在奶中產生外源蛋白的轉基因哺乳動物的製作方法

2023-09-19 23:35:15

專利名稱：在奶中產生外源蛋白的轉基因哺乳動物的製作方法
在奶中產生外源蛋白的轉基因哺乳動物
背景技術：
在過去十年中已經由製藥工業通過提取或通過重組技術來普遍地生產人保健中 所涉及的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遺傳構建體在細菌、酵母或哺乳動物細胞系中 成功地得到了表達。然而，使用哺乳動物細胞培養物來獲得複雜蛋白質，如需要適當糖基化 模式的那些，涉及高成本的方法。在過去十年間已經日益增長地使用重組DNA技術來生產商業上重要的生物材料。 為此，已經克隆了編碼各種醫學上重要的人蛋白質的DNA序列。這些包括胰島素、纖溶酶原 激活劑、a 1-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新興的重組DNA技術，通 常也從血液和組織中純化這些蛋白質，這是昂貴而費時的方法，可能帶有傳播傳感因子如 導致AIDS和肝炎的那些的風險。儘管在細菌中表達DNA序列來生產所需的醫學上重要的蛋白質看起來是有吸引 力的提議，但實際上細菌作為宿主常常證明是不能令人滿意的，因為外源蛋白在細菌細胞 中不穩定並且沒有被正確地加工。認識到這個問題，已經嘗試了在哺乳動物組織培養物中表達所克隆的基因並已經 在一些情況下證明了是可行的策略。然而，動物細胞的批量發酵是昂貴的且需要技術的過程。因此存在對用於生產生物物質如正確修飾的真核多肽的高產率，低成本方法的需 要。在這種方法中不存在對人具傳染性的因子將是一個優勢。為了在奶中獲得大量的人蛋白質，獲得所需基因的轉基因動物如牛的可能性已經 引起了工業的極大興趣。文獻中的幾個小組報導了他們生產人血清清蛋白、a抗胰蛋白酶 的成功以及在轉基因奶牛或山羊中的一些其它實例。之前已經在小鼠或大鼠中進行了許多實驗，將轉基因表達限制於乳腺中往往是優 選的，因為使用0酪蛋白或乳清蛋白啟動子，其只響應哺乳期雌性中的乳腺轉錄因子。專門在奶中表達異源蛋白意欲避免對宿主哺乳動物健康的不利影響並提供容易 的純化方法。在細菌或細胞培養物中表達異源蛋白可能由於該重組蛋白對宿主哺乳動物的毒 性作用而受到阻礙或阻止。在文獻中可以找到許多實例，其中在特定的系統中不能表達某 種蛋白，甚至是天然非毒性的蛋白，因為它對宿主是有害的，甚至引起宿主的死亡。死亡的 原因可能是細胞內的高濃度蛋白，高濃度的分泌蛋白或與該蛋白的特異性相互作用和在外 源宿主中引起細胞病變活性的一些細胞成分。已經研發了幾種方法來克服這些缺陷，以實現毒性蛋白的異源基因表達，包括使 用融合蛋白，修飾原始蛋白序列，分開表達蛋白的不同多肽等。(參見，Protein Expression and Purification(蛋白表達和純化)，2001 年 8 月，22(3) :422_9)。在轉基因牛中表達重組蛋白時，可以產生相似的作用。在轉基因哺乳動物的產生 中，將細胞轉染以獲得攜帶目標外源基因的轉基因克隆，然後將其用於產生轉基因哺乳動 物。該方法通常導致該目標序列插入到宿主基因組中，如果使用特異性的啟動子，這是隨後應當導致異源蛋白在靶組織或腺體中表達的事件，或如果使用通用啟動子，將導致全身表達。蛋白表達的水平將取決於多種因素，包括基因組內插入發生的位置。即使當通過組織特異性啟動子指導基因表達時，使用幾種蛋白，在許多不同哺乳 動物物種中，已經觀察到外源蛋白滲漏至外周循環系統中(參見Life Sciences, 2006年1 月 25 日；78(9) :1003-9，Epub2005 年 9 月 15 日；和 Journal of Biotechnology，2006年 7 月13日；124(2) =469-72, Epub 2006年5月23日)。根據表達的水平、滲漏的水平、異源 蛋白的性質、物種(宿主和外源蛋白)之間的關係和異源蛋白與宿主受體相互作用的能力， 這種滲漏可能具有相關的生物學後果。鑑於與宿主同源蛋白的相似性，這些通過轉基因表 達的蛋白中的一些可以對外源宿主發揮其天然的生物活性並可以引起能導致哺乳動物死 亡的病理作用(參見，Endocrinology 1997年7月；138 (7) =2849-55) 0此外，可能的是異 源蛋白不是通過與相應同源宿主受體的相互作用影響哺乳動物的健康，而是通過當一些異 源蛋白在細菌中表達時發生的毒性、非特異性作用影響哺乳動物的健康。本發明提供了通常與在轉基因哺乳動物中表達對該哺乳動物具有毒性作用的蛋 白相關的缺陷的創新性解決方法。發明概述本發明涉及非人哺乳動物，將其用於生產可能對哺乳動物具有毒性的目標蛋白。 該哺乳動物的特徵在於以下的事實其是轉基因的，用於在其奶中生產失活形式的目標蛋 白。目標蛋白的失活形式是目標蛋白對表達目標蛋白的非人轉基因哺乳動物是沒有毒性的 目標蛋白形式。如在此所用的，毒性意指引起嚴重的傷害或死亡。目標蛋白的失活形式可 以在表達失活形式的目標蛋白的非人轉基因哺乳動物中具有一些生物活性；然後，目標蛋 白的失活形式對非人轉基因哺乳動物是無毒的(即，哺乳動物沒有死亡或沒有遭受嚴重的 傷害)。可以在體外激活失活形式的蛋白。這種失活蛋白，可能是蛋白的非天然物質，可以 是，但不限於，重組修飾的人胰島素前體。目標蛋白可以是，但不限於，重組人胰島素。非人 轉基因哺乳動物可以是，但不限於，與物種的哺乳動物。本發明進一步涉及提供用於在哺乳動物的乳房細胞中表達失活形式的目標蛋白 的質粒，其中表達通過β酪蛋白啟動子來調控。本發明進一步涉及使用非人轉基因哺乳動物生產對非人轉基因哺乳動物可能有 毒的目標蛋白的方法。通過將蛋白表達為失活蛋白來避免蛋白的潛在毒性。這種失活蛋白， 可能是蛋白的非天然物質，可以是，但不限於，修飾的人胰島素前體。目標蛋白可以是，但不 限於，重組人胰島素。非人轉基因哺乳動物可以是，但不限於，牛物種的哺乳動物。本發明還涉及生產重組胰島素的方法，包括製備非人轉基因哺乳動物，該轉基因 動物在其奶中產生重組的修飾胰島素前體，從非人轉基因哺乳動物獲得奶，從奶中純化前 體，將純化的前體接受酶切割和轉肽作用，以產生重組胰島素，並將重組胰島素純化。重組 胰島素可以是，但不限於，重組人胰島素。轉基因哺乳動物可以是，但不限於，牛物種的哺乳 動物。附圖簡述

圖1顯示了表達質粒ρ β mhuIP的略圖，其含有編碼修飾的人胰島素前體(mhuIP) 的基因序列和指導其表達至乳房細胞中的啟動子。圖2顯示了起始構建體的略圖，其含有編碼mhuIP的序列。
圖3顯示了表達質粒pNJK IP的略圖，其含有編碼修飾的人胰島素前體(mhuIP) 的基因序列，指導其表達至乳房細胞中的啟動子和雞β球蛋白絕緣子的編碼序列的片段。圖4顯示了表達質粒ρ β KLE IP的略圖，其含有編碼修飾的人胰島素前體(mhuIP) 的基因序列，指導其表達至乳房細胞中的啟動子，牛α乳清蛋白基因的編碼序列的大部分 和腸激酶切割位點。發明詳述本發明涉及用於生產對哺乳動物可能有毒的目標蛋白的非人哺乳動物。該哺乳動 物的特徵在於以下事實其是轉基因的，用於在其奶中生產失活形式的目標蛋白。術語失活 蛋白指的是目標蛋白對表達目標蛋白的非人轉基因哺乳動物為無毒的形式。在本發明進一 步的實施方案中，術語失活蛋白指的是沒有進一步翻譯後修飾而缺乏生物活性的蛋白。失 活蛋白的實例包括前體蛋白(即，前肽)，含有修飾(即，與天然蛋白相比時，胺基酸的取代、 添加或缺失)的蛋白，該修飾使得蛋白質在生物上失活，而沒有進一步加工，或修飾的前體 蛋白(即，與天然前肽相比時含有胺基酸取代、添加或缺失的前肽)。換句話說，通過將蛋白 表達為沒有殺滅表達目標蛋白的非人轉基因哺乳動物的失活蛋白來避免目標蛋白的潛在 毒性。這種失活蛋白，可能是蛋白的非天然物質，可以是，但不限於，以下的前體、修飾前體 或修飾形式抗體、激素、生長因子、酶、凝血因子、阿樸脂蛋白、受體、藥品、藥物、生物藥品、 保健食品、致癌基因、腫瘤抗原、腫瘤抑制劑、細胞因子、病毒抗原、寄生蟲抗原和細菌抗原。 