢測受體與配體結合能力的蛋白，本研究在國內外首次證實該蛋白可以用於檢測抗膽鹼能M3型受體抗體。並評價該抗體對SS診斷的敏感性和特異性，了解該抗體與SS臨床表現及其它自身抗體的關係。
本發明的抗膽鹼能M3型受體抗體可以通過多種方法(例如免疫印跡法、斑點法、酶聯免疫吸附法、金標記法等)對乾燥症候群患者進行檢測，其檢測方法為本領域技術人員所熟知。同時，檢測的抗膽鹼能M3型受體抗體類型可為IgG型、IgA型或其他類型的免疫球蛋白。
本發明所述的膽鹼能M3型受體可以用本領域人員所熟知得方法得到，例如固相合成法、基因工程表達純化法等。
圖1.免疫印記法檢測原理。首先將膽鹼能M3型受體進行Tris-HCL SDS-PAGE，然後將其轉移到硝酸纖維膜上，脫脂牛奶封閉過夜。將其與待測血清一起孵育，如果血清中存在抗膽鹼能M3型受體抗體，該抗體就會與硝酸纖維膜上的抗原結合，形成抗原-抗體複合物。將未結合的抗體及其它成份衝洗去除後，與生物素標記的山羊抗人IgG共同孵育。再洗去未結合的成份，加入辣根過氧化物酶標記的鏈黴卵白素一起溫育。洗去未結合的成份，加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色。若血清中含有抗膽鹼能M3型受體抗體，在硝酸纖維膜上抗原所在特定位置上顯示出顏色，且抗體滴度越高顏色越深。
圖2.重組膽鹼能M3型受體蛋白電泳。蛋白純度為95％。10％ Tris-HCL SDS-PAGE，考馬斯亮蘭R250染色。顯示分子量為70kD的重組膽鹼能M3型受體蛋白。
圖3.免疫印跡法(Western Blot)檢測抗膽鹼能M3型受體抗體。檢測結果顯示已知的抗膽鹼能M3型受體的多抗與重組膽鹼能M3型受體蛋白發生了特定的抗原抗體反應，出現特異性陽性條帶(A)；而陰性對照則無該條帶(B)。
圖4.抗膽鹼能M3型受體抗體與SS患者血清及對照組血清反應。結果顯示山羊抗人抗膽鹼能M3型受體多抗(膜條1)與抗膽鹼能M3型受體反應呈陽性；乾燥症候群患者(膜條2-12)血清與重組膽鹼能M3型受體蛋白發生抗原抗體反應，出現陽性條帶；而疾病對照組(條帶13)及正常對照(條帶14)組與該蛋白無反應，無條帶。
圖5.抗膽鹼能M3型受體抗體在不同風溼性疾病的陽性率。應用免疫印跡法檢測80例SS患者，其中67例抗膽鹼能M3型受體抗體陽性，陽性率為83.8％；在40例類風溼關節炎(RA)患者中無陽性出現；在40例系統性紅斑狼瘡(SLE)患者中僅2例陽性，陽性率為5％；40名正常對照組中，有1例陽性。SS組抗膽鹼能M3型受體抗體陽性率與疾病對照組及正常對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。抗膽鹼能M3型受體抗體在SS患者的敏感性為83.8％，特異性為97.5％。
圖6.抗膽鹼能M3型受體抗體與其他自身抗體敏感性及特異性比較。在80例SS患者中對各種抗體的比較可以看出，抗膽鹼能M3型受體抗體的敏感性高於抗SSA、SSB及抗α-胞襯蛋白抗體，差異有統計學意義(p＜0.01)；抗膽鹼能M3型受體抗體在診斷SS的特異性方面，優於抗SSA和抗SSB，差異有統計學意義(P＜0.01；P＜0.05)；抗膽鹼能M3型受體抗體的特異性高於抗α-胞襯蛋白抗體，差異無統計學意義(P＞0.05)。
圖7.抗膽鹼能M3型受體抗體在其他抗體陰性的SS患者的陽性率。在抗SSA、SSB、抗α-胞襯蛋白抗體陰性的SS患者中，72％-81％出現抗膽鹼能M3型受體抗體陽性。特別是在抗SSA抗體陰性的SS患者中，抗膽鹼能M3型受體抗體的陽性率達80.0％，對SS的診斷中更有意義。
