用於生物分子鑑定及表徵的凝膠、方法和儀器的製作方法

2023-09-19 08:50:10

專利名稱：用於生物分子鑑定及表徵的凝膠、方法和儀器的製作方法
1.簡介本發明涉及計算機輔助的方法和儀器，其用於高效及系統地研究存在於生物學樣品中的分子並測定它們在健康和疾病中的作用。尤其是，本發明涉及蛋白質圖(protemics)的成像領域，其包括存在於生物學樣品中的蛋白質的系統鑑定及表徵，其中蛋白質包括糖基化的或展示其它翻譯後修飾的蛋白質。蛋白質圖方法對於鑑定對診斷、預後或監測應答治療的有用之蛋白質以及在鑑定用於疾病預防和治療的蛋白質目標中提供了極大的優點。
2.發明背景在分子遺傳學上的最新進展揭示了用於在特定細胞或組織中核酸表達研究的高通量的測序技術和系統策略的益處。這些進展已經突出了對不依賴操作者的計算機介導的方法的需求，這些方法用於鑑定和選擇來自蛋白質、寡糖及其它生物分子的複雜混合物的子集或個體分子，並分離這種選擇的生物分子用於進一步分析。
用於靶物驅動的藥物發現以及合理的藥物設計的策略需要鑑定在因果關係上涉及疾病過程的關鍵細胞組分，例如蛋白質，以及使用這種組分作為治療幹預的靶物。然而，現在的分析生物分子例如蛋白質的方法耗費時間並且昂貴，而且在檢測、成像、純化及分析方面要受效率低下的困擾。
雖然基因組方法已經推進了我們對生物學過程之遺傳基礎的理解，但有明顯的局限性。首先，鑑定的基因，尤其是部分cDNA序列編碼的產物的功能經常是未知的。其次，有關蛋白質翻譯後修飾的信息很少能從其基因序列的知識推導出，並且現在很明顯大部分蛋白質經歷能夠深刻地影響其生物化學特性的翻譯後修飾(例如糖基化及磷酸化)。第三，蛋白質表達通常受翻譯後控制，所以細胞的mRNA水平不是必定與其基因產物的表達水平相關聯。第四，自動化的核酸隨機測序策略包括在確定其顯示臨床或科學意義(如果有的話)之前大量核酸分子的分析。
因為這些原因，需要補充基因組資料，方法是通過研究蛋白質和碳水化合物的表達模式以及通過對蛋白質、寡糖和其它生物分子的直接分析研究其在生物學或疾病過程中翻譯後修飾的模式。然而，技術上的局限到現在為止已經阻礙了在生物學樣品中蛋白質或其它生物分子的快速、經濟、可重複的系統分析。
3.發明概述本發明涉及用於生物學樣品中生物分子的鑑定、選擇和表徵的高效計算機輔助的方法及儀器。根據本發明，通過分離存在於複雜混合物中的生物分子產生一個二維陣列。本發明提供了一種計算機產生的數位化分布圖，其表示在二維陣列中檢測的多數生物分子的特徵性及相對豐度，籍此允許計算機介導的來自多重生物學樣品分布圖的比較。這種篩選生物學樣品並比較其分布圖的自動化技術，實現了對個體生物分子快速高效的鑑定，這些分子的存在、缺乏或改變的表達與疾病或目標病況相聯繫。這種生物分子可用作治療劑，用作用於治療幹預的靶物以及用作診斷、預後和評價對治療反應的標記。這種技術也實現了快速並高效的鑑定成套的生物分子，其表達模式與疾病或目標病況相聯繫；這些成套的生物分子提供了用於診斷、預後及評價對治療反應標記的圖樣。
本發明的高通量、自動化的方法和儀器進一步實現了根據預先規定標準對個體分離的生物分子(或分離的生物分子的子集)不依賴操作者的選擇，而不需要任何序列信息或生物分子的其它結構特徵的知識。而這又提供了在生物學樣品中檢測的多數所選生物分子的自動化、不依賴操作者的分離以及並行表徵。因此，本發明在測序或結構表徵之前，有利地實現了生物分子的自動化選擇。在一個特定的實施方案中，本發明提供了一種適於生物分子(如蛋白質)電泳的凝膠並且其結合於固體支持物上以使凝膠具有二維空間穩定性，並且支持物基本上不幹擾關於與凝膠中一個或多個生物分子相結合的標記的檢測(例如結合於一個或多個蛋白質的螢光標記)。在另一個特定的實施方案中，本發明提供了一個綜合的電腦程式，該電腦程式通過比較數位化分布圖來選擇在二維陣列中檢測的一個或多個生物分子，並產生指令指導一種機器人裝置從二維陣列中分離這種選擇的生物分子。然而在進一步的實施方案中，這個程序也實現了實驗室信息管理系統(LIMS)，其跟蹤實驗室樣品以及相關的數據例如臨床數據，在樣品上進行的操作和通過分析樣品產生的數據。
4.附圖簡述

圖1是根據本發明特定的實施方案，在不同蛋白質的混合物上進行的操作流程圖。
圖2是闡明在本發明特定的實施方案中依靠計算機執行的功能的流程圖。
圖3是用來從本發明的被支持的凝膠中分離生物分子的機器人裝置的圖解。
5.發明詳述本發明提供了用來快速和有效地鑑定及表徵生物學樣品中生物分子如蛋白質的方法和儀器。在本發明的一個應用中，生物學樣品進行兩個連續的分離步驟。在第一個分離步驟中，生物分子根據一種物理或化學特性被分離，以產生包含生物分子的一維陣列；例如，蛋白質通過等電聚焦沿著第一軸被分離。在第二個分離步驟中，在該一維陣列中的生物分子根據第二種物理或化學特性被分離，以產生一個分離的生物分子的二維陣列；例如，通過等電聚焦分離的蛋白質沿著與第一個軸垂直的第二個軸進行SDS-PAGE。分離的生物分子穩定地保持在二維陣列中以隨後成像。基於對來自成像數據的自動化計算機分析，穩定的二維陣列可保存或存檔一段較長的時期(如數月或數年)，並且選擇的生物分子能在任何要求的時間從陣列中檢索。
對每個檢測的生物分子，通過檢測器對二維陣列成像而產生包含一組x，y坐標及一個信號值的計算機可讀的輸出信號。如需要，在計算機介導的分析之前或之後計算機可讀的輸出信號能夠在顯示器或任何適當的媒介上以計算機產生的圖像顯示給人類操作者。對計算機可讀的輸出信號之計算機介導的分析導致計算機可讀的分布圖，對大多數檢測的生物分子而言它表示每個這種生物分子的相對豐度以及從其在二維陣列中x，y坐標推斷的屬性。例如，來自包含通過等電聚焦後由SDS-PAGE分離蛋白質的凝膠成像的分布圖，顯示了大多數被檢測蛋白質的等電點(pI)、表觀分子量(MW)以及相對豐度。
本發明的計算機可讀的分布圖適於計算機介導的分析來鑑定滿足特定標準的一個或多個生物分子。在一個實施方案中，第一組分布圖與第二組分布圖比較以鑑定在所有第一組分布圖中存在(或以第一組分布圖的第一個百分比)而在第二組分布圖中缺失(或第二組分布圖的第二個百分比缺失，第一和第二百分比可以獨立地指定)的生物分子。在其它實施方案中，比較多組分布圖以鑑定與另一樣品組分布圖的指定百分比相比，在一個樣品組分布圖中存在以指定的較高水平表達的生物分子，或鑑定一個樣品組與另一個樣品組在翻譯後加工中不同的生物分子。
選擇如此鑑定的一個或多個生物分子來進行分離。在一個實施方案中，這種選擇是根據預先規定的編程的標準通過計算機自動進行的，沒有更多的人類幹預。在另一個實施方案中，人類操作者綜合計算機介導的分析結果，然後輸入計算機一個選擇。為分離每個選擇的生物分子，計算機產生指導機器人裝置的機器可讀性指令(a)取出包含選擇的生物分子二維陣列的一個或多個部分並且(b)將取出的部分輸運至一個或多個適當的容器用於進一步表徵。例如，可以分析選擇的蛋白質以確定其全部或部分的胺基酸序列，以檢測並表徵任何結合的寡糖部分，以及研究翻譯後加工的其它方面，例如磷酸化、十四烷基化等等。本發明有利地實現了從二維陣列取出生物分子的自動化並行步驟，從而促進許多選擇的生物分子快速及有效的表徵。圖一表示根據本發明的一個特定實施方案，一個樣品的圖解處理的流程圖。