優選，失活蛋白是不會在表達修飾的胰島素前體的非人轉基因哺乳動物中引起低血糖的重 組修飾的胰島素前體。更優選，失活蛋白是重組修飾的胰島素前體，最優選，是重組修飾的 人胰島素前體。目標蛋白可以是，但不限於，重組胰島素，更優選，重組哺乳動物胰島素，最 優選，重組人胰島素。該非人哺乳動物可以是，但不限於，牛物種的哺乳動物。轉基因哺乳 動物的其他物種可以是，但不限於，豬物種、綿羊物種、公山羊物種或齧齒動物物種。胰島素是負責控制體內葡萄糖的轉運、利用和貯存的主要激素。胰腺的β細胞分 泌胰島素的單鏈前體，稱為胰島素原。胰島素原由三個結構域組成氨基端B鏈，羧基端A 鏈和中間稱為C肽的連接肽。胰島素原的蛋白水解導致胰島素原鏈中某些鹼性胺基酸連同 連接肽(C肽)的去除，以產生生物活性的多肽胰島素。在實施方案中，修飾蛋白為不是蛋白天然存在形式的蛋白質形式。在實施方案中， 修飾的胰島素前體含有氨基端B鏈和羧基端A鏈。然而，修飾的胰島素前體含有修飾的C 肽。在修飾的胰島素前體中，編碼在天然存在的胰島素原中發現的連接C肽的胺基酸由未 在天然存在的胰島素原中發現的胺基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽含有以下三個氨 基酸:Ala-Ala-LyS。此外，修飾的胰島素前體可以含有修飾的B鏈。在實施方案中，修飾的 B鏈含有天然存在的B鏈幾乎所有的C-端胺基酸。在進一步的實施方案中，修飾的胰島素前體是由53個胺基酸組成的修飾人胰島 素前體，分子量約為6kD。修飾的人胰島素前體含有具有天然存在B鏈胺基酸1-29的修飾B 鏈和具有三個胺基酸Ala-Ala-Lys的修飾C肽。可以將修飾的人胰島素前體接受酶切割和 轉肽作用，以產生人胰島素，這對於糖尿病的治療是必需的，並且其應用也是非常確定的。本發明還涉及轉基因的用於在其奶中生產重組修飾的人胰島素前體的非人哺乳 動物，其特徵在於以下的事實重組修飾的人胰島素前體沒有使哺乳動物不能生存。本發明進一步涉及用於生產重組人胰島素的牛物種的轉基因哺乳動物。已知人胰島素在牛中是有活性的。預期表達成熟形式的人胰島素的牛可能呈現出與低血糖相關的症 狀，因為轉基因蛋白可以滲漏至血流中。因此，表達重組人胰島素的轉基因牛可能是不能生 存的。然而，本發明克服了這種缺陷，並使得可以在轉基因哺乳動物中表達可能對轉基因哺 乳動物有毒的蛋白。本發明表達失活形式的目標蛋白。從轉基因哺乳動物的奶中純化失活 蛋白，並在體外轉化成蛋白的成熟(即，活性)形式。勿庸置疑地，哺乳動物，如牛，將其用 作生產表達時對哺乳動物有害的治療蛋白(例如，人胰島素)的工具構成了出乎意料的和 創新性的貢獻。本發明進一步涉及在其奶中產生重組修飾的胰島素前體的非人轉基因哺乳動物，其基因組包含整合的質粒，該質粒包含編碼修飾的胰島素前體的核酸，該核酸可操作地連 接指導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的啟動子。非人哺乳動物可以是，但不限於，牛 物種的哺乳動物。轉基因哺乳動物的其他物種可以是，但不限於，豬物種、綿羊物種、公山羊 物種或齧齒動物物種。修飾的胰島素前體可以是修飾的哺乳動物胰島素前體，更優選，修飾 的人胰島素前體，修飾的牛胰島素前體，修飾的豬胰島素前體，修飾的綿羊胰島素前體，修 飾的公山羊胰島素前體，修飾的齧齒動物胰島素前體，最優選，修飾的人胰島素前體。啟動 子可以是β酪蛋白啟動子。合適的β酪蛋白啟動子包括，但不限於，牛β酪蛋白啟動子 或公山羊β酪蛋白啟動子。其他β酪蛋白啟動子包括，但不限於，豬β酪蛋白啟動子，綿 羊β酪蛋白啟動子或齧齒動物β酪蛋白啟動子。整合的質粒還可以含有抗生素抗性基因， 如新黴素抗性基因。此外，整合的質粒可以是ρβιΛιιΙΡ。整合的質粒還可以是pNJK IP或 ρ β KLE IP。本發明進一步涉及非人轉基因哺乳動物，其中在哺乳動物的體細胞和生殖細胞中 都發現了上述的整合質粒。本發明進一步涉及在其奶中產生重組修飾的人胰島素前體的牛物種的非人轉基 因哺乳動物，其基因組包含整合的質粒，該質粒包含編碼修飾的人胰島素前體的核酸和指 導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的β酪蛋白啟動子。合適的β酪蛋白啟動子包括， 但不限於，牛β酪蛋白啟動子或公山羊β酪蛋白啟動子。其他β酪蛋白啟動子包括，但 不限於，豬β酪蛋白啟動子，綿羊β酪蛋白啟動子或齧齒動物β酪蛋白啟動子。整合的 質粒還可以含有抗生素抗性基因，如新黴素抗性基因。此外，整合的質粒可以是ρβπ ιιΙΡ。 整合的質粒還可以是pNJKIP或ρβΚΙ IP。本發明還涉及包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列和抗性基因的質粒，該核酸 序列可操作地連接β酪蛋白啟動子，該抗性基因使得可以選擇抗生素抗性細胞。合適的β 酪蛋白啟動子包括，但不限於，牛β酪蛋白啟動子或公山羊β酪蛋白啟動子。其他β酪蛋 白啟動子包括，但不限於，豬β酪蛋白啟動子，綿羊β酪蛋白啟動子或齧齒動物β酪蛋白 啟動子。在實施方案中，抗生素抗性基因是新黴素抗性基因，其使得可以選擇遺傳黴素抗性 細胞。這樣的質粒的實例是ρβιΛιιΙΡ，如圖1中所示。這樣的質粒的其他實例是pNJK IP, 如圖3中所示，和ρ β KLE IP，如圖4中所示。本發明進一步涉及包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列的質粒，其中修飾的胰 島素前體是修飾的哺乳動物胰島素前體。修飾的哺乳動物胰島素前體可以是修飾的人胰島 素前體，修飾的牛胰島素前體，修飾的豬胰島素前體，修飾的綿羊胰島素前體，修飾的公山 羊胰島素前體或修飾的齧齒動物胰島素前體。在實施方案中，修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體。本發明進一步涉及包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列的質粒，該修飾的胰島素前體不會在表達修飾的胰島素前體的非人轉基因哺乳動物中引起低血糖。本發明進一步涉及包含編碼含有修飾C肽的修飾人胰島素前體的核酸序列的質 粒。在修飾的人胰島素前體中，編碼在天然存在的人胰島素原中發現的連接C肽的胺基酸 由未在天然存在的胰島素原中發現的胺基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽含有以下三 個胺基酸Ala-Ala-LyS。此外，修飾的人胰島素前體可以含有修飾的B鏈。在實施方案中， 修飾的B鏈含有天然存在的B鏈的胺基酸1-29。本發明進一步涉及包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列的質粒，其進一步包含 一個或多個其他遺傳元件，這些遺傳元件將增強質粒穩定性，增強從質粒轉錄的mRNA的穩 定性，降低修飾的胰島素前體的降解和/或提高修飾的胰島素前體的表達。合適的遺傳元 件包括，但不限於，調控元件(例如，啟動子、增強子、絕緣子或轉錄終止位點)、不是胰島素 基因編碼序列的片段或不是胰島素基因的編碼序列。在實施方案中，遺傳元件是雞β球蛋 白絕緣子的編碼序列的片段。這樣的質粒的實例是PNJK IP，如圖3中所示的。在其他實施 方案中，遺傳元件是牛α乳清蛋白基因的編碼序列的片段。這樣的質粒的實例是P β KLE IP，如圖4中所示的。依據布達佩斯條約的條款將質粒ρ β mhuIP、pNJK IP和ρ β KLE IP保藏。保藏的 名禾爾禾口地址是 DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B，D_38134Braunschweig，德國。ρ β mhu IP 在 2008 年 4 月 4 日保藏於 DSMZ， 並給予DSMZ保藏號DSM 21359。