圖8.抗膽鹼能M3型受體抗體在其他抗體陽性的SS患者的陽性率。在抗SSA、SSB、抗α-胞襯蛋白抗體陽性的SS患者中，出現抗膽鹼能M3型受體抗體陽性率分別為87.5％、88.2％、85.4％。
以下通過實施例進一步說明本發明，但下列實施例不以任何方式限制本發明的範圍。
實施例實施例1膽鹼能M3型受體的鑑定膽鹼能M3型受體是一種主要分布於外分泌腺及平滑肌的膽鹼能受體，也是一種G-蛋白偶聯受體。近年來的研究發現SS患者血清中的抗膽鹼能M3型受體抗體可以識別並激活M3型受體。以往人們認為膽鹼能M3型受體的抗原表位位於其細胞外第二環，但是，發現使用M3型受體細胞外第二環多肽檢測SS患者血清中抗膽鹼能M3型受體抗體方法的重複性不佳[8]。一些研究提出膽鹼能M3型受體可能為構象型抗原表位[28]，因而提示抗膽鹼能M3型受體抗體很可能識別的是M3型受體蛋白質的空間結構。因而本研究選擇真核表達的重組膽鹼能M3型受體蛋白作為抗原基質，通過免疫印跡(Western Blot)的方法檢測SS患者血清中的抗膽鹼能M3型受體抗體。該蛋白是一種用於檢測受體與配體結合能力的蛋白，本研究在國內外首次證實該蛋白可以用於檢測抗膽鹼能M3型受體抗體。
本研究從從sigma公司購進sf9細胞真核表達的人膽鹼能M3型受體蛋白，序列為gggcaatggc......agcaaaaaaa aaaaaaa，(引自Gene bank gi54792120)通過SDS-PAGE及免疫印跡法對其進行鑑定。
將購得的蛋白進行SDS-PAGE，並進行凝膠染色，結果在70KD處出現明顯條帶，與預期一致。(見圖2)用抗膽鹼能M3型受體多抗與重組膽鹼能M3型受體蛋白進行免疫印跡法檢測，結果出現了陽性條帶，而陰性對照組無條帶。(見圖3)。
由此說明抗膽鹼能M3型受體多抗可與重組膽鹼能M3型受體結合，可以嘗試應用與檢測SS患者血清中的抗膽鹼能M3型受體抗體。
實施例2乾燥症候群患者和對照組血清中抗膽鹼能M3型受體抗體的檢測採用本研究建立的免疫印跡法(即Western Blot)檢測乾燥症候群(SS)、類風溼關節炎(RA)、系統性紅斑狼瘡(SLE)患者和正常對照血清中的抗膽鹼能M3型受體抗體，以評價該抗體在各種疾病中的分布。
首先將抗膽鹼能M3型受體進行蛋白SDS-PAGE，然後將其轉移到硝酸纖維膜上，經脫脂牛奶封閉過夜。將其與待測血清一起進行溫育，如果血清中存在抗膽鹼能M3型受體抗體，該抗體就會與硝酸纖維膜上的抗原結合，形成抗原-抗體複合物。將未結合的抗體及其它成分衝洗乾淨後，與加入生物素標記的山羊抗人IgG一起孵育，洗去未結合的成分後，加入辣根過氧化物酶標記鏈黴卵白素一起溫育，再次洗去未結合的成分，加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色，若血清中含有抗膽鹼能M3型受體抗體，則會在硝酸纖維膜的特定位置顯示出顏色，且抗體滴度越高顏色越深。檢測原理示意圖見圖1。
本研究共檢測80例SS、80例其他風溼性疾病患者及40例正常人血清中的抗膽鹼能M3型受體抗體。檢測結果在硝酸纖維膜膜的特定位置出現肉眼可見的棕色條帶的為陽性(圖4)。
本實施例主要通過以下幾個方面闡明本發明抗膽鹼能M3型受體抗體在乾燥症候群患者診斷中的意義1.抗膽鹼能M3型受體抗體陽性率在乾燥症候群、類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡及正常人的比較。
本研究用免疫印跡法檢測了抗膽鹼能M3型受體抗體在乾燥症候群、類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡及正常人的陽性率(表1，圖5)。結果顯示，抗膽鹼能M3型受體抗體在乾燥症候群的陽性率顯著高於類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡和正常人。