本發明可用於鑑定及分析蛋白質，但是一般地更適於鑑定及分析任何生物分子。如在此使用的，術語「生物分子」指的是存在於生物學樣品中的任何有機分子，並包括肽、多肽、蛋白質、寡糖、脂類、類固醇、前列腺素、前列環素以及核酸(包括DNA和RNA)。如在此使用的，術語「蛋白質」包括糖基化的及非糖基化的蛋白質。5.1.生物學樣品如在此使用的，術語「生物學樣品」指的是從任何活生物體排洩或分泌物中獲得的任何固體或液體樣品，包括單細胞微生物(例如細菌和酵母)以及多細胞生物(例如植物和動物，如脊椎動物或哺乳動物，尤其是健康或表面上健康的人或由將被診斷或調查的病情或疾病侵襲的人類患者)。生物學樣品可以是從任何部位(例如血液、血漿、血清、尿液、膽汁、腦脊液、含水的或玻璃樣體液，或任何身體分泌物)獲得的生物學液體，滲出液，分泌液(例如從膿腫或任何感染或發炎的其它部位獲得的液體)，或從關節(例如正常的關節或被疾病例如風溼性關節炎、骨關節炎、痛風或膿毒性關節炎侵襲的關節)獲得的液體。另外，生物學樣品可從任何器官或組織(包括活組織檢查或屍體解剖樣品)獲得，或從包括細胞(無論是原代的或培養的細胞)或被任何細胞、組織或器官決定的介質中獲得。如需要，生物學樣品可以經過初步加工，包括初步分離技術。例如，可以提取細胞或組織並進行亞細胞分級分離，用來在特定的亞細胞部分分離分析生物分子，例如在細胞的不同部分發現的蛋白質或藥物。見Deutscher(編)，1990，酶學方法(Methods InEnzymology)182卷，147-238(在此引入其全部以供參考)。類似地，可以進行免疫沉澱以鑑定抗原相關的生物分子，例如蛋白質。見Firestone和Winguth在Duetscher中，出處同前，688-699(在此引入其全部以供參考)。
優選地，對分析有用的相關臨床信息依相應的樣品按目錄分類並編為索引；基於計算機的實驗室信息管理系統(LIMS)優選地用於此目的。這種信息優選地包括患者資料例如家族史、臨床診斷、性別、年齡、民族、居住地、工作地以及病史。在LIMS中，涉及樣品本身的信息也優選地編入索引；這種信息可包括樣品類型、取樣的精確位置、取樣品的日時、採集與保存之間的時間、保存的方法及獲得樣品使用的方法。
將信息記錄索引到適合的樣品的方法可以包括對記錄和樣品分配匹配的編號。優選地通過使用條形碼和條形碼掃描器使這個過程自動化。處理每個樣品時，掃描器用於將樣品鑑定號碼記錄進LIMS，通過其不同操作追蹤樣品，因而在記錄和樣品之間保持連結。條形碼的使用同樣實現了自動歸檔並檢索保存的樣品及凝膠。5.2.蛋白質分析在一個實施方案中，使用本發明的方法及儀器鑑定並表徵在生物學樣品中的一個或多個蛋白質。5.2.1.第一步分離對那些本領域的技術人員來說，很多種分離蛋白質的技術是眾所周知的，見例如，Deutscher(編)，1990，酶學方法182卷，9-18頁和285-554頁(在此引入其全部以供參考)，並可根據本發明進行應用。以舉例方式但並不限於此，蛋白質可以基於等電點(例如通過層析聚焦或等電聚焦)、基於電泳遷移率(例如通過非變性電泳或通過在變性劑如尿素或十二烷基硫酸鈉(SDS)存在情況下，在有或沒有提前經還原劑例如2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇處理的電泳)，通過在任何合適的基質上的包括FPIC和HPIC的層析(例如凝膠過濾層析，離子交換層析，反相層析或親和層析，例如帶有固定化抗體或凝集素)，或通過離心(例如等密度離心或速度離心)分離。
任何分離技術，包括上面列舉的任何技術，可以用於第一步分離。在一個實施方案中，第一步分離導致一個不連續的一維陣列(例如在親和層析中收集的級分)。更優選地，第一步分離導致連續的一維陣列；特別優選的是在配有合適電解質的聚丙烯醯胺條形凝膠中的等電聚焦。5.2.2.第二步分離第二步分離應用一種不同於在第一步分離中使用的分離技術，產生一個分離蛋白質的二維陣列。在任何介質中可使用任何分離技術(包括上文列舉的那些)只要(a)所得的生物分子(例如蛋白質)的二維陣列可以成像以檢測在分離介質中許多生物分子的物理位置，並且(b)一個或多個選擇的生物分子可以從進行第二步分離的介質中分離。在一個優選的實施方案中，第二步分離在凝膠如聚丙烯醯胺平板凝膠中應用電泳；特別優選的是在十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。如果第一步分離導致不連續的一維陣列，一維陣列的組分(或其等分樣品)經受第二種分離技術。例如來自親和層析的等分樣品上樣於進行SDS-PAGE的聚丙烯醯胺凝膠孔中。如果第一步分離導致連續的一維陣列，那麼該陣列(或其部分)再經過第二種分離技術。例如通過等電聚焦將包含沿著第一軸分離的蛋白質的帶狀凝膠加樣於聚丙烯醯胺平板凝膠，用於沿著與第一軸垂直的第二軸進行SDS-PAGE。5.2.3.被支持的聚丙烯醯胺凝膠本發明的一個方面是適用於電泳中的被支持的凝膠，其中凝膠穩固地結合於固體支持物上以便凝膠具有二維空間穩定性，此支持物是堅硬的並基本上不幹擾結合或以其它方式聯結凝膠中的一個或多個生物分子的標記的有關檢測。優選地，支持物基本上不幹擾螢光標記的有關檢測；玻璃支持物適用於此目的，因為玻璃不象塑料，缺乏損害或阻礙螢光成像的光學活性。
由於凝膠與固體支持物間穩固的結合，現在凝膠的一個或多個部分可以移開(例如通過切除)而不伴有凝膠剩餘部分的位置移動，或只有最小限度的變形，因此在操作及保存期間保持了分離蛋白質二維陣列的完整性；優選地，凝膠共價結合於固體支持物上。在成像確定分離蛋白質的x，y坐標之後，一個或多個部分的包含所選蛋白質的被支持的凝膠可以被移開用於進一步分析，而剩餘的蛋白質穩定地保持於先前成像位置，如需要可隨後移開。本發明被支持的凝膠代表了在促進分離生物分子精確的、可重複的切除及分離的生物分子的分離方面的主要進展。此外，被支持的凝膠可條形碼化以提供在原始樣品的特徵性與分離的生物分子二維陣列之間不可分離的連結；這種連結可以使用本發明的LIMS來保持。
