抑制Wnt活性的多核苷酸及其編碼多肽和用途的製作方法

2023-09-19 23:36:10 2

專利名稱：抑制Wnt活性的多核苷酸及其編碼多肽和用途的製作方法
技術領域：
本發明公開了一類新的編碼具有抑制Wnt活化的功能的人蛋白的多核苷酸及其編碼的多肽，多肽的抗體。本發明也公開了這類新的多核苷酸在宿主細胞中外源表達對Wnt活性的抑制作用的應用。本發明還公開了所述多肽、抗體在製備預防和治療腫瘤的藥物上的用途。
背景技術：
Wnt通路是一條十分保守的信號傳導通路，從低等生物果蠅到高等哺乳動物，其成員都具有高度的同源性。在小鼠中，腫瘤病毒整合在Wnt之後而導致乳腺癌，命名為Int1，它與果蠅的無翅基因(Wingless，wg)有高度同源性。Wnt作為一類分泌型糖蛋白，主要通過自分泌或旁分泌發揮作用。Wnt具有生長因子特點如缺乏附加的跨膜區域，有疏水的信號肽，富含保守半胱氨酸片段，具備N端糖基化位點。目前認為的wnt通路的主要成員細胞外因子(wnt)；跨膜受體(frizzled)；胞質蛋白(β-catenin)；以及核內轉錄因子(TCF)等一系列蛋白。Wnt信號途徑可概括Wnt→Frz→Dsh→β-catenin的降解複合體解散→β-catenin積累，進入細胞核→TCF/LEF→基因轉錄(如c-myc、cyclinD1)。Wnt信號在動物發育中起重要作用，其異常表達或激活能引起腫瘤。
Wnt的受體是捲曲蛋白(frizzled，Frz)，為7次跨膜蛋白，結構類似於G蛋白偶聯型受體，Frz胞外N端具有富含半胱氨酸的結構域(cysteine rich domain，CRD)，能與Wnt結合。Frz作用於胞質內的蓬亂蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)，Dsh能切斷β-catenin的降解途徑，從而使β-catenin在細胞質中積累，並進入細胞核，與T細胞因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)相互作用，調節靶基因的表達，TCF/LEF是一類具有雙向調節功能的轉錄因子，它與Groucho結合抑制基因轉錄，而與結合β-catenin則促進基因轉錄。Wnt還需要另外一個受體(co-receptor)，即LRP5/6，屬於低密度脂蛋白受體相關蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)，但至今還不清楚它如何與Frz一起活化Dsh。
β-catenin的降解複合體主要由APC、Axin、GSK-3β、CK1等構成。
GSK-3β是一種蛋白激酶，在沒有Wnt信號時，GSK-3β能將磷酸基團加到β-catenin氨基端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上，磷酸化的β-catenin再結合到β-TRCP蛋白上，受泛素的共價修飾，被蛋白酶體(proteasome)降解。β-catenin中被GSK3磷酸化的胺基酸序列稱為破壞盒(destructionbox)，此序列發生變異可能引起某些癌症。
CK1酪蛋白激酶(caseinkinase 1)，能將β-catenin的Ser45磷酸化，隨後GSK-3β將β-catenin的Thr41、Ser37、Ser33磷酸化。APC是一種抑癌基因，其突變引起良性腫瘤——結腸腺瘤樣息肉(adenomatous polyposis coli)，但隨著時間的推移，可能發生惡變。APC蛋白的作用是增強降解複合體與β-catenin的親和力。
Axin是一種支架蛋白，具有多個與其它蛋白作用的位點，能將APC、GSK-3β、β-catenin、CK1結合在一起。此外它還能與Dishevelled、PP2A(protein phosphatase 2A)等成分結合，其中Dsh與Axin結合能使降解複合體解體。PP2A可能引起Axin去磷酸化，而使降解複合體解體，因此屬於Wnt途徑的正調控因子，但PP2A至少由催化亞基和調節亞基兩部分構成，其調節亞基仍算作是抑癌基因。
Wnt信號途徑的其它成分GBPGSK-3β結合蛋白(Frat基因的產物)，對Wnt信號途徑起正調控作用，GBP/Frat抑制GSK3-β的活性。
Dickkopf1(DKK1)是一種分泌蛋白，其與Wnt受體LRP5/6及另一類穿膜蛋白Kremen1/2結合，形成三聚體，誘導快速的細胞內吞，減少細胞膜上的LRP5/6，由此阻斷了Wnt信號向胞內的傳遞。
sFRP分泌型Frz相關蛋白(secreted frizzled-related proteins)，含有一個CRD結構域，但缺少七次跨膜域，它可能與Frz競爭結合Wnt蛋白。其他的抑制蛋白還有Sizzled、WIF-1和Cerberus，它們也直接與Wnt蛋白結合，從而拮抗Wnt信號。
β-catenin(β-連鎖蛋白，在果蠅中叫做犰狳蛋白(Armadillo)是一種多功能的蛋白質，是wnt通路關鍵的細胞內信號蛋白，它具有雙重功能，其一是參與細胞間黏附作用；其二是Wnt信號傳導過程中的重要成分，取決於他的位置在細胞膜還是細胞核。膜相關β-catenin在細胞黏附中起重要作用，它結合E-cadherin的胞內區，連接E-cadherin和α-catenin，進而連接肌動蛋白細胞骨架。有文獻報導E-cadherin可以通過抑制β-catenin以黏附依賴的方式抑制細胞生長，也有報導β-catenin亦可抑制E-cadherin的表達，總之他們之間的平衡調節細胞的生長分化。正常組織中細胞內由於結腸腺性息肉基因(APC)、哺乳動物糖元合成激酶3(GSK3β)等的作用，游離的β-catenin很快即被降解，一般不會出現聚集。當細胞外因子與受體結合後，通過一系列胞質蛋白的相互作用激活Wnt信號途徑後，能引起胞內在胞質內積累，當游離的β-catenin進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF形成複合物，與DNA結合，促進靶基因的持續轉錄。靶基因的持續轉錄與細胞的增殖與轉化密切相關。
Wnt具有生長因子的特點如缺乏附加的跨膜區域，有疏水的信號肽，富含保守半胱氨酸片段，具備N端糖基化位點。Wnt通路的下遊靶基因多數是參與細胞增生與凋亡的基因，如cylinD1、c-myc等.越來越多的研究結果表明，Wnt信號通路不僅在胚胎發育、細胞分化和增生過程中起著至關重要的作用，而且與許多人類腫瘤的發生發展也具有密切關係。
1.Wnt和發育生物學Wnt3能明顯協助誘導原條和哺乳動物中結的形成，雖然沒有證據證明Wnt3的表達是中胚層誘導所必須，然而胚胎頭區的形成(非常關鍵的頭部結構)需要Wnt和Bmp4活性的抑制。阻斷Wnt信號通路促進骨髓MSCs進入細胞周期Wnt是1982年第一次被克隆的原癌基因，屬生長因子類，與胚胎發育、腫瘤形成有密切關係。目前研究表明，Wnt信號通過膜上的Frizzled受體和共同受體LRP5、LRP6(脂蛋白相關蛋白受體)進入胞內，然後分為β-catenin信號通路、JNK信號通路、Wnt/Ca2+通路3條信號途徑。在β-catenin信號通路中，激活的下遊信號匯集橋梁分子，抑制糖原合成酶激酶(GSK3)，啟動分化和增殖。激活的橋梁分子可激活RhOA，進一步活化JNK，調整細胞骨架；經G蛋白可致細胞內Ca2+釋放，激活磷酸蛋白酶C(PKC)、磷脂酶(PLC)。在胚胎發育中，Wnt啟動了器官形成和幹細胞分化。成人骨髓MSCs從體內分離出後，往往經過3-5d的停滯期，隨後進入細胞周期。在停滯期末，細胞自身合成分泌了Wnt信號的抑制分子Dickkopf1。Dickkopf1是在頭部形成中起重要作用的新蛋白家族中一種分泌型蛋白，可拮抗Wnt信號通路，其通過降低細胞內β-catenin水平，阻斷Wnt信號通路途徑，而促進細胞進入細胞增殖周期。
2.Wnt與腫瘤wnt基因家族成員的wnt-1、wnt-3和wnt-10b都是由MMTV誘發小鼠乳腺癌的過程中活化的癌基因.小鼠wnt-1、wnt-2、wnt-3a、wnt-5a、wnt-7基因在體外均具有轉化細胞的能力.目前雖無明確證據表明，wnt基因異常能直接導致人類腫瘤的發生，但已有大量的研究報導顯示二者關係密切.例如，wnt-2在大腸癌發展的多階段都有過度表達；wnt-5a在乳腺癌、大腸癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤中過度表達，在乳腺癌及早期乳腺增生中過度表達更為明顯，因此wnt-5a具有癌基因的某些特性.值得一提的是，還有研究報導，在缺失wnt-5a的膀胱癌細胞系及腎癌細胞系中導入wnt-5a基因可使惡性轉化細胞表型逆轉，說明wnt-5a在泌尿道腫瘤中很可能又是一個抑癌基因.所以，wnt-5a作為一個重要的生長調節基因，在不同的組織細胞中可能發揮不同的生理功能和作用。新研究表明Wnt信號控制了腸內一種特別的帕內特氏細胞的成熟和正確的位置，對抗細菌肽的分泌來說帕內特氏細胞是很重要的。對腸腫瘤細胞的觀察也證實了Wnt信號維持原始細胞和引導細胞成熟的雙重功能，腸腫瘤因原始細胞過度生產而造成，腸腫瘤細胞中也顯示出成熟帕內特氏細胞的特徵。
