糞臭素代謝的遺傳學標記的製作方法

2023-09-19 16:50:55 2

專利名稱：：糞臭素代謝的遺傳學標記的製作方法
技術領域：
：本發明涉及糞臭素的新的代謝產物，涉及鑑定與糞臭素代謝相關的新酶。本發明用於開發鑑定和降低公豬羶味(boartaint)的方法。
背景技術：
：為肉品生產而飼養的公豬通常在出生後不久就被閹割，以防止屠宰後的畜體中產生臭味(公豬羶味)。公豬羶味主要是由於高水平的16-雄甾烯類固醇(特別是5a(-雄甾-16-烯各酮))或者脂肪中的糞臭素而產生。EU研究項目AIR3-PL94-2482的最新結果表明，糞臭素對於產生公豬羶味的作用高於雄甾烯酮(Bonneau，M.，1997)。糞臭素是由尾腸中的細菌產生，這些細菌降解來自未消化的飼料的色氨酸或者由豬腸道內層細胞運轉的色氨酸(Jensen和Jensen,1995)。糞臭素由腸道吸收，主要在肝臟中被代謝掉(Jensen和Jensen,1995)。高水平的糞臭素會在脂肪中積聚，在公豬中尤其如此。已經有人提出，退行性基因Ska.sup.l的存在導致降低了對糞臭素的代謝和清除(Lunds的m等人，1994;Friis，1995)。在反芻動物中，已經對糞臭素的代謝進行廣泛的研究(Sm池等人，1993)，瘤胃細菌大量生成糞臭素並且對肺產生毒性作用(Yost，1989的綜述)。豬體內的與糞臭素相關的代謝路徑還未被充分描述。特別地，還不清楚僅某些未被閹割的公豬的脂肪內具有高濃度的糞臭素的原因。環境和飲食因素是重要的(Kjeldsen,1993;Hansen等人，1995)，但是不足以解釋豬體內的脂肪中的糞臭素濃度發生改變的原因。Claus等人(1994)提出，脂肪糞臭素濃度高是由於雄激素和糖皮質激素作用使得腸道糞臭素生成增加的結果。LimdsWm等人(1994)報導一種對脂肪中的糞臭素濃度的遺傳影響，這可能是由於對糞臭素的酶促清除進行遺傳控制。肝臟是糞臭素代謝的主要部位，肝臟的酶促活性可能是糞臭素在脂肪中沉積的決定因素。B.aebutted.K等人(1995)描述了數種在血液和尿液中發現的糞臭素的肝臟代謝產物，主要類型為Mil和MIII。Mil是6-羥基糞臭素(pro-Mil)的硫酸鹽偶聯物，僅高濃度地存在於豬的血漿中，豬血漿能夠迅速地將糞臭素從豬體內清除，而高的MIII濃度與糞臭素清除緩慢相關。因此，合成MII的能力是迅速代謝清除糞臭素的主要步驟，導致在脂肪中生成低濃度的糞臭素，從而產生低水平的公豬羶味。回顧前述內容，需要進行進一步的工作，徹底了解糞臭素在豬肝臟中的代謝，並鑑定相關的關鍵酶。對與糞臭素代謝相關的生物化學事件的了解，可以獲得處理、減少或防止公豬羶味的新策略。此外，這些候選基因的多態性可被用作公豬羶味少的豬的可能標記。發明概述本發明人已經鑑定出由豬肝臟微粒體對糞臭素(3-甲基吲哚，3MI)進行第I階段代謝所產生的新的代謝產物。所鑑定的代謝產物為3-羥基-3-甲基假吲哚(3-OH-3-methylindolenine)(HMI);3-甲基羥吲哚(3-methyloxindole)(3MOI);吲哚-3-甲醇(I-3C);和2-氨基苯乙酮(2-AM)。測量這些代謝產物在豬體內的水平，對於鑑定豬代謝糞臭素的能力及其產生公豬羶味的傾向性是有用的。本發明人還確定，糞臭素的代謝產物之一HMI被醛氧化酶代謝成為3-羥基-3-甲基羥吲哚(3-OH-3-methyloxindole)(HMOI)。因此，對於提高糞臭素代謝和降低公豬羶味來說，增強醛氧化酶的活性可能是有用的。因此，本發明提供用於增強3-甲基吲哚代謝從而降低公豬羶味的方法，包括增強豬體內的醛氧化酶活性。增強醛氧化酶的活性，可以使用(a)增強醛氧化酶的活性；或者(b)誘導或增強醛氧化酶基因的表達的物質。本發明人還確定，細胞色素P450酶CYP2A6也與豬肝臟微粒體對糞臭素的代謝相關。因此，本發明提供用於增強3-甲基吲哚代謝從而降低公豬羶味的方法，包括增強豬體內的CYP2A6的活性。增強CYP2A6的活性，可以通過使用如下物質，其(a)增強CYP2A6的活性；或者(b)誘導或增強CYP2A6基因的表達。鑑別出與糞臭素代謝相關的酶，使得可以開發用於篩選與糞臭素代謝中的那些酶相互作用的物質的方法。該篩選方法可用於鑑定可用於減少或處理公豬羶味的物質。本發明還包括生產公豬羶味發生率較低的豬的方法，其通過篩選具有高水平的醛氧化酶和/或CYP2A6的豬，並且繁殖所選擇的豬。根據下面的詳細描述，本發明的其他特徵和優點將是顯然的。但是，應當理解，指示本發明的優選實施方案的詳細描述和特定實施例僅作為說明目的，因為對於本領域技術人員來說，根據該詳細描述，在本發明的精神和保護範圍內的各種變化和改變是顯然的。現參照附圖描述本發明，其中圖1是由豬肝臟微粒體生成的主要五種代謝產物的色譜圖形，在250nm通過UV吸收檢測。保持時間對應於9.16min，UV-1;11.24min，3-羥基-3-甲基羥卩引哚；14.42min，吲哚-3-甲醇；17.51min，3-甲基羥吲哚;19.43min，2-氨基苯乙酮;22.84min，親本化合物(3-甲基卩引哚)。(A)含有2iig/ml各種代謝產物的標準混合物。(B)溫育混合物。圖2是(A)UV-l代謝產物[入匿(nm):204，238];(B)3-甲基羥吲哚[入咖x(腿):205，252];和(C)3-羥基-3-甲基羥吲哚[HMOI:入隱(nm):208，253]的UV光譜。圖3A是代謝產物UV-1的LC-MS光譜。圖3B是m/z148的子離子的MS/MS光譜。圖4是代謝產物UV-1的iH-NMR光譜。圖5顯示由豬肝臟微粒體生成的3MI代謝產物的化學結構式和百分比。圖6顯示由醛氧化酶催化的將3-羥基-3-甲基假吲哚氧化轉化為3-羥基-3-甲基羥吲哚。圖7顯示由3-羥基-3-甲基假吲哚生成3-羥基-3-甲基羥吲哚(HMOI)，由豬的細胞溶膠(cytosol)催化。每個數據點表示在3頭豬上進行的重複試驗的平均值。圖8顯示甲萘醌誘導抑制由3-羥基-3-甲基假吲哚生成3-羥基-3-甲基羥吲哚(HMOI)。每個數據點表示在3頭豬上進行的重複試驗的平均值。圖9顯示奎納克林誘導抑制由3-羥基-3-甲基假吲哚生成3-羥基-3-甲基羥吲哚(HMOI)。每個數據點表示在3頭豬上進行的重複試驗的平均值。圖10顯示豬體內背部脂肪中3-甲基吲哚的含量與肝臟醛氧化酶活性相比的圖形(n=30)。醛氧化酶活性被測定為每分鐘由1毫克的胞質蛋白形成的3-羥基-3-甲基羥哼l哚(HMOI)納摩爾數。圖ll顯示CYP2A6基因(SEQIDN0:3)與突變體(SEQIDNO:l)在位置1220上的序列比對，以粗體顯示。圖12顯示來自豬肝臟的豬細胞色素P4502A6cDNA的核苷酸序列和推導的胺基酸序列。CYP2A6分離自豬cDNA文庫。(SEQIDNO:18)該序列已經在GenBank中登記(登錄號AY091516)。推導的胺基酸序列顯示在相應的核苷酸序列的下方。CYP2A6的三個活性位點用下劃線標出。核苷酸和胺基酸的數量顯示在右側。圖13顯示人CYP2A6(SEQIDNO:19)、CYP2A3(SEQIDNO:20)和豬2A6(SEQIDNO:21)的胺基酸序列比對。Glnl04、Phe209和His477被認為是人CYP2A6香豆素7-羥化酶活性的活性位點。CYP2A6香豆素7-羥化酶氧化代謝菸鹼和可鐵寧(cotinine)。胺基酸的數量顯示在右側。星號表示這些活性位點在人和豬之間是相同的。圖14顯示CYP2A6在不同豬組織中的表達的Northern印跡分析結果。總RNA分別從脾臟、胸腺、肝臟、肺部、卵巢、腎臟、小腸、心臟和睪丸中提取。在含2.0M甲醛的1.0o/。瓊脂糖凝膠中，對20yg總RNA(每條泳道)進行電泳。將RNA轉移到尼龍膜上，然後用dig-標記的豬CYP2A6cDNA進行雜交。圖15顯示CYP2A6在豬肝臟中的遺傳多態性、測序、western印跡分析和微粒體酶活性以及脂肪中的糞臭素水平。A，CYP2A6cDNA的PCR-SSCP分析。M:缺失突變；W:野生型。B，對缺失突變和野生型進行CYP2A6的測序分析。M:缺失突變的測序數據；W:野生型的測序數據。C，通過12%SDS-PAGE電泳從微粒體中分離的總蛋白，用小鼠抗人單克隆2A6-抗體進行免疫印跡。重複試驗，將40yg來自肝臟微粒體的總蛋白加載到每條泳道中。M:來自具有CYP2A6的缺失突變的個體的總蛋白；W:來自野生型豬的肝臟的總蛋白。D，突變體和野生型的微粒體CYP2A6的活性和脂肪中的糞臭素水平。發明詳述I.糞臭素的代謝產物本發明人已經鑑定由豬肝臟微粒體對糞臭素(3-甲基噴哚，3MI)進行的第I階段代謝所產生的新的代謝產物。所鑑定的代謝產物為3-羥基-3-甲基假吲哚(HMI)、3-甲基羥吲哚(3M01)、卩引哚-3-甲醇(I-3C)和2-氨基苯乙酮(2-AM)。對於確定豬代謝糞臭素的能力及其對公豬羶味的傾向性來說，測量這些代謝產物在豬體內的水平是有用的。因此，本發明提供評價豬代謝3-甲基吲哚的能力的方法，包括檢測來自豬的樣品中的一種或多種選自3-羥基-3-甲基假吲哚(腹I)、3-甲基羥吲哚(3M01)、卩引哚-3-甲醇(I-3C)和2-氨基苯乙酮的代謝產物。由於糞臭素代謝產物還會發生第II階段的硫酸化和葡萄糖苷化反應，該試驗可以包括測量代謝產物的硫酸化和葡萄糖苷化產物。該樣品可以是來自豬的任何生物學樣品，優選為肝臟、血漿或脂肪。測量特定代謝產物的水平，可用於將豬劃分為具有好的或差的糞臭素代謝能力。糞臭素代謝能力低可能是產生公豬羶味的原因，因此，對於鑑定具有公豬羶味的豬或者具有產生公豬羶味的風險的豬來說，該試驗是有用的。進一步選擇產生公豬羶味風險低的豬(即代謝能力好)，進行繁殖以生產公豬羶味低的豬。II.酶a)醛氧化酶本發明人還確定，糞臭素的代謝產物之一HMI被胞質金屬黃素蛋白(metalloflavoprotein)醛氧化酶代謝成3-羥基-3-甲基羥B引哚(HMOI)。本發明人還確定，醛氧化酶糞臭素(或者3MI)的代謝中起重要作用，其催化活性與充分清除3MI相關。因此，增強醛氧化酶的活性可用於提高糞臭素代謝並且降低公豬羶味。因此，本發明提供用於增強3-甲基B引哚代謝的方法，包括增強豬體內的醛氧化酶活性。可以用(a)提高醛氧化酶活性；或者(b)誘導或增加醛氧化酶基因的表達的物質，來增強醛氧化酶的活性。還可以採用基因治療方法來增強醛氧化酶的活性，其中離體或體內將編碼醛氧化酶的核酸序列導入豬體內中。可採用從人、牛或兔子基因獲得的信息克隆豬基因，獲得編碼醛氧化酶的核酸序列。如上提及，醛氧化酶活性與3MI清除相關。因此，檢測豬體內的醛氧化酶的酶促活性可用於確定豬產生公豬羶味的傾向性。具有高醛氧化酶活性的豬產生公豬羶味的風險低於具有低醛氧化酶活性的豬。可以選擇具有高醛氧化酶活性的豬，繁殖來生產低公豬羶味的豬。因此，本發明提供確定豬對公豬羶味的傾向性的方法，包括確定來自豬的樣品中的醛氧化酶活性。在實施例2中詳細描述了用於確定醛氧化酶活性的方法。b)CYP2A6本發明還確定，細胞色素P450酶CYP2A6也與由豬肝臟微粒體對糞臭素進行的代謝有關。因此，提高CYP2A6的活性對於增強糞臭素的代謝和減少公豬羶味是有用的。因此，本發明提供一種用於增強3-甲基口引哚的代謝的方法，包括提高豬體內的CYP2A6活性。用(a)提高CYP2A6活性；或(b)誘導或提高CYP2A6基因的表達的物質來增強CYP2A6的活性。還可以用基因治療方法來增強CYP2A6的活性，其中離體或體內將編碼CYP2A6酶的核酸序列導入豬體內。利用來自人基因的信息，通過克隆豬基因來獲得編碼CYP2A6的核酸序列。檢測豬體內的CYP2A6催化活性，用於確定豬產生公豬羶味的傾向性。具有高CYP2A6活性的豬產生公豬羶味的風險低於CYP2A6活性低的豬。選擇具有高CYP2A6活性的豬，繁殖生產低公豬羶味的豬。因此，本發明提供確定豬產生公豬羶味的傾向性的方法，包括確定來自豬的樣品中的CYP2A6活性。c)篩選分析鑑定參與糞臭素代謝的酶，使得可以開發篩選與這些酶相互作用的從而調節糞臭素代謝的物質的分析方法。一個方面，本發明提供篩選增強醛氧化酶或CYP2A6活性的物質的方法。在本發明一個實施方案中，提供用於篩選通過提高醛氧化酶活性來增強豬體內的糞臭素代謝的物質的方法，包括步驟(a)在存在測試物質時，在醛氧化酶能夠將底物轉化為反應產物的條件下，將醛氧化酶底物與醛氧化酶反應；(b)分析反應產物、未反應的底物或未反應的醛氧化酶；(C)與對照比較，確定測試物質是否可選擇地增強醛氧化酶活性從而能夠提高糞臭素在豬體內的代謝。用於本發明的方法中的醛氧化酶底物包括HMI，HMI被代謝成HMOI。採用各種技術，包括測量醛氧化酶的蛋白質或者mRNA水平，或者通過檢測醛氧化酶活性，來測定對醛氧化酶活性的誘導作用。可以用各種分析方法，包括實施例2中描述的分析方法和Rajagopalan等人，1966描述的那些方法來測量醛氧化酶活性。在本發明的另一個實施方案中，提供用於篩選通過提高CYP2A6活性來增強糞臭素在豬體內的代謝的物質，包括步驟(a)在存在測試物質時，在CYP2A6能夠將底物轉化為反應產物的條件下，將CYP2A6底物與CYP2A6反應；(b)分析反應產物、未反應的底物或未反應的CYP2A6;(c)與對照比較，確定測試物質是否可選擇地增強CYP2A6活性從而能夠提高糞臭素在豬體內的代謝。用於本發明的方法中的CYP2A6底物包括糞臭素和香豆素。採用各種技術，包括測量CYP2A6的蛋白質或者mRNA水平，或者通過如Aitio，1978描述檢測CYP2A6活性，來測定對CYP2A6活性的誘導作用。