表1.抗膽鹼能M3型受體抗體在不同風溼性疾病的陽性率
*SS患者的抗膽鹼能M3型受體抗體與其他風溼性疾病及正常對照組陽性率比較P均＜0.012.抗膽鹼能M3型受體抗體與其它乾燥症候群特異性抗體的敏感性和特異性比較。
在80例SS患者中對各種抗體的比較可以看出，抗膽鹼能M3型受體抗體的敏感性高於抗SSA、SSB及抗α-胞襯蛋白抗體，具有顯著的差異(p＜0.01)，而對診斷SS特異性，抗膽鹼能M3型受體抗體與抗SSA、SSB比較，差異有顯著性(P＜0.01；P＜0.05)；雖然抗膽鹼能M3型受體抗體的特異性高於抗α-胞襯蛋白抗體，但差異無統計學意義(P＞0.05)(表2、圖6)。
表2 SS患者血清抗膽鹼能M3型受體抗體與其他自身抗體的敏感性和特異性比較
注*抗膽鹼能M3型受體抗體的敏感性和特異性均明顯高於其他抗體，P＜0.01；3.抗膽鹼能M3型受體抗體對血清陰性SS患者的意義抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體是目前乾燥症候群較為特異的實驗室指標，本研究發現在抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體陰性的SS患者血清中可以檢測到抗膽鹼能M3型受體抗體，在抗SSA、抗SSB、α-胞襯蛋白抗體陰性的SS患者血清中抗膽鹼能M3型受體抗體陽性率分別為80.0％、82.5％及81.2％，說明抗膽鹼能M3型受體抗體的檢測對於抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體陰性的SS患者的診斷具有重要意義(見表3、圖7)。
表3.抗膽鹼能M3型受體抗體在其他抗體陰性的SS患者的陽性率
4.抗膽鹼能M3型受體抗體對其他抗體陽性SS患者的意義本研究結果顯示抗膽鹼能M3型受體抗體在抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體陽性的SS患者血清中的陽性率分別為87.5％、88.2％及85.4％，說明該抗體與臨床上用於檢測SS的抗SSA、抗SSB及α-胞襯蛋白抗體具有很好的一致性，可能是一種新的診斷SS的抗體(表4、圖8)。
表4.抗膽鹼能M3型受體抗體在其他抗體陽性的SS患者的陽性率
4、抗膽鹼能M3型受體抗體與80例SS住院患者臨床症狀和實驗室指標的關係本研究結果顯示，抗膽鹼能M3型受體抗體陽性患者的口乾、眼乾、臟器受累的發生率低於抗膽鹼能M3型受體抗體陰性組，無統計學意義(P＞0.05)。抗膽鹼能M3型受體抗體陽性組ANA、RF的陽性率和IgG、IgA及ESR升高的發生率高於抗膽鹼能M3型受體抗體陰性組，但兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)。此外，抗膽鹼能M3型受體抗體陽性組的67例SS患者與該抗體陰性組的13例SS患者在年齡及病程上比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。
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3.Dana C，Sally waterman，Tom P，et al.Failure to detect to extracellular loop peptides of muscarinic M3receptor in Primary Sjogren’s syndrome.J Rheumatol，2002；29(6)1342-1344.