pNJK IP在2008年4月4日保藏於DSMZ，並給予DSMZ保 藏號 DSM 21360。p^KLE IP 在 2008 年 6 月 12 日保藏於 DSMZ。本發明進一步涉及轉染上述遺傳構建體的方法。在實施方案中，通過將遺傳構建 體插入脂質體中並將脂質體接觸哺乳動物細胞來將上述遺傳構建體轉染至哺乳動物細胞 中。脂質體可以是陽離子脂質。在合適的介質中新黴素抗性細胞的選擇方法是本領域技術人員已知的。必需小心 挑選這樣的細胞，以便避免細胞損傷。本發明還涉及將停止於Gtl或細胞周期不同時間的細胞核移植至上核哺乳動物卵 母細胞，最優選牛卵母細胞中的方法。本發明涉及將轉基因胚胎移植至激素刺激的哺乳動物子宮，最優選奶牛的子宮中 的方法。本發明進一步涉及製造非人轉基因哺乳動物的方法，包括將編碼失活目標蛋白的 核酸序列克隆至質粒中，藉此將該序列可操作地連接至指導該序列在乳房細胞中表達的啟 動子，形成表達質粒；用該表達質粒轉染體細胞使得將質粒摻入到細胞的基因組中，形成轉 基因體細胞；將成熟卵母細胞去核，形成去核的卵母細胞；將一個轉基因體細胞與去核的 卵母細胞融合形成單細胞胚胎；將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；並監視妊娠直到轉基 因哺乳動物的出生。目標失活蛋白可以是沒有在哺乳動物中引起低血糖的修飾胰島素前 體。修飾的胰島素前體優選是修飾的哺乳動物胰島素前體，更優選，修飾的人胰島素前體， 修飾的牛胰島素前體，修飾的豬胰島素前體，修飾的綿羊胰島素前體，修飾的公山羊胰島素 前體或修飾的齧齒動物胰島素前體，並且最優選，修飾的人胰島素前體。非人轉基因哺乳動物可以是，但不限於，牛物種的哺乳動物。轉基因哺乳動物的其他物種可以是，但不限於，豬 物種，綿羊物種，公山羊物種或齧齒動物物種。啟動子可以是β酪蛋白啟動子。合適的β 酪蛋白啟動子包括，但不限於，牛β酪蛋白啟動子或公山羊β酪蛋白啟動子。其他β酪蛋 白啟動子包括，限於，豬β酪蛋白啟動子，綿羊β酪蛋白啟動子或齧齒動物β酪蛋白啟動 子。質粒還可以含有抗生素抗性基因，如新黴素抗性基因。此外，表達質粒可以是P β mhuIP。 表達質粒還可以是pNJK IP或ρβ KLE IP。本發明進一步涉及表達失活形式目標蛋白的非人轉基因哺乳動物的製備方法，該 轉基因哺乳動物包含編碼含有修飾C肽的修飾胰島素前體的核酸序列。在修飾的胰島素前 體中，編碼在天然存在的胰島素原中發現的連接C肽的胺基酸由未在天然存在的胰島素原 中發現的胺基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽含有以下三個胺基酸Ala-Ala-Lys。此 夕卜，修飾的人胰島素前體可以含有修飾的B鏈。在實施方案中，修飾的B鏈含有天然存在的 B鏈的幾乎所有C-端胺基酸。本發明進一步涉及表達失活形式目標蛋白的非人轉基因哺乳動物的製備方法，其 中體細胞可以是成纖維細胞。此外，轉基因體細胞可以分離自在其奶中表達失活形式目標 蛋白的雌性轉基因動物。轉基因體細胞可以是成纖維細胞。本發明進一步涉及表達失活形式目標蛋白的非人轉基因哺乳動物的製備方法，其 中編碼失活形式目標蛋白的核酸序列在哺乳動物的體細胞和生殖細胞中都有發現。本發明進一步涉及在其奶中產生重組修飾人胰島素前體的非人牛物種轉基因哺 乳動物的製備方法，其基因組包含整合的質粒，該質粒包含編碼修飾人胰島素前體的核酸 序列和指導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的β酪蛋白啟動子。合適的β酪蛋白啟 動子如上所述。整合的質粒可以含有抗生素抗性基因，如新黴素抗性基因。此外，整合的實 例可以是pPmhuIP。整合的質粒還可以是pNJK IP或ρβΚΙ ΙΡ。本發明進一步涉及生產失活形式的目標蛋白的方法，包括製備在其奶中產生失活 形式目標蛋白的非人轉基因哺乳動物；從非人轉基因哺乳動物獲得奶；從奶中純化失活蛋 白；在體外轉換目標蛋白的失活形式；和純化目標蛋白，其中目標蛋白對非人轉基因哺乳 動物可能是有毒的。失活蛋白可以是，但不限於，以下的前體、修飾前體或修飾形式抗體、 激素、生長因子、酶、凝血因子、阿樸脂蛋白、受體、藥品、藥物、生物藥、營養補給品、致癌基 因、腫瘤抗原、腫瘤抑制劑、細胞因子、病毒抗原、寄生蟲抗原和細菌抗原。優選，失活蛋白可 以是重組修飾的胰島素前體，更優選，重組修飾的哺乳動物胰島素，最優選，重組修飾的人 胰島素前體。非人哺乳動物可以是，但不限於，牛物種的哺乳動物。轉基因哺乳動物的其他 物種可以是，但不限於，豬物種、綿羊物種、公山羊物種或齧齒動物物種。本發明還涉及在非人轉基因哺乳動物中生產失活形式目標蛋白的方法，該轉基因 哺乳動物是通過以下方法製得的該方法包括將編碼失活形式目標蛋白的核酸序列克隆至 質粒中，藉此將該序列可操作地連接至指導該序列在乳房細胞中表達的啟動子，形成表達 質粒；用質粒轉染體細胞，任選成纖維細胞，使得將質粒摻入到體細胞的基因組中，形成轉 基因體細胞；將成熟卵母細胞去核，形成去核的卵母細胞；將一個轉基因體細胞與去核的 卵母細胞融合形成單細胞胚胎；將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；並監視妊娠直到轉基 因哺乳動物的出生。目標失活蛋白可以是沒有在哺乳動物中引起低血糖的修飾胰島素前 體。修飾的胰島素前體優選是修飾的哺乳動物胰島素前體，更優選，修飾的人胰島素前體，修飾的牛胰島素前體，修飾的豬胰島素前體，修飾的綿羊胰島素前體，修飾的公山羊胰島素 前體或修飾的齧齒動物胰島素前體，並且最優選，修飾的人胰島素前體。非人轉基因哺乳動 物可以是，但不限於，牛物種的哺乳動物。轉基因哺乳動物的其他物種可以是，但不限於，豬 物種，綿羊物種，公山羊物種或齧齒動物物種。啟動子可以是β酪蛋白啟動子。合適的β 酪蛋白啟動子如上所述。質粒還可以含有抗生素抗性基因，如新黴素抗性基因。此外，表 達質粒可以是P β mhuIP。質粒還可以包含一個或多個其他遺傳元件，這些遺傳元件將增強 質粒穩定性，增強從質粒轉錄的mRNA的穩定性，降低修飾的胰島素前體的降解和/或提高 修飾的胰島素前體的表達。合適的遺傳元件包括，但不限於，調控元件(例如，啟動子、增強 子、絕緣子或轉錄終止位點)、不是目標蛋白基因編碼序列的片段或不是目標蛋白基因的編 碼序列。表達質粒可以是PNJK IP或ρβ KLE IP。
在實施方案中，使用編碼含有修飾C肽的修飾胰島素前體的核酸序列來克隆表達 失活形式目標蛋白的非人轉基因哺乳動物。在修飾的胰島素前體中，編碼在天然存在的胰 島素原中發現的連接C肽的胺基酸由未在天然存在的胰島素原中發現的胺基酸替代。在實 施方案中，修飾的C肽含有以下三個胺基酸:Ala-Ala-LyS。此外，修飾的胰島素前體可以含 有修飾的B鏈。在實施方案中，修飾的B鏈含有天然存在B鏈的幾乎所有的C-端胺基酸。在進一步的實施方案中，通過其中體細胞是成纖維細胞的方法製得表達失活形式 目標蛋白的非人轉基因哺乳動物。此外，轉基因體細胞可以分離自在其奶中表達失活形式 目標蛋白的雌性轉基因動物。轉基因體細胞可以是成纖維細胞。在進一步的實施方案中，表達失活形式目標蛋白的核酸序列在表達失活形式目標 蛋白的非人轉基因哺乳動物的體細胞和生殖細胞中都有發現。本發明進一步涉及在其奶中產生重組修飾人胰島素前體的非人轉基因哺乳動物 中生產失活形式人胰島素的方法，其基因組包含整合的質粒，該質粒包含編碼修飾的人胰 島素前體的核酸序列和指導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的β酪蛋白啟動子。合 適的β酪蛋白啟動子如上所述。整合的質粒可以含有抗生素抗性基因，如新黴素抗性基 因。此外，整合質粒可以是ρβιΛιιΙΡ。整合質粒還可以包含一個或多個其他遺傳元件，這些 遺傳元件將增強質粒穩定性，增強從質粒轉錄的mRNA的穩定性，降低修飾的胰島素前體的 降解和/或提高修飾的胰島素前體的表達。