用於本發明中的醛氧化酶和CYP2A6酶來自天然的、重組的或者商業的來源。表達酶的細胞或者肝臟微粒體也可以用於該方法中。根據如測試物質和底物的性質和含量等各種因素，選擇使反應產物生成的條件。通過常規的分離技術，如鹽析、色譜、電泳、凝膠過濾、分餾、吸收聚丙烯醯胺凝集電泳、凝集或者它們的組合，來分離反應產物、未反應的底物或者未反應的酶。為了便於對反應產物、未反應的底物或者未反應的酶進行分析，可以使用抗反應產物或者底物的抗體，或者標記的酶或底物，或者標記物質。抗體、酶、底物或物質用可檢測的標記來標記，例如放射性標記、特定標記的抗體所識別的抗原、螢光化合物、特異於標記抗原的抗體和化學發光化合物。用於本發明的方法中的底物可以是不溶的。例如，該底物結合到合適的載體上。合適的載體的例子為瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、交聯葡聚糖(Sephadex)、瓊脂糖(Sepharose)，羧甲基纖維素聚苯乙烯、濾紙、離子交換樹脂、塑料膜、塑料管、玻璃珠、聚胺-甲基乙烯基-醚-馬來酸共聚物、胺基酸共聚物、乙烯基-馬來酸共聚物、尼龍、絲等。載體的形狀可以是，例如試管、檢光板、圓盤、球形等。用已知的物理或化學方法，如溴化氰偶聯，將酶、底物或物質與合適的不溶載體反應來製備不溶的酶、底物或物質。在另一個方面，本發明包括擁有篩選通過調節與糞臭素代謝相關的酶的轉錄或翻譯來增強糞臭素代謝的物質的方法。在本發明的一個實施方案中，提供篩選通過提高編碼醛氧化酶的基因的轉錄和/或翻譯來增強糞臭素代謝的物質的方法，包括步驟(a)在存在測試物質時培養宿主細胞，該細胞包括含有編碼醛氧化酶的核酸序列和該核酸序列轉錄或翻譯的必需元件和任選地一種報導基因的核酸分子；和(b)將醛氧化酶的表達水平或者報導基因編碼蛋白的表達水平與不存在測試物質時的用核酸分子轉染的對照細胞比較。在本發明的另一個實施方案中，提供用於篩選通過提高編碼CYP2A6的基因的轉錄和/或翻譯來增強糞臭素代謝的物質的方法，包括步驟(a)在存在測試物質時培養宿主細胞，該細胞包括含有編碼CYP2A6的核酸序列和該核酸序列轉錄或翻譯的必需元件和任選地一種報導基因的核酸分子；和(b)將CYP2A6的表達水平或者報導基因編碼蛋白的表達水平與不存在測試物質時的用核酸分子轉染的對照細胞比較。用包含編碼適當酶的核酸序列的核酸分子轉染合適宿主，製備用於本發明的方法中的宿主細胞。合適的轉錄和翻譯元件來自各種來源，包括細菌的、真菌的、病毒的、哺乳動物的或者昆蟲的基因。對適當的轉錄和翻譯元件的選擇依賴於所選擇的宿主，容易由本領域技術人員來實現。這種元件的例子包括轉錄啟動子和增強子或者RNA聚合酶結合序列、核糖體結合序列，包括翻譯起始信號。因此，根據所選擇的宿主細胞和所用的載體，可以將其他遺傳元件結合到表達載體中，如複製起始點、其他的DNA限制位點、增強子和賦予轉錄可誘導性的序列。還可以預期，必需的轉錄和翻譯元件可以由酶的天然基因和/或其側翼序列來提供。報導基因的例子是編碼一些蛋白質的基因，此類蛋白質如綠色螢光蛋白、e-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、螢火蟲螢光素酶或者免疫球蛋白或其部分如免疫球蛋白(優選為IgG)的Fc部分。通過報導蛋白的濃度改變來監控報導基因的轉錄，這些報導蛋白如e-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、螢火蟲螢光素酶。這使得可能可視化和分析酶的表達，特別是確定一種物質對酶表達的作用。合適的宿主細胞包括各種原核和真核宿主細胞，包括細菌的、哺乳動物的、酵母或者其他真菌的、病毒的、植物的或者昆蟲的細胞。用於轉染宿主細胞的方法在本領域是已知的(參見，Sambrook等人，MolecularCloningALaboratoryManual,第2版，冷泉巷實驗室出版社，1989，其在此引入作為參考)。也可以將商業上可獲得的宿主細胞用於本發明的方法中。例如，購自Gentest公司的h2A3和h2B6細胞適合用於本發明的篩選方法中。通過提高醛氧化酶或CYP2A6活性來增強糞臭素代謝的物質(包括通過上述方法篩選得到的物質)可用於降低或處理公豬羶味，或者可用於製備降低或處理公豬羶味的藥劑。d)組合物將增強糞臭素代謝的物質(包括用本發明的方法鑑定的物質，其選擇性地提高醛氧化酶或CYP2A6的活性)結合到藥物組合物中。因此，本發明提供一種用於降低公豬羶味的藥物組合物，其包括有效量的一種或多種增強糞臭素代謝的物質和藥學上可接受的載體、稀釋劑或者賦形劑。在此所用的術語"有效量"是指足以以一定劑量、在必需的時期內獲得期望結果的量。在一個實施方案中，本發明提供一種藥物組合物，其包括有效量的一種物質，該物質選自(a)提高醛氧化酶活性的物質；(b)誘導或增強醛氧化酶基因表達的物質；(c)提高CYP2A6酶活性的物質；和(d)誘導或增強CYP2A6基因表達的物質。可以施用本發明的物質，用於口腔、體表、直腸、胃腸外、局部、吸入或腦內的應用。優選地，通過口腔(加入食物或飲用水中)或者作為一種注射製劑來施用該活性物質。在本發明的方法中，在此詳細描述的和用本發明的方法從活性成分中鑑定的物質通常以混合物施用。根據特定的施用形式，如口服片劑、膠囊、藥丸、糖漿等，選擇的合適藥物稀釋劑、賦形劑或者載體，按照常規的獸醫操作，將所鑑定的物質與所選擇的稀釋劑、賦形劑或者載體混合。例如，進行口服施用時，以片劑或膠囊的形式製備活性成分，包含在食物或飲用水中。在這種情形下，活性物質與口服的、無毒的、藥學上可接受的惰性載體組合，該載體如乳糖、澱粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸鈣、硫酸鈣、甘露醇等；對於以液體形式的口服施用，口服的活性物質與任何的口服的、無毒的、藥學上可接受的惰性載體組合，該載體如乙醇、甘油、水等。如果期望或者需要，將合適的粘合劑、滑潤劑、分解劑和著色劑結合到劑量形式中。合適的粘合劑包括澱粉、凝膠、天然的糖人葡萄糖或者e-乳糖、玉米甜味劑、天然的或合成的膠如阿拉伯樹膠、西黃蓍膠(tragacanth)或者藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、臘等。用於這些劑量形式中的合適滑潤劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。分解劑的例子包括澱粉、甲基纖維素、瓊脂、斑脫土、黃原膠等。凝膠膠囊含有活性物質和粉末狀載體，如乳糖、澱粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。可以使用類似載體和稀釋劑來製備壓縮的片劑。將片劑和膠囊加工成緩釋產品，以在一段時間內連續釋放活性成分。壓縮的片劑可以是用糖包裹或者膜包被，來掩蓋任何讓人不舒服的味道並且將片劑與空氣隔離，或者用腸衣包被以在胃腸道中選擇性地分解。用於口服施用的液體劑量形式可能含有著色劑和風味劑，提高接受程度。水、適當油、鹽、水溶性葡聚糖和相關的糖溶液以及二元醇如丙二醇或聚乙二醇，都可被用作胃腸外溶液的載體。這種溶液還優選地含有活性成分的水溶性鹽、合適的穩定劑，如果需要，含有緩衝物質。合適的穩定劑包括抗氧化劑，如硫酸氫鈉、硫酸鈉或者抗壞血酸，它們可單獨使用或者組合使用，檸檬酸及其鹽以及EDTA鈉。胃腸外溶液還含有防腐劑，例如殺藻胺、甲基-或丙基-對羥基苯甲酸酯以及氯丁醇。可以以脂質體呈遞系統的方式來施用在此詳細描述的並用本發明的方法鑑定的物質，例如小的單層脂質體、大的單層脂質體和多層脂質體。脂質體可用各種磷脂製備，例如膽固醇、硬脂胺(stearylamine)或卵磷脂。將在此詳細描述的並用本發明的方法鑑定的物質與可溶的聚合物結合，這種聚合物是可耙向的藥物載體。這種聚合物的例子包括聚乙烯吡咯垸酮、吡喃共聚物、聚羥丙基-甲基丙烯酸胺石碳酸、聚羥乙基-天冬醯胺石碳酸或者用棕櫚醯殘基取代的環氧乙烷-聚賴氨酸。該物質還可以與用於實現藥物的控制釋放的可生物降解的聚合物結合。合適的聚合物包括多聚乳酸、多聚乙醇酸、多聚乳酸和多聚乙醇酸的共聚物、多聚"己內酯(caprolactone)、多聚羥基丁酸、多聚正交酯、聚縮醛、多聚二羥基吡喃、多聚氰基丙烯酸酯和水凝膠的交聯的或親兩性的嵌段共聚物。合適的藥學載體以及製備藥學劑量形式的方法被公開在雷明頓藥物禾鬥學(Remington'sPharmaceuticalSciences),MackPublishingCompany中，其是本領域的標準教科書。不只一種在此詳細描述的並用本發明的方法鑑定的物質可被擁有增強糞臭素的代謝。在這種情形下，該物質通過任何用以與藥劑協同使用的傳統方法來施用，作為同時或連續施用的單獨的分開劑量單位，或者在單一的或者組合的劑量單位中與各種成分物理結合。可以單獨施用活性試劑，但是通常與一種藥學載體一起施用，這種載體根據所選擇的施用路徑和在此描述的標準藥學實踐來選用。e)遺傳學篩選本發明還包括鑑定編碼負責豬體內的糞臭素代謝的酶的基因的多態性，這種酶包括上文詳細描述的醛氧化酶和CYP2A6。從對糞臭素的代謝能力強的豬(因而產生公豬羶味的概率低)體內鑑定編碼這些酶的基因，用於開發公豬羶味發生率低的豬品系。此外，鑑定這些基因，用作鑑定傾向於產生公豬羶味的發生率低的豬的標記。因此，本發明提供一種用於生產產生公豬羶味的發生率較低的豬的方法，其包括選擇表達高水平醛氧化酶和/或CYP2A6的豬；和繁殖所選擇的豬。還可生產生成高水平醛氧化酶和/或CYP2A6的轉基因豬。用傳統方法製備轉基因豬。例如，用重組分子來導入(a)編碼醛氧化酶的基因或(b)編碼CYP2A6的基因。通過一種技術，如轉染、電穿孔、注射等，將這種重組構建體導入細胞中，如胚胎幹細胞。通過Southern印跡、Northem印跡或者或通過本領域已知的其他方法，鑑定具有高水平的醛氧化酶和/或CYP2A6的細胞。然後，將這種細胞與胚胎幹細胞融合，生成轉基因動物。通過，如用早期胚胎如八細胞期的胚胎匯集胚胎幹細胞，將生成的囊胚體外移植到受體雌性個體中，產生生成的聚集嵌合體的種系傳播，從而實現了突變的種系傳播。這種轉基因豬與具有類似表型的豬交配，生產產生公豬羶味的發生率低的豬，類似表型為高水平的醛氧化酶和/或CYP2A6。如下非限制性的實施例用於闡明本發明實施例實施例l:糞臭素代謝產物的鑑定材料與方法化學藥品。3-甲基吲哚(3MI)、口引哚-3-甲醇(13C)、吲哚-3-乙醛、卩引哚-3-羧酸、2-氨基苯乙酮和來自/7Wx的H-2型硫酸酯酶購自Sigma-Aldrich加拿大有限公司(Oakville，ON，加拿大)。羥B引哚、3-甲基羥吲哚(3MOI)和3-羥基-3-甲基羥吲哚(HMOI)分別用Kende和Hodges(1982)以及Skiles等人(1989)的方法合成。可信的5-羥基-3-甲基噴哚和6-羥基-3-甲基U引哚(6-硫酸羥糞臭素(6-sulfatoxyskatole)的形式)是JensHansen-Moller(DanishMeatResearchInstitute,Roskilde，丹麥)惠贈。為了從6-硫酸羥糞臭素獲得6-羥基-3-甲基B引哚，在含有90單位/ml的H-2型硫酸酯酶的總體積0.5ml乙酸緩衝液，pH5.0中水解該化合物。4(TC下，在搖床水浴中水解4小時，加入0.5ml冰冷乙腈，終止反應並沉澱蛋白。以7,500rpm離心15分鐘，將50pl澄清的上清液加載到層析柱上，採用在"分析層析"中描述的條件。微粒體製備。從30頭未經過閹割的公豬中獲取肝臟樣品，該公豬通過將歐洲野豬X瑞典約克夏豬的F3代公豬與瑞典約克夏母豬回交(Squires和Lundstrom，1997)而獲得。用液氮冷凍肝臟樣品，存儲在-80。C下。對於微粒體的製備，將部分解凍的肝臟樣品切碎，使用Ultra-Turax勻眾儀(Janke和Kunkel，GDR)，用4倍體積的0.05MTris-HCl緩衝液pH7.4(含有0.15MKC1、1mMEDTA和0.25M蔗糖)進行勻漿。以10,000xg離心勻漿20分鐘，生成的上清液再以100,000xg離心60分鐘，獲得微粒體沉澱。將沉澱懸浮在0.05MTris-HCl緩衝液，pH7.4中，達到20mg蛋白/ml的最終濃度，並分析前存儲在-8(TC下，該緩衝液含有20%甘油、1mMEDTA和0.25M蔗糖。通過Smith等人(1985)的方法，用購自Pierce化學公司(Rockford，Ill.，美國)的二辛可寧酸蛋白分析試劑確定蛋白質濃度，牛血清白蛋白作為標準物。微粒體溫育。37"C下，將2mg微粒體蛋白用溶解在0.05M磷酸鈉緩衝液(pH7.4)中的0.4mM3MI禾Q4mMNADPH溫育30分鐘(在10-40分鐘的時間範圍內，代謝產物的產量是線性的)，該緩衝液中含有5mMMgCl2和1mMEDTA。溫育的體積為0.5ml。在37'C進行3分鐘的預溫育期後，加入NADPH來起始反應，用0.5ml冰冷乙腈來終止反應。重複對所有30個樣品進行溫育，對照的溫育不用NADPH。在加入乙腈後，旋渦攪動混合物，以5000rpm離心20分鐘。通過高效液相色譜(HPLC)對澄清上清液的50pl等分試樣進行分析。分析層析。用Spectra-Physics系統(Spectra-Physics，聖何塞，加利福尼亞州，美國)進行分析HPLC，該系統由SP8800梯度泵、具有50|11注射環(injectionloop)的SP8880自動取樣器、SP光譜100UV檢測儀和光譜系統FL-2000螢光檢測儀。