3.Wnt與神經幹細胞分化幹細胞是一類有潛力分化成各種類型細胞的全能細胞，而一個幹細胞是繼續進行自我擴增還是分化成身體所需的特化細胞類型則需要一個精妙的控制系統。新的研究顯示幹細胞變成一個神經元的決定是由附近星形細胞分泌的Wnt3信號分子控制的。Wnt3是星形細胞分泌出的「勸誘」信號分子。Wnt蛋白形成了一個在許多類型的幹細胞中控制細胞擴增和命運抉擇的高度保守的信號分子家族。研究人員使用基因療法中的分子工具抑制了小鼠大腦中的Wnt3。當添加另外的Wnt3時，神經元的數量增加了。這種增加證明Wnt信號在活性狀態下確實起到重要的作用。
既然很多疾病的發生和發展與Wnt及其調控異常相關，那麼對某些疾病進行治療性幹預是合乎邏輯的。相關的動物實驗也表明，對Wnt的封閉或者活性部位的突變於胚胎發育、腫瘤、神經系統異常等方面的改變，不過到目前為止，尚未見到有關該基因或其表達蛋白用於治療的報導，或者是對該通路的調控進行幹預用於治療的例子。因此，Wnt信號轉導及其調控機理研究對於今後很多疾病的治療具有重要意義。

發明內容
人基因組學研究目前是國際上的熱點，除大規模測序的方法外，還缺少從功能研究開始的高通量篩選具有一定功能的基因的方法。針對這種現狀及現有藥物或試劑的不足，本發明的目的是提供一類新的編碼具有抑制Wnt活化功能的人蛋白的多核苷酸WntIF1、2、3、4、5、6、7、8。
本發明的另一目的是提供這類多核苷酸所編碼的多肽。
本發明的另一目的是提供含有這類多核苷酸的載體，和這類多核苷酸及其載體轉化或轉導的宿主細胞。
本發明的另一目的是提供這類多核苷酸所編碼的多肽的抗體和用於檢測的核酸分子。
本發明的另一目的是提供這類新的多核苷酸在宿主細胞中外源表達抑制Wnt活化的應用。
本發明的另一目的是提供生產這些多核苷酸和其編碼的多肽的方法以及該多核苷酸及其編碼的多肽的用途。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案在本發明的第一方面，提供新穎的分離的多核苷酸，它包含編碼具有抑制Wnt活化的功能的蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列選自(a)與編碼含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16的胺基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；(b)編碼含有與SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16的胺基酸序列有至少70％相似性的胺基酸序列的多肽的多核苷酸(c)與(a)或(b)的多核苷酸互補的多核苷酸。
較佳地，該多核苷酸編碼的多肽具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16。
較佳地，該多核苷酸的序列與選自下組的核苷酸序列有至少85％相似性(a)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15的編碼區序列或全長序列；(b)在遺傳密碼簡併範圍內相應於(a)中提到的序列的至少一個序列；(c)與(a)或(b)中提到的序列互補的序列雜交的至少一個序列。
更佳地，該多核苷酸的序列選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15的編碼區序列或全長序列。
在本發明的第二方面，提供了上述核苷酸所編碼的多肽，它包含具有選自下組中的胺基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16；或與以上任一胺基酸序列具有至少90％以上相似性的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽是具有選自下組的胺基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、 SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞，還提供了被上述多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了與上述多肽特異性結合的抗體，還提供了可用於檢測的核酸分子，它含有上述任一多核苷酸中8-100個連續的核苷酸。
在本發明的第五方面，提供了上述多核苷酸在宿主細胞中外源表達抑制Wnt活化的應用。
在本發明的第六方面，提供了上述多核苷酸和多肽在製備預防和/或治療神經系統的疾病或腫瘤的藥物中的用途。
在本發明地第七方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明中的具有抑制Wnt活化功能的多肽及藥學上可接受的載體。
在本發明的第八方面，提供了一種神經系統疾病或腫瘤的體外檢測方法，利用上述抗體或核酸片段來檢測宿主樣品中的多肽的存在或水平。
本發明的其他方面由於本文的技術的公開，對本領域技術人員而言是顯而易見的。
如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如果從天然狀態中與共同存在的其他物質分開，則為分離純化的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分，既然載體或組合物不是它們的天然環境的成分，這些多核苷酸或多肽仍然是分離的。
如本文所用，「相似性」是指核苷酸或多肽序列比對過程中用來描述檢測序列和目標序列之間相同DNA鹼基或胺基酸殘基順序所佔比例的高低，是一種直接的數量關係，通過部分相同或相似的百分比來度量核苷酸序列或者多肽序列之間相似的程度，此相似性百分比可以通過本領域已有的比對方法來計算，例子有兩兩序列間的比對方法FASTA程序(Pearson，W.R.and Lipman，D.J.1988.Improved tools for biological sequence comparison.Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448)，BLAST程序(Altschul，S.F.，et al.1990 Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215403-410)等，或多序列比對方法CLUSTAL W(CORPET，F.1998 Multiple sequencealignment with hierarchical clustering.Nucleic Acids Res.，1610881-10890)等。同源序列是指從某一共同祖先經趨異進化而形成的不同序列，根據相似性百分比可以判斷比對序列間的同源性。當基因或蛋白質間相似程度很高時，表示它們具有一段共同的進化歷程，從而判斷它們會具有相似的生物學功能。當具有至少50％的相似程度時，比較容易推測檢測序列和目標序列可能是同源序列。較佳地，具有至少70％的相似程度；更佳地，具有至少85％的相似程度；最佳地，具有至少90％的相似程度。而當相似性程度低於20％時，就難以確定或者根本無法確定其是否具有同源性。