為製備被支持的凝膠，固體支持物可以被功能化，例如用雙功能連結物如γ-異丁烯醯基氧基丙基三甲氧基矽烷；然後將凝膠澆注在功能化的支持物上。在一個優選的實施方案中，支持物通常是平板(如通常的平板玻璃)；特別優選的是平直薄板玻璃。如需要，可以在例如低溫(如在4℃、-20℃或-70℃)保存被支持的凝膠。保存的適當方法在1997年7月9日提交的國際專利申請號PCT/GB97/01846中描述，在此引入其全部以供參考。對於有些操作(例如凝膠一個或多個部分的切除)，外露的被支持的凝膠是優選的；對其它的操作(例如電泳)，凝膠可任選地夾在凝膠穩定結合的第一個固體支持物(例如用雙功能連結物處理的玻璃板)與凝膠不穩定結合的第二個固體支持物(例如未處理的玻璃板或經矽烷化劑處理的玻璃板)之間。5.2.4.分離蛋白質的檢測二維陣列中的蛋白質可用任何期望的技術檢測。在一個實施方案中，如本領域內眾所周知的，聚丙烯醯胺凝膠中的蛋白質用適當的染料(例如考馬斯蘭或螢光染料)或通過適當染色技術(例如銀染)標記。在一個優選的實施方案中，聚丙烯醯胺凝膠中的蛋白質通過將凝膠用染料浸漬來標記，其中當染料結合或接觸到蛋白質時，其變為螢光活性或改變其螢光特性，從而避免了在成像之前清除未結合染料的需要；Sypro Red(Molecular Bioprobes，Inc.，Eugene，俄勒岡州)適用於此目的。在另一個實施方案中，蛋白質可以通過將凝膠用抗體、凝集素或其它適當的配體浸漬來標記，這些配體與報告部分例如放射性核素、酶，或結合生物素的品種聯結；清除未結合的抗體、凝集素或其它配體後，報告物可以用任何適當的技術檢測。在進一步的實施方案中，蛋白質在分離之前被放射標記，例如用任何適當的放射性核素通過新陳代謝標記(例如氚，一種硫的放射性核素或碳的放射性核素)或用任何適當的放射性核素(例如放射性碘)通過化學或酶法標記。在又一實施方案中，蛋白質被電轉移到適當的膜上形成一個二維陣列的複製品，將它用與報告部分聯結的抗體、凝集素或其它適當配體探查；這種Western印跡技術在本領域內是眾所周知的。
標記的蛋白質用任何能夠檢測所用的報告物(例如通過光密度測定法或光譜法、或通過檢測螢光或放射活性)並產生計算機可讀輸出信號的檢測器成像。在一個實施方案中，檢測器是雷射螢光掃描儀，其中旋轉鏡面沿著第一軸沿著凝膠掃描雷射束，而凝膠沿著與第一軸垂直的第二軸前進。這種掃描儀中凝膠沿直線傳送，穿過連續的掃描雷射，使凝膠能夠從箱中(例如染色箱)被自動地加載於傳送機件，掃描並在掃描完成後自動密封，從而提高凝膠的通過量並減少手工處理。優選地，由凝膠發出的螢光進入波導並傳送至光電檢測器例如光電倍增管。在一個實施方案中，雷射束從旋轉鏡面沿著與凝膠平行的平面傳播直至達到第二個弓形鏡面，其以直角反射雷射到凝膠。由於弓形鏡面，雷射束的路徑長度保持恆定而凝膠被從一邊到另一邊掃描。恆定的路徑長度促進了相位敏感的檢測，其中雷射束的振幅是循環調製的；由蛋白質染料複合物(信號)發出的螢光信號顯示了用於區分信號與背景螢光(幹擾)的相位移，在背景螢光中沒有觀察到相位移(或較小的相位移)。這種雷射螢光掃描儀在Basiji，1997，應用內部反射光學及相敏感檢測的高通量螢光掃描儀的進展(博士論文，University of Washington，Seattle，WA)中描述，在此引入其全部以供參考。
需要提供一個或多個由成像裝置可檢測的參照點，用於確定在分離的蛋白質的二維陣列中檢測的任何特徵的x，y坐標。參照點可以在凝膠共價結合於其上的支持物(如通常功能化的平板玻璃面)上提供。另外，參照點可以在成像時凝膠固定於其上的框架上提供；匹配的框架可在機器人分離裝置中提供。5.3.寡糖分析生物學樣品中的寡糖(聚糖)可以用本發明的方法和儀器，利用已建立的切割、標記和分離寡糖技術鑑定並表徵。見例如，Townsend和Hotchkiss(編)，1997，糖生物學技術(Techniques in Glycobiology)(Marcel Dekker，Inc.，New York)；Takahashi，1996，層析雜誌(J.Chromatography)720217-225，在此引入各自的全部以供參考。
在一個優選的實施方案中，寡糖由螢光標記(如用鄰位取代的苯胺衍生物如2-氨基苯甲脒或2-鄰氨基苯甲酸)並通過二維聚丙烯醯胺凝膠電泳分離。見Starr等人，1996，層析雜誌720295-321；Bigge等人，1995，分析生物化學(Analyt.Biochem.)230229-238(在此引入各自全部以供參考)。例如，為了達到主要基於寡糖內在荷質比的分離，螢光標記的寡糖在第一維中可以經歷聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)(例如使用15％丙烯醯胺凝膠以及3(羥甲基)氨基甲烷(「Tris」)/N-3(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(「TAPS」)緩衝液，pH7.4)。然後，為了達到主要基於來自伴隨寡糖的硼酸陰離子非共價絡合物的誘導電荷的分離，寡糖的一維陣列在第二維中進行PAGE，使用20％丙烯醯胺凝膠及20mM Tris/硼酸緩衝液，pH8.5。所得的二維陣列中的寡糖用螢光掃描儀成像以產生計算機可讀的信號輸出信號。5.4.檢測器輸出信號的計算機分析本發明方便地提供了檢測器輸出信號的計算機介導的分析。以舉例方式但不限於此，本發明的此方面在首先通過等電聚焦然後通過SDS-PAGE分離蛋白質的情況中討論；然而，在此描述的方法和儀器同樣地適用於分析來自分離的生物分子之任何二維陣列成像的輸出信號，這對本領域的技術人員是顯而易見的。
為了傳遞輸出信號用於分析，檢測器有效地連結於計算機上。如在此使用的，術語「有效地連接」包括直接連接(例如通過傳導電纜、紅外線通信設備等等永久的或間斷的連接)或間接連接，籍此數據通過中間存儲設備傳輸(例如伺服器或軟盤)。檢測器的輸出信號應該是能被計算機接受的格式，這是容易理解的。位圖格式(例如GIF格式)優選地用於此目的。
一旦傳輸到合適的編程的計算機，輸出信號就可以被處理以檢測參照點；過濾並去除人為因素；檢測並定量特徵；並產生圖像文件。特徵可以通過計算機介導的潛在的蛋白質斑點與背景的比較來檢測。例如，電腦程式可以選擇對應於顯示超過設定閾值的染色或螢光的凝膠區域的信號。
此外，計算機可以用於編輯檢測的特徵並對給定樣品(或任何數目的複製品)進行匹配的複製品分析。輸出信號可以被評價和比較並去掉不合格的圖像文件，它們總體上異常或上樣低或全部圖像亮度太低，或解析度太差，或複製品太不相似。如果複製品的一個圖像文件不合格，那麼屬於該複製品的圖像文件無論其圖像質量如何也是不合格的。一經給人類操作者顯示一個圖像文件，所有這些功能可以根據操作者確定的標準，交互式地或自動地執行。
參照物鑑定可用於校正凝膠泳動中的任何可變性。這個過程包括在給定生物學樣品中已知的或期望發現的一種或多種參照物蛋白質的鑑定，它們具有恆定的等電點以及電泳遷移率。這些參照物蛋白質可以作為內在標準以校正任何可能的凝膠變化或變形。或者，另外一個或多個蛋白質可加到樣品中以作為外在的標準。被認為是人為因素的特徵可以從分析中濾出；這種人為因素可能主要發生在凝膠邊緣，並尤其在或接近樣品作用點及染料前沿。
如需要，兩個或多個試驗中的輸出信號可以經校準並結合形成全景圖像文件；例如，含有蛋白質的樣品可以通過雙向電泳分離，在第一個試驗中使用pH4.0到5.0梯度的等電聚焦，而在第二個試驗中使用pH 5.0到6.0梯度的等電聚焦。為了觀察或進一步分析，現在計算機可以用於表示從這些試驗中得到的為單一全景圖像的輸出信號。