該HPLC方法是對先前報導的雙梯度系統方法(Baek等人，1995)的改進。用反相ProdigyODS，5pm，250X4.6mm柱(Phenomenex，託蘭斯，加利福尼亞州，美國)分離3MI及其代謝產物。流動相由兩種溶劑組成，A(0.01M磷酸二氫鉀緩衝液pH3.9)和B(乙腈)，採用如下梯度0分鐘—90%A，6分鐘—80%A;12分鐘—70%A;18分鐘—30%A;25分鐘10。/。A;26分鐘90。/。A;35分鐘—90%A。所有的梯度是線性的，流速設定為1.2ml/分鐘。在250nm下監測吸光率；在分別為286nm和350nm的激發和發射波長下監測螢光強度。溫育後，立即對3MI代謝產物進行HPLC分析。通過比較保持時間和共同注入標準物(比較代謝產物混合物與可信的標準物的峰值)，確定代謝產物。通過製備性HPLC來分離和純化代謝產物。為了獲得足以進行UV光譜分析的含量的代謝產物，進行大規模的溫育(最終體積為4ml)，採用與上述相同濃度的反應物。用Spectra-PhysicsSP8800梯度泵(Spectra-Physics,聖何塞，加利福尼亞州，美國)、裝配了500^1注射環的手動注射器(Rheodyne，Cotati，加利福尼亞州，美國)和SP光譜100UV檢測儀，進行製備性HPLC。用反相Waters製備性HPLCC18，10jim，300X7.6mm柱(^VatersAssociates,DivisionofMillipore公司分公司，Milord，Mass.，美國)，分離3MI的代謝產物。流動相與上述相同，而流速設定為3.0ml/分鐘。根據保持時間確定代謝產物為HMOI、I3C、3MOI和2-氨基苯乙酮，收集足量的對應於這些代謝產物的峰值，用於確定它們的UV光譜。用前面在"分析性層析"下描述的方法，通過HPLC確定所收集的餾分的純度。由豬肝臟微粒體生成的代謝產物之一不能根據保持時間的比較來確定；由於這種代謝產物的吸收發生在紫外線光譜外，而且事實上它是從柱中洗脫出來的第一個代謝產物(Babol等人，1998a)，被命名為UV-1。對應於該代謝產物的峰值，在9.1-10.1分鐘之間洗脫出來，在進行多次500W注射收集，並且進行HPLC-MS分析，附加一次H-NMR和UV光譜分析。紫外線光譜分析。記錄HPLC代謝產物HMOI、I3C、3MOI和2-氨基苯乙酮的紫外線光譜(200-300nm)。記錄所用可信標準物的紫外線光譜，並與分離的代謝產物的光譜比較。用4054型LKBBiochromUV-Visible分光光度計(PharmaciaLKBBiochrom有限公司，劍橋，英國)。由於產量低，不可能分離足量的羥基糞臭素來確定它們的紫外線光譜。代謝產物UV-1的LC/MS。通過LC-MS分析代謝產物UV-1，採用如下條件採用Prodigy5ODS-2，5pm，150X3.2mm柱(Phenomenex，託蘭斯，加利福尼亞州，美國)和水乙腈(50:50)作為流動相進行HPLC。用雙向LC泵(HewlettPackard1090系列II/L，PaloAlto，加利福尼亞州，美國)來呈遞流動相。洗脫液經過樣品噴射閥Rheodyne7010(Rheodyne，Cotati，加利福尼亞州，美國)，以0.7ml/分鐘的流速進入裝配有電暈放電針的氣壓化學電離(APCI)源中。通過自動取樣器(HewlettPackard1090系列II/L，PaloAlto，加利福尼亞州，美國)注射20|11的樣品體積。用VGQuattroII三倍四極質譜分析儀(FisonsUK有限公司，Altrincham，英國)進行質譜分析(MS)檢測。用MassLynx軟體包，進行儀器操作控制、數據獲取和數據加工。液氮作為乾燥和保護的氣體，流速分別為200和50升/小時。以陽離子模式操作儀器，離子源溫度為150。C，電暈放電針的電壓為+3.75kV，錐面電壓(conevoltage)為15V。在內部掃描延遲為10秒的全掃描模式下，以400amu/秒的速度掃描第一個四極，從m/z125-700中獲得LC/MS的總離子色譜。以連續的形式獲取數據。通過將質子化分子離子([M+H].sup.+)從第一個四極傳遞給含有超純氬的第二個四極，用串聯質譜分析(MS/MS)來進行產物掃描。10秒內從m/z50到450掃描第三個四極，記錄產物的色譜。撞擊能量在-20到-50eV間變化，優化所選擇的質子化分子離子的破碎。代謝產物UV-1的NMR光譜分析。分離UV-1代謝產物，用基本上如上述的溫育條件來進行NMR分析。但是，該溫育包含lmnol細胞色素P450，而不是2mg的總蛋白。通過上述HPLC條件，從其他微粒體的3MI代謝產物中分離UV-1，使用由LDCAnalyticalConstametric4100溶劑呈遞模塊(ThermoQuest,裡維埃拉，Fla.，美國)、HewlettPackard1040A二極體陣列檢測儀和HewlettPackard9000系列HPLC工作站(HewlettPackard公司，惠靈頓，Del.，美國)組成的系統。通過HPLC純化UV-1，在SavantSpeed-Vac(SavantInstruments,Farmingdale，紐約，美國)中濃縮後，從兩種相同溫育操作中收集。由於不穩定的UV-l會發生聚合和降解，不可能將濃縮物乾燥。因此，將樣品蒸發到200L的體積和在注射到HPLC中在進行純化。但是在這種情形下，水性的流動相由O.OIM磷酸氫二鉀緩衝液，pH9.0組成，處於99.9原子％氧化氚中。由於UV-1的不穩定性，當將其蒸發至乾燥時，最終的純化步驟有必要在NMR溶劑氧化氳中進行。再次收集UV-1，蒸發到250L的最終體積，直接添加到Shigemi麗R管中。用VarianUnityl雨a600MHz薩R(VarianAssociates公司，PaloAlto，加利福尼亞州，美國)，在氧化氚中獲取.sup.lH-NMR光譜。結果HPLC。由豬肝臟微粒體生成的代謝產物都不與吲哚-3-羧基乙醛或吲哚-3-羧酸一起被洗脫。但是，通過UV和/或螢光檢測來測量與HMOI、3MOI、13C、2-氨基苯乙酮一起被洗脫的代謝產物，以及兩種羥基糞臭素(5-和6-羥基-3-甲基吲哚)。羥吲哚代謝產物(HMOI和3MOI)以及吡咯環打開的代謝產物(2-氨基苯乙酮)不發出螢光，通過UV吸收來檢測和定量；通過螢光檢測來檢測和定量I3C和羥基糞臭素。當微粒體溫育物形成峰值時，根據保持時間來鑑定所有代謝產物，與其對應的可信標準物一起進行色譜分析。在250nm下通過UV吸收監測的微粒體溫育物和標準混合物的色譜圖形顯示在圖1中。UV光譜分析。根據在HPLC上的保持時間鑑定的代謝產物(HMOI、3MOI、13C和2-氨基苯乙酮)的UV光譜與可信標準物的UV光譜相同。用水作為溶劑，記錄代謝產物的光譜，最大吸收值的波長如下HMOI:入脂x(nm》208，253;3MOI:Xmax(nm):205，252;I3C:入薩(nm):221，278;2-氨基苯乙酮入max(nm):228,257。3-甲基吲哚的UV光譜為人max(nm):224，281;UV畫1代謝產物UV光譜為Amax(nm):204，238。UV-i的UV光譜與圖2所示的羥吲哚代謝產物3M0I和HMOI的光譜相似。將pH從3改變為H，不改變UV-1的光譜；該紅移的缺乏表明該未知代謝產物具有不游離的石碳酸基團。室溫下，將分離的UV-1保存在乙腈水溶液中，以7天的間隔通過HPLC分析該溶液6周。6周後，僅保留約25%原始化合物，UV-1轉化成3M01。3MOI和UV-l相對於時間的線性回歸的斜率表明，在HPLC-UV分析中，對UV-1摩爾響應因子是3MOI的2.95倍。代謝產物UV-1的結構數據。分離的UV-1的質譜分析產生一個m/z148[M+H].sup.+的分子離子，主要部分在m/z133[M—CH3]+，104[M--H3C—C—OH]+和77(質子化的苯環)(圖3)。代謝產物UV-1的^-NMR光譜顯示在圖4中。給出了質子信號的歸屬(assignment),以化學位移(多樣性、整合和歸屬)列出1.4(s，3H，—CH3);6.8(d，2H，H-5和H-6);7.2(d，2H，H-4和H-7);8.4(s，1H，H-2)。在8.4處的單峰(singlet)被指定是3-羥基-3-甲基假吲哚的C-2上的質子。該質子連接到sp.sup,2雜交的C-2上，C-2也被相鄰的氮原子去屏蔽。因此，該質子高度去屏蔽，在所提議的結構中位於其他所有質子的前場(downfield)。在2.0處，有螢光對應於汙染物乙腈的甲基質子的單峰。由於純化樣品所採用的方式，要去除存在於HPLC有機相中的所有乙腈是極其困難的。總之，發現了7種由豬肝臟微粒體生成的3MI的代謝產物3M01、HMOI、6-羥基-3-甲基卩引哚(6-羥基-3MI)、13C、2-氨基苯乙酮、5-羥基-3-甲基吲哚(5-羥基-3MI)，和命名為UV-1的代謝產物。當假設摩爾吸收率超過3MOI2.95倍來量化UV-l時，所生成的總納摩爾量平均佔微粒體溫育過程中代謝的3MI分子的％.0%(86.5-105.0%的範圍)。豬肝臟微粒體顯育中鑑定的七種代謝產物的產率顯示在表1中。UV-1代謝產物的產率最高(750.7pmol/mg蛋白/分鐘)，而5-羥基-3MI的產率最低(5.1pmol/mg蛋白/分鐘)。對於相同代謝產物的產率，最大的個體間的差異是顯著的。例如，UV-1代謝產物以1556.3pmol/mg蛋白/分鐘的速度由一頭豬的微粒體生成，而其他微粒體以180.5pmol/mg/蛋白/分鐘的速度生成該化合物律1)。以較大的量生成的代謝產物是UV-1，其平均佔所生成的所有代謝產物的45.1%。含有的羥吲哚佔總代謝產物的46.4%:平均所生成的代謝產物的27.9Q/。對應於3M01，而18.5%對應於HMOI。其他代謝產物以較少的含量生成。6-羥基-3MI佔代謝產物的4.9%，13(3佔2.7%，而2-氨基苯乙酮和5-羥基-3MI僅分別佔代謝產物的0.5%和0.3%。這些代謝產物的化學結構和產量比例顯示在圖5中。討論先前，在豬體內僅鑑定了三種階段I的3MI代謝產物HMOI和羥基糞臭素，5-羥基-3MI和6-羥基-3MI。已經發現HMOI存在於豬血漿和尿液中(Baek等人，1997)，以及豬肝臟微粒體溫育物中(Babol等人，1998a);在豬血清(Baek等人，1997)和豬肝臟微粒體溫育物(Babol等人，1998a)中都檢測到6-羥基-3MI，而5-羥基-3MI僅被報導存在於豬血清中(Baek等人，1997)。在本研究中，在微粒體溫育物都檢測到所有三種代謝產物，報導生成4種新的代謝產物。在如山羊、小鼠和大鼠等物種中確定的3MI生物轉化路徑之一是生成羥吲哚衍生物3MOI和HMOI(Frydman等人，1972;Smith等人，1993)。平均起來，在本研究中，46.4%由豬微粒體生成的代謝產物對應於這兩種羥吲哚衍生物；該發現表明，在豬體內，在數量上，氧化路徑是十分重要的。已經在大鼠肝臟微粒體溫育物(Frydman等人，1972)、山羊肺部和肝臟微粒體溫育物(Huijzer等人，1987)和山羊尿液(Hammond等人，1979)中鑑定了3M01。Babol等人(1998a)在豬微粒體溫育物中觀察到的代謝產物之一被命名為"UV-3"，本研究的結果表明，該代謝產物對應於3MOI。已經從施用3MI的豬的尿液中分離到3MI、麗OI的其他羥吲哚衍生物(Baek等人，1997)，還報導這些衍生物是由豬肝臟微粒體生成(Babol等人，1998a);HMOI還是施用放射標記的3MI的小鼠產生的主要尿液代謝產物(Skiles等人，1989)，另外，它們還存在於人(Albrecht等人，1989)和山羊(Smith等人，1993)的尿液中。有趣的是，在本研究中，豬肝臟微粒體生成大量3MOI和HMOI的氧化衍生物。在其他研究物種中，這些代謝產物之一佔主導地位。在山羊中，主要生成3MOI(Hammond等人，1979)，而在小鼠中，HMOI佔主導地位(Sm池等人，1993)。3MI的3-甲基基團可被氧化成乙醇。乙醛和羧酸官能團(Ham腸nd等人，1979)。在本研究中，發現豬肝臟微粒體僅生成3-甲基基團(吲哚-3-甲醇)的乙醇官能團。代謝產物具有強烈的螢光性，在紫外線下吸收，雖然先前已經報導其是由豬肝臟微粒體生成(由Babol等人，1998a命名為F_i)，其結構是未知的。重要的是，進一步代謝吲哚-3-甲醇的乙醇官能團可能是由乙醇脫氫酶催化的；如果這種理論是正確的，該反應的產物口引哚-3-羧基乙醛不會在微粒體溫育物中產生。在碳原子4、5、6或7的任何一個上都會發生3MI的芳香環的羥基化；但是，試驗證據表明，位置5和6上的羥基化是主要的。1962年，Jepson及其同事證實了兔子肝臟微粒體的羥基色胺、吲哚乙酸及其對應於6-羥基衍生物的相關吲哚。微粒體系統需要NADPH和氧氣，不會生成5-或7-羥基吲哚(Jepson等人，1962)。Mahon和Mattok(1967)分析了IO位正常的人受試者的尿液，發現所有樣品都含有6-羥基糞臭素，而9份樣品含有5-異構體，雖然5-異構體的排洩率約為6-異構體的50%，在三份樣品中檢測到7-羥基糞臭素，7-羥基糞臭素的排洩率僅為6-異構體的5%。所有的受試者都不排洩4-羥基糞臭素(Mahon和Mattok，1967)。