本發明的多核苷酸包括其互補鏈可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。如本文所用，「編碼具有誘導細胞凋亡功能的多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。以WntIF1所編碼的多肽為例，編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是遺傳密碼簡併的變異體。如本文所用，「遺傳密碼簡併」是指一個胺基酸有幾個密碼子的現象。例如在本發明中WntIF1所編碼的多肽的遺傳密碼簡併的變異體指編碼具有SEQ ID NO2的多肽的核苷酸，且此核苷酸與SEQ IDNO1所示的編碼區序列有差別。對於其他具有抑制Wnt活化功能的多肽，可依此類推。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，它編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。該多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與本發明所述多核苷酸序列的互補序列雜交且兩個序列間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與此多核苷酸序列的互補序列可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲醯胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好的是在97％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與本發明所述的多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明的多核苷酸序列能用本領域已有的方法獲得。這些技術包括但不局限於(1)通過雜交技術分離DNA序列；(2)人工化學合成DNA序列；(3)通過構建cDNA文庫大規模獲得所需的多核苷酸；(4)PCR擴增技術。
第一種方法是先構建基因組文庫或者cDNA文庫，然後通過分子雜交等技術從基因組文庫或cDNA文庫中篩選出目的基因或序列。當生物基因組比較小時，此方法較易成功；當生物基因組很大時，構建其完整的基因組文庫較困難，再從龐大的文庫中去克隆目的基因的工程量也很大。
第二種方法是按設計好的序列一次合成100-200bp長的DNA片段，再用這些合成的片段組合連接成完整的基因。這種合成長的基因序列的方法的價格十分昂貴。此方法主要用於合成作為引物、接頭等的核酸片段。
第三種方法是用本領域通常的方法構建cDNA文庫，多次測序後，結合生物信息學分析技術(Ota et al.Nat Genet.2004 Jan；36(1)40-5)，大規模獲得目的cDNA克隆。生物信息學分析技術包括但不限於用BLAST或BLAT與已有的公共資料庫比對，如refseq資料庫等；用Phred算法評估測序質量；用計算轉錄起始密碼子ATG的出現概率的ATGpr算法篩選全長cDNA序列等。
第四種方法用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)。用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。本發明優選應用的方法是兩步法通量化RT-PCR技術在混合cDNA文庫中擴增得到大量的cDNA克隆。混合cDNA文庫包括現有的cDNA文庫和腫瘤文庫。
本發明的基因，或者各種DNA片段等核苷酸序列的測定可用常規方法，如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)；也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需要反覆進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。本發明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本發明的多肽可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括具有抑制Wnt活化功能的多核苷酸編碼的人蛋白多肽的片段、衍生物和類似物。術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持與本發明的天然具有抑制Wnt活化功能的人蛋白多肽相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物和類似物可以是(a)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優先保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(b)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(c)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(d)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。
本發明的多肽可以通過常規的重組DNA技術，利用本發明的多核苷酸序列來表達或生產重組的具有抑制Wnt活化功能的蛋白多肽(Science，1984；2241431)。包括以下步驟(1)用本發明的多核苷酸(或其變異體)，或用含有此多核苷酸的表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養步驟(1)得到的宿主細胞；(3)從培養基或細胞中分離、純化所需的蛋白多肽。
本發明中的多核苷酸和多肽優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明也涉及包含本發明所述多核苷酸的載體。本發明中，編碼具有抑制Wnt活化功能的人蛋白多肽的多核苷酸序列可以插入到重組表達載體中。術語「重組表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒，如腺病毒、逆轉錄病毒，或者其他載體。在本發明中適用的載體可以是原核表達載體，也可以是真核表達載體，如在細菌中表達的基於T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)，在哺乳動物細胞中高表達的真核表達載體pcDNATM3.1/myc-hisB(-)(Invitrogen)，pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，以下縮寫為pcDT)。本發明優選pcDT，它可以直接與PCR產物連接來構建真核表達載體，大大提高了規模化生產的效率。只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以應用。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。用本領域的技術人員熟知的方法來構建含有本發明所述多核苷酸序列和轉錄/翻譯控制信號的表達載體即可。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組DNA技術等(Sambrook，et al.MolecularCloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。
本發明的多核苷酸序列可有效地連接到表達載體中的適當的啟動子上來指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。表達載體優選的包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性、或真核細胞培養用的綠色螢光蛋白(GFP)、新黴素抗性及二氫葉酸還原酶。
本發明還涉及用上述載體或者本發明的多核苷酸經基因工程產生的宿主細胞。本發明的載體和多核苷酸可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達具有抑制Wnt活化功能的蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞；293T、Hela細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常有10-300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。例子有在複製起始點下遊的100-270個鹼基對的SV40增強子、在複製起始點下遊的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域的普通技術人員都知道如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主細胞為原核細胞如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收集，用CaCl2法處理，所用步驟是本領域眾所周知的。可供選擇的是MgCl2處理，也可用電穿孔的方法處理。當宿主是真核細胞時，可選擇以下轉染方法磷酸鈣共沉澱法、常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。獲得的轉化子可以用常規方法培養，來表達本發明的多核苷酸所編碼的多肽。根據所選的宿主細胞選擇合適的常規培養基，在適於宿主細胞生長的條件下培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用適當的方法如溫度轉化或化學誘導，來誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