複製品凝膠可通過參照物加以排列且進行匹配。匹配過程可包括複製品凝膠上對應特徵的配對。因為配對的特徵顯示了分離的可重複性，這為隨後的準確測量等電點及表觀分子量提供了進一步的保證。處理的圖像文件可以顯示於屏幕上為肉眼觀察，可作為圖形表示列印出來並用於隨後的分析。
在一個實施方案中，計算機用於測量所有檢測蛋白質(或根據操作者確定的標準交互式或自動選擇的子集)的x，y坐標。參考用於分離步驟中的實驗參數、參照物蛋白質或外在標準，將這些坐標與特定的等電點及表觀分子量關聯。表示蛋白質特徵的信號的強度也被測量和存貯。
圖像處理的適當程序在本領域中是眾所周知的。由BioRad實驗室，Hercules，加利福尼亞發布的商業化程序(版本2.2，1997)，商品名為MELANIE適用於此目的。在優選的實施方案中，MELANIE用來對檢測器輸出信號執行下面的操作(a)為了把列與行坐標轉化為等電點(pI)及分子量(MW)值，通過參考參照物的定義校正凝膠；(b)凝膠圖像中特徵的檢測；(c)複製品凝膠間的特徵配對；(d)為每個檢測的特徵，計算其絕對特徵強度(Vol.)、相對特徵強度(％Vol.)、pI及MW；和(e)來自不同樣品的凝膠間的特徵配對。因此從MELANIE輸出的信號可以包括特徵報告、參照物報告和配對報告。5.5.分布圖的計算機產生及分析圖像處理程序(如MELANIE)的輸出信號可用計算機進一步處理，產生適於比較分析的數位化分布圖。5.5.1分布圖的構建現在可以對MELANIE處理的每個圖像文件構建數位化分布圖。在優選的實施方案中，每個樣品於兩個或多個複製品(稱為「同胞」) 中分析，其中之一被隨意地指定為同胞集合的「代表性的」凝膠。對每個鑑定的特徵，數位化分布圖優選地包括1)唯一的隨意鑑定代碼，2)x，y坐標，3)等電點，4)分子量以及5)螢光強度。
對每個同胞凝膠集合來說，來自同胞圖像的特徵報告通過匹配特徵之間的平均％Vol、pI及MW匯集成綜合的合成畫面。然後綜合的合成畫面由分配給取自同胞集合代表性凝膠的特徵ID的平均特徵參數組成。另外，％Vol的平均數的標準偏差通過下面的公式(用於複製凝膠)計算D＝100*SQRT(sqr(V-V1)+sqr(V-V2))/V
其中V＝(V1+V2)/2，而V1，V2是成對特徵的％Vol值。
另外的信息，例如用於凝膠的蛋白質的總量及凝膠的條形碼同樣可與綜合的合成畫面相結合。在優選的實施方案中，綜合的合成畫面包括一個MELANIE格式的特徵報告，參考代表性凝膠並為代表性凝膠的條形碼提供線索。
可通過對用於產生圖像的實際儲存凝膠追蹤分布圖，由此構建綜合合成畫面圖像，以致通過計算機分析分布圖可檢索到鑑定的蛋白質。分布圖也可追溯到原始樣品或患者。通過使用標準及參照物繼之以與主凝膠(master gel)相關斑點的匹配，帶有校正的凝膠系統的可重複性使在相同或不同時間用相同或不同樣品進行電泳的多個凝膠的比較成為可能。而且，為了進行對基於如年齡或臨床結果這樣的信息選擇的樣品橫斷面的計算機分析，在收集原始生物學樣品收集中匯合的數據(如在5.1節中描述)可以與凝膠數據再結合。
圖2表示根據本發明的一個特定的實施方案闡明的計算機介導的分析的流程圖。5.5.2.樣品間的交叉匹配現在將來自不同樣品分析中產生的資料進行計算機分析。在優選的實施方案中，每一有意義特徵被分配一個索引(「分子簇索引」，「MCI」)，其識別特徵的分子內容並在所有凝膠的匹配特徵中具有相同的值。對樣品的每種類型來說，建立唯一地定義了每一凝膠連續映射到其上的坐標系統的「分子簇表」。這種方法消除了試圖匹配凝膠集合中每一凝膠與其它凝膠的N×N問題。
為了產生分子簇表，隨意選擇代表性的凝膠作為主凝膠，優選地被認為對其樣品類型是最佳的凝膠。對同胞集合的綜合的合成畫面的每個特徵(分子簇)產生了分子簇表中的新條目，其中此代表性凝膠是該同胞集合的一員。當另外的分子簇在其它的凝膠中被觀察到但在主凝膠中不具有代表性時，可加到表上。這樣的其它凝膠被認為是「二級主凝膠」。
在一個實施方案中，通過pI/MW空間分層的象限樹(quadtree)分解，從特徵的pI和MW計算MCI。首先，計算包含整個pI/MW空間的2D坐標方格。作為例子但不限於此，pI可以取0到14的任意值，而MW可以取1000到1000000之間的任意值。因為蛋白質的行位置(代表其凝膠上的位移)與其分子量的對數是大約成比例的，就分子量的自然對數即ln(MW)計算坐標方格的位置。2D pI/ln(MW)空間可被接連的水平及垂直對分分為連續的較小象限，每個象限包括比其母體較少的特徵，直到解析度達到在2D空間的每個單元中特徵的數目不太可能大於1。
在詳細的實施方案中，生成9個連續的部分，所以全部的pI/ln(MW)空間被垂直和水平地分為512部分(RES＝512)。現在從主坐標系統中的pI和MW，通過下面的公式計算主凝膠中特徵的MCIMCI＝((int)((ln(MWmax)-ln(MW))/dM)*8192+(int)(pI/dI))*8192/RES
其中ln(MWmax)＝14；ln(MWmin)＝7；dM＝(ln(MWmax)-ln(MWmin))/RES＝0.013672；pImax＝14；pImin＝0；dI＝(pImax-pImin)/RES＝0.027344給定類型的所有其它樣品的代表性凝膠現在可以與那種樣品類型的主凝膠及次級主凝膠匹配(使用MELANIE)。然後對每一匹配的特徵，通過加上主凝膠或次級主凝膠分布圖中特徵的MCI注釋數位化分布圖。5.5.3.分布圖的差分分析一旦分布圖用MCI注釋，就可進行計算機分析來選擇一個或多個代表目標蛋白質或其它生物分子的特徵。優選地，通過比較來自單個樣品的同胞凝膠複製品分析的綜合合成畫面分布圖進行分析。
一個圖像集合是從資料庫中用戶可選擇的樣品列表中產生的。圖像集合的每個成員包含同胞集合的綜合合成畫面分布圖和用於匹配特徵的主分子簇表。
然後定義特徵集合，表示已經被發現的在圖像集合中的特徵集合。一個任意的閾值水平X被指定給一個特徵集合；如果它出現在(即其中具有相同的MCI)圖像集合至少X％的成員，那麼給定特徵被定義為該集合的一部分。對特徵集合的每一成員來說，定義了下列的特性(1)MCI，(2)％Vol均值(特徵出現的圖像集合中所有成員的平均％Vol)，(3)％Vol中值，以及(4)特徵被鑑定的集合中的圖像數目。
現在可以進行二元集合的運算以比較兩圖像集合(指的是「背景」和「前景」集合)之間的特徵集合。基本二元運算是在兩特徵集合中匹配特徵間摺疊變化(fold-change)的計算。摺疊變化(G)通過下面的算法確定使V1和V2分別為背景特徵集合F1和前景特徵集合F2中特徵的％Vol均值，(其中缺失的特徵用V＝0表示)，然後G＝V2/V1(當V2＞V1)G＝V1/V2(當V1＞V2)G＝+MAX_G(當V1＝0)