合適的遺傳元件包括，但不限於，調控元件(例 如，啟動子、增強子、絕緣子或轉錄終止位點)、不是胰島素基因編碼序列的片段或不是胰島 素基因的編碼序列。整合質粒可以是PNJK IP或ρβ KLE IP。此外，本發明涉及從在其奶中產生失活蛋白的轉基因哺乳動物的奶中純化失活形 式目標蛋白的方法。純化方法可以包括色譜和過濾步驟。可以使用不同類型的色譜，並包 括離子交換色譜或反相色譜。離子交換色譜可以是陽離子交換色譜。此外，可以進行多個 色譜步驟。本發明進一步涉及從在其奶中產生失活蛋白的非人轉基因哺乳動物的奶中純化 失活形式目標蛋白的方法，包括從非人轉基因哺乳動物獲得奶，將非人轉基因哺乳動物的 奶澄清，獲得澄清的奶，並使澄清的奶接受色譜，獲得純失活蛋白。色譜步驟可以包括離子 交換色譜或反相色譜。反相色譜可以使用反相基質，如C4或C18反相基質。此外，可以進 行多個色譜步驟。本發明進一步涉及從在其奶中產生失活蛋白的非人轉基因哺乳動物的奶中純化失活形式目標蛋白的方法，包括從非人轉基因哺乳動物獲得奶，將非人轉基因哺乳動物的 奶澄清，獲得澄清的奶，並使澄清的奶接受陽離子交換色譜，獲得陽離子交換色譜處理過的 材料，使陽離子交換色譜處理過的材料接受反相色譜，獲得純失活蛋白。本發明的失活蛋白可以是重組的修飾胰島素前體，優選，重組修飾的哺乳動物胰 島素前體，更優選，重組修飾的人胰島素前體，重組修飾的牛胰島素前體，重組修飾的豬胰 島素前體，重組修飾的綿羊胰島素前體，重組修飾的公山羊胰島素前體或重組修飾的齧齒 動物胰島素前體，並最優選，重組修飾的人胰島素前體。此外，修飾的胰島素前體沒有在表 達修飾胰島素前體的非人轉基因哺乳動物中引起低血糖。在修飾的胰島素前體中，編碼在 天然存在的胰島素原中發現的連接C肽的胺基酸由未在天然存在的胰島素原中發現的氨 基酸替代。在實施方案中，修飾的c肽含有以下三個胺基酸:Ala-Ala-LyS。此外，修飾的胰 島素前體可以含有修飾的B鏈。在實施方案中，修飾的B鏈含有天然存在B鏈的幾乎所有 的C-端胺基酸。非人哺乳動物可以是，但不限於，牛物種的哺乳動物。轉基因哺乳動物的 其他物種可以是，但不限於，豬物種、綿羊物種、公山羊物種或齧齒動物物種。本發明進一步涉及將失活形式的目標蛋白轉化成成熟(即，活性)形式目標蛋白 的方法，然後純化目標蛋白。轉化可以包括目標蛋白前體的酶切割。酶切割可以涉及胰蛋 白酶水解(trypsinolysis)。目標蛋白的純化可以包括色譜步驟。這些色譜步驟可以包括 反相色譜。反相色譜可以使用反相基質，C4或C18反相基質。此外，可以進行多個色譜步 馬聚o本發明進一步涉及將重組修飾的胰島素前體轉化成重組胰島素的方法，然後純化 重組胰島素。轉化可以包括重組修飾的胰島素前體的酶切割和轉肽作用。酶切割可以涉及 胰蛋白酶水解。重組胰島素的純化可以包括色譜步驟。這些色譜步驟可以包括反相色譜或 離子交換色譜。此外，可以進行多個色譜步驟。本發明還涉及將重組修飾的胰島素前體轉化成重組胰島素的方法，然後純化重組 胰島素。該方法包括使重組修飾的胰島素前體接受胰蛋白酶水解和轉肽作用，形成胰蛋白 酶水解和轉肽的材料，使胰蛋白酶水解和轉肽的材料接受第一個反相色譜，形成第一個反 相色譜處理過的材料，使第一個反相色譜處理過的材料接受第二個反相色譜，形成第二個 反相色譜處理過的材料，並使第二個反相色譜處理過的材料接受第三個反相色譜，形成純 的重組胰島素。反相色譜的步驟包括使用反相基質，優選C4或C18反相基質。重組胰島素和重組修飾的胰島素前體可以分別是，重組哺乳動物胰島素和重組修 飾的哺乳動物胰島素前體，更優選，各自為重組人胰島素和重組修飾的人胰島素前體，重組 牛胰島素和重組修飾的牛胰島素前體，重組豬胰島素和重組修飾的豬胰島素前體，重組綿 羊胰島素和重組修飾的綿羊胰島素，重組公山羊胰島素和重組修飾的公山羊胰島素，或重 組齧齒動物胰島素和重組修飾的齧齒動物胰島素前體，最優選，重組人胰島素和重組修飾 的人胰島素前體。此外，修飾的胰島素前體不會在表達修飾胰島素前體的非人轉基因哺乳 動物中引起低血糖。在修飾的胰島素前體中，編碼在天然存在的胰島素原中發現的連接C 肽的胺基酸由未在天然存在的胰島素原中發現的胺基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽 含有以下三個胺基酸:Ala-Ala-LyS。此外，修飾的胰島素前體可以含有修飾的B鏈。在實 施方案中，修飾的B鏈含有天然存在B鏈的幾乎所有的C-端胺基酸。本發明進一步涉及生產目標蛋白的方法，包括製備在其奶中產生失活形式目標蛋白的非人轉基因哺乳動物，從非人轉基因哺乳動物獲得奶，從奶純化失活蛋白，通過將純化 的失活蛋白接受酶切割在體外轉化失活蛋白，並最終純化目標蛋白。本發明進一步涉及生產重組胰島素的方法，包括製備在其奶中產生重組修飾的胰 島素前體的非人轉基因哺乳動物，從非人轉基因哺乳動物獲得奶，從奶純化重組修飾的胰 島素前體，通過使純化的前體接受酶切割和轉肽作用在體外將前體轉化成重組胰島素，並 最終純化重組胰島素。此外，本發明還涉及生產重組胰島素的方法，包括製備在其奶中產生重組修飾的 胰島素前體的非人轉基因哺乳動物，從非人轉基因哺乳動物獲得奶，將奶澄清，獲得澄清的 奶，使澄清的奶接受陽離子交換色譜，獲得陽離子交換色譜處理過的材料，使陽離子交換色 譜處理過的材料接受反相色譜，形成純的重組修飾的胰島素前體，使純的重組修飾的胰島 素前體接受胰蛋白酶水解和轉肽作用，獲得胰蛋白酶水解和轉肽的材料，使胰蛋白酶水解 和轉肽的材料接受第一個反相色譜，形成第一個反相色譜處理過的材料，使第一個反相色 譜處理過的材料接受第二個反相色譜，形成第二個反相色譜處理過的材料，並使第二個反 相色譜處理過的材料接受第三個反相色譜，形成純的重組胰島素。重組胰島素和重組修飾的胰島素前體各自可以是，重組哺乳動物胰島素和重組修 飾的哺乳動物胰島素前體，更優選，各自為重組人胰島素和重組修飾的人胰島素前體，重組 牛胰島素和重組修飾的牛胰島素前體，重組豬胰島素和重組修飾的豬胰島素前體，重組綿 羊胰島素和重組修飾的綿羊胰島素，重組公山羊胰島素和重組修飾的公山羊胰島素，或重 組齧齒動物胰島素和重組修飾的齧齒動物胰島素前體，最優選，重組人胰島素和重組修飾 的人胰島素前體。非人哺乳動物可以是，但不限於，牛物種的哺乳動物。轉基因哺乳動物的 其他物種可以是，但不限於，豬物種、綿羊物種、公山羊物種或齧齒動物物種。反相色譜的步 驟包括使用反相基質，優選C4或C18反相基質。以下實施例是本發明的各個方面和特徵的說明，而非限制。實施例1表達質粒的構建產生了構建體，其含有大部分的牛0酪蛋白基因啟動子，包括5』非-編碼日酪 蛋白基因區的短片段，與修飾的人胰島素前體的編碼序列融合。短的非翻譯片段是0酪蛋 白基因的第一個外顯子的片段。所用的0酪蛋白基因為約3.8kb。通過將修飾的人胰島素前體(mhuIP)的編碼序列和大部分的牛0酪蛋白基因啟 動子基因(對應於來自0酪蛋白基因5』區的3，800bp)插入合適的載體中來進行表達質 粒pPmhuIP的構建(參見圖1)。該啟動子確保基因在其控制下組織特異性地和發育調控 地表達，在這種情況下為異源修飾的人胰島素前體。為了轉基因細胞的正確選擇，在質粒中包括編碼新黴素磷酸轉移酶的基因。該基 因使得可以用抗生素遺傳黴素來選擇轉基因細胞，並且其在SV40啟動子的控制下。其他構建體可以源自用來提高轉染細胞選擇或DNA整合至牛細胞基因組中的效 率的原始構建體。通過限制酶分析和DNA測序來分析構建體。之前通過螢光抗體識別在乳腺細胞系 中測試了構建體表達mhuIP的能力。以下詳細地描述了質粒p 0 mhuIP的製備。
14