Baek等人(1995)在豬血清中發現了5-羥基-3MI和6-羥基-3MI的偶聯物。在本研究中，6-羥基-3MI的平均產率約比5-異構體的產率高11倍，表明位置C6上的羥基化是主要的。Frydman等人(1972)發現，在用兔子肝臟微粒體溫育3-MI後，生成兩種吡咯環打開的代謝產物。這兩種化合物被鑑定為2-甲醯胺苯乙酮(formamidoacetophenone)和2-氨基苯乙酮；所生成的代謝產物中的33%對應於2-甲醯胺苯乙酮，12%對應於2-氨基苯乙酮，和5%對應於3-M0L在本研究中發現，2-氨基苯乙酮由所有被分析的肝臟樣品生成，平均百分比為0.5%，比Frydman等人(1972)報導的大鼠的百分比低得多。在文獻中，沒有關於由豬代謝3MI生成2-氨基苯乙酮的報導。代謝產物UV-1的^-NMR、LC-MS和UV-光譜特徵表明，該化合物對應於3-羥基-3-甲基假吲哚。UV-1是一種不穩定的化合物，是3MI和3MOI之間的中間產物。實際上，UV-1被轉化成3MOI，說明該化合物是3MOI的前體，可能是2，3-環氧-3-甲基吲哚，Sm他等人(1993)己經推測了2，3-環氧-3-甲基吲哚的結構，更加可能是2，3-環氧-3-甲基吲哚的開環產物3-羥基-3-甲基假吲哚(Skordos等人，簡a，簡b)。化合物(147)的分子量及其斷裂模式與epoxyde或亞胺具有可比性(圖3)，但是在238nm下具有入，的UV光譜(圖2)與亞胺的結構更為一致。147的分子量還對應於3MI的芳香石碳酸代謝產物；但是，當在不同pH獲取分離UV-l的UV光譜時，並不顯示出在石碳酸吲哚中觀察到的典型紅移。而且，實際上，代謝產物UV-1的UV光譜與3MOI和HMOI的光譜(圖2)十分相似，表明代謝產物UV-1與兩種羥吲哚的任何一種在結構上是相關的；這些在吡咯環的2-原子位置上被氧化的代謝產物具有顯著區別於3MI或其他代謝產物如13C、2-氨基苯乙酮或羥基糞臭素的光譜。最後，UV-1的^-NMR光譜(圖4)與將該代謝產物指定為(assignment)3-羥基-3-甲基假吲哚是一致的。本研究的結果表明，豬肝臟微粒體在體內生成了3MI的七種主要代謝產物。從數量上看，豬肝臟微粒體在階段I生物轉化3MI的主要路徑是形成羥吲哚的衍生物和形成3-羥基-3-甲基假吲哚。3MI在不同物種中的代謝命運的不同解釋了物種對發生3MI誘導的肺中毒的傾向性的差異。3MI被廣泛地代謝為羥B引哚衍生物可解釋由Carlson和Yost(1989)報導的在豬身上未表現出肺中毒(pneumotoxicity)。親電子代謝產物3-亞甲基-噴哚，被推斷是由細胞色素P-450酶產生的3MI反應產物，是肺部微粒體溫育物中的I3C的前體和以可檢測量存在的易受影響的形式I3C(Skiles和Yost，1996)。在該體外試驗中，少於3%的由豬肝臟微粒體生成的代謝產物對應於I3C,這可能還解釋了豬缺乏遭受3MI-誘導的肺部損傷易感性的原因。觀察到代謝產物產率存在大的個體間差異。階段I代謝中的這些差異可能是由於細胞色素P450酶的個體差異，而且應當對該組織進行進一步的研究。先前已經報導，CYP2E1在豬代謝3MI中起重要作用(Squires和Lundstr6m，1997;Babol等人，1998a)，但是其他異構酶的作用還未被確定。Babol等人(1998b)報導，一些由豬肝臟微粒體生成的3MI代謝產物的硫酸化和葡萄糖苷酸化。但是，需要更多的試驗來確定由本研究確定的3MI的不同代謝產物的整個階段II的代謝。實施例2:醛氧化酶材料與方法化學藥品。甲萘醌、奎納克林和別嘌呤醇購自Sigma-Aldrich加拿大(Oakville，ON，加拿大)。可信的HMOI由猶他州大學的藥理學和毒性學學院的G.S.Yost博士惠贈。HMI用豬肝臟微粒體生產，如先前描述的製備性HPLC分離和純化(Diaz等人，1999)。冷凍乾燥分離的HMI，並在-2(TC下保存在乾燥器中，直到使用。製備豬肝臟胞質。從30頭未經過閹割的公豬中獲取肝臟樣品，該公豬通過將歐洲野豬X瑞典約克夏豬的F3代公豬與瑞典約克夏母豬回交(Squires和Lundstrom，1997)而獲得。用液氮冷凍肝臟樣品，存儲在-80"C下。對於胞質餾分的製備，將部分解凍的肝臟樣品切碎，使用Ultra-Turax勻漿儀(Janke和Kunkel，GDR)，用4倍體積的0.05MTris-HCl緩衝液pH7.4(含有0.15MKC1、1mMEDTA和0.25M蔗糖)進行勻漿。以10，000xg離心勻漿20分鐘，生成的上清液再以100,000xg離心60分鐘，獲得胞質餾分和微粒體沉澱。分析前將胞質餾分存儲在-8(TC下。通過Smith等人(1985)的方法，用購自Pierce化學公司(Rockford，Ill.，美國)的二辛可寧酸蛋白分析試劑確定蛋白質濃度，牛血清白蛋白作為標準酶分析。為了研究AO在HMI轉化為HMOI中的作用，進行含有HMI、豬肝臟胞質和不同濃度所選擇的AO抑制劑甲萘醌和奎納克林的溫育。重複進行溫育，並對三種隨機選擇的豬胞質樣品進行溫育。通過"色譜分析"下描述的HPLC檢測和量化的HIMOI形成。測量AO活性為每分鐘由每毫克胞質蛋白形成的HMOI。分析混合物含有O.05M磷酸鈉緩衝液(pH7.4)，在250iU的最終分析體積中具有5mMMgCl2和1mMEDTA、1mg胞質蛋白禾P1UgHMI。對於抑制試驗，在分析混合物中測試不同最終濃度的甲萘醌(0、2、5—、10、25、50和100uM)或奎納克林(0、0.05、0.1、0.25、0.5禾01.0mM)。將甲萘醌溶解在乙醇(最終分析濃度4%，v/v)，對無抑制劑的對照活性無作用；將奎納克林溶解在緩衝液中。37。C下在搖床水浴中溫育10分鐘；用250U1冰冷乙腈終止反應。在加入乙腈後，漩渦攪拌混合物，以7,500rpm離心15分鐘。用400ul水稀釋400nl的澄清上清液的等分試樣，立即用高相液相色譜(HPLC)分析100ul混合物。需要用水稀釋，以避免色譜峰值的引導(leading)。用外部標準物來量化HMOI產量。對照包括用煮沸的胞質的溫育和未添加胞質進行的溫育。用0.1、0.5和l.OmM別嘌呤醇進行與上述相同條件下進行的溫育，以研究XO對將HMI酶促轉化為HMOI的作用。色譜分析。用Spectra-Physics系統(Spectra-Physics，聖何塞，加利福尼亞州，美國)進行HPLC，該系統由SP8800梯度泵、具有100nl注射環的SP8880自動取樣器和SP光譜100UV檢測儀組成。該HPLC方法是對先前報導的雙梯度系統方法(Baek等人，1997)的改進。用反相ProdigyODS，5pm，250X4.6mm柱(Phenomenex，託蘭斯，加利福尼亞州，美國)分離HMOI和HMI。流動相由兩種溶劑組成，A(0.01M磷酸二氫鉀緩衝液pH3.9)和B(乙腈)，採用如下梯度O分鐘--90%A，6分鐘—80%A;12分鐘--70%A;18分鐘—30%A;25分鐘10%A;26分鐘90%A;35分鐘-90%A。所有的梯度是線性的，流速設定為1.2ml/分鐘。在250nm下監測吸光率。溫育後，立即進行HPLC分析。測量3MI的脂肪含量。對3MI脂肪含量的測量，從每頭豬身上獲取背部脂肪樣品，用比色分析測量其中的3MI含量(Mortensen和Sorensen，1984)。所有分析重複進行。統計分析。用統計分析系統(SAS，1995)計算皮爾森相關係數、線性回歸分析和單因子ANOVA。結果豬胞質以時間依賴的方式(圖7)催化HMI轉化為HMOI(圖6)。在這些分析條件下，發現HMOI的形成為線性(r2=0.995)長達10分鐘(圖7)。在溫育前加入煮沸的胞質或者當未將胞質加入到分析混合物中時，無HMOI生成。將醛氧化酶抑制劑甲萘醌或奎納克林加入含有HMI和胞質蛋白質的溫育混合物，降低以劑量依賴的方式形成HMOI。當未加入抑制劑時，將所生成的總量HMOI視為100%。在濃度為lOyM甲萘醌時，僅檢測到在缺乏甲萘醌時形成的HMOI的33.3%,而在濃度為100pM的甲萘醌時，無HMOI生成(圖8)。在濃度為50uM的奎納克林時，觀察到對照HMOI產量的75.5%，而為1mM濃度時，觀察到對照HMOI產量的43.4%(圖9)。由於即使奎納克林濃度比甲萘醌濃度高10倍(lmM比iU00M)也不足以完全消除將HMI轉化為HMOI，甲萘醌是更為可能的反應抑制劑。將多達l.OmM別嘌昤醇加入到分析混合物中，並不影響將HMI轉化為HMOI(數據未顯示)。AO活性估計為每分鐘由每毫克胞質蛋白質生成的HMOI的納摩爾數，30頭用於本研究中的豬的AO活性與3MI脂肪含量相比顯示在圖10中。這兩個變量間的皮爾森相關係數為-0.70(P<0.001)，而決定係數為r2=0.49。用於解釋3MI脂肪含量是AO活性的函數的線性回歸模型為-脂肪中的3MI=0.22-AO活性0.042763。該模型極其顯著(P<0.001)。所有樣品中的3MI的脂肪含量範圍在0.07-0.3mg/kg，平均值為0.15mg/kg，而AO活性範圍在0.25到3.53nmolHMOI/mg蛋白/分鐘，平均值為1.27nmolHMOI/mg蛋白/分鐘。根據每頭豬的3MI脂肪含量，將結果劃分為如下三類高3MI沉積(0.2mg/kg3MI或更高)、中度3MI沉積(0.11-0.19mg/kg3MI)和低沉積(0.1mg/kg3MI或更低)。Lundstr6m和Bo皿eau(1996)已經通過感官分析證明，0.2-0.25mg/kg或更高的3MI含量導致產生難以接受的臊味。這三類豬的3MI脂肪含量和AO活性的平均值顯示在表2中。討論甲萘醌被充分證明是AO的抑制劑(Johns，1967;Krenitzky等人，1974;Rodrigues，1994)，而對甲萘醌抑制敏感的生物化學反應引起AO(Beedham等人，1995;Rashidi等人，1997)。Rodrigues(1994)發現，在10iiM的濃度下，甲萘醌完全消除Nl-甲基菸鹼和AO模型底物的氧化。在本試驗中，濃度為lOyM甲萘醌降低56.7%的HMOI形成，而在100wM甲萘醌時，無HMOI生成，表明完全抑制其催化活性。所觀察到的HMOI產量和甲萘醌濃度之間相反的劑量依賴關係有力地證明了在豬胞質中，AO負責將HMI生物轉化為HMOI的酶。奎納克林被報導為一種抵抗所有底物的競爭性的醛氧化酶抑制劑(Ki=1.5X10—6M)(Rajagopalan禾口Handler,1964)。在本試驗中，在抑制將HMI轉化HMOI中，奎納克林的效率低於甲萘醌，但是奎納克林在更大的程度上抑制反應。奎納克林抑制HMOI生成還表明，由HMI生成HMOI是由AO催化的。另一個方面，當將別嘌呤醇加入到反應混合物中未觀察到抑制作用，表明XO與HMI轉化為HMOI的氧化代謝無關。N-雜環陽離子構成AO底物的主要基團(Beedham，1985)。環膽原子的季胺化刺激雜環發生親質子取代，從而增強化合物發生酶催化的連接的反應活性(Beedham，1985)。HMI是最近被鑑定的由豬微粒體酶生成的N-雜環季胺化的代謝產物(Diaz等人，1999)，因此，其構成了AO催化氧化的合適底物。本研究的結果有力地證明了豬胞質中存在的AO活性負責HMI的氧化，生成極性更高、更加穩定的代謝產物HMOI。當肝臟AO活性相對於3MI的脂肪含量作圖(以HMOI生成來測量)，觀察到明顯的反比例關係(圖9)。該結果表明，肝臟AO活性與3MI清除相關。相對高的決定係數(r2=0.49)表明幾乎50。/。的3MI的脂肪含量變化是由肝臟中的AO酶促活性引起的。顯示在表2中的結果也表明在大量清除豬體內的3MI時，AO活性是重要的。高的3MI的脂肪含量還有低酶促活性相關(平均值分別為0.24mg/kg3MI和0.80nmolHMOI/mg蛋白/分鐘)，而低3MI水平與高酶促活性相關(平均值分別為0.09mg/kg3MI和2.73nmolHMOI/mg蛋白/分鐘)。劃分為高3MI沉積的豬的平均AO活性比那些劃分為低沉積的豬低3.4倍；該差異是顯著的(P<0.05)。本研究的結果暗示，AO在豬體內的3MI代謝中起重要作用，其催化活性與充分清除3MI相關。豬體內的AO酶促活性可以用作一種潛在的標記，用於鑑定在脂肪中含有低水平3MI的豬，這將最終有助於控制"公豬羶味"。甲萘醌通常被用作豬飼料中的維生素K的來源(NationalResearchCouncil,1987)。推薦的含量為2.5mg/kg用於生長料，2.0mg/kg用於肥育料(Patience等人，1995)。由於甲萘醌是一種有效的AO抑制劑，該酶在3MI的代謝中似乎是重要的，豬飼料中不應當存在過量的甲萘醌。有可能某些情況下的"公豬羶味"是由於飼料中的高含量甲萘醌引起的，高含量的甲萘醌導致在豬脂肪中產生高水平的3MI。還需要研究以確定通常用於豬飼料中的甲萘醌水平是否能夠抑制AO活性。此外，已經觀察到飼料中高水平的銅導致鉬缺乏，從而引起低AO活性，這是因為鉬是AO酶的協同因子(Beedham，1985)。避免在豬飼料中使用過量銅是重要的，以避免AO活性降低和可能產生"公豬羶味"。實施例3:CYP2A6在豬肝臟微粒體代謝3-甲基吲哚中的作用用選擇性的化學抑制劑，研究不同細胞色素P450酶對3-甲基吲哚(3MI)代謝的作用。