G＝-MAX_G(當V2＝0)，其中MAX_G是一些合適的大數目。
在摺疊變化計算中，這個算法可任選地使用％Vol中值代替％Vol均值進行。結果可以以棒圖或其它任何方便的格式報告。
作為一些樣品記錄變量的一個函數，可以進行一系列的集合運算以確定特徵集合中每一特徵表達中的變動。例如這種比較可以用於(a)在一樣品供體集合中表達變化的時間序列研究；(b)對患有不同疾病的個體集合的表達變化比較；或(c)對進行不同治療個體集合的表達變化比較。一系列的集合運算產生一個結果的矩陣，其中的行計數了特徵集合的個體成員，列計數了矩陣中不同的圖像集合併且矩陣中的單元包含從上文描述的每一圖像集合中每一特徵的％Vol均值中計算的數目。
例如，為了比較一個關於三個圖像集合(稱為S1、S2和S3)的特徵(稱為MCI(F))，對每個樣品V1、V2和V3的MCI(F)的％Vol是作為相應圖像集合中MCI(F)的％Vol均值計算的。其次，均值、中值和最大值V1、V2和V3是跨行計算的。而一個樣品集合不包括MCI(F)，相應的％Vol取為零。使用者選擇一個參照列，Vref，它可以是任何一個圖像集合或均值或中值。然後每個單元如下計算P1＝(V1-Vref)/VmaxP2＝(V2-Vref)/VmaxP3＝(V3-Vref)/Vmax這些數值全部在-1.0到+1.0範圍內。這個範圍可以分為期望的的亞區間數目(例如七個相等的亞區間)，結果以圖形顯示並且用每個亞區間的符號代表的單元中的數值。
計算機介導的根據操作者指定標準的比較促進了大量分布圖快速有效的分析，並允許被比較的分布圖間較小差異的鑑定，即使每個分布圖可代表成百上千個檢測的生物分子。大量樣品集合的快速有效的處理能力提高了檢測統計學上顯著性差異的可能性。
同樣應該理解，本發明的操作者可以將新產生的每一分布圖加到連續增長的資料庫中，允許交叉試驗比較，或者以原始研究者未想像到的組合進行比較。分布圖資料庫可以允許進行虛擬試驗，其中來自任何研究的分布圖可以與來自任何其它研究的分布圖比較，而不必重新產生實際的臨床資料。例如，提供蛋白質分子量和等電點的任何資料庫可以與本發明的來自蛋白質分析的分布圖比較。
本領域技術人員能夠理解，這種分析可採取多種形式，並且隨後的實施例通過舉例而非限制方式提供。
可比較患病以及正常個體的分布圖以鑑定兩人群間一貫不同的斑點模式。這些斑點可以包括有治療或診斷意義的蛋白質。
可比較來自單個個體的患病和正常組織的分布圖以鑑定在患病與正常組織間一貫不同的斑點模式。這些斑點可以包括用於治療或診斷目的的感興趣的生物分子。因為比較是在取自單個個體的樣品之間進行的，這對不同個體間變化的控制具有特殊優勢。
可比較治療以及未治療個體的分布圖以鑑定與某些治療或藥物處理相關的斑點模式。這在研究抗藥性或藥物開發中對闡明藥物的機理是有幫助的。
健康、患病和已治療的患病個體的三方比較可以鑑定哪種藥物能夠將患病的分布圖恢復到更接近類似正常的分布圖。無論在臨床試驗還是在常規治療中這種方法均可用於篩選藥物、監測治療效果及檢測或預測副作用的發生，並可用於鑑定哪些斑點對疾病的顯示及治療更重要。
未治療、用藥物A治療或用藥物B治療的患病個體的三方比較也可以鑑定感興趣的生物分子。例如，如果已知A是有效的而B是無效的，那麼在治療組A(一方面)與未治療組及與治療組B(另一方面)之間不同的生物分子對預後有用，並且是用於治療目標研究的任選物。
5.6.被支持凝膠的選擇部分的移出一旦被分離，生物學分子被約束於穩定的陣列中，這是本發明的被支持的凝膠的一個特徵。現在可以移出一部分包含單一被檢測特徵的凝膠而不影響陣列中剩餘部分的空間完整性。以舉例方式，通過切除部分凝膠、通過局部應用液化凝膠的試劑以使期望的物質可以通過吸出或溢出被轉移、或通過局部應用電洗脫裝置可以完成轉移。基於分布圖，包含需要分析物質的部分凝膠的移出能夠準確及重複地實施；這些部分可以從已經成像的凝膠中或從複製品或其它成像凝膠的複製物中移出。很容易理解，這很適於計算機控制的分析及選擇。
優選地，使用本發明的儀器切除選擇的凝膠部分。因此，提供了軟體控制的機器人裝置，它使用在生物分子分離之後獲得的生物學分子分布圖作參照。這種裝置可以有效地與計算機連接並通過機器可讀的指令驅動，根據指令以不依賴操作者的方式在凝膠上進行切除及操作，這些指令是通過計算機介導的對來自多種生物分子混合物分析的多種分布圖的分析產生的。計算機設計x，y運動並指引機器人裝置的切割頭採取單一切割或一系列重疊切割以分離並移走鑑定的特徵。
這種裝置可以包括(1)與在成像中凝膠放於其中的框架相同或匹配的規定的一個框架。(2)一個用於控制帶有凝膠框架的位置的底板。(3)一個帶有附著到可變操作的驅動的可移動的x，y坐標定位機械裝置，和用於定位操作者規定的感興趣的定位凝膠區域的由軟體指導的切除部件，並且能夠執行要求的操作，輸運凝膠或凝膠衍生物到接受盒中規定位置。這種裝置的一個實施方案在圖3中闡明。
這種設備能夠從背面為玻璃的凝膠中轉移凝膠片段並將轉移的凝膠片段轉移到適當的容器中。單獨的反應管(例如Eppendorf管)可用於每一凝膠片段；更優選地，凝膠片段轉移到試管架或盒子中的多容量容器例如96孔收集微量培養板上。將要操作的背面為玻璃的凝膠安裝在設備底板上的導軌上，因此用切割裝置對正玻璃和凝膠。根據機器可讀的指令，這個設備移出一個或多個選擇的凝膠部分。在一個實施方案中，對每個特徵和用於打斷凝膠與玻璃的連接並移出凝膠片段的核心切割、剪切和抽吸的過程，均選擇新的尖頭。優選地，剪切過程包括尖頭沿著第一軸從一邊到另一邊運動，接著尖頭以與第一軸成一定角度(最優選地直角)沿著第二軸從一邊到另一邊運動。每一凝膠片段被轉移到收集板上並排出，優選地投到液體中以幫助凝膠片段從尖頭移出。為了預防凝膠片段在切割過程中被抽吸進真空泵並在排出過程將凝膠片段推出尖頭的雙重目的，優選地在尖頭中包含一個可移動的梭形閥。為了在不同特徵之間將遺留減到最小，切割工具可以在整體的自動清潔站中清潔。更優選地，切割工具是可更換的，所以對每一特徵使用一種新的切割工具，因此防止任何遺留。
大的特徵通過製作多種相鄰或重疊切割被切除，相同特徵的所有的部分在收集平板的同一孔中沉澱，或不同的特徵部分在不同的孔中沉澱。另外，沿著大特徵的周邊界切割分布圖；然後當在凝膠下面進行切割時，凝膠被提起以從支持物上分離，所有的特徵被轉移到收集容器中。已經設置這個系統以允許多個凝膠被切割進一個收集板，並且同樣允許一個凝膠被切割進任何數目的採集板中，因此允許所有特徵被進一步處理。一旦收集板充滿或完成，即可進一步處理或保存。在選擇的凝膠片段已經切除後，凝膠的剩餘部分可以保存，例如在如上文描述的低溫條件下。5.7.處理凝膠轉移的部分凝膠的一個或多個轉移部分被傳送至工作站，例如一個普通的模塊化化學單元，其完全可編程並設置用於蛋白質水解。這個工作站允許任何規程的操作，包括試劑增加、用滴管吸取並轉移、孵育、混合、冷卻、真空乾燥和固相提取技術、或模塊能夠開發的任何其它技術。板被安裝到託架上，通過一個集成的託架操作器託架重新安裝在設備的底板上。這些板可以為任意形式，優選地為一種孔的正交陣列，更優選地採取9mm間距微量培養板形式。特別優選地為在每孔的底部帶有允許液體流過的管口的微量培養板，如由英國，Shepperton的Porvair有限公司製造的板。在這樣的微量培養板中，液體和凝膠片段通過聚四氟乙烯板保留，依靠移液管組件以從上面施加的空氣壓力通過板提取液體。在提取過程中液體可以作為廢物扔掉或在肽洗脫過程中收集於位於管口下面的第二塊板中。