p日mhuIP的製備形成起始構建，其包括編碼mhuIP (含有修飾C肽的人胰島素原)的序列。mhuIP 與人胰島素原相似，除了 mhuIP中的C肽比天然存在的胰島素原中發現的C肽短。圖2描繪了起始構建的略圖。開始時，可以找到編碼牛信號肽的區域，接著是編碼 胰島素B鏈(缺乏C-端胺基酸)的序列。然後，可以找到編碼三個胺基酸的間隔區的區域， Ala-Ala-Lys，其後是編碼胰島素全部A鏈的序列，最後是編碼mRNA polyA的區域。三個氨 基酸間隔區，Ala-Ala-Lys，替代天然存在的胰島素原中發現的C肽。通過從6個重疊重建mhuIP序列產生了起始構建，6個重疊是含有限制酶Bam HI 和Not I的識別位點的化學合成的寡核苷酸。引物序列如下所示Insl 5 『 -ACTGGGATCCATGGCCCTGTGGACACGCCTGCGGCCCCTGCTGGCCCTGCTGGCGCTCTGGCCCCCCCCCCCGGCCCG-3『Ins2 5 『 -CTCCGCACACCAGGTACAGCGCCTCCACCAGGTGGGAGCCACACAGATGCTGGTTG ACGAAGGCGCGGGCCGGGGGGGGG-3『Ins3 5 『 -ACCTGGTGTGCGGAGAGCGCGGCTTCTTCTACACGCCCAAGGCTGCTAAGGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAG-3『Ins4 5' -GTGTGGGGCTGCCTGCAGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGG GAGCAGATGCTGGTACAGCA-3『Ins5 5 『 -CAGGCAGCCCCACACCCGCCGCCTCCTGCACCGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCCCTGCTGTGCCGTCTGT-3『Ins6 5 『 -TGACGCGGCCGCAGCGTGGAGAGAGCTGGGAGGGGCTCACAACAGTGCCGGGAAGTGGGGCTTGGCCCAGGGCCCCCAAGACACACAGCAGGCACAGCA-3『通過PCR進行重建過程。從引物Insl和Ins2 (產物f 12)、Ins3和Ins4 (產物f34) 以及Ins5和Ins6 (產物f56)的混合物產生PCR產物。然後在單個混合物中使用fl2和f34 重疊片段來進行相同的過程，其獲得了產物fl4。最終，在含有f56的混合物中在PCR中使 用H4產物，以擴增大約410bp的片段，其含有全長mhuIP (f 16)。一旦獲得了片段fl6，將其克隆至合適的載體中，並轉化至感受態大腸桿菌細菌細 胞中，用於進一步擴增帶有其相應插入片段的克隆載體。載體源自pBKCMV。pBKCMV是獲自 Invitrogen Co. (Carlsbad, CA)的表達載體，其編碼CMV啟動子，新黴素抗性基因和卡那黴 素抗性基因。用3.8kb牛0酪蛋白啟動子替代CMV啟動子，並使用Bam HI和Not I限制 位點將片段H6克隆至所得到的載體中。擴增後，進行限制測試，以檢查克隆的插入片段的同一性。通過測序獲得最終的證實。
此後，在4kb的牛0酪蛋白啟動子下遊的質粒載體中定向插入起始構建體(Bam HI/NotI)。質粒載體還含有新黴素抗性基因。所得到的載體pPmhuIP，其是最終的構建體， 含有0酪蛋白啟動子，編碼mhuIP的序列和新黴素抗性基因。人胰島素原由三個結構域組成氨基末端B鏈(30個胺基酸)，羧基末端A鏈(21 個胺基酸)和中間稱為C肽的連接肽(31個胺基酸)。mhuIP不同於天然存在形式的人胰 島素原，因為B鏈的C-端胺基酸已經除去，並且編碼C肽的胺基酸已經由通常未在C肽中 發現的三個胺基酸Ala-Ala-Lys替代。在C肽切割後，形成了成熟的人胰島素，其僅由A鏈 和B鏈組成。表達人胰島素原的轉基因哺乳動物是無法生存的，因為宿主肽酶可以切割並 除去C肽，形成成熟的胰島素。如上所述，非人轉基因哺乳動物中成熟人胰島素的表達可能 殺死哺乳動物，因為成熟的人胰島素可能滲漏至哺乳動物的血流中。相反，使用pPmhuIP 製得的非人轉基因哺乳動物表達修飾的人胰島素前體，其不會引起轉基因哺乳動物產生任 何明顯的低血糖並且對轉基因哺乳動物是無毒的。不希望受到以下的限制，因為編碼修飾 的人胰島素前體的三個胺基酸間隔區的區域不同於天然存在的人胰島素原中發現的C肽， 宿主肽酶沒有識別和切割三個胺基酸間隔區。因此，修飾的人胰島素前體保持失活並且沒 有在轉基因動物中引起低血糖，這是所要求保護的本發明的重要優點。選擇克隆，其含有0酪蛋白啟動子和正確融合的mhuIP，以在該啟動子控制下僅 表達mhuIPo該表達質粒的大小為約8.4kbp。體細胞的轉染然後將質粒p 0 mhuIP用於轉染體細胞的初級培養物，使用磷酸鈣或脂質體方法。 通常將胎牛成纖維細胞用於轉染。通過將遺傳黴素加入培養物中來選擇轉染的細胞。2至8周的時間段後，對遺傳黴 素有抗性的細胞適於用作供體細胞來獲得轉基因克隆。通過PCR來分析轉染的選擇細胞， 以證實細胞含有表達盒。實施例2卵母細胞去核和成熟去核卵母細胞中的中期核移植牛卵母細胞的收集和體外成熟從屠宰場卵巢中吸出牛卵母細胞並使之在TCM-199+5% FCS+3mMHEPES+殺真菌藥 中成熟。然後將選定的卵母細胞置於TCM-199+細胞周期蛋白依賴激酶中，在5% C02的氣 氛和39°C下20小時。此後，將卵母細胞置於TCM-199+5% FCS+FSH(促卵泡激素)+抗生素 中，在5% C02的氣氛和39°C下24小時。通過在含有lmg/ml牛睪丸透明質酸酶的PBS中 渦旋2分鐘來將成熟卵母細胞去核。實施例3使用卵丘細胞的核移植去核使用Narishige水壓顯微操作器和Nikon Diaphot顯微鏡將卵母細胞機械去 核。用20 iim斜角和尖銳的移液管進行去核。之前用5iig/ml Bisbenzimidine (Hoechst 333421)染料將卵母細胞染色20分鐘。通過在紫外線下觀察染色的染色體來將中期去核。 在吸入移液管後，測定中期染色體。將轉基因體細胞轉染至卵周隙中，並與去核卵母細胞緊密相對。融合、激活和胚胎培養將轉基因體細胞和去核的卵母細胞人工地排列在融合室中，使得待融合的膜與電 極平行。使用玻璃胚胎操作移液管來進行。使用持續15 ii s的180伏特/cm的一個電脈衝進行融合(BTXElectro細胞操作儀 200)2並用BTX Optimizer-Graphic脈衝分析儀。用於脈衝胚胎的室由安放在玻璃顯微鏡載 玻片上的相隔0. 5mm的兩個0. 5mm不鏽鋼金屬絲電極構成。融合後三小時，通過在TL-HEPES 中與5 P M離子要素一起培養4分鐘和在TCM-199中用2mM 6-DMAP培養3小時來誘導激活。然後在5% C02+5% 02+90% N2的氣氛下，在S0F培養基中將激活的卵母細胞培養 6. 5天，直到產生胚細胞。此後，將胚胎移植至代孕母牛中。通常，每隻受體奶牛非外科手術地移植兩個胚細 胞，並且在30-35天時通過超聲波檢查來確定妊娠。使植入的奶牛正常地經過妊娠直到自然分娩。最後，外科方法(Caesarea)可以用 於分娩。在頭48小時期間給新生兒餵養富含Ig的初乳，然後使用合成的食物，之後使用天 然的食物(所有這些食物都不含動物來源的化合物)。^igma Chemical Co. ，St. Louis, M0, USA2BTX Inc.，San Diego, Ca, USA實施例4對轉基因小牛進行的測試該實施例中，我們呈現了對特定的轉基因小牛所進行測試的完整描述，該轉基因 小牛是作為實施例1至3中所述方法的結果而獲得的。儘管如此，應當保持清楚的是對作 為其它獲得轉基因小牛方法的結果而出生的牛可以進行同一套的測定，這些其他方法如轉 基因雌性的亞克隆、轉基因雌性的超排卵，接著人工授精，或用來自對所需蛋白為轉基因的 公牛的精子將轉基因或非轉基因雌性人工授精。通過對從小牛白細胞中純化得到的DNA進行PCR反應，使用來自非轉基因jersey 小牛的DNA作為負對照，證明了在轉基因小牛細胞的基因組中包括牛3酪蛋白啟動子和編 碼修飾的人胰島素前體的序列。可以作為不同於小牛的同源3酪蛋白基因的獨特DNA片 段一起發現它們。使用Pharmacia自動測序儀，證實了插入的序列對應於克隆質粒中所含的編碼修 飾的人胰島素前體的序列。