上述方法中的重組多肽可包被於細胞內、細胞外或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其他特性通過各種分離方法分離和純化重組多肽。這些方法是本領域技術人員所熟知的，如常規的復性處理，用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析和其它各種液相層析技術或這些方法的結合。
本發明還涉及與本發明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含有15個核苷酸，較好的是至少30個核苷酸，更好的是至少50個核苷酸，最好的是至少100個核苷酸。此核酸片段通常是在本發明的核苷酸序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。上述核酸片段可以用於PCR擴增技術(如作為引物)以確定和/或分離編碼具有抑制Wnt活化功能的多核苷酸；也可以作為雜交所用的探針。也可以用於RNA幹擾技術。本發明的多核苷酸的一部分或全部也可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA晶片上，用於分析組織中基因的差異表達和基因診斷。探針的標記可用放射性同位素，螢光素或酶(如鹼性磷酸酶)等。
本發明的多肽可以直接作為藥物治療疾病，如神經系統疾病和腫瘤等；還可用於篩選促進或對抗具有抑制Wnt活化的功能的蛋白的抗體、多肽或其它配體，例如，篩選可用於促進或抑制本發明的蛋白的功能的抗體。用表達的重組的本發明的蛋白來篩選多肽庫，用於尋找有治療價值的能夠促進或抑制本發明的蛋白的功能的多肽分子。
本發明的多肽可以單獨使用或者與合適的藥物載體組合後使用。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑及不影響藥物效果的載體和賦型劑。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩衝液、甘油及它們的組合。藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。給藥於患者的用量取決於許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。
本發明的多肽也可以通過在活體表達這些多肽來使用。例如患者的細胞可以通過在體外用編碼本發明多肽的基因進行基因工程操作，然後將工程細胞提供給患者，使工程細胞在體內高表達這種多肽，從而達到治療的目的。
具有抑制Wnt活化功能的人蛋白的多核苷酸也可用於多種治療目的。可用在基因治療技術中來治療由於具有抑制Wnt活化的功能的人蛋白表達異常或活性異常導致的疾病。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的具有抑制Wnt活化的功能的人蛋白，來抑制內源性的具有抑制Wnt活化功能的人蛋白的活性。重組的具有抑制Wnt活化功能的人蛋白基因也可包裝到脂質體中轉移至細胞內。
抑制本發明多肽mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酸也在本發明的範圍之內。反義RNA和DNA以及核酸可用本領域已有的方法合成。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷間的連接用磷酸硫酯鍵或肽鍵。
本發明的多肽及其片段、衍生物、類似物或表達它們的細胞可以作為抗原來生產抗體。這些抗體包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的抗體。本發明的多肽的抗體可用本領域公知的抗體製備方法來生產。例子有單克隆抗體可用雜交瘤技術生產(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。多克隆抗體的生產可用本發明的多肽免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑。將人恆定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已有的技術產生(Morrison etal.PNAS，1985，816851)。單鏈抗體也可用已有的技術生產(U.S.Pat No.4946778)。
本發明的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活體標本中的具有誘導細胞凋亡功能的蛋白。還可以在臨床上用於與具有誘導細胞凋亡功能的人蛋白相關的疾病的臨床診斷、治療、療效評價等。例如用放射性同位素標記與本發明的多肽結合的單克隆抗體，然後注入體內跟蹤其位置和分布，可以作為一種非創傷性診斷方法來定位腫瘤細胞，或判斷腫瘤細胞是否轉移。本發明中的抗體還可以用於治療或預防與具有抑制Wnt活化功能的人蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷具有抑制Wnt活化功能的人蛋白的產生或活性。
本發明還涉及定量和定位檢測具有抑制Wnt活化功能的蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。實驗中檢測的具有抑制Wnt活化功能的蛋白水平，可以用作解釋具有抑制Wnt活化功能的蛋白在各種疾病中的重要性和用於診斷具有抑制Wnt活化功能的蛋白起作用的疾病。
具有抑制Wnt活化功能的蛋白的多核苷酸可用於具有抑制Wnt活化功能的蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，具有抑制Wnt活化功能的蛋白的多核苷酸可用於檢測具有抑制Wnt活化功能的蛋白的表達與否，或在疾病狀態下具有抑制Wnt活化功能的蛋白的異常表達。如具有抑制Wnt活化功能的蛋白的DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷具有抑制Wnt活化功能的蛋白的表達異常。雜交技術是本領域已公開的成熟技術，包括Southern印跡法、Northern印跡法、原位雜交等，相關的試劑盒可以從商業途徑獲得。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA晶片上，用於分析組織中基因的差異表達和基因診斷。用具有抑制Wnt活化功能的蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)體外擴增也可以檢測具有抑制Wnt活化功能的蛋白的轉錄產物。
檢測具有抑制Wnt活化功能的蛋白基因的突變也可用於診斷具有抑制Wnt活化功能的蛋白相關的疾病。具有抑制Wnt活化功能的蛋白基因的突變形式包括與正常野生型的具有抑制Wnt活化功能的蛋白的DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用本領域已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Westen印跡法可間接判斷基因有無突變。
基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8在實驗中所有用到的正常組織、胎兒組織、腫瘤組織中都有表達，說明其為人體自身重要的Wnt影響因子；在不同的組織中表達量高低有差別，說明其在不同的組織中發揮功能的程度不同。
以下對本發明的實施方案進一步詳細說明。