一種根據本發明分離的蛋白質可以如下面所述進行分析，或用於產生針對分離蛋白質的多克隆或單克隆抗體向實驗動物如小鼠、大鼠或兔施用。這種抗體在診斷及預後試驗中有用，並用於大量蛋白質的純化，例如通過抗體親和層析。
5.8.蛋白質分析工作站可以被設計用於化學法蛋白質水解，或用於單獨或結合使用一種或多種適當的酶(例如胰蛋白酶或糜蛋白酶)的酶法蛋白質水解。見如Shevchenko等人，1996，分析化學68850-858和Houthaeve等人，1995，FEBS Letters 37691-94(在此引用每篇的全部以供參考)。如需要，電洗脫可任選地用於從凝膠薄片中提取蛋白質。在一個優選的實施方案中，工作站被編程，以使移出的凝膠片段中的蛋白質被切割，產生適於進一步表徵的肽庫。因此，工作站接收在適當託架中切割的凝膠塊的樣品，並且將這些凝膠塊經歷洗滌、還原、烷化、洗滌以及胰蛋白酶水解步驟。所得的肽被提取到第二塊板中用於進一步清洗或在分析之前額外製備。見例如Shevchenko，出處同前。孵育可以在高達100℃及以上的任意溫度進行；工作站包括一個密封結構，以便在高溫或延長期間進行孵育時防止或最小化液體損失。設備被設計成可無人操作，理想地為整夜，並有全面的檢測、監視及自檢機制，以確保編程的規程正確地執行、報告任何錯誤、並在預先規定的偶然事故發生時中斷操作。多個平板可以並行處理，並且如需要可以根據不同的規程進行處理。工作站也能進行肽的提純以及其他處理例如肼解和標記。
5.8.1.胺基酸序列的確定現在可以確定來自轉移的蛋白質的一個或多個肽之胺基酸序列，例如通過適當的質譜技術，例如矩陣輔助的與飛行時間質量分析(MALDI-TOF MS)或電噴離子化質譜(ESI MS)結合的雷射解吸附作用/離子化。見Jensen等人，1997，通過質譜的蛋白質分析，Creighton編，蛋白質結構，實用方法(牛津大學出版社)，牛津，29-57頁；Patterson和Aebersold，1995，電泳161791-1841；Figeys等人，1996，分析化學(Analyt.Chem.)681822-1828(在此引入每篇的全部以供參考)。優選地，一種分離技術例如HPIC或毛細管電泳被直接或間接地與質譜儀結合。見Ducret等人，1996，電泳17866-876；Gevaert等人，1996，電泳，17918-924；Clauser等人，1995，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)925072-5076(在此引入每篇的全部以供參考)。特別優選地是在美國專利申請08/877,605中描述的從頭測序技術(在此引入其全部以供參考)。在從頭測序中，肽的分子量通過適當的技術，優選地用質譜儀被精確測定。考慮到形成肽鍵時的水丟失、質子化、改變測量的胺基酸質量的其它因素以及制約胺基酸的容許組合的實驗因素，用計算機確定加入到測量的肽的分子量的胺基酸的所有可能的組合。然後計算機構建在許可組合中胺基酸所有線性組合的容許文庫。然後對組合的容許文庫中每一成員計算理論上的片段質譜，並與未知肽的通過質譜測定獲得的實驗片段質譜比較，以確定未知肽的胺基酸序列。最優選地，使用串聯的質譜儀以測定未知肽的胺基酸序列。
一旦分離的蛋白質之全部或部分胺基酸序列已經用實驗方法測定，可用計算機在可得到的資料庫中搜尋匹配的胺基酸序列或核苷酸序列，包括表達的序列標記(EST)，其預測的胺基酸序列與實驗方法測定的胺基酸序列匹配。如果沒有發現匹配的核苷酸序列，通過本領域內熟知的技術反向構建編碼實驗測定的胺基酸序列的一組簡併性核苷酸序列；這樣的一組簡併性核苷酸序列可用於克隆編碼經分離的蛋白質的基因及用於表達測序的蛋白質或肽片段的。另外，僅使用蛋白質從其所獲得的物種中偏好的密碼子(例如在人類中偏好的密碼子，其中蛋白質為人類蛋白質)，可以反向構建簡併性的核苷酸序列組的亞組；如需要，這個亞組可被限定為相關物種中最高度優選的一個核苷酸序列。
一旦編碼分離蛋白質的基因在公共或私人資料庫中鑑定，這個基因就可以克隆並轉入細菌、酵母或哺乳動物宿主細胞中。如果這種基因在資料庫中沒有被鑑定，那麼可以使用簡併性組探針克隆這個基因，這個探針編碼通過本發明的方法和儀器確定的蛋白質的胺基酸序列。如果資料庫包含一個或多個編碼實驗上確定的蛋白質的胺基酸序列之部分核苷酸序列，那麼這樣的部分核苷酸序列(或其互補序列)可用作克隆基因的探針，從而避免了使用簡併性組的需要。
表達這種重組蛋白質的經基因工程構建的細胞可以在篩選程序中使用，從而鑑定與重組蛋白質有特定相互作用的其它的蛋白質或藥物，或生產大量的重組蛋白質，用於如治療施用。擁有克隆的基因實現了以替代或補充與疾病相關的蛋白質的表達缺失或減少的基因治療。擁有克隆的基因同樣實現了以抑制其存在或其增強表達與疾病相關的蛋白質表達反義或三螺旋治療。5.8.2.翻譯後加工的分析許多蛋白質用化學基團而不是用胺基酸進行翻譯後修飾，例如磷酸基團及寡糖。這些基團在蛋白質中的存在、定位及化學特性可以通過使用本發明的儀器及方法獲得的蛋白質特異性多肽之片段來分析。在一個實施方案中，從凝膠片段中分離的蛋白質中獲得的肽庫被分開。如上面5.8.1.節中所描述，一部分用於蛋白質的鑑定。其餘一部分或多部分通過本領域已知的標準方法用於鑑定個體的翻譯後修飾。例如，磷酸化分析在Carr等人，1996，分析生物化學(Analyt.Biochem.)239180-192以及Townsend等人，1996，蛋白質科學(Protein Science)51865-1873中有描述(在此引入每篇的全部以供參考)。聚糖分析在Dwek等人，1993，分析生物化學，6265-100中(在此引入其全部以供參考)以及上面5.3.節中的參考文獻中描述。
6.實施例來自風溼性關節炎患者血清和滑液的蛋白質風溼性關節炎(RA)患者血清和滑液中的蛋白質通過等電聚焦隨後SDS-PAGE被分離並比較。6.1.等電聚焦對於等電聚焦(IEF)，將每一樣品用於ImmobilineDryStrip試劑盒(Pharmacia Biotech)，隨後的步驟在製造商說明書中描述，見ImmobilineDryStrip試劑盒說明書，Pharmacia，#18-1038-63，AB版(在此引入其全部以供參考)，帶有可選擇的修飾，被Sanchez等人，1997，電泳18324-327描述(在此引入其全部以供參考)。