篩選P450酶的8種化學抑制劑對豬微粒體中的3MI代謝的抑制特異性a-萘磺酮(CYP1A2)、8-甲氧基補骨脂素(8-methoxypsoralen)(CYP2A6)、薄荷呋喃(menthoforan)(CYP2A6)、磺胺二甲基苯基吡唑酮(sulphaphenazole)(CYP2C9)、奎納定(quinidine)(CYP2D6)、4-甲基吡唑(CYP2E1)，二乙基二硫代氨基甲酸酯(diethyldithiocarbamate)(CYP2E1，CYP2A6)和三乙醯竹桃黴素(troleandomycin)(CYP3A4)。在微粒體溫育物中，不同的3MI代謝產物的生成僅受CYP2E1和CYP2A6抑制劑存在的影響。在第二個試驗中，通過Western印跡分析，篩選一組豬微粒體(n=30)中的CYP2A6含量，以及7-羥基化活性(CYP2A6活性)。蛋白質含量和酶促活性與3MI的脂肪含量相關。本研究的結果表明，對CYP2A6水平和/或活性的測量是3MI誘導的公豬羶味的一種有用標記。表l:豬肝臟微粒體生成的3MI代謝產物的產率(pmol/mg微粒體蛋白/分鐘)(r^30)tableseeoriginaldocumentpage32*11.丄=未檢測到表2tableseeoriginaldocumentpage33同一列中的a《是指缺乏相同上標的之間具有顯著的差別(P<0.05)。實施例4根據本發明，聯合不同形式的細胞色素P450酶如CYP2A6，用於鑑定和選擇公豬羶味不同的豬。例如，按照本發明，鑑定CYP2A6基因的缺失突變體，其產生閱讀框移碼和缺失的功能突變，在豬體內產生更高的糞臭素水平。本發明人已經克隆了豬的CYP2A6異構體。本發明人發現一種導致閱讀框移碼和成熟前終止的缺失突變。這種動物肝臟中的CYP2A6(香豆素7-羥化酶)酶活性為零，脂肪中的糞臭素水平高。鑑定了另一種多態性，導致nt編號124上的a轉變為c，而SEQIDNO:3(野生型)的胺基酸編號42的Phe變為Leu。按照本發明，還鑑定了豬體內與糞臭素代謝相關的其他基因多態性(其他的細胞色素P450相關基因)，根據豬產生公豬羶味的傾向性來遺傳鑑定和選擇豬。一旦確定一種基因或基因產物與特定特性之間的關係時，對編碼這種蛋白質的基因進行篩選，確定其作為標記的多態性，這種標記用於顯示這些動物在相關特性方面的差異。這些基因的多態性使得可以鑑定遺傳學標記，用於特定的品種或遺傳品系(geneticline)或動物，在動物幼年時確定其產生公豬羶味的可能性。按照本發明，鑑定了其他形式的CYP2A6，其會引起移碼，產生成熟前終止密碼子和功能缺失，導致在豬體內產生較高的糞臭素水平。用在此公開的CYP2A6的新序列，或者上文的SEQIDNO:18或3，在此公開的SEQIDNO:1的突變體(缺失124nt和422)、SEQIDNO:5的突變體(僅缺失124nt)和SEQIDNO:7(僅缺失422)的突變體，可以開發檢測是否存在這種改變形式CYP2A6的方法。這些檢測方法包括但是不限於PCR、SSCP等。因此，本發明涉及動物體內具有經濟價值的特性的遺傳學標記。基於醛氧化酶路徑和CYP2A6與糞臭素生成相關的發現，該標記表現為與公豬羶味相關的等位基因或者其他基因形式。因此，本發明涉及遺傳學標記和在特定的動物、品種、品系、種群(population)或類群(group)的一頭動物中鑑定這些標記的方法，其中動物體內的糞臭素代謝被增加、降低或者改變，從而增加、降低或者改變公豬羶味。任何鑑定這些標記的存在與否的方法都可以使用，包括，例如單鏈構象多態性(SSCP)分析、鹼基刪除序列掃描(BESS)、RFLP分析、異源雙鏈分子分析、變性梯度凝膠電泳和溫度梯度電泳、等位基因PCR、連接酶鏈式反應直接測序、小型測序、核酸雜交、微陣列檢測編碼與糞臭素代謝相關酶的基因。在本發明的保護範圍內還包括分析存在該多態性時發生的蛋白質構象和序列的改變。多態性可能是或者可能不是導致結果的突變，但是指示存在這種改變，可以分析產生這種表型差異的基因或蛋白質的基礎。如下是用於分析本發明的遺傳學標記的技術的概括。在本發明中，從動物中獲取遺傳物質的樣品。樣品可以從血液、組織、精液等獲得。通常，外周血細胞用作來源，遺傳物質為DNA。獲得足量細胞，以提供足夠用於分析的DNA。這種含量是已知的，容易由本領域技術人員確定。通過本領域技術人員知曉的技術從血細胞中分離DNA。核酸的分離和擴增從任何便捷的來源中分離基因組DNA樣品，包括唾液、口腔細胞、髮根、血液、臍帶血(cordblood)、羊水、間質液(interstitialfluid)、腹水、絨毛膜和任何其他合適的細胞或者具有完整的間期細胞核或者中期細胞的組織樣品。從固體組織中獲取細胞，如從鮮新或者冷凍的器官或者從組織樣品或者活組織檢查中獲得。樣品中含有不是天然地與生物材料混雜的化合物，如防腐劑、抗凝血劑、緩衝液、固定劑、營養劑抗生素等。用於從這些各種來源中分離基因組DNA的方法被描述在，例如Kirby，ZWJF/"g"n'油'wg，爿"/旨ot/Mc"o"，W.H.Freeman&Co.紐約(1992)中。還可以從培養的原代或者次級細胞培養物或者從來源於上述組織樣品的任何之一的轉化細胞系中分離基因組DNA。還使用動物RNA樣品。如上文的Sambrook等人中所述，從表達該基因的組織中分離RNA。RNA可以是總細胞RNA、mRNA、polyA+RNA，或者它們的任何組合。為了獲得最好的結果，將RNA純化，也可以是純化的胞質RNA。可以將RNA反轉錄成DNA，然後將DNA作為擴增模板，使得PCR直接擴增出特定的RNA轉錄本群體。參見，例如Sambrook，同上文，Kawasaki等人，PCRTechnology中第8章(1992)同上文，和Berg等人，/fMm.Ge"ef.85:655-658(1990)。PCR擴增最常用的擴增方法是聚合酶鏈式反應(PCR)，如美國專利4,683,195;4，683,202和4，965，188中所描述，這些專利的每一份在此引入作為參考。如果用PCR在血細胞中擴增目標區域，應當將肝素化的全血加到封閉的真空管中，與其他樣品分開，戴乾淨的手套。為了獲得最佳結果，在收集血液後應立即進行加工；如果不可能做到這一點，應當在fC下將血液保存在封閉容器中，直到使用。還應當分析其他生理液體中的細胞。當使用這些液體的任何一種時，應當通過離心從液體成分中分離液體中的細胞。用無菌的、一次性解剖刀和無菌針頭(或者兩片解剖刀)，在5mmPetri培養皿中粗略地切碎組織。在本領域技術人員知曉的各種專業手冊中描述了從組織切片上去除石蠟的方法。為了通過PCR擴增樣品中的目標核酸序列，該序列必須能夠被擴增系統中的成分接近。一種分離目標DNA的方法是粗提取，可用於相對較大的樣品。簡而言之，用標準方法，通過在無菌的Ficoll-Hypaque梯度上分層，分離來自血液樣品的單核細胞、來自羊水的羊膜細胞(amnk)cyte)、培養的絨毛膜細胞等。收集間期細胞，進行DNA提取前，在無菌磷酸緩衝鹽水中洗滌三次。如果對來自外周血淋巴細胞DNA進行檢測，進行滲壓休克(用蒸餾水處理沉澱IO秒鐘)，如果在初次洗滌後可見殘餘的紅血球，再洗滌兩次。這將防止血色素攜帶的亞鐵血紅素基團對PCR反應的抑制作用。如果在樣品收集後不立即進行PCR檢測，則將106細胞的等分試樣沉澱在無菌的Eppendorf管中，將乾燥沉澱冷凍在-2(TC下，直到使用。將細胞重懸(每100ii1有106個去核細胞)在緩衝液中，該緩衝液含有50mMTris-HCl(pH8.3)、50mMKC1、1.5mMMgCl2、0.5%Tween20和0.5%NP40,添加lOOug/ml蛋白酶K。在56"下溫育2小時後，加熱細胞到95。CIO分鐘，滅活蛋白酶K，立即轉移到溼冰上(速冷)。如果存在粗聚集物，需要在相同的緩衝液中進行另一個循環消化。將10Pl該提取物用於擴增。當從組織中提取DNA時，如從絨毛膜細胞或者匯合的培養細胞中提取，上述具有蛋白酶K的緩衝液的用量根據組織樣品大小而變化。在50-60。C下溫育提取物4-10小時，然後在95。C下溫育10分鐘，以滅活蛋白酶。在較長的溫育時期內，在最初濃縮的約4小時後應當加入鮮新的蛋白酶K。當樣品含有少數細胞時，通過Higuchi，"SimpleandRapidPreparationofSamplesforPCR"，PCT7fec/""o/ogK，Ehrlich，H.A.(編輯)，Stockton出版社，紐約中描述的方法來進行提取，其在此引入作為參考。採用PCR來擴增數量極少的細胞(1000-5000個)中的目標區域，這些細胞來源於骨髓和外周血培養物的單個菌落。樣品中的細胞懸浮在20ul的PCR溶解緩衝液(10mMTris畫HCl(pH8.3)、50mMKC1、2.5mMMgCl2、0.1mg/ml白明膠、0.45%NP40、0.45%Tween20)中，冷凍直到使用。將進行PCR時，將0.6ul蛋白酶K(2mg/ml)加入到PCR溶解緩衝液中的細胞中。然後將樣品加熱到約6(TC，溫育1小時。將樣品加熱到95t:iO分鐘，然後在冰上冷卻，滅活蛋白酶K，終止消化。用PCR提取DNA的相對容易的方法是鹽析，由Miller等人，M/c/e/cA^^/fe&16:1215(1988)描述的方法改進得到，該文獻在此引入作為參考。在Ficoll-Hypaque梯度中分離單核細胞。將細胞重懸在3ml溶解緩衝液(lOmMTris-HC1、400mMNaCl、2mMNa2EDTA，pH8.2)中。將50u1的20mg/ml蛋白酶K溶液和150P1的20%SDS溶液加入到細胞中，在37"下溫育過夜。溫育過程中搖動試管，將增進樣品的消化。如果在過夜溫育後，蛋白酶K消化不完全(仍然可見碎片)，在溶液中再混合50ul20mg/ml蛋白酶K溶液，在37C下在搖床上再溫育一個晚上。在充分消化後，將lml6MNaCl溶液加到樣品中，用力混合。生成的溶液以3000rpm離心15分鐘。沉澱含有沉澱的細胞蛋白，而上清液含有DNA。將上清液轉移到含有4ml異丙醇的15ml試管中。輕輕混合試管中的內容物，直到水和醇相相互混合，生成白色的DNA沉澱。取出DNA沉澱，浸潤在70%乙醇溶液中，輕輕混合。從乙醇中取出DNA沉澱，風乾。將沉澱放到水中，溶解。用於提取高分子量的DNA的PCR試劑盒包括基因組分離試劑盒A.S.A.P.(BoehringerMannheim，印第安納波利斯，印第安納州)、基因組DNA分離系統(GIBCOBRL，Gakhersburg，馬裡蘭州)、Elu-QuikDNA純化試劑盒(Schleicher&Schuell，Keene，N.H.)、DNA提取試劑盒(Stmtagene，LaJolla，加利福尼亞州)、TurboGen分離試劑盒(Invitrogen，聖地牙哥，加利福尼亞州)等。在實施本發明的方法前，通常適合按照廠商的推薦，使用這些試劑盒來純化DNA。在260nm和280mn下，分光光度分析稀釋的等分試樣的吸光率，可以確定所提取的DNA的濃度和純度。在提取DNA後，進行PCR擴增。每個PCR循環的第一步包括通過引物延伸分離形成的核酸雙鏈體。一旦鏈被分離，PCR中的下一個步驟包括使分離的鏈雜交與目標序列側面連接的引物。然後延伸引物，形成互補的目標鏈拷貝。為了成功的進行PCR擴增，設計引物，使得由一條引物合成的延伸產物從模板(互補序列)上分離時，作為其他引物延伸的模板。重複變性、雜交和延伸的循環必需的次數，以獲得期望數量的擴增核酸。在特別有用的PCR擴增實施方案中，通過將反應加熱到足夠高的溫度和足夠長時間，使二聚體變性而不會不可逆地變性聚合酶，實現鏈分離(參見美國專利4,965,188，在此引入作為參考)。典型的加熱變性包括在80-105。C的範圍內加熱數秒到數分鐘。但是，可以通過任何合適的變性方法，包括物理的、化學的、或者酶促的方法，來實現鏈分離。可以用解旋酶，如具有解旋酶活性的酶，誘導鏈分離。例如，存在ATP時，酶RecA具有解旋酶活性。適合用解旋酶進行鏈分離的反應條件在本領域是已知的(參見KuhnHoffman-Berling，1978，C57f-0/朋故加've所o/ogy，43:63-67;和Radding，1982，Tev.G^幼b16:405-436，這些文獻的每一份在此引入作為參考)。在反應液中存在足量四種三磷酸脫氧核糖核酸(典型地為ATP、dGTP、dCTP和dTTP)時，PCR中模板依賴的引物擴增是由聚合試劑催化的，該反應液包含適當鹽、金屬陽離子和Ph緩衝體系。合適的聚合試劑是己知能夠催化模板依賴的DNA合成的酶。在有些情形下，目標區域可能編碼一部分由細胞表達的蛋白質。在這種情形下，用mRNA擴增目標區域。此外，用PCR從RNA生成cDNA文庫，用於進一步擴增，用於引物延伸的起始模板是RNA。適合用於從RNA模板合成互補的、拷貝DNA(cDNA)序列的聚合試劑是逆轉錄酶(RT)，例如鳥成髓病毒(avianmyeloblastosisvims)RT、莫洛尼鼠白血病病毒RT或者Thermus嗜熱菌(Tth)DNA聚合酶、PerkinElmerCetus公司銷售的具有逆轉錄酶活性的熱穩定DNA聚合酶。通常，在僅留下DNA模板的起始反轉錄步驟後，在第一個變性步驟中將基因組RNA模板加熱降解。適合與DNA模板一起使用的聚合酶包括，例如大腸桿菌DNA聚合酶I或其Klenow片段、T4DNA聚合酶、Tth聚合酶和Taq聚合酶、分離自棲熱水生菌(T7z^附^a，加'c附)並且可以從PerkinElmerCetus公司購買得到的熱穩定的DNA聚合酶。後面這種酶被廣泛用於核酸的擴增和測序。使用Taq聚合酶的反應條件在本領域是已知的，描述在Gelfand，1989，T^c/z"o/ogy，同上文o等位基因特異性PCR等位基因特異性PCR顯示在變體或多態性上存在差別的目標區域之間的差異。