插入的序列包括分泌信號和終止子。將控制修飾的人胰島素前 體序列在我們的小牛中表達的牛0酪蛋白啟動子也進行了測序。所有那些元件與其預期 的理論序列精確地一致，該理論序列來自用於轉化產生了克隆的細胞的遺傳構建體。實施例5從奶中純化重組的mhuIP，將mhuIP轉化成人胰島素和人胰島素的純化從轉化的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的發酵獲得為研發從奶中純化前 體的程序所需量的重組mhuIP蛋白。為此，在通過甲醇可誘導的啟動子的控制下，將編碼 mhuIP的序列亞克隆至酵母分泌信號序列下遊的表達載體中，並在酵母細胞中轉化。此後，進行合適克隆的選擇並從選定的克隆製得液體培養物。在含有作為碳源的甘油、少量元素的培養基中進行轉化的酵母克隆的發酵。將甲醇用於誘導。該發酵獲得0.5克mhuIP/升培養物。一旦發酵結束，進行純化步驟來獲得純產物。最初的目標是從酵母培養物獲得純的重組mhuIP。因此，用純水將轉化的巴斯德 畢赤酵母培養物的上清液稀釋十倍，並使用冰醋酸將其PH調節至3. 0。證實該溶液的傳導 率，使得其沒有呈現高於7mS/cm的值。此後進行純化過程，以獲得用於研發從轉基因哺乳 動物的奶中純化重組mhuIP的方法的起始材料，並進一步將其轉化成重組人胰島素。首先，使上述溶液接受陽離子交換色譜步驟，使用SP S印haroseFF樹脂 (Amersham)，以lOOcm/h的流速。使用5%醋酸進行柱的裝載(每mL樹脂裝載10mL上清 液)和平衡。為了蛋白質的洗脫，使用PH 3的5%醋酸1M NaCl的梯度，在25個柱體積 的總體積中，從100 0的溶液比例開始，直到達到0 100的溶液比例。在第二個純化步驟中，使來自陽離子交換色譜的洗出液接受反相色譜。用純水將 之前的洗出液稀釋五倍，並用三氟醋酸(TFA)將pH調節至3。將所得到的溶液裝載至含有C4Baker Wide Pore樹脂的柱中。將流動設定為 lOOcm/h的速率。為了裝載和平衡，使用了 0. 的TFA/水。為了洗脫，使用0. 1 % TFA/ 水-乙腈梯度，在50個柱體積的總體積中，從100 0的溶液比例開始，直到達到0 100 的溶液比例。之前純化步驟的總產率大約為42%，並獲得了純度高於95%的mhuIP。研發了以下的方法，其包括從奶中純化重組mhuIP(因為轉基因哺乳動物將在其 奶中分泌前體)，將重組mhuIP轉化成重組人胰島素和重組人胰島素的最終純化。通過將純 的重組mhuIP (獲自巴斯德畢赤酵母，如上所述)與常規牛奶混合來獲得用於該研發的起始 材料。研發了徹底的純化方法。該方法包括以下步驟通過切向過濾獲得奶泡，稀釋所 獲得的洗出液來獲得最終保留在酪蛋白膠束中的重組mhuIP更好的溶解度(澄清)；並將 該溶液通過陽離子交換色譜柱。使所得到的溶液接受反相色譜(C4)步驟，此後使富含重組 mhuIP的級分接受胰蛋白酶水解和轉肽作用。最後，進行重組人胰島素的純化，因為在製造 生物藥品時，將目標蛋白純化至同質性以避免產品中可能汙染物的存在是強制性的。用於從奶中純化重組mhuIP，之後轉化成重組人胰島素和重組人胰島素最終純化 的程序包括以下次序的步驟(a)切向流過濾(澄清)，(b)陽離子交換色譜，(c)反相色譜 (C4)，(d)胰蛋白酶分解和轉肽作用，(e)反相色譜(C4)，(f)反相色譜(C4)和(g)反相色 譜(C18)。澄清將鮮奶與足量的純重組mhuIP混合，重組mhuIP如之前所述在巴斯德畢赤酵母 中產生。此後，將產物接受切向流過濾步驟。濾器孔徑大小為0.1 ym，並且該方法產率為 80%。陽離子交換色譜對從之前步驟得到的材料進行色譜處理，使用陽離子交換基質。用冰醋酸將待色 譜的溶液的pH調節至3. 0。檢查傳導率，使其不高於7mS/cm。使用流速為100cm/h的SP Sepharose FF樹脂(Amersham)進行色譜步驟。使用 5%醋酸進行柱的裝載和平衡。為了蛋白質的洗脫，使用pH 3的5%醋酸1M NaCl的梯度，在25個柱體積的總體積中，從100 0的溶液比例開始，直到達到0 100的溶液比例。色譜步驟具有90%的產率。測定選定的含有重組mhuIP的級分的總蛋白(通過 Bradford方法)和目標蛋白(通過Western印跡)，並貯存於2-8°C。反相色譜(1)然後使從之前步驟得到的材料接受反相色譜，使用C4 Baker WidePore樹脂。將 流動設定為lOOcm/h的速率。為了裝載和平衡，使用了 0.1%的TFA/水。為了洗脫，使用 0.1%TFA/水-乙腈梯度，在50個柱體積的總體積中，從100 0的溶液比例開始，直到達 到0 100的溶液比例。該步驟具有68%的產率。胰蛋白酶水解和轉肽作用用胰蛋白酶處理從之前步驟得到的材料。為了胰蛋白酶水解，用胰蛋白酶(以200iiM的濃度)在12°C下將10mM mhuIP溶
液培養24小時。一旦結束培養，進行轉肽反應，以在人胰島素B鏈的位置30添加蘇氨酸。為此，制 備含有 0. 8M Thr-0bu, 50 % DMF/EtOH (1 1)，26% H20，醋酸，10mM mhuIP 和 200 ii M 胰蛋 白酶的溶液，並使轉肽反應進行直到完全。一旦轉肽步驟已經結束，使所得到的溶液接受三次連續的反相色譜步驟，以產生 純的重組人胰島素。反相色譜(2)使從之前步驟得到的材料接受反相色譜。首先，使用50mM NaH2P04, pH5. 0將之前消化的材料稀釋至0. 125mg/mL。此後，加 入50 y L醋酸/100mL溶液。然後樣品是清澈的，pH大約為4. 5，並且樣品是即可裝載的。緩衝液組成如下所述移動相A (MPA) :210mL硫酸鹽緩衝液+790mL純水(大約48mS的傳導率)。移動相B (MPB) 105mL硫酸鹽緩衝液+40 %乙腈，純水q. s. p.至1L。1L硫酸鹽緩衝液含有132. lgr. NH4S04,14mL H2S04,並且將其pH調節至2. 00。裝載後，如下以lOOcm/h的流速進行洗脫首先，使用MPA-MPB梯度，在135mL的 總體積中，從100 0的溶液比例開始，直到達到55 45的溶液比例；此後，使用另一個 MPA-MPB梯度，在360mL的總體積中，從55 45的溶液比例開始，直到達到25 75的溶液 比例；並且最後，使用最終的MPA-MPB梯度，在50mL的總體積中，從25 75的溶液比例開 始，直到達到0 100的溶液比例。所獲得的級分含有純度超過98%的重組人胰島素，並且該步驟的產率大約為 85%。反相色譜(3)對於該步驟，通過將其pH調節至7. 4，對從之前步驟獲得的材料進行調節。然後使用C4 Baker Wide Pore基質對所得到的溶液進行色譜。將流動設定為 lOOcm/h的速率。為了裝載和平衡，使用了 0. 的TFA/水。為了洗脫，使用0. 1 % TFA/ 水-乙腈梯度，在50個柱體積的總體積中，從100 0的溶液比例開始，直到達到0 100 的溶液比例。
19