在某些事例中，為了增加在特定pH範圍內的解析度或加載大量目標蛋白質到凝膠上，根據Westermeier，1993，電泳實踐(Electrophorsis inPractice)，(VCH，Weinheim，德國)，197-209頁(在此引入其全部作為參考)中所描述，使用了pH範圍為2pH單位或更小的窄範圍的「放大凝膠」(zoom gel)。6.2.凝膠平衡和SDS-PAGE如Sanchez等人，同上所描述，通過在SDS緩衝系統中平衡，製備用於SDS-PAGE的IEF凝膠，平衡根據一個兩步程序進行，包括最初二硫鍵的還原，隨後烷化游離巰基團。其後，根據Hochstrasser等人，1988，分析生物化學173412-423(在此引入其全部以供參考)的描述，如下面詳細說明修改，進行SDS-PAGE。6.3.被支持的凝膠的製備通過在凝膠附著的玻璃板上(「底板」)使用0.4％Y-異丁烯醯基-氧基丙基三甲氧基矽烷的乙醇溶液，SDS-PAGE凝膠共價粘附到玻璃支持物上。通過用水衝洗將過剩的試劑清除，並使底板乾燥。在此階段，既作為凝膠的標識，又作為鑑定平板塗層面的標記，粘性的條形碼被粘到底板不會接觸凝膠基質的位置。
用RepelSilane(pharmacia Biotech)處理相對的玻璃板(「頂板」)以最小化凝膠的粘附。應用了試劑之後，通過將熱空氣流(如從熱空氣槍中)作用於板的表面加熱頂板。過量的試劑再次用水衝洗清除並使頂板乾燥。
乾燥的平板被裝配進帶有13個凝膠夾層的澆注箱中。一些澆注箱可以平行地裝配以在相同的條件下澆注更多的凝膠。每個夾層的頂板和底板用1mm厚的隔板隔開。夾層用醋酸層間隔以促進在凝膠聚合後夾層的分離。然後根據Hochstrasser等人，出處同前進行澆注。6.4.SDS-PAGE來自IEF步驟的凝膠條加於澆注的SDS-PAGE凝膠上部並開始電泳。為了確保電泳進行中凝膠平均冷卻，基本上如Amess等人，1995，電泳，161255-1267(再次引入其全部以供參考)所描述，設計了一個系統。甚至還需要更有效的冷卻，以便在凝膠電泳過程中最小化溫度的波動並因此保持蛋白質遷移的一致性。進行電泳直到示蹤染料達到凝膠的底邊。然後將凝膠立即轉移進行染色。6.5.染色小心移去凝膠盒子的頂板，剩下結合到底板的凝膠。然後將帶有結合凝膠的底板放進能容納12片凝膠的染色設備中。凝膠完全浸入固定液中過夜，固定液包括40％(v/v)乙醇，10％(v/v)乙酸，50％(v/v)水。然後將固定液從箱中排出，並且將凝膠浸入7.5％(v/v)乙酸，0.05％(w/v)SDS中引發30分鐘。然後將引發液排出，將凝膠完全浸入染色液染色4小時。螢光染色儲存液根據製造商的說明書，通過稀釋SyproRed(Molecular Bioprobes，Inc.，Eugene，俄勒岡州(Oregon))製備。稀釋的溶液通過0.4μm濾器真空過濾。
為了達到不同溶液連續地、甚至循環地經過所有12片凝膠，溶液通過分配杆被引入箱中，沿著箱的底部擴散跨過其全部寬度並提供使溶液均勻地流過每一凝膠的洞。6.6.凝膠成像根據製造商的說明書，(見Storm使用指南，1995，版本4.0，號碼149-355，在此引入其全部以供參考)，如下文所述修改，通過使用Storm掃描儀(Molecular Dynamics，Sunnyvale，加利福尼亞)對螢光染色的凝膠成像生成計算機可讀的輸出信號。因為凝膠堅固地結合到玻璃板上，在成像過程中凝膠保持與掃描儀的接觸。為了避免由於凝膠與掃描儀工作檯不一致的接觸產生的幹涉圖案，在凝膠下面導入水膜，小心避免氣泡。而且，將凝膠放於帶有兩個與凝膠共同成像的螢光按鈕的框架中，提供用於確定凝膠中檢測的其它特徵的x，y坐標的參照點(命名為M1和M2)。為了保持準確的凝膠定位，在機器人凝膠切除器上提供了匹配的框架。在成像之後，凝膠密封於包含少量染色溶液的聚乙烯袋中，然後保存於4℃。
來自掃描儀的輸出信號首先使用MELANIE處理以自動檢測記錄的點，M1和M2；自動修剪圖像(即除去源自凝膠邊界，如參考框架之外區域的掃描的圖像的信號)；濾出由於灰塵的人為因素；檢測並定量特徵；以及產生GIF格式的圖像文件。通過計算機介導的與背景比較潛在的蛋白質斑點以選擇與超過代表背景染色給定閾值的信號相關的凝膠區域進行特徵檢測。
使用第二個程序對檢測的特徵進行交互式編輯並對每一樣品匹配複製品凝膠。首先，要估計圖像以丟棄總體上不正常的或上樣量太低或全部圖像亮度太低，或解析度太差，或複製品太不相似的圖像。如果一個複製品的圖像被丟棄，那麼屬於這個複製品的其它圖像無論圖像的質量如何也被丟棄。安排時間對丟棄的樣品進行重複分析。
參照物的鑑定用於校正凝膠電泳中的任何變動。這個方法包括鑑定期望在任何給定的生物學樣品中發現的某些蛋白質。因為這些普通蛋白質在不同的樣品中表現一致的等電點和分子量，它們可以用作校正任何可能的凝膠變異或變形的標準。在參照凝膠中參照物的pI和分子量值通過樣品與大腸桿菌蛋白質共同電泳來確定，大腸桿菌蛋白質先前已經用人類血清中的已知蛋白質標定。認為是人為因素的特徵(主要地在凝膠圖像的邊緣，特別是由於樣品上樣點及染料前沿的那些)被清除掉。然後複製的凝膠通過參照物排列，進行匹配使得在複製的凝膠上有成對的一致斑點。因為成對的斑點顯示了分離的可重複性，這為後來測定等電點及分子量是準確的提供了更多保證。校正的凝膠，除了用於隨後的分析，也被列印出來進行肉眼檢察。
圖像的產生繼之以計算機測量每一蛋白質的x，y坐標，它通過參考已知的參照物蛋白質或標準與特定等電點和分子量相關聯。測量每一蛋白質斑點強度並保存。每一蛋白質斑點被分配一個識別代碼並與主凝膠(即在每型樣品中可見的包含的多數或全部蛋白質斑點並且用作與其它樣品的蛋白質斑點匹配的模板的參考凝膠)上的一個斑點匹配。這一步驟允許橫跨許多不同凝膠的假設的相關斑點的鑑定。在原始生物學樣品的收集中收集的資料，如在5.1.節中所描述，與凝膠數據再結合，籍此實現了基於如年齡或臨床結果等信息的樣品之計算機選擇的橫斷面分析。
此方面分析的最終結果是數位化分布圖的生成，對每一鑑定的斑點，它包含1)唯一的隨機識別代碼，2)x，y坐標，3)等電點，4)分子量，5)信號值，6)每一前述方法的標準偏差，以及7)主凝膠上斑點的與其匹配的指向MCI的指針。依靠LIMS，對分布圖其所產生於的實際保存的凝膠是可追蹤的，所以，通過計算機分析凝膠分布圖資料庫鑑定的蛋白質可以被檢索到。LIMS也可使分布圖被追溯到原始樣品或患者。6.7.凝膠的數字分析一旦生成分布圖，就針對於有興趣蛋白質的選擇進行分析。