選擇PCR擴增引物，該引物僅結合目標序列的某些等位基因。Gibbs，A^c/e/c爿cWiey.l7:12427-2448(1989)中描述了該方法。等位基因特異性寡核苷酸篩選方法其他診斷性的篩選方法採用等位基因特異性寡核苷酸(ASO)篩選方法，如Saiki等人，Atowe324:163-166(1986)所描述。對於任何特定的等位基因，生成具有一個或多個鹼基對錯配的寡核苷酸。ASO篩選方法檢測不同目標基因組的或者PCR擴增的DNA與未突變的寡核苷酸之間的錯配，顯示相對於突變寡核苷酸，該寡核苷酸的結合能力下降。設計寡核苷酸探針，使得在低嚴格性條件下，這些探針能夠結合到兩種多態性形式的等位基因上，但是在高嚴格性條件下，結合到其所對應的等位基因上。此外，設計嚴格性條件，以產生實質上的雙元反應，即對應於不同形式的目標基因的ASO將會雜交到該等位基因上，而不結合到野生型的等位基因上(連接酶介導的等位基因檢測方法通過連接酶介導的等位基因檢測，將測試對象的DNA的目標區域與未受影響的和受影響的家族成員中的目標區域比較。參見Landegren等人，Sc/wce241:107-1080(1988)。還可以用連接酶，在Wu等人，Ge"om/cs4:560-569(1989)描述的連接擴增反應中檢測點突變。連接擴增反應(LAR)採用如Wu，同上文，和Barany，戶rac.Ato.A^/.88:189-193(1990)中描述的模板依賴的連接，擴增特異性DNA序列。變性梯度凝膠電泳用聚合酶鏈式反應生成的擴增產物用變性梯度凝膠電泳分析。根據不同的序列依賴性解鏈特性和溶液中的DNA的電泳遷移，鑑定不同的等位基因。在溫度升高或者變性的條件下，DNA分子成段解鏈，該片段稱作為解鏈結構域。在不同的鹼基特異性解鏈溫度(Tm)下，各個解鏈結構域共同解鏈。解鏈結構域至少長20個鹼基對，而且長達數百個鹼基對。可以用聚丙烯醯胺凝膠電泳，如Erlich編輯的戶Cirec/mo/ogy的第7章，"PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification",W.H.FreemanandCo.,紐約(1992)中所描述，其內容在此引入作為參考，來評價等位基因間基於序列特異性解鏈結構域差別的差異。通常，通過變性梯度凝膠電泳分析的目標區域用與目標區域側面連接的PCR引物來擴增。將所擴增的PCR產物應用於具有線性的變性梯度的聚丙烯醯胺凝膠，如Myers等人，Me//z.￡:"w"7o/.155:501-527(1986)，禾口Myers等人，GW20附/cy^a/，》，APracticalApproach,K.Davies編輯，IRL出版有限公司，牛津，95-139(1988)，其內容在此引入作為參考。將電泳系統維持的略微低於目標序列的解鏈結構域的Tm的溫度下。在可替代的變性梯度凝膠電泳方法中，首先將目標序列連接到一條稱作為GC夾的GC核苷酸鏈上，這種GC核苷酸鏈在Eriich，同上文的第7章中有描述。優選地，GC夾中的核苷酸至少80%為鳥嘌呤或胞嘧啶。優選地，GC夾至少長30個鹼基。這種方法特別適合於具有高Tm的目標序列。通常，用如上所述的聚合酶鏈式反應來擴增目標區域。寡核苷酸PCR引物之一在其5'端具有GC夾區域，至少30個鹼基的富含GC的序列，其在擴增過程中結合到目標區域的5'端上。在如上描述的變性梯度條件下，對所生成的擴增目標區域進行電泳。單個鹼基改變而不同的DNA片段將通過凝膠遷移到不同位置上，通過溴乙啶染色來顯示。溫度梯度凝膠電泳溫度梯度凝膠電泳(TGGE)基於與變性梯度凝膠電泳相同的潛在原理，不過變性梯度是由溫度不同而不是化學變性劑的濃度不同產生。標準TGGE採用一種電泳設備，在泳道上形成溫度梯度。由於樣品是在具有相同濃度的化學變性劑的凝膠上遷移，遭遇逐步升高的溫度。一種可替代的TGGE方法，瞬時溫度梯度凝膠電泳(TTGE或tTGGE)採用穩定升高的整個電泳凝膠的溫度，獲得相同結果。當樣品沿著凝膠遷移，整個凝膠的溫度升高，使得樣品在凝膠上遷移時遭遇逐步升高的溫度。樣品的製備，包括結合GC夾的PCR擴增和產物顯示，與變性梯度凝膠電泳相同。單鏈構象多態性分析在所選擇的公豬羶味位點上的目標序列或等位基因用單鏈構象多態性分析來區分，該分析通過單鏈PCR產物在電泳遷移中的變化鑑定鹼基差異，如Orita等人，屍rac.淑A^5W.85:2766-2770(1989)所描述。如上所述生成所擴增的PCR產物，加熱或變性，生成單鏈的擴增產物。單鏈核酸可能再摺疊或者形成部分地依賴於鹼基序列的二級結構。因此，單鏈擴增產物的電泳遷移率能夠檢測等位基因或者目標序列之間的鹼基序列差異。錯配的化學或酶促斷裂通過如Grompe等人，^肌j:/^m.Ge"".48:212-222(1991)描述的錯配鹼基對的示差性化學斷裂，檢測目標序列之間的差異。在另一種方法中，通過Nelson等人，Atowre4:11-18(1993)描述的酶促斷裂錯配鹼基對，檢測目標序列間的差別。簡而言之，來自動物和受影響的家族成員的遺傳物質用於生成無錯配的異種雜合(heterohybrid)DNA二聚體。如在此所用，"異種雜合體"是指包含一條來自一種動物的DNA鏈和第二條來自另一種動物的DNA鏈的DNA二聚體，通常動物在感興趣特性的表型是不同。陽性選擇無錯配的異種雜合體，可以確定小的插入、缺失或者其他與多態性相關的多態現象。非凝膠系統其他可能技術包括非凝膠系統，如TAQMANTM(PerkinElmer)。在該系統中，設計寡核苷酸PCR引物，與所研究的突變側面連接，以PCR擴增該區域。然後設計第三種寡核苷酸探針，與含有在基因的不同等位基因間發生變化的鹼基的區域雜交。該探針的5'和3'端用螢光染料標記。選擇染料，使得在它們相互接近時，它們之一的螢光性被另一個淬滅而不被檢測到。通過TaqDNA聚合酶，由相對於探針位於模板5'端上的PCR引物進行延伸，導致由TaqDNA聚合酶的5'核酸酶活性，將連接到退火探針的5'端上的染料斷裂。這去除了淬滅作用，使得可以檢測來自探針的3'端的染料的螢光性。如果探針與模板分子結合不完全，即存在某些形式的錯配，不發生染料斷裂，出現不同DNA序列間的差別。因此，僅當寡核苷酸探針的核苷酸序列與其所結合的模板分子完全互補時，才避免淬滅。反應混合物含有不同探針序列，各種探針序列被設計來結合可能存在的不同等位基因，從而可以在一個反應中檢測兩種等位基因。還有另一種技術包括侵略者分析(InvaderAssay),包括依賴於催化釋放螢光性的等溫性擴增。參見www.twt.com的ThirdWaveTechnology。非基於PCR的DNA診斷學對於連接到編碼與糞臭素代謝相關的酶的序列上的DNA序列的鑑定，可以不用擴增步驟來進行，而基於多態性，包括動物和家族成員中的限制性片段長度多態性。雜交探針通常是寡核苷酸，其通過互補鹼基配對結合到目標核酸的全部或部分上。探針通常結合到缺乏探針序列的完全互補性的目標序列上，這取決於雜交條件的嚴格性。優選地直接或間距地標記探針，使得通過分析探針的存在與否，可以檢測目標序列的存在與否。直接標記方法包括放射性同位素標記，例如用P"或S35。間接標記方法包括螢光標記、結合抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素的生物素複合物，或者肽或蛋白質標記。視察方法包括冷光劑(photoluminescent)、德克薩斯紅(Texasred)、羅丹明及其衍生物、紅色的無色染料和3,3',5,5'-四甲基對二氨基聯苯(TMB)，螢光素及衍生物、丹磺醯、7-羥基香豆素等等，或用辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶等。雜交探針包括任何能夠雜交到豬染色體上的核苷酸序列，其中CYP2A6基因或其他與糞臭素代謝相關基因存在於該染色體上，從而定義連接到該基因上的遺傳學標記，包括限制性片段長度的多態性、超變區、重複元件或者變化的串聯重複。雜交探針可以是任何基因或合適的類似物。其他的合適探針包括外顯子片段或者己知會作圖到染色體的相關區域上的cDNA或基因的部分。按照本發明使用的優選串聯重複雜交探針是那些在高嚴格性條件下識別特定基因座上的少量片段的探針，或者在嚴格性條件降低時識別該基因座上的較多片段的探針。可以使用一種或多種其他限制性酶和減探針和減引物。其他酶、構造的探針和弓I物可由本領域普通技術人員通過常規試驗來確定，落入本發明的保護範圍內。按照本發明，已經鑑定了編碼與糞臭素代謝相關的酶的基因中的多態性，該多態性與公豬羶味相關。在一個實施方案中，通過PCR-RFLP分析檢測是否存在這些標記，使用限制性核酸內切酶，由於多態性周圍的區域高度同源，用類似的人、豬或其他序列設計擴增引物，或者用在GenBank中列舉的已知基因序列數據設計擴增引物，甚至根據在此描述的技術和參考文獻，根據從來自緊密環繞基因的連接數據獲得的序列來設計擴增引物。環繞多態性的序列將便於開發可替代的PCR檢測方法，在該方法中，從緊鄰多態性的序列中獲得的約4-30個連續鹼基的引物與聚合酶鏈式反應連同使用，在用期望的限制性酶處理前極大地擴增該區域。引物不必是完全互補的；基本上相當的序列是可接受的。設計用於PCR擴增的引物是本領域技術人員已知的，被詳細地公開在Ausubel(編車葺)，ShortProtocolsinMolecularBiology,第4版，JohnWiley禾卩Sons(1999)。如下簡單描述引物的設計。引物設計策略聚合酶鏈式反應(PCR)方法使用的增加，促進許多輔助設計或選擇用作PCR引物的寡核苷酸的程序開發。四個可以通過網際網路免費獲得的這種程序的例子是由懷特黑德學院的MarkDaiy和SteveLincoln開發的PRIMER(UNIX、VMS、DOS和Macintosh)、聖路易斯的華盛頓大學的PhilGreen和LaDeanaHiller開發的寡核苷酸選擇程序(OSP)(LTNIX、VMS、DOS和Macintosh)、Yoshi開發的PGEN(僅在DOS下操作)和威斯康星大學的BillEngels開發的Amplify(僅在Macintosh下操作)。通常，這些程序通過搜索已知重複序列元件的比特數，然後通過分析假定引物的長度和GC含量來優化Tm，輔助PCR引物設計。還可以購買得到商業軟體，引物選擇操作被包括在大多數的序列分析軟體包中。測序和PCR的引物設計用作測序或PCR的引物的寡核苷酸，需要選擇特異性地識別目標的合適序列，然後檢測該序列，排出該寡核苷酸具有穩定的二級結構的可能性。用上面描述的那些重複鑑定或RNA再摺疊程序，確定序列中的反向重複。如果觀察到一種可能的莖結構，在任何方向上改變引物序列的少數核苷酸，使預期的二級結構最小化。還將寡核苷酸的序列與適當的載體和插入DNA的鏈的序列比較。顯然，測序引物與目標DNA僅具有單一配對。去除與不期望的目標DNA序列僅有單個錯配的也是明智的。對於用於擴增基因組DNA的PCR引物，應當將引物序列與GenBank資料庫中的序列比較，確定是否發生任何顯著配對。如果寡核苷酸序列存在於任何已知的DNA序列中，或者更重要的是存在於任何未知的重複元件中時，應當更換該引物序列。本發明的方法和材料更通常用於評價豬的DNA、對個體豬進行遺傳分析和檢測豬間的遺傳差異。特別地，參照一個或多個多種，評價豬基因組DNA樣品，確定特定基因中的多態性是否存在。優選地，對豬基因進行RFLP分析，將結果與對照比較。對照是RFLP分析不同豬的基因，其中豬基因的多態性是已知的。類似地，通過獲得其基因組DNA，RFLP分析DNA中的基因，將結果與對照比較，可以確定豬的基因型。此外，對照是RFLP分析不同豬的基因的結果。通過劃分基因中的多態性，該結果可對豬進行遺傳分型。最後，可以通過從至少兩頭豬獲得基因組DNA樣品，鑑定基因中是否存在多態性，比較該結果，可以檢測豬之間的遺傳差異。這些分析可用於鑑定與公豬羶味相關的遺傳學標記，如上所討論，用於鑑定編碼與糞臭素代謝相關的酶的基因中的其他多態性，和用於常規分析豬的基因型和表型。在此的實施例和方法公開某些基因，其被鑑定具有一種與一種有益特性正相關或負相關的多態性，該特性對肉品質、大量增肌(heavymuscling)和/或具有這種多態性的動物中的骨骼肌痙攣產生影響。確定在基因中存在多態性通常通過單鹼基改變來進行，該單鹼基改變在某些等位基因形式中產生限制性位點。但是，如在此所證明和討論，某些等位基因具有與之相關的大量鹼基變化，其只是相同的多態性(等位基因)，也可以被分析。此外，其他的遺傳學標記或基因也與在此公開的多態性相關，使得分析包括鑑定其他基因或基因片段，但是其最終依賴於動物對相同多態性的遺傳特徵。任何根據在此公開的等位基因差異來挑選和鑑定動物的檢測方法包括在本發明的保護範圍內。一旦鑑定了多態性和與所確立的特定特性的相關性，本領域的技術人員將會理解，存在多種途徑來對該動物的多態性進行基因分型。這種可替代檢測的設計僅僅代表對本領域技術人員已知的參數的優化，旨在包含在本文充分公開的本發明的保護範圍內。實施例5:來自豬肝臟的細胞色素P4502A6基因的克隆、表達和功能表徵在養豬行業中，未閹割的公豬具有更好的飼料轉化率、屠宰後畜體的瘦弱率高和容易進行動物護理(addressedanimalwelfare),被用於肉品生產。因此，飼養公豬可能提高多達30%的豬肉生產收益率(Babol等人，1995)。但是，來自未閹割公豬的肉品煮熟後，常常產生令人不適的氣味，通常稱作為"公豬羶味"，是最令顧客反感的。