本發明通過對NCBI的refseq資料庫進行人功能未知預測基因檢索，獲得人未知功能基因序列，進一步利用Human_est資料庫通過BLASTn方法進行序列校正，根據校正後得到的序列設計基因特異引物，從混合人組織cDNA文庫中通過兩步法通量化RT-PCR技術擴增得到目的基因的編碼區cDNA片段。此編碼區cDNA片段與pcDT重組構建真核表達載體。然後採用雙螢光素酶報告基因法檢測WntIF1、2、3、4、5、6、7、8基因對Wnt的影響。該方法採用的是體內信號轉導途徑順式報導系統，其中所用的Wnt-luc報告質粒載有螢火蟲螢光素酶基因，該基因的表達由合成的啟動子所調控，其中包含基本的啟動子元件(TATA box)，以及轉錄因子Wnt的結合位點，Wnt-luc報告質粒的結構圖如圖2所示。當細胞內的Wnt通過某種信號轉導途徑而被活化時，Wnt便會結合於報告質粒Wnt-luc的增強子元件，從而啟動報告基因螢火蟲螢光素酶基因的轉錄，進一步胞內翻譯成螢光素酶，導致細胞內螢光素酶數量增加，活性增強；相反，當細胞內的Wnt活化受到抑制的時候，螢光素酶的表達量及活性就低。所以，通過檢測螢光素酶的活性，便可以反映不同刺激物以及共轉染的目的基因對細胞內Wnt是否具有促進活化或者抑制活化的功能。pRL-SV40報告質粒載體如圖2所示，含有水母螢光素酶基因，該基因的表達由猿猴病毒40(SV40)增強子/啟動子所調控，轉染哺乳動物細胞後可以產生較強的基本水平的水母螢光素酶的表達，且表達的活性不受Wnt活化與否的調節，所以在實驗中用作內對照報告基因。實驗表明本發明的多肽具有顯著、穩定的抑制Wnt活化的作用。
由於採用了以上技術方案，本發明具有如下優點1、提供了規模化克隆和篩選新基因的技術平臺。
2、提供了人類新功能基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8的cDNA序列及其編碼多肽；3、首次發現人類新功能基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8具有抑制Wnt活化的作用，並且高效、穩定；4、WntIF1、2、3、4、5、6、7、8在機體多數正常細胞表達，說明其為自身重要的Wnt調控分子。
5、基於上述的4個優點，本發明為進一步研究WntIF1、2、3、4、5、6、7、8與Wnt之間的調控關係，以及開發治療與神經系統相關疾病或腫瘤的新藥物，為開創新的臨床診斷、療效評價及預後指標奠定必要的基礎。


圖1、真核表達載體pcDT-WntIFx的構建示意圖(x選自1、2、3、4、5、6、7、8之一)。
圖2、pWnt-luc螢光素酶基因報告質粒的結構圖(2A)和pRL-TK報告質粒結構圖(2B)。
圖3、WntIF1、2、3、4、5、6、7、8外源表達抑制氯化鋰對Wnt的活化具體實施方式
下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。這些實施例和附圖僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等箸，科學出版社)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1、兩步法通量化RT-PCR技術擴增目的基因(1)對NCBI的refseq資料庫進行人功能未知預測基因檢索，獲得人未知功能基因序列，並利用Human_est資料庫通過BLASTn方法進行序列校正，最終得到的序列設定為下組序列SEQID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15。根據此類序列設計基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8的特異引物

(2)用上述引物，按目的基因的表達譜在現有的cDNA文庫和腫瘤文庫中選擇模板，進行初擴。現有的文庫包括12種人體正常組織(心、胰、睪丸、卵巢、前列腺、結腸、小腸、骨骼肌、胸腺、淋巴結、扁桃體、白細胞)；6種人腫瘤組織(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、乳腺癌)；和8種胎兒組積(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎腎、胎腦、胎骨骼肌、胎胸腺)的cDNA文庫(Clonetch，K1420-1，1241-1)。初擴反應條件如下
50μlPCR反應

PCR延伸時間根據所擴目的基因的最長片段，按50sec/Kb的原則進行擴增

初擴產物純化到30μl，以去除PCR反應體系中大量的引物及dNTPs等，並濃縮整個體系，得到對應目的基因序列的二級擴增庫，作為二擴(大擴)的模板。
(3)將(2)中的純化產物作為模板，分別對每個目的基因進行二擴，反應條件如下50μlPCR(每個基因)反應

PCR延伸時間根據所擴目的基因的最長片段，按50sec/Kb的原則進行擴增

得到的PCR產物取10μl上樣電泳，挑選有擴增條帶的PCR產物，進行等體積純化(40μl)。通過兩步PCR反應擴增出非單一條帶的基因用Qiagen膠回收試劑盒切膠回收目的片段。擴增的結果表明，這些組織的細胞中都存在基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8的cDNA，說明WntIF1、2、3、4、5、6、7、8在這些組織的細胞中都產生了基因WntIF1、2、3、4、5、6、7、8的轉錄產物，有較廣的表達圖譜，在多種組織中參與轉錄因子的調節。
實施例2、目的基因真核表達載體的構建將二擴純化產物和真核表達載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，縮寫為pcDT)，按照試劑盒製造廠商建議的條件進行連接反應。連接產物電擊法轉化大腸桿菌DH5α，轉化物在含氨苄青黴素的固體LB平板培養基上生長，挑選生長的單一克隆菌落，提取質粒，用EcoRI酶切，酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳鑑定，挑選有插入片段的陽性克隆，通過測序(ABI PRISM 3700 DNA分析儀)選出正確的正向插入克隆，各自命名為pcDT-WntIF1、2、3、4、5、6、7、8。
同時收集培養液，用SDS-PAGE分析沉澱蛋白，獲得WntIF1、2、3、4、5、6、7、8多肽。
WntIF1、2、3、4、5、6、7、8蛋白分析結果顯示WntIF1、2、3、4、5、6、7、8蛋白序列如下組序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO10、SEQID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16所示。
實施例3、雙螢光素酶報告基因法測定目的基因對氯化鋰誘導Wnt活化的抑制作用。
用目的基因和報告基因pWnt-luc，pRL-TK共轉染人胚胎腎293T細胞，通過分別檢測兩種螢光素酶活性來測定Wnt的活性。共轉染的方法為陽離子非脂性轉染法，採用威格拉斯生物技術(北京)有限公司，按產品說明書所述進行。
轉染操作步驟如下(1)細胞培養將293T細胞(ATCC NumberCRL-11268)(2.0×104)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養基(Hyclone，SH0022.02)鋪在96孔細胞培養板(Costar，3599)上，接種密度1.2萬/孔，培養基體積100ul/孔，在5％CO2，37℃的培養箱中培養18-24小時。
(2)製備轉染複合物取2.5μl生理鹽水稀釋40ng報告基因pWnt-luc，4ng pRL-TK和50ng目的質粒，緩慢混合均勻；同樣用2.5μl生理鹽水稀釋適當量的vigofect(一般為0.04μl/孔)，緩慢混合均勻，在室溫下放置5分鐘，與稀釋的DNA緩慢混合，室溫放置15分鐘，以形成轉染複合物。
(3)轉染將轉染複合物緩慢滴入細胞培養板(5μl/孔)，輕微搖勻。5％CO2，37℃的培養箱中培養18-24小時。
轉染18-24小時後用氯化鋰(1mM，2μl/孔)刺激細胞，37℃孵箱培養。6-8小時後棄去培養液，加入Passive Lysis Buffer(Promega，E1960)，放入-80℃冰箱。檢測時，取出細胞板，室溫下自然解凍，使細胞完全裂解，10μl細胞裂解液移至白色螢光板，加入Dual-luciferase雙報告系統檢測底物，用微孔板酶標儀(Genios Pro，Tecan)檢測螢光素酶活性。
設定轉染pcDB空載體、氯化鋰刺激時細胞內的螢光素酶活性比值(螢火蟲螢光素酶螢光強度/水母螢光素酶螢光強度表示)為1，其他條件下細胞內的螢光素酶活性比值以此為標準，用相對值表示。結果參照圖3，分別用待檢質粒和pWnt-luc共轉染293T細胞，用氯化鋰刺激的293T細胞中螢光素酶的活性明顯地下調，表明WntIF1、2、3、4、5在293T細胞中的表達產物對氯化鋰誘導Wnt活化有強的抑制作用。
根據以上實驗結果可以確定，當Wnt表達水平的上調引起與某些疾病相關基因的轉錄表達相應增加時，WntIF1、2、3、4、5、6、7、8對Wnt活化的抑制作用可以阻止該疾病的發生和發展。因此，本發明可以用於製備預防和治療由於Wnt過表達而引起的神經系統疾病或腫瘤的藥物。