來自成對血清和關節滑液樣品的個體圖像之蛋白質特徵被電子化比較。與在2-D分離中位置的特徵性一樣，整個圖像集合的任一特徵的分子特徵性在此分析中被闡述。在個體圖像中個體特徵豐度的定量測定是基於測定該圖像中特徵的標準化螢光強度。在多個血清及關節滑液樣品集合之間豐度不同的那些蛋白質通過在所有相關圖像中所有檢測特徵的電子比較被揭示。6.8.選擇的蛋白質的回收和分析差異地表達的蛋白質被機器人切除並處理，產生胰蛋白酶肽；通過質譜分析，使用從頭測序，確定這些肽的部分胺基酸序列。6.9.結果這些最初實驗鑑定的12種蛋白質在人類RA關節滑液中水平高於匹配的血清樣品，而在人類RA關節滑液中9種蛋白質比匹配的血清樣品中存在的水平要低。對每一種差異地表達的蛋白質，確定了部分胺基酸序列。公共資料庫的計算機分析揭示了這些部分測序蛋白質中的16種在本領域內是已知的，而5種在檢查的所有公共資料庫中沒有描述。
權利要求
1.一種用於選擇和指導在二維陣列中存在的一種或多種生物分子分離的計算機輔助方法，包括對所述二維陣列或其複製品成像生成計算機可讀的輸出信號，對所述二維陣列中檢測的多種生物分子的每一個包括一對x，y坐標和一個信號值；在至少一臺計算機中處理所述的輸出信號，以根據先前規定的或操作者制定的標準選擇一種或多種所述檢測的生物分子；並且生成機器可讀的指令，其指導機器人裝置從所述二維陣列中分離至少一種所選的生物分子。
2.根據權利要求1的方法，其進一步包括根據所述機器可讀的指令由該機器人裝置從所述二維陣列中分離至少一種所選的生物分子。
3.根據權利要求2的方法，其在所述成像之前，進一步包括第一個分離步驟，其中存在於生物學樣品中的多種生物分子根據第一種物理或化學特性被分離以形成生物分子的一維陣列；第二個分離步驟，其中根據第二種物理或化學特性分離所述生物分子的一維陣列以形成所述二維陣列。
4.根據先前任何一項權利要求的方法，其中所述生物分子為寡糖。
5.根據權利要求1到3中任何一項的方法，其中所述生物分子為蛋白質。
6.根據權利要求5的方法，其中所述蛋白質為糖蛋白。
7.根據先前任何一項權利要求的方法，其中所述二維陣列包含於聚丙烯醯胺凝膠中。
8.根據權利要求7的方法，其中所述生物分子通過等電聚焦隨後在十二烷基硫酸鈉存在下通過電泳被分開。
9.根據權利要求7或權利要求8的方法，其中所述聚丙烯醯胺凝膠通常結合到一種平面固體支持物上，以使凝膠有二維空間穩定性，而且支持物基本上不幹擾蛋白質攜帶的可檢測標記的相關檢測。
10.根據權利要求9的方法，其中所述聚丙烯醯胺凝膠共價結合到所述固體支持物上。
11.根據權利要求9或權利要求10的方法，其中所述可檢測標記為一種螢光標記。
12.根據權利要求9到11中任何一項的方法，其中所述固體支持物為玻璃。
13.用於對存在於二維陣列中的一種或多種選擇的生物分子進行計算機輔助分離的儀器，包括一種能夠對所述二維陣列成像生成一種計算機可讀的輸出信號的檢測器，對每一種在該二維陣列中的多種生物分子來說其包括一對x，y坐標以及一個信號值；一臺或多臺編程的計算機，其根據先前規定的或操作者制定的標準，選擇在所述輸出信號中描述的一種或多種生物分子，並且生成機器可讀的指令來指導機器人裝置分離至少一種所選的生物分子；並且根據所述指令能夠分離至少一種所選的生物分子的一種機器人裝置，其中所述檢測器有效地連接到一臺或多臺計算機中的至少一臺，並且所述的一臺或多臺計算機中的至少一臺有效地連接到所述機器人裝置。
14.根據權利要求13的儀器，其中所述生物分子如在權利要求4到6中任何一項所定義。
15.根據權利要求13或權利要求14的儀器，其中所述二維陣列包含於聚丙烯醯胺凝膠中。
16.根據權利要求15的儀器，其中所述聚丙烯醯胺凝膠通常結合到平面固體支持物上，以使凝膠具有二維空間穩定性，並且支持物基本上不幹擾蛋白質攜帶的可檢測標記的相關檢測。
17.根據權利要求16的儀器，其中所述聚丙烯醯胺凝膠共價地結合到所述固體支持物。
18.根據權利要求16或權利要求17的儀器，其中所述可檢測的標記為一種螢光標記。
19.根據權利要求16到18中任何一項的儀器，其中所述固體支持物為玻璃。
20.一種適於在電泳中使用的被支持的凝膠，其中凝膠通常結合到平面固體支持物上以使凝膠具有二維空間穩定性，並且支持物基本上不幹擾由凝膠中的多種生物分子攜帶的可檢測標記的相關檢測。
21.根據權利要求20的被支持的凝膠，其中凝膠被共價地結合到固體支持物上。
22.根據權利要求21的被支持的凝膠，其中凝膠和支持物是通過雙功能連接物結合的。
23.根據權利要求22的被支持的凝膠，其通過功能化支持物並在功能化的支持物上澆注凝膠可以獲得。
24.根據權利要求20到23中任何一項的被支持的凝膠，其中所述生物分子為蛋白質。
25.根據權利要求20到24中任何一項的被支持的凝膠，其中所述可檢測的標記為一種螢光標記。
26.根據權利要求20到25中任何一項的被支持的凝膠，其中所述固體支持物為玻璃。
27.根據權利要求20到26中任何一項的被支持的凝膠，從中將一種或多種蛋白質移出而不影響凝膠的空間穩定性。
28.根據權利要求20到27中任何一項的被支持的凝膠，包括多種經分離的標記的物種。
29.一種通過凝膠電泳鑑定標記物種的試驗，包括根據權利要求20到26中任何一項分離凝膠上的物種，轉移包含分離的物種之凝膠的一個或多個部分而不影響凝膠的空間穩定性，並且分析在所述一個或多個部分中的物種。
30.用於分析凝膠上分離的物種的儀器，其包括檢測凝膠上物種陣列的方法，被固定到基本不幹擾物種攜帶的可檢測標記相關檢測的支持物上的凝膠；選擇陣列的一個或多個點，作為包含的物種進行分析；在所述一個或多個點的每一個點轉移凝膠；並且分析轉移的凝膠中的內容。
31.根據權利要求30的儀器，包括用於切除凝膠的離散部分的機器人方法。
32.根據權利要求30或權利要求31的儀器，其中凝膠是根據權利要求20到26中任何一項的一種被支持的凝膠。
33.一種用於分析生物學樣品中物種的自動化的集成方法，包括(a)通過將樣品的內容加到一種固定到支持物的基本不影響物種攜帶的可檢測標記相關檢測的凝膠上分離物種；(b)對所得物種陣列的結果作圖；(c)選擇陣列的一個點，作為包含的物種用於分析；(d)在所選的點轉移凝膠；(e)分析轉移凝膠的內容；並(f)對陣列的另一個點，重複步驟(c)、(d)和(e)，籍此回收並表徵個體物種。
全文摘要
本發明提供了用於鑑定、選擇和表徵生物學樣品中的分子的計算機輔助的方法和儀器。通過分離存在於複雜混合物中的生物分子產生一個二維陣列。構建一種計算機可讀的分布圖,其表示通過對二維陣列成像檢測的多數生物分子的特徵性及相對豐度。計算機介導的來自多重樣本分布圖的比較允許自動鑑定滿足預先規定標準的生物分子子集。根據計算機產生的指令,通過機器人裝置鑑定的生物分子可從二維陣列中被自動分離。提供了一種適用於電泳的被支持的凝膠,它結合於固體支持物上以使凝膠具有二維空間穩定性,並且固體支持物基本上不幹擾與凝膠中的一個或多個生物分子結合的標記如螢光標記的有關檢測。
文檔編號G01N27/62GK1242076SQ9718110
公開日2000年1月19日 申請日期1997年12月1日 優先權日1996年11月29日
發明者R·B·帕裡克, R·阿麥斯, J·A·布魯斯, S·B·普瑞姆, A·E·普拉特, R·M·斯託尼 申請人:牛津糖科學(英國)有限公司