糞臭素是公豬羶味的主要原因之一(Gonzalo等人，2000)。糞臭素在腸道被吸收，然後主要在肝臟代謝。已經發現在豬體內，細胞色素P450酶顯著影響糞臭素的代謝。已經證明，CYP2A6是糞臭素代謝中的主要酶之一(Gonzalo等人，2000)。已經發現在豬體內，CYP2A6與脂肪中的糞臭素沉積成高度負相關(Babol等人，1998;Gonzalo等人，2000)。因此，在豬體內，CYP2A6對糞臭素的代謝和清除起重要作用。細胞色素P450血紅蛋白的一個超家族(Ingelman-Sundberg等人，1999)。在人體內，CYP2A6主要在肝臟中表達(Koskela等人，1999;Oscarson，2001)。CYP2A6是該家族的主要肝臟成員，代謝藥物(Miles等人，1990)和許多其他藥品和環境化學物質(Yamazaki等人，1992)。在人體內，CYP2A6最早被鑑定為香豆素-7羥化酶(Yamano等人，1990)，由於其在菸鹼的C-氧化中起主要作用和包括與吸菸行為和肺癌易感性相關，從此受到大量關注(Xu等人，2002;Oscarson，2001)。與人體內的CYP2A6相關的知識已經得到充分發展。但是，關於CYP2A6基因、表達和CYP2A6遺傳變體如何影響豬體內的糞臭素水平的信息仍然是空白。在本研究中，本發明人通過快速擴增cDNA末端(RACE)的方法，從豬肝臟構建cDNA文庫，報導了豬CYP2A6cDNA的序列。本發明人通過Northern分析，檢查了CYP2A6mRNA種類在不同豬組織中的表達模式。用聚合酶鏈式反應技術結合單鏈構象多態性(PCR-SSCP)，掃描和鑑定來自豬肝臟的CYP2A6編碼區的任何遺傳多態性，該多態性可能會改變該酶的代謝能力。此外，對CYP2A6的遺傳多態性進行功能研究。組織樣品從公豬獲取肝臟樣品，用於構建cDNA文庫。為了鑑定CYP2A6中的任何遺傳多態性，來自各種品種的69頭豬，包括約克夏豬、杜洛克豬、長白豬和皮特蘭豬，以及長白豬和杜洛克豬的雜種、大白豬和杜洛克豬的雜種、大白豬和皮特蘭豬的雜種，在144kg(144kg±33)的平均活體重時，在畜禽科學學院(DepartmentofAnimalandPoultryScience)的屠宰場屠宰。在放血後，立即摘取肝臟樣品，在液氮中冷凍並存儲在々(TC下，直到使用。總RKA的分離在1mlTri-Reagent(Sigma)中勻槳100mg組織樣品，在室溫下溫育10分鐘。溫育後，加入0.2ml氯仿並渦旋。4。C下以12，000xg離心樣品IO分鐘，將液相轉移到無菌試管中。將液相與0.5ml異丙醇混合，在室溫下溫育10分鐘以沉澱RNA。通過離心(4。C下以12，000xg離心10分鐘)獲取沉澱。用75%乙醇洗滌沉澱，然後懸浮在50ul的DEPC水中。豬cDNARACE文庫的構建和篩選用SmartRACEDNA擴增試劑盒(Clontech)從肝臟分離的總RNA，用5'和3'快速擴增從1yg總RNA構建cDNA(RACE)，用作隨後PCR篩選豬CYP2A6的模板。通過用改進的鎖定引入(lock-docking)oligo(dT)引物合成第一條鏈cDNA，然後通過末端轉移酶在產物的5'端添加5'AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3'(SEQIDNO:9)(錨定引物)，進行5'RACE。用oligo(dT)引物進行3'RACE，包括與5'RACE相同的鎖定引入(lock-docking)核苷酸位置。用引物擴增第一個CYP2A6片段，該引物根據人2A6、小鼠2A5和大鼠2A3cDNA序列的保守區域設計。正向引物為5'AGGACAAAGAGTTCCTGTCACTG3'，(SEQIDNO:10)，反向引物為5'CAATCTCCTCATGGACCTTGG3'(SEQIDNO:11)。為了獲得全長的豬CYP2A6，在隨後的PCR篩選中使用如下引物5'ATGAGCAGCAGGAAGCCGTAG3'(SEQIDNO:12)和具有5'Race的錨定引物作為模板；5'CTACGGCTTCCTGCTGCTCAT3'(SEQIDNO:13)和具有3'Race的錨定引物作為模板；具有3'或5'Race的5'CACAACGATGCGCTACGGCT3'(SEQIDNO:14)禾口5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAG3'(SEQIDNO:15)作為模板。PCR包括35個循環的94。C下變性1分鐘C，最佳退火1分鐘，和延伸1分鐘，最後在72。C下延伸10分鐘。在1%瓊脂糖凝膠上電泳分析10ii1的PCR產物。克隆雜交當從3'和5'Race模板上擴增出多個條帶時，將PCR產物克隆到pGEM-TEasy載體系統(Promega)中，然後在DNA測序前進行克隆雜交，驗證擴增片段的特異性。該克隆上移到正電荷尼龍膜(Roche)上，然後在0.5MNaCl中溶解和固定5分鐘，在5xSSC中洗滌1分鐘，風乾；用ECL核苷DNA標記和檢測試劑盒(AmershamLifeScience)進行克隆雜交。用於雜交的探針是由從人2A6、小鼠2A5和大鼠2A3cDNA保守區設計的引物最先擴增的片段。在42i:下雜交過夜，用0.15xSSC洗滌20分鐘2次，曝光到x射線底片(Kodak)上。產生最強信號的克隆進行測序。分離全長的豬CYP2A6cDNA為了獲得全長的豬CYP2A6序列，根據從5'和3'RACE獲得的序列，設計正向引物5'CTCGCAGTGCCACCATGCTG3'(SEQIDNO:16)和反向引物5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAGGTC3'(SEQIDNO:17)，用於擴增全長的豬CYP2A6，用5'或3'RACEcDNA作為模板。PCR擴增為94'C下3分鐘，接著進行35個循環的94"C下1分鐘、64'C下1.5分鐘、72t:下2分鐘和最後在72'C下延伸IO分鐘，加入兩滴礦物油。將PCR片段克隆到T-Easy載體(Promega)中，進行序列分析。Northern印跡分析用Tri-Reagent(Sigma),從豬脾臟、胸腺、肝臟、肺、肌肉、卵巢、腎臟、小腸、心臟和睪丸組織中分離RNA。在含有2.0M甲醛的l。/。瓊脂糖凝膠中對20ng來自各種組織的總RNA進行電泳，藉助向下虹吸轉移到尼龍膜上(AmershamPharmaciaBiotech)。用正向引物5'CTCGCAGTGCCACCATGCTG3'(SEQIDNO:16)和反向引物5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAGGTC3'(SEQIDNO:17)，從本發明人構建的豬肝臟cDNA文庫中構建全長的豬CYP2A6(M兆bp)。用具有地高辛-dUTP(RocheMolecularBiochemicals)的隨機引物標記CYP2A6cDNA，在50r下雜交過夜。在用含有0.1%SDS的2xSSC預先洗滌後，67。C下用含有0.1%SDS的0.2xSSC洗滌膜15分鐘，兩次。用抗地高辛的鹼性磷酸酶偶聯物免疫檢測被雜交的探針，用比色底物(DIG,Roche)檢測，室溫下對KodakScientific成像底片(Kodak)曝光1小時。序列分析將PCR片段連接到pGEM-TEasy載體系統(Promega)中，然後轉化給感受態DH5cx細胞。純化DNA，用AppliedBiosystemsABI377型DNA測序儀進行測序。formulaseeoriginaldocumentpage50為了掃描來自個體的CYP2A6的遺傳多態性，擴增包括整個編碼區的RT-PCR產物，然後進行SSCP分析。用Superscript逆轉錄酶(Invitrogen)和oligo(dT)引物(Sigma),從1-5ug來自肝臟樣品的總RNA合成第一條cDNA鏈。反轉錄後，將2.5lU的第一條cDNA鏈用作PCR的模板。PCR混合物(50u1)含有1XPCR緩衝液(100mMTris-HCI，pH8.3;500mMKCl、llmMMgCl2、0.1%白明膠)、0.2mMdNTP、0.4mM弓l物(正向引物和反向引物)以及2.5URedTaq聚合酶(Sigma)。根據本發明人分離的CYP2A6(GenBank登錄號AY091516)，設計引物對(正向引物，5'CTCGCAGTGCCACCATGCTG3'，(SEQIDNO:16)和反向序列，5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAGGTC3')(SEQIDNO:17)，擴增全長的豬CYP2A6編碼區。PCR擴增為94"下3分鐘，接著進行35個循環的9fC下1分鐘、65。C下1分鐘、72°CT1分鐘和最後在72"C下延伸10分鐘。單鏈構象多態性分析首先用Bstxl酶將PCR產物剪切成片段，然後進行SSCP分析(，37。C下，用20u1反應物中的Bstxl消化5li1的PCR擴增產物3小時。然後，用13ul加載緩衝液(10%蔗糖、0.01%溴苯酚蘭和0.01%二甲苯苯胺FF)稀釋7iU的消化片段。每個消化反應在IO(TC下變性5分鐘，在冰上冷卻，溶解在10%聚丙烯醯胺凝膠中。在垂直單元中(Bio..RadLaboratories,130X160X1.0mm)進行電泳，15。C禾口160V下，在0.6XTBE緩衝液中進行17小時。然後銀染凝膠。CYP2A6活性通過測量豬肝臟微粒體學樣品中的香豆素7-羥化酶活性，分析CYP2A6活性。將20u1含有0.4mg微粒體蛋白的微粒體懸浮液與200y1香豆素羥化酶反應混合物(0.05MTris緩衝液pH7.4，5mMMgCl2和0.2mM香豆素)混合。加入15lU25mMNADPH來起始反應。在37°C下溫育15分鐘後，加入50lU的20%四氯乙酸來終止反應，接著以10,000g離心2分鐘。用2ml的0.1MTris緩衝液(pH9.0)稀釋200ul上清液，在390nm的激發波長和440nm發射波長下確定螢光性。測量脂肪中的糞臭素水平在第11根肋骨的中線點採集背部脂肪樣品，在-2(TC下冷凍，直到用於糞臭素的分析。按照Gonzalo等人(2000)描述的方法，用比色分析測量糞臭素含量。Western分析在5ml樣品緩衝液(1%膽酸、0.1%SDS溶於PBS緩衝液)中勻槳肝臟組織(lg)，用BCA試劑盒(Pierce)，確定勻漿中的蛋白質濃度。採用12%聚丙烯醯胺凝膠，對40Ug總蛋白進行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳。將蛋白質轉移到硝基纖維素濾膜(BioRad)上，用小鼠抗人單克隆2A6-抗體MAB-2A6(Gentest)溫育，接著用在山羊中產生的抗小鼠的IGG過氧化酶偶聯物(Sigma)進行溫育。用化學發光方法(ECL，AmershamLifeScience)對免疫反應性條帶進行染色，通過射線自顯跡法顯示。CYP2A6cDNA序列和序列表徵通過PCR篩選由RACE構建的肝臟cDNA文庫來分離豬CYP2A6cDNA。CYP2A6cDNA的核苷酸序列長度為1519bp，含有長1485bp的開放閱讀框(ORF),其編碼497個胺基酸(圖12)。豬CYP2A6cDNA序列提交給Genbank資料庫，登錄號為AY091516。人CYP2A6、小鼠CYP2A5、大鼠CYP2A3被確定為香豆素-7羥化酶。本發明人將豬CYP2A6ORF與上述基因比較，顯示出與人CYP2A687%同源，與小鼠CYP2A585%同源，和與大鼠2A386%同源。推導的豬CYP2A6胺基酸序列與人2A687%同源，與小鼠2A590%同源，和與大鼠2A389。/。同源(圖13)。在人CYP2A6中，Glnl04、Phe209和His477被報導是CYP2A6香豆素7-羥化酶活性的活性位點，該酶的活性為氧化代謝菸鹼和可鐵寧(Lewis等人，1999)。R128代表了人CYP2A6的關鍵結合殘基之一(Kiragawa等人，2001;Lewis等人，1999)。所有上述活性位點保留在推導的豬CYP2A6中。CYP2A6mRNA種類在各種組織中的表達用豬CYP2A6cDNA作為探針，通過Northern印跡，研究CYP2A6mRNA在各種組織中的表達模式，包括來自豬的脾臟、胸腺、肝臟、月市、肌肉、卵巢、腎臟、小腸、心臟和睪丸。結果表明，CYP2A6僅在肝臟和腎臟組織中表達(圖14)。在肝臟中觀察到較高水平的CYP2A6mRNA，而較低水平的CYP2A6mRNA在腎臟中表達。該結果表明，CYP2A6主要在豬肝臟組織中表達。這說明肝臟是豬體內在CYP2A6代謝中起重要作用的主要器官。CYP2A6遺傳多態性為了鑑定CYP2A6的任何遺傳多態性，該多態性可能改變該酶的代謝能力，用聚合酶鏈式反應技術結合單鏈構象多態性(PCR-SSCP)掃描來自豬肝臟組織的CYP2A6編碼區。用引物對正向引物5'CTCGCAGTGCCACCATGCTG3'(SEQIDNO:16)和反向引物5'GCAGGAAGCTCATGGTGTAGGTC3'(SEQIDNO:17)，通過PCR從肝臟組織中擴增豬CYP2A6的全長cDNA。生成的PCR產物大小為1500bp。採用本發明人的優化系統，對用Bstxl消化的PCR產物進行SSCP分析。本發明人發現，在CYP2A6編碼區中存在數種不同的多態性(數據未顯示)。