實施例4、抗體製備抗原選用原核細胞或真核細胞表達的WntIF1、2、3、4、5、6、7、8蛋白全長或部分肽段，也可以合成多肽作為抗原。
多克隆抗體的製備免疫動物選用成年雄性紐西蘭兔或BALb/c小鼠，初次免疫用200ug(紐西蘭兔)或20ug(BALb/c小鼠)抗原與等體積弗氏完全佐劑(FCA)充分乳化後，於背部皮下多點注射。初次免疫後21、42、63天，用弗氏不完全佐劑(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加強免疫1次，用量同前。每次免疫後7~10天，ELISA方法檢測血清效價，達到1×10-4時，放血分離血清.Western blot鑑定抗體特異性。
單克隆抗體製備免疫BALb/c小鼠同前，取脾臟製成B細胞懸液，與對數生長期的骨髓瘤細胞SP2/0融合，通過HAT(H次黃嘌呤；A氨基喋呤；T胸腺嘧啶核苷)選擇性培養，獲得雜交細胞系，再通過ELISA方法檢測抗體效價，篩選出特定的雜交瘤細胞系，並得到單克隆抗體。
序列表110北京諾賽基因組研究中心有限公司120抑制Wnt活化的多核苷酸及其編碼多肽和用途130
16016170PatentIn version 3.321012111242212DNA213人220
221CDS222(176)..(1105)4001cgtgagtgcc gctgacagaa gtcaagagaa tcggctggga cggggttggg gcgacaacgg 60gccggggggg acccgacagg ccagagcccc ttggggagga gcggcggctg gaggcgcgag120gctcctccgg atgcccggag agccgcttgc gacttaactc ccgcctcttt cccag atg 178Met1ccg cgt cac tgc tcc gcc gcc ggc tgc tgc aca cgg gac acg cgc gag 226Pro Arg His Cys Ser Ala Ala Gly Cys Cys Thr Arg Asp Thr Arg Glu5 10 15acg cgc aac cgc ggc atc tcc ttc cac aga ctt ccc aag aag gac aac 274
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aca gac aag gca gac gcc ctg cac cag cag cac gag tct ctg gaa aaa 258Thr Asp Lys Ala Asp Ala Leu His Gln Gln His Glu Ser Leu Glu Lys40 45 50gac aac ctc gcc ctg cgg aag gag atc cag tcc ctg cag gcc gag ctg 306Asp Asn Leu Ala Leu Arg Lys Glu Ile Gln Ser Leu Gln Ala Glu Leu55 60 65 70gcg tgg tgg agc cgg acc ctg cac gtg cat gag cgc ctg tgc ccc atg 354Ala Trp Trp Ser Arg Thr Leu His Val His Glu Arg Leu Cys Pro Met75 80 85gat tgt gcc tcc tgc tca gct cca ggg ctc ctg ggc tgc tgg gac cag 402Asp Cys Ala Ser Cys Ser Ala Pro Gly Leu Leu Gly Cys Trp Asp Gln90 95 100gct gag ggg ctc ctg ggc cct ggc cca cag gga caa cat ggc tgc cgg 450Ala Glu Gly Leu Leu Gly Pro Gly Pro Gln Gly Gln His Gly Cys Arg105 110 115gag cag ctg gag ctg ttc cag acc ccg ggt tcc tgt tac cca gct cag 498Glu Gln Leu Glu Leu Phe Gln Thr Pro Gly Ser Cys Tyr Pro Ala Gln120 125 130ccg ctc tct cca ggt cca cag cct cat gat tct ccc agc ctc ctc cag 546Pro Leu Ser Pro Gly Pro Gln Pro His Asp Ser Pro Ser Leu Leu Gln135 140 145 150tgc ccc ctg ccc tca ctg tcc ctt ggc ccc gct gtg gtt gct gaa cct 594Cys Pro Leu Pro Ser Leu Ser Leu Gly Pro Ala Val Val Ala Glu Pro155 160165cct gtc cag ctg tcc ccc agc cct ctc ctg ttt gcc tcg cac act ggt 642Pro Val Gln Leu Ser Pro Ser Pro Leu Leu Phe Ala Ser His Thr Gly170 175 180
tcc agc ctg cag ggg tct tcc tct aag ctc agt gcc ctc cag ccc agc 690Ser Ser Leu Gln Gly Ser Ser Ser Lys Leu Ser Ala Leu Gln Pro Ser185 190 195ctc acg gcc caa act gcc cct cca cag ccc ctc gag ctg gag cat ccc 738Leu Thr Ala Gln Thr Ala Pro Pro Gln Pro Leu Glu Leu Glu His Pro200 205 210acc aga ggg aag ctg ggg tcc tct ccc gac aac cct tcc tct gcc ctg 786Thr Arg Gly Lys Leu Gly Ser Ser Pro Asp Asn Pro Ser Ser Ala Leu215 220 225 230ggg ctt gca cgt ctg cag agc agg gag cac aaa cct gct ctc tca gca 834Gly Leu Ala Arg Leu Gln Ser Arg Glu His Lys Pro Ala Leu Ser Ala235 240 245gcc act tgg caa ggg ctg gtt gtg gat ccc agc cct cac cct ctc ctg 882Ala Thr Trp Gln Gly Leu Val Val Asp Pro Ser Pro His Pro Leu Leu250 255 260gcc ttt cct ctg ctc tcc tct gct caa gtc cac ttc taa cctggtcttc 931Ala Phe Pro Leu Leu Ser Ser Ala Gln Val His Phe265 270ggagctgggt tggccccttc tttgggctca ggaagcagcc ttagcacacg ggcctctcct991ccctcactac tgggtgctgc cctgcgtggc tgaccagctg gcccaggatt tcacagtcga 1051aaaggaagcc accactgatg cctcccactg tgacaggccc tgtcaccacc aatat11062106211274212PRT213人