該步驟具有大約65%的產率。反相色譜(4)對於最終的反相色譜步驟，通過將其pH調節至3. 0，對從之前步驟獲得的材料進 行調節。然後使用C18反相基質對調節過的材料進行色譜。將流動設定為lOOcm/h的速率。 為了裝載和平衡，使用了 0. 1 %的TFA/水。為了洗脫，使用0. 1 % TFA/水-乙腈梯度，在50 個柱體積的總體積中，從100 0的溶液比例開始，直到達到0 100的溶液比例。該步驟具有大約61%的產率。實施例6表達質粒pNJK IP的構建產生了在轉基因牛乳腺中中表達mhuIP的備選構建體，其含有大部分的公山羊3 酪蛋白基因啟動子，其與雞0球蛋白絕緣子的編碼序列的片段融合。絕緣子是保護啟動子 不受鄰近調控元件影響的DNA序列元件，鄰近的調控序列包括鄰近的抑制基因表達的沉默 序列。產生了這種含有雞0球蛋白絕緣子的備選構建體，以阻斷0酪蛋白啟動子受任何 鄰近沉默序列的抑制。進行了這種備選質粒的構建，首先，通過從pBCl (其是可從Invitrogen Co. (Carlsbad,CA)獲得的商業載體)切除15kb片段，其含有雞0球蛋白絕緣子的2.4kb 片段，3. lkb的公山羊0酪蛋白啟動子序列，包括來自公山羊0酪蛋白基因的內含子和非 翻譯外顯子，內含子和非翻譯外顯子之間的來自公山羊0酪蛋白基因的Xho I克隆位點， 以及來自3』 0酪蛋白基因組序列的poly A信號和側翼區。將該15kb片段克隆至pPmhuIP的主鏈中。首先，從pPmhuIP切除3.8kb牛3酪 蛋白啟動子和mhuIP片段。使用Sal I和Not I限制位點將15kb片段插入該載體中。然 後，將410bp mhuIP H6片段克隆至位於15kb片段中的Xho I克隆位點(在來自公山羊3 酪蛋白基因的內含子和非翻譯外顯子之間，如上所述)。將所得到的載體(pNJK IP,圖3)轉化至感受態的大腸桿菌細菌細胞中，用於進一 步擴增含有其對應插入片段的克隆載體。擴增後，進行限制位點分析來檢查mhuIP fl6片段插入片段的方向。通過測序獲 得最終的證實。實施例7表達質粒p 0 KLEIP的構建產生了在轉基因牛乳腺中中表達mhuIP的備選構建體，其含有大部分的牛3酪 蛋白基因啟動子，包括0酪蛋白基因的第一個外顯子的短的非翻譯片段，其與大部分的牛 a乳清蛋白基因的編碼序列融合，接著為腸激酶切割位點，其接著為修飾的人胰島素前體 (mhuIP)的編碼序列。該備選構建體表達a乳清蛋白-mhuIP融合蛋白。由於其較大的序 列，該備選構建體應當產生具有較高穩定性的mRNA。此外，因為a乳清蛋白是在牛乳腺中 天然表達的蛋白，該備選構建體應當最小化mhuIP降解和提高mhuIP表達。為了產生該構建體，首先，使用來自牛外周血的白細胞的DNA作為模板來進行PCR 反應，以克隆大部分的a乳清蛋白基因。PCR產物包含約700bp的a乳清蛋白直到第二個 外顯子結束，並包括a乳清蛋白信號序列。
第一個PCR反應使用了以下寡核苷酸NES :GGA GGT GAG CAG TGT GGT GACALB :GAA GTT ACT CAC TGT CAC AGG AGA然後，進行了第二個PCR反應，使用以下寡核苷酸SIG :TCA CCA AAA TGA TGT CCT TTG TCLAC :TGT CAC AGG AGA TGT TAC AGA通過該程序，獲得了 620bp片段並使用Sma I限制位點克隆至pUC中(pUC a乳清 蛋白)。通過PCR從內部的IP克隆質粒獲得帶有mhuIP基因的片段，使用以下的寡核苷 酸EKB :tag get age gat gat gat gat aaa ttc gtt aac cag cac ctgCadAr :tca gcg gcc gc tta gtt gca gta gtt所得到的260bp片段包括編碼腸激酶識別位點的短序列，該腸激酶識別位點在 mhuIP的編碼序列的上遊。腸激酶切割位點使得IP可以與剩餘的肽分離。然後用Nhel消 化260bp片段並插入pUCa乳清蛋白中相當的Xbal限制位點。選擇所得到的構建體，其中 260bp片段位於構建體方向中的a乳清蛋白基因的下遊。該構建體具有大部分的牛a乳 清蛋白基因的編碼序列，包括a乳清蛋白信號序列，接著是腸激酶識別位點，其進一步接 著修飾的人胰島素前體(mhuIP)的編碼序列。首先用EcoRI消化pUC a乳清蛋白質粒，並用Klenow處理所得到的粘性末端。此 外，進行了 NotI消化並分離所得到的基因片段。在位於所述啟動子區域3'端的唯一BamHI 位點中消化帶有0酪蛋白啟動子的PBK質粒，用於待連接的a乳清蛋白基因融合體。因 此，還將BamHI位點鈍化來連接來自該片段的EcoRI鈍化端，在給插入片段的NotI端提供 同源末端之前，還進行了 PBK質粒的NotI消化。然後將p 0 KLE IP轉化至感受態大腸桿菌細菌細胞中，用於帶有其對應插入片段 的克隆載體的進一步擴增。擴增後，通過測序獲得最終的證實。現在已經充分地描述了本發明，本領域普通技術人員將會理解可以在寬泛而等價 範圍的條件、製劑和其他參數內進行本發明，而不影響本發明或其任何實施方案的範圍。在 此引用的所有專利和出版物在此以其整體全部引入作為參考。
權利要求
一種質粒，其包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列，該核酸序列可操作地連接到β酪蛋白啟動子上。
2.權利要求1的質粒，其中修飾的胰島素前體是修飾的哺乳動物胰島素前體。
3.權利要求2的質粒，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體、修飾 的牛胰島素前體、修飾的豬胰島素前體、修飾的綿羊胰島素前體，修飾的公山羊胰島素前體 或修飾的齧齒動物胰島素前體。
4.權利要求3的質粒，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體。
5.權利要求4的質粒，進一步包含抗生素抗性基因。
6.權利要求5的質粒，其中抗生素抗性基因是新黴素抗性基因。
7.權利要求6的質粒，其是p0 mhuIP。
8.質粒pPmhuIP。
9.權利要求6的質粒，進一步包含編碼公山羊0酪蛋白啟動子的核酸序列和編碼雞 3球蛋白絕緣子片段的核酸序列，包括編碼來自公山羊0酪蛋白基因的內含子和非翻譯 外顯子的核酸序列。
10.權利要求9的質粒，其是pNJKIP。
11.質粒pNJK IP。
12.權利要求6的質粒，進一步包含編碼0酪蛋白基因的第一個外顯子的非翻譯片段 的核酸序列。
13.權利要求12的質粒，進一步包含編碼牛a乳清蛋白基因片段的核酸序列和編碼腸 激酶切割位點的核酸序列，其在修飾的胰島素前體的上遊。
14.權利要求13的質粒，其是pPKLEIP。
15.質粒p3KLE IP。
16.權利要求1的質粒，其中修飾的胰島素前體不會在其奶中表達修飾的胰島素前體 的非人轉基因動物中引起低血糖。
17.權利要求16的質粒，其中修飾的胰島素前體包含修飾的C肽。
18.權利要求17的質粒，其中修飾的C肽包含通常未在天然存在的胰島素原中發現的胺基酸。
19.權利要求18的質粒，其中修飾的C肽包含以下三個胺基酸Ala-Ala-LyS。
20.權利要求16的質粒，其中修飾的胰島素前體進一步包含修飾的B鏈。
21.權利要求20的質粒，其中修飾的B鏈包含天然存在B鏈的幾乎所有C-端。
22.將權利要求1的質粒轉染至哺乳動物細胞中的方法，包括將質粒插入脂質體中，並 使脂質體與哺乳動物細胞接觸。
23.權利要求22的將質粒轉染至哺乳動物細胞中的方法，其中脂質體是陽離子脂質。
24.在其奶中產生修飾的胰島素前體的非人轉基因哺乳動物
25.權利要求24的非人轉基因哺乳動物，其中哺乳動物屬於牛物種、豬物種、綿羊物 種、公山羊物種或齧齒動物物種。
26.權利要求25的非人轉基因哺乳動物，其中哺乳動物屬於牛物種。
27.權利要求24的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的胰島素前體是修飾的哺乳動物胰 島素前體。
28.權利要求27的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人 胰島素前體、修飾的牛胰島素前體、修飾的豬胰島素前體、修飾的綿羊胰島素前體、修飾的 公山羊胰島素前體或修飾的齧齒動物胰島素前體。
29.權利要求28的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人 胰島素前體。
30.權利要求24的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的胰島素前體不會在非人轉基因動 物中引起低血糖。
31.權利要求30的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的胰島素前體包含修飾的C肽。