其中，一個導致編碼區移碼的突變引起本發明人的最大關注。由於缺失一個G，CYP2A6的ORF區的長度由1485bp變為612bp。這還引起其編碼基因產物的長度由495個胺基酸變為204個胺基酸。這表明，缺失可能會導致CYP2A6活性失活或者生成含有該缺失的個體。已經證明，CYP2A6是糞臭素代謝中的主要酶之一(Gonzalo等人，2000)。CYP2A6與脂肪中的糞臭素沉積成負相關(Babol等人，1998)。因此，本發明人推斷，由於CYP2A6基因的編碼區移碼，存在這種缺失的樣品中的CYP2A6的香豆素7-羥化酶活性為零，由於缺乏從機體中清除糞臭素的酶活性，糞臭素水平較高。為了評價上述假設，研究CYP2A6的這種遺傳多態性與糞臭素水平的相關性，進一步進行用糞臭素水平測量值進行表型分型、香豆素7-羥化酶活性分析和用單克隆抗人CYP2A6的抗體(Gentest)進行免疫印跡。結果表明，具有缺失突變的樣品中糞臭素水平高於野生型樣品。香豆素7-羥化酶分析和免疫印跡分析也說明，具有缺失突變的樣品的香豆素7-羥化酶活性和陰性免疫反應條帶未零，而野生型樣品保留較低的糞臭素水平、較高的活性和會檢測的免疫反應條帶(圖15)。結果有力地本發明人的觀點，即CYP2A6缺失導致完全喪失酶促活性，從而在豬體內產生較高水平的糞臭素含量。在人方面，CPY2A6基因已經被廣泛地研究；但是，關於CYP2A6基因、其表達以及CYP2A6的遺傳變體如何影響豬體內的糞臭素水平的信息仍然是空白的。在本研究中，本發明人報導了豬的CYP2A6基因的分子克隆、功能表徵。本發明人根據人2A6、小鼠2A5和大鼠2A3的cDNA序列設計引物。在人和小鼠中，香豆素7-羥基化由高親合性的CYP2A6和CYP2A5酶催化(Miles等人，1990;Donato等人，2000)，而在大鼠中由CYP2A3催化。7-羥基香豆素的形成已經被用作人CYP2A6、小鼠CYP2A5和大鼠2A3的體內外探針(Rodrigues等人，1994;Rautio等人，1992;Femandez-Salguero等人，1995)。因此，用所設計的引物，本發明人篩選出了第一個片段，接著篩選出全長的豬CYP2A6cDNA。對人CYP2A6、小鼠CYP2A5和CYP2A3進行測序(登錄號人的為U22027，小鼠的為BC046605和大鼠的為M33190)，分別作圖到染色體19ql3.2(b:Femandez-Salguero等人，1995)、染色體7(Kent等人，1987)和染色體1(STS:DlMgh28)上。如結果在所表明，當將豬CYP2A6序列與其直向同源基因人CYP2A6、小鼠2A5和大鼠CYP2A3的序列比較時，本發明人發現，豬CYP2A6在cDNA序列和胺基酸序列上，與其直向同源基因具有高度同源性。在人CYP2A6中的所有重要胺基酸序列活性位點也保留在本發明人推導的豬CYP2A6序列中。此外，本發明人用豬CYP2A6cDNA，對人、小鼠和大鼠基因組資料庫進行檢索，僅命中來自染色體19ql3.2的人基因組克隆(NT011109)、來自染色體7的小鼠基因組克隆(NT—039410)和來自染色體lq21的大鼠基因組克隆(NW一043361)。命中值表明，豬CYP2A6cDNA序列與人染色體19ql3.2上的人CYP2A6基因組克隆(91%)、小鼠染色體7的小鼠2A5基因組克隆(89%)和大鼠染色體lq21的大鼠CYP2A3基因組克隆(88%)具有最高相同性。將所有這些結果綜合在一起，使本發明人得出推斷的CYP2A6就是真正的豬CYP2A6的結論。在本研究中，本發明人對豬CYP2A6mRNA在不同組織中的分別進行northern印跡分析，結果表明，CYP2A6主要在肝臟中表達，在肝臟中具有較高水平，在腎臟在具有較低水平。這表明肝臟是豬體內用於從機體中清除糞臭素的最重要的組織。儘管豬CYP2A6與其直向同源基因具有高度相似性，這些酶在組織分布上存在差別。已經報導，對於人2A6，主要在肝臟中觀察到其mRNA表達(Koskela等人，1999;Oscarson,2001)，而小鼠2A5的mRNA表達存在於肝臟、腎臟和小腸(Su等人，1998)，而大鼠2A3的mRNA表達存在於嗅黏膜和肺(Su，等人，1996;Kimura等人，1989)。在本研究中，本發明人發現，CYP2A6不在豬的小腸和肺中表達。CYP2A6mRNA及其直向同源基因在各種組織中的表達差異說明，它們的啟動子區域可能存在差異，這種差異可用於研究組織特異性基因表達的調控。在人方面，由於CYP2A6在菸鹼代謝中的重要性，和可能與吸菸行為和肺癌易感性有關，CYP2A6是菸鹼C-氧化中最重要的酶之一(Xu等人，2002;Oscarson，2001)。因此，人CYP2A6基因的多態性可能影響吸菸行為和肺癌的易感性。因此，人們在檢測其遺傳多態性及其結果中己經投入巨大努力(Paschke等人，2001;Kamataki等人，1999;Oscarson等人，2001;Kitagawa等人，2001)。在人方面，由於遺傳變化主要位於開放閱讀框內，已經發現在CYP2A6酶水平上存在大的個體間差異(Nakajima等人，2002)。已經檢測到人CYP2A6的大量遺傳多態性，包括編碼區內導致失活的SNP，例如Gly479Val(Oscarson等人，2001)和Argl28Gln(Kitagawa等人，2001)。這些研究中的進展將推動分子研究，以闡明CYP2A6多態性在引起遺傳差異和其結果中的重要性。細胞色素P450酶包括CYP2A6在糞臭素代謝中的作用，己經在人、小鼠和兔子進行了研究(Thornton-Manning等人，1996)。在豬方面，已經報導CYP2A6是肝臟代謝糞臭素中的關鍵酶之一(Gonzalo等人，2000)，而CYP2A6與脂肪中的糞臭素沉積成負相關(Babol等人，1998)。因此，具有高水平的這些酶包括CYP2A6的豬在脂肪中具有較低水平的糞臭素，這是由於糞臭素被快速代謝，並從機體中清除，這些酶的水平低的豬在脂肪中具有較高水平的糞臭素。因此，一旦CYP2A6的遺傳變體及其對糞臭素的作用被研究，CYP2A6可用作一種遺傳學標記，選擇來抵抗糞臭素。由於沒有關於CYP2A6基因的信息，本發明人用RACE方法，首次從肝臟樣品中分離豬CYP2A6，然後根據本發明人的優化基因分析系統，進行PCR-SSCP分析來篩選豬CYP2A6編碼區。在本研究中，本發明人致力於評價CYP2A6的功能區及其遺傳多態性。本發明人已經鑑定一種遺傳多態性，導致在編碼區內發生移碼，滅活酶的活性。由於CYP2A6的缺失，香豆素7-羥基化和CYP2A6基因產物是不是可檢測的。還不知曉在哪個階段發生CYP2A6的不可調控。在本發明的使用香豆素的CYP2A6表型劃分研究中，用小鼠抗人的單克隆2A6-抗體進行western分析，和測量豬中的糞臭素，本發明人還分析，在編碼區外存在其他等位基因，其調節或滅活CYP2A6的活性(數據未顯示)。因此，在將來的研究中，研究CYP2A6的啟動子區域，結合具有香豆素的表型個體、作為體內和體外CYP2A6活性的指示劑的免疫檢測條帶將會有用的，由於可能存在還未知的其他CYP2A6的等位基因。在該研究中，本發明人從肝臟中分離豬CYP2A6cDNA，發現ORF區域中的CYP2A6缺失，該缺失會引起酶促活性的完全喪失。還沒有發表研究CYP2A6中遺傳多態性對豬體內清除的糞臭素的影響的研究。本研究中提供的數據表明，CYP2A6基因缺失可能會在開發糞臭素的遺傳學標記中起重要作用。參考文獻Diaz，G丄禾llSquires,E丄(2000).Metabolismof3-MethylindolebyPorcineLiverMicrosomes:ResponsibleCytochromeP450Enzyme.7bx/co/og/c"/5Wewce55，284-292.Babol，J.，Squires,E丄禾口Lundstr6m，K.(1998)RelationshipbetweenOxidation禾PConjugationMetabolismofSkatoleinPigLiverandConcentrationsofSkatoleinFat.Jowwa/o/Jm'膽/5We"ce76，829-838.Donato，M.T.，Viitala，P.，Rodriguez-Antona，C.，Lindfors，A.，Castell，J.V.，Raunio，H.，G6mez畫Lech6n，M丄和Pelkonen，O.(2000)CYP2A5/CYP2A6expressioninmouseandhumanhepatocytestreatedwithvariousinvivoinduces.Drwg她to6o/z'纖_D—cw'ow28，1321-1326Fernandez-Salguero,P.禾卩Gonzalez,F丄(1995)TheCYP2Agenesubfamily:speciesdifferences,regulation,catalyticactivitiesandroleinchemicalcarcinogenesis./VwrwacogewWcs5，123-128Fernandez-Salguero,P.，Hoffman，S.M.，Cholerton，S.，Mohrenweiser，H.，Raunio，H.，Rautio，A.，Pelkonen，J.D.，Humang，W.E.，Eeans，J.R.禾口Idle.(1995)Ageneticpolymorphismincoumarin7-hydroxylation:sequenceofthehumanCYP2AgenesandidentificationofvariantCYP2A6alleles.772e^附en.cawJ"oi^"o/o///wma"57，651-660Ingelman-Sundberg，M.，Oscarson，M.禾口Mclellan，R.A(1999)PolymorphichumancytochromeP450enzymes:anopportunityforindividualizeddrugtreatment,r7'e"(is1〖w/Vzarmaco/ogz.ca/5bz'ewce20，342-349Kamataki，T.，Nimoya，K丄，Sakai，Y.，Kushida，H.禾卩Fujita，K.I.(1999)GeneticpolymorphismofCYP2A6inrelationtocancer.h離c/z428，125-130Kent,R.B.，Fallows,D.A.，Geissler，E.，Glaser，T.，Emanuel,J.R.，Lalley,RA.，Levenson，R.禾口Housman，D.E.(1987)GenesencodingalphaandbetasubunitsofNa，K-ATPasearelocatedonthreedifferentchromosomesinthemouse.o/iV加'o""/o/&/e"ce，USA84，5369-5373Kimura，S.，Kozak，C.A.禾卩Gonzalez,F.J.(1989)IdentificationofanovelP450expressioninratlung:cDNAcloningandsequence,chromosomemapping，andinductionby3-mtehylcholanthrene.5/0cAemZW/728，3798-3803Kitagawa，K.,Kunugita，N.，Kitagawa，M.禾卩Kawamoto,T.(2001)CYP2A6*6，anovelpolymorphismincytochromeP4502A6，hasasingleaminoacidsubstitution(R128Q)thatinactivatesenzymes.TTjeJbwma/o/C/zem^/zj276，17830-17835Koskela，S.，Hakkola，J.，Hukkanen，J.，Pdkonen,O.，Sorri，M.禾卩Saranen，A.(1999)ExpressionofCYP2Ageneinhumanliverandextrahepatictissue./7za/7woco/ogy57，1407-1413Lewis,D.F.V.，Dickins，M.,Lake,B.G.，Eddershaw，P丄，Tarbit，M.H.禾口Goldfarb,P.S.(1999)MolecularmodelingofthehumancytochromeP450isoformCYP2A6andinvestigationsofCYP2Asubstrateselectivity.7bx/co/ogy133，1-33Miles,J.S.，Mclaren，S.W，Forrester,LM.，Glancey，M.J.，Lang，M.A.禾口Wolf，C.R.(1990)Identificationofthe人livercytochromeP-450responsibleforcoumarin7-hydroxylaseactivity.BiochemistryJournal267，365-371Nakajima，M.，Kuroiwa，Y.禾卩Yokoi，T.(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