序列表110北京大學人民醫院120抗膽鹼能M3型受體抗體測定在乾燥症候群診斷中的應用14020051008307701412005-10-81601170PatentIn Ver.3.221012111773212DNA213人(Homo sapiens)4001atgaccttgc acaataacag tacaacctcg cctttgtttc caaacatcag ctcctcctgg 60atacacagcc cctccgatgc agggctgccc ccgggaaccg tcactcattt cggcagctac120aatgtttctc gagcagctgg caatttctcc tctccagacg gtaccaccga tgaccctctg180ggaggtcata ccgtctggca agtggtcttc atcgctttct taacgggcat cctggccttg240gtgaccatca tcggcaacat cctggtaatt gtgtcattta aggtcaacaa gcagctgaag300acggtcaaca actacttcct cttaagcctg gcctgtgccg atctgattat cggggtcatt360tcaatgaatc tgtttacgac ctacatcatc atgaatcgat gggccttagg gaacttggcc420tgtgacctct ggcttgccat tgactacgta gccagcaatg cctctgttat gaatcttctg480gtcatcagct ttgacagata cttttccatc acgaggccgc tcacgtaccg agccaaacga540acaacaaaga gagccggtgt gatgatcggt ctggcttggg tcatctcctt tgtcctttgg600gctcctgcca tcttgttctg gcaatacttt gttggaaaga gaactgtgcc tccgggagag660tgcttcattc agttcctcag tgagcccacc attacttttg gcacagccat cgctgctttt720tatatgcctg tcaccattat gactatttta tactggagga tctataagga aactgaaaag780cgtaccaaag agcttgctgg cctgcaagcc tctgggacag aggcagagac agaaaacttt840gtccacccca cgggcagttc tcgaagctgc agcagttacg aacttcaaca gcaaagcatg900aaacgctcca acaggaggaa gtatggccgc tgccacttct ggttcacaac caagagctgg960aaacccagct ccgagcagat ggaccaagac cacagcagca gtgacagttg gaacaacaat1020gatgctgctg cctccctgga gaactccgcc tcctccgacg aggaggacat tggctccgag1080acgagagcca tctactccat cgtgctcaag cttccgggtc acagcaccat cctcaactcc1140accaagttac cctcatcgga caacctgcag gtgcctgagg aggagctggg gatggtggac1200ttggagagga aagccgacaa gctgcaggcc cagaagagcg tggacgatgg aggcagtttt1260ccaaaaagct tctccaagct tcccatccag ctagagtcag ccgtggacac agctaagact1320tctgacgtca actcctcagt gggtaagagc acggccactc tacctctgtc cttcaaggaa1380gccactctgg ccaagaggtt tgctctgaag accagaagtc agatcactaa gcggaaaagg1440atgtccctgg tcaaggagaa gaaagcggcc cagaccctca gtgcgatctt gcttgccttc1500atcatcactt ggaccccata caacatcatg gttctggtga acaccttttg tgacagctgc1560atacccaaaa ccttttggaa tctgggctac tggctgtgct acatcaacag caccgtgaac1620cccgtgtgct atgctctgtg caacaaaaca ttcagaacca ctttcaagat gctgctgctg1680tgccagtgtg acaaaaaaaa gaggcgcaag cagcagtacc agcagagaca gtcggtcatt1740tttcacaagc gcgcacccga gcaggccttg tag 177權利要求
1.具有膽鹼能M3型受體的胺基酸、多肽類似物及蛋白。
2.含權利要求1的膽鹼能M3型受體或其類似物的診斷試劑盒。
3.含權利要求1的膽鹼能M3型受體或其類似物用於免疫印跡法(或使用其它膜條，如硝酸纖維膜或醋酸纖維膜等作為介質來包被抗原的印跡法)、斑點法、ELISA法和金標法檢測試劑盒。
全文摘要
本發明提供了一種膽鹼能M3型受體及其類似物用於乾燥症候群的檢測。這種蛋白可特異性的結合乾燥症候群患者體內的特異性抗體，具有很高的敏感性和特異性。
文檔編號G01N33/53GK1896101SQ20051008307
公開日2007年1月17日 申請日期2005年7月14日 優先權日2005年7月14日
發明者慄佔國 申請人:北京大學人民醫院