32.權利要求31的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的C肽包含通常未在天然存在的胰 島素原中發現的胺基酸。
33.權利要求32的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的C肽包含以下三個胺基酸: Ala-Ala-Lyso
34.權利要求31的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的胰島素前體進一步包含修飾的B鏈。
35.權利要求34的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的B鏈包含天然存在B鏈的幾乎所 有C端。
36.權利要求24的非人轉基因哺乳動物，其基因組包含整合的質粒，其中該質粒包含 編碼修飾的人胰島素前體的序列，該序列可操作地連接到指導該序列在哺乳動物的乳房細 胞中表達的啟動子上。
37.權利要求36的非人轉基因哺乳動物，其中哺乳動物屬於牛物種、豬物種、綿羊物 種、公山羊物種或齧齒動物物種。
38.權利要求37的非人轉基因哺乳動物，其中哺乳動物屬於牛物種。
39.權利要求24的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的胰島素前體是修飾的哺乳動物胰 島素前體。
40.權利要求39的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人 胰島素前體、修飾的牛胰島素前體、修飾的豬胰島素前體、修飾的綿羊胰島素前體、修飾的 公山羊胰島素前體或修飾的齧齒動物胰島素前體。
41.權利要求40的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人 胰島素前體。
42.權利要求41的非人轉基因哺乳動物，其中啟動子是0酪蛋白啟動子。
43.權利要求42的非人轉基因哺乳動物，其中質粒進一步包含抗生素抗性基因。
44.權利要求43的非人轉基因哺乳動物，其中抗生素抗性基因是新黴素抗性基因。
45.權利要求44的非人轉基因哺乳動物，其中質粒是p0 mhuIP。
46.在其奶中產生修飾的人胰島素前體的牛物種的非人轉基因哺乳動物，其基因組包 含整合的質粒，其中該質粒包含編碼修飾的人胰島素前體的序列和指導該序列在哺乳動物 的乳房細胞中表達的0酪蛋白啟動子。
47.權利要求46的非人轉基因哺乳動物，其中質粒進一步包含新黴素抗性基因。
48.權利要求47的非人轉基因哺乳動物，其中質粒是p0 mhuIP。
49.權利要求48的非人轉基因哺乳動物，其中在哺乳動物的體細胞和生殖細胞中都發現了整合的質粒。
50.權利要求46的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的人胰島素前體不會在非人轉基因 動物中引起低血糖。
51.權利要求50的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的人胰島素前體包含修飾的C肽。
52.權利要求51的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的C肽包含通常未在天然存在的胰 島素原中發現的胺基酸。
53.權利要求52的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的C肽包含以下三個胺基酸 Ala-Ala-Lyso
54.權利要求51的非人轉基因哺乳動物，其中修飾的人胰島素前體進一步包含修飾的 B鏈。
55.權利要求54的質粒，其中修飾的B鏈包含天然存在B鏈的幾乎所有C-端。
56.製備非人轉基因哺乳動物的方法，包括a)將編碼修飾的胰島素前體的核酸序列克隆至質粒中，由此將該序列可操作地連接到 將指導該序列在乳房細胞中表達的啟動子上，得到表達質粒；b)用表達質粒轉染體細胞，使得質粒整合至細胞的基因組中，得到轉基因體細胞；c)將成熟的卵母細胞去核，得到去核的卵母細胞；d)將一個轉基因體細胞與去核的卵母細胞融合，得到單細胞胚胎；e)將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；和f)監視妊娠直到轉基因哺乳動物的出生。
57.權利要求56的方法，其中啟動子是0酪蛋白啟動子，並且其中修飾的胰島素前體 是修飾的人胰島素前體。
58.權利要求57的方法，其中表達質粒進一步包含新黴素抗性基因。
59.權利要求58的方法，其中表達質粒是p0 mhuIP。
60.權利要求56的方法，其中哺乳動物是在其奶中產生修飾的人胰島素的牛，其基因 組包含整合的質粒，其中該質粒包含編碼修飾的人胰島素前體的序列和指導該序列在哺乳 動物的乳房細胞中表達的0酪蛋白啟動子。
61.權利要求60的方法，其中質粒進一步包含新黴素抗性基因。
62.權利要求61的方法，其中質粒是p^mhuIP。
63.權利要求56的方法，其中體細胞是成纖維細胞。
64.權利要求56的方法，其中通過從用於在其奶中產生修飾的胰島素前體的轉基因雌 性動物分離來獲得轉基因體細胞。
65.權利要求64的方法，其中轉基因體細胞是成纖維細胞。
66.權利要求56或64的方法，其中在哺乳動物的體細胞和生殖細胞中都發現了編碼修 飾的胰島素前體的序列，其可操作地連接到指導該基因在乳房細胞中表達的啟動子上。
67.權利要求56或64的方法，其中哺乳動物屬於牛物種、豬物種、綿羊物種、公山羊物 種或齧齒動物物種。
68.權利要求67的方法，其中哺乳動物屬於牛物種。
69.權利要求56或64的方法，其中修飾的胰島素前體是修飾的哺乳動物胰島素前體。
70.權利要求69的方法，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體、修飾的牛胰島素前體、修飾的豬胰島素前體、修飾的綿羊胰島素前體、修飾的公山羊胰島素前 體或修飾的齧齒動物胰島素前體。
71.權利要求70的方法，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體。
72.權利要求56或64的方法，其中修飾的胰島素前體不會在非人轉基因哺乳動物中引 起低血糖。
73.權利要求72的方法，其中修飾的人胰島素前體包含修飾的C肽。
74.權利要求73的方法，其中修飾的C肽包含通常未在天然存在的胰島素原中發現的胺基酸。
75.權利要求74的方法，其中修飾的C肽包含以下三個胺基酸Ala-Ala-LyS。
76.權利要求73的方法，其中修飾的人胰島素前體進一步包含修飾的B鏈。
77.權利要求76的方法，其中修飾的B鏈包含天然存在B鏈的幾乎所有C-端。
全文摘要
本發明涉及用於生產對哺乳動物可能有毒的目標蛋白的非人轉基因動物。該哺乳動物的特徵在於以下事實其是轉基因的，用於在其奶中產生失活形式的目標蛋白，優選重組人胰島素。不可能在轉基因哺乳動物中產生重組人胰島素，因為該分子在哺乳動物中具有一定程度的生物活性，並可能對哺乳動物是有毒的。因此，本發明涉及克隆遺傳構建體，該遺傳構建體包含編碼修飾的人胰島素前體的序列，該序列處於表達載體中的β酪蛋白啟動子的控制下。本發明還包括將該表達質粒轉染至胎牛體細胞，如成纖維細胞中，並通過核移植將牛卵母細胞去核來產生轉基因胚胎。本發明產生了能夠在其乳腺中產生修飾的人胰島素前體的轉基因牛。此後，可以收集這些轉基因哺乳動物的奶，可以在體外將修飾的人胰島素前體轉化成重組的人胰島素，並將重組的人胰島素純化至作為純生物藥品的同質性。
文檔編號C12N15/00GK101802210SQ200880022998
公開日2010年8月11日 申請日期2008年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者A·伯克維奇, A·普林克, C·梅洛, M·克裡斯庫羅, N·費爾南德斯 申請人:斯特林貝爾德生物技術北美公司