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65 70 75gcc ctg gaa gag ctg gcg acc aag aga ttc aag ggg aag agc aag gag 409Ala Leu Glu Glu Leu Ala Thr Lys Arg Phe Lys Gly Lys Ser Lys Glu80 85 90gag gcc ttc gat gcc atc tgc cag ctg gtg gca ggc aaa gag cca gcc 457Glu Ala Phe Asp Ala Ile Cys Gln Leu Val Ala Gly Lys Glu Pro Ala95 100 105aat gtg ggc gtc act aaa gca aaa aca ggg ggt gct gta gac cgg ctg 505Asn Val Gly ValThr Lys Ala Lys Thr Gly Gly Ala Val Asp Arg Leu110115 120 125acg gac acc agc aga tac acg ggc tcc cac aag gag cgc ttc gat gag 553Thr Asp Thr Ser Arg Tyr Thr Gly Ser His Lys Glu Arg Phe Asp Glu130 135 140agc ggc aag ggc aag ggc att gcg gga cgg cag gac atc ctg gac gac 601Ser Gly Lys Gly Lys Gly Ile Ala Gly Arg Gln Asp Ile Leu Asp Asp145 150 155agt ggc tac gtg agc gcc tac aag aat gca ggc acc tac gat gcc aag 649Ser Gly Tyr Val Ser Ala Tyr Lys Asn Ala Gly Thr Tyr Asp Ala Lys160 165 170gtg aag aag tga ggcttgggaa gaccgccctg ccaagtgcgg ctgcccctgc 701Val Lys Lys175cagaggctca ggcctgggtc taaggggcac gtggagcaag agatcctggt cccctccctg 761ctggacctgc cacccagagc ttcctgccta gtcccactgg gctggcccac caggcctctg 821acccaggctg ctctgcggcc ccttcctcct cctcttcctg ctccaacttc tgtccacctg 881
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210152111637212DNA213人220
221CDS222(273)..(995)40015ccgggaaccg aacccgatgg agaggagggg gcccccatgg atttaggggg ggaggggaaa 60gtcatggggg ggcacccccc cggaacccct ttcccaggcg cgcgttctcc gctgaaagag 120gctcagagag acactttctc cgggatctta agtgtggggg ctgctggctg gggggcccgt 180ccggcccaac gccggaggct tggaaaagag agttagcagc gggagcggac tacgtgccgg 240gccatggccc ttctgcccgg gccctggcca ca atg acc tct ttg ccc tgc ccc 293Met Thr Ser Leu Pro Cys Pro1 5ctc ccc ggc cgg gac gcc tcc aaa gct gtc ttc cca gac ctc gcc cct 341Leu Pro Gly Arg Asp Ala Ser Lys Ala Val Phe Pro Asp Leu Ala Pro10 15 20gtc ccg tcg gta gcg gct gcc tac ccg ctt ggc ttg tcc cct aca acc 389Val Pro Ser Val Ala Ala Ala Tyr Pro Leu Gly Leu Ser Pro Thr Thr25 30 35gca gcc tcc ccc aat ttg tcc tac tcc agg ccg tat ggc cac ctc ctg 437Ala Ala Ser Pro Asn Leu Ser Tyr Ser Arg Pro Tyr Gly His Leu Leu40 45 50 55
tct tac ccc tac acc gag cca gcg aac ccc gga gac tcc tac ctg tcc 485Ser Tyr Pro Tyr Thr Glu Pro Ala Asn Pro Gly Asp Ser Tyr Leu Ser60 65 70tgc cag caa ccc gcg gcg ctc tct cag ccc ctc tgc gga cct gca gag 533Cys Gln Gln Pro Ala Ala Leu Ser Gln Pro Leu Cys Gly Pro Ala Glu75 80 85cac cct cag gaa ctc gag gca gac tcg gag aag ccg cgg ctg tcc ccg 581His Pro Gln Glu Leu Glu Ala Asp Ser Glu Lys Pro Arg Leu Ser Pro90 95 100gaa ccc tcc gag cgg cgc cct cag gcc ccc gcc aaa aag ctc cgc aag 629Glu Pro Ser Glu Arg Arg Pro Gln Ala Pro Ala Lys Lys Leu Arg Lys105 110 115ccg agg acc atc tac tcc agc ctg cag ctg cag cac cta aac cag cgt 677Pro Arg Thr Ile Tyr Ser Ser Leu Gln Leu Gln His Leu Asn Gln Arg120 125 130 135ttc cag cac acg cag tac ctg gcg ctg ccc gag agg gcc cag ctg gca 725Phe Gln His Thr Gln Tyr Leu Ala Leu Pro Glu Arg Ala Gln Leu Ala140 145 150gcg cag ctc ggc ctc acc cag acc cag gta aag atc tgg ttt cag aac 773Ala Gln Leu Gly Leu Thr Gln Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn155 160 165aaa cgc tcc aag tat aag aag ctc ctg aag cag aat tct ggg ggg cag 821Lys Arg Ser Lys Tyr Lys Lys Leu Leu Lys Gln Asn Ser Gly Gly Gln170 175 180gaa ggg gac ttc cct ggg agg acc ttc tct gtg tct ccc tgc tcc cca 869Glu Gly Asp Phe Pro Gly Arg Thr Phe Ser Val Ser Pro Cys Ser Pro185 190 195
ccc ctc ccc tcc ctc tgg gat cta ccc aag gca ggg acc ctg ccc acc917Pro Leu Pro Ser Leu Trp Asp Leu Pro Lys Ala Gly Thr Leu Pro Thr200 205 210 215agt ggc tat ggc aac agc ttt gga gcc tgg tat cag cat cac tcc tca965Ser Gly Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Ala Trp Tyr Gln His His Ser Ser220 225 230gat gtc ctg gct tcg cct cag atg atg tga atctggggaa gggcgggtca 1015Asp Val Leu Ala Ser Pro Gln Met Met235 240ggcccacagc cttcctgcaa agcccaggac ccaggcagtc cacctgcacc ccttctgggc 1075tgggaggaaa ccagctccag atgggttttc tctggaggac aagcagttag aggagaaaaa 1135ggaatggagc agagcctgta cccctaaccc taacagctaa atcaaggacc tcagccttat 1195ataatcattg tccccaccac taccatggac tggacacctt cactccagct ggacaaagac 1255tctggagaga gagccattgg ctggagttga gactgtcccc agaacccttg gtcttgccac 1315tcccccactc cttcttccct ctctcccttt ctcctctccc tgctttcttg aaaaggactg 1375aatcgccact acagcctggg tgcaaaatca gcaagaaaca ttgagtattt ttttttcttt 1435gtatgccttt ggccttgcac aacccatttg tgagcaaaag cagaagtgga ccaccatcag 1495ctcccaccca cccagcgatt tttccttgga ggtcagcccg ttacccccat aactgattta 1555cctacttacc atactgggag gtagaagaga tgcagagaaa tgtggaattt gtggacctat 1615gggtaattta tgctttcctc ct 163721016
211240212PRT213人40016Met Thr Ser Leu Pro Cys Pro Leu Pro Gly Arg Asp Ala Ser Lys Ala1 5 10 15Val Phe Pro Asp Leu Ala Pro Val Pro Ser Val Ala Ala Ala Tyr Pro20 25 30Leu Gly Leu Ser Pro Thr Thr Ala Ala Ser Pro Asn Leu Ser Tyr Ser35 40 45Arg Pro Tyr Gly His Leu Leu Ser Tyr Pro Tyr Thr Glu Pro Ala Asn50 55 60Pro Gly Asp Ser Tyr Leu Ser Cys Gln Gln Pro Ala Ala Leu Ser Gln65 70 75 80Pro Leu Cys Gly Pro Ala Glu His Pro Gln Glu Leu Glu Ala Asp Ser85 90 95Glu Lys Pro Arg Leu Ser Pro Glu Pro Ser Glu Arg Arg Pro Gln Ala100 105 110Pro Ala Lys Lys Leu Arg Lys Pro Arg Thr Ile Tyr Ser Ser Leu Gln115 120 125
Leu Gln His Leu Asn Gln Arg Phe Gln His Thr Gln Tyr Leu Ala Leu130 135 140Pro Glu Arg Ala Gln Leu Ala Ala Gln Leu Gly Leu Thr Gln Thr Gln145 150 155 160Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ser Lys Tyr Lys Lys Leu Leu165 170 175Lys Gln Asn Ser Gly Gly Gln Glu Gly Asp Phe Pro Gly Arg Thr Phe180 185 190Ser Val Ser Pro Cys Ser Pro Pro Leu Pro Ser Leu Trp Asp Leu Pro195 200 205Lys Ala Gly Thr Leu Pro Thr Ser Gly Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Ala210 215 220Trp Tyr Gln His His Ser Ser Asp Val Leu Ala Ser Pro Gln Met Met225 230 235 240
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸含有編碼具有抑制Wnt活化的功能的多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列選自(a)與編碼含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQID NO14、SEQ ID NO16的胺基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％相似性的多核苷酸；(b)編碼含有與SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16的胺基酸序列有至少70％相似性的胺基酸序列的多肽的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸互補的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸編碼的多肽具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ IDNO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16。
3.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸的序列與選自下組的核苷酸序列有至少85％相似性(a)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15的編碼區序列或全長序列；(b)在遺傳密碼簡併範圍內相應於(a)中提到的序列的至少一個序列；(c)與(a)或(b)中提到的序列互補的序列雜交的至少一個序列。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸的序列選自SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ IDNO15的編碼區序列或全長序列。
5.權利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽，其特徵在於，所述多肽包含選自下組中的胺基酸序列的多肽SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16；或與以上任一胺基酸序列具有至少90％相似性的多肽；或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
6.權利要求5所述的多肽，其特徵在於，所述多肽具有選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16。
7.一種載體，其特徵在於，所述載體含有權利要求1所述的多核苷酸。
8.一種遺傳工程宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞選自(a)用權利要求7所述的載體轉化或轉導的宿主細胞；(b)用權利要求1所述的多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
9.一種抗體，其特徵在於，所述抗體是能與權利要求5所述的多肽特異性結合的抗體。
10.一種核酸片段，其特徵在於，所述核酸片段含有權利要求1所述的任一多核苷酸中8-100個連續的核苷酸。
11.一種分離的多核苷酸在抑制Wnt活化中的應用，其特徵在於所述多核苷酸選自權利要求1所述的多核苷酸，該多核苷酸在宿主細胞中外源表達會抑制Wnt活化。
12.權利要求1所述的多核苷酸或權利要求5所述的多肽在製備預防和/或治療神經系統疾病或腫瘤的藥物中的用途。
13.一種神經系統疾病或腫瘤的體外檢測方法，其特徵在於，利用權利要求9所述的抗體或權力要求10所述的核酸片段來檢測宿主樣品中的多肽的存在或水平。
全文摘要
本發明公開了一類新的編碼具有抑制Wnt活化的功能的人蛋白的多核苷酸及其編碼的多肽，多肽的抗體。本發明也公開了這類新的多核苷酸在宿主細胞中外源表達對Wnt活化的抑制作用的應用。本發明還公開了所述多肽、抗體在製備預防和治療腫瘤的藥物上的用途。
文檔編號C07H21/00GK1982455SQ20051013452
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月15日 優先權日2005年12月15日
發明者陸陽, 高霞, 鄧唯唯, 馬大龍, 高鵬, 於鵬, 張晨穎, 馬進京, 郭金海, 程華玲, 王欣宇, 王峰, 蔡恬靜, 王平章, 李娜, 童鬱蓉, 石太平 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司