用於鑑定rgs21活性調節子的方法、包含rgs21調節子的組合物以及用其調節味覺的方法

2023-09-14 03:43:10

專利名稱：用於鑑定rgs21活性調節子的方法、包含rgs21調節子的組合物以及用其調節味覺的方法
用於鑑定RGS21活性調節子的方法、包含RGS21調節子的組合物以及用
其調節味覺的方法
對於相關申請的交叉引用 本申i青要救006年7月26日遞交的美國臨時專利申請系列號60/820， 426的 優先權的權利，其內容以其M:並A^文。
本發明的背景 發明領域
本發明涉及用於鑑定G蛋白f言號調節子(RGS)蛋白的調節子的方法。本發 明還涉及包含RGS調節化合物的組合物，以及fOT這樣的組^"t/來調節G蛋白偶 聯受體(GPCR)信號轉導的方法。特別地，本發明涉及用於鑑定特異性抑制或 增強RCS21蛋白或其生物學活性片段的活性的化合物的方法；包含這樣的化合物 的組合物；以及f頓這樣的化合物iM:GPCR味覺信號轉導途^^調節味覺信號 轉導的方法。
背景
G蛋白偶聯受體(GPCRs)在信號轉導中起重要作用，並且是很多治療藥物 的耙標。很長時間以前已經抵直了GPCR信號轉導的標準模式限於三組分體系 G-蛋白偶聯受體(GPCR) 、 G蛋白和安M子(Neubig和Siderovski， 2002， Nat. Rev. Drug Discov， 1 (3) : 187-97) 。 GPCR是具有七個跨膜結構域的細胞-表 面受體蛋白。B蛋白是膜-結合的異源三聚體複合物，其包含GTP-水解Gci亞 基和G P Y 二聚體亞單位。G a亞基是在細胞中控制大量生理學過程的^ 開關。 Ga亞基以非活性的GDP-結合狀態或以活性的GTP-結合狀態存在，其中後者與下 遊信號蛋白相互作用而引起特異性信號反應(圖l) 。 Gci蛋白的活化和鈍化分 別由配奢結合的GPCR和GTP斷腿蛋白(GAP)來調控。當結針配基時，GPCR M催化鳥苷三磷酸(GTP)轉化為鳥苷二磷酸(GDP)到異源三聚淋蛋白的ci 亞基上來艦細胞信號。GAP結合到活性的GTP結合形式的Gci蛋白上，從而{腿G蛋白固有的GTP酶活性，藉此將結合的GTP的末端磷Kk殘基水解為GDP，從而 使Ga蛋白回至排活性狀態(圖l)。
當激動劑結合至1JGPCR時，其弓胞提高GPCR的鳥嘌呤核苷轉化活性的構型變 化，導致Ga亞基的GDP釋放(以及隨後結^FGTP)。 一旦與GTP結合，Ga亞基 的三個"開關"區域內的構型變化使G3 y亞基釋放，並且隨後接創寺異於每個 Gct亞型的效應子。釋放的G3 Y亞基還可以調節包含離子M和特定亞型的腺 苷醯環化酶和磷脂酶(PLC)在內的的效應子(Neubig和Siderovski， 2002， Nat. Rev. Drug Discov. 1 (3) : 187—97，圖l和表l)。
最近，已經發現了一個作為GPCR信號轉導新元件的蛋白家族。該蛋白家族 由稱為G蛋白信號調節子(RGS)蛋白的蛋白質組成(DeVries等人，2000， Ann. Rev， Pharmacol. 40:235; Ross禾nWilkie， 2001， Ann. Rev. Biochem. 69:795)。 RGS蛋白有效調節G蛋白的活性，並且在GPCR信號轉導中起關鍵作用。其^^f周 知的功能是充當GTP酶活化蛋白(GAP) ， M3iiSSGTP7K解來抑制G蛋白信號， 並Ji人而關閉G蛋白信號。特別地，RGS蛋白Mil直接結合節;TP-結^Gci亞S5 控制由活化G(i亞S 俞出的信號。該結合顯著鵬了亞基的GTP水解率，因此促 進了GPCR信號的鈍化率(Neubig和Siderovski， 2002， Nat. Rev. DrugDiscov. I (3): 187-97; Berman等人，3996， Cell 86: 445—52; Hunt等人，1996， Nature 383: 175—77; Watson^A， 1996， Nature 383: 172—75)。
至少有37種RGS蛋白存在於人基因組中，並且這些蛋白可以再分成不同的蛋 白家族，它們在其功能域的組分上有所不同(圖2) o所有的RGS蛋白包含至少 一個稱為"RGS-盒"的大約120個胺基酸的保守結構域，其導挪GS蛋白可觀察 到的的GAP活性(圖3) 。 RGS-盒與G a開關區i^蟲來使其構象在GTP-結合和GDP-結合形態之間的逝度狀態上穩定。因為RGS蛋白超一常多樣的，具有獨特的組織 分布，並且在活細胞中起各種功能性的作用，所以RGS蛋白一般還包含各種非 -RGS-盒結構域和基序(例如GGL、 DEP、 DH/PH、 PDZ結構域以及半胱氨酸串基 序)。
RGS蛋白負調控GPCR信號，因此將RGS蛋白認為是潛在的發現藥物的耙標， 因為RGS-^GAP活性的抑帝鵬導致由激動齊[j-結^GPCR的信號的延長和增強 (Neubig和Siderovski， 2002， Nat. Rev. Drug Discov. 1 (3) : 187-97)。 RGS蛋白的抑制齊阿以S3i減弱Ga蛋白的鈍化來增強G蛋白信號。RGS抑制劑的潛在治療作用包括但不限於，內源神糹SI質的增強功能；夕卜源GPCR-激動齊啲增 強功能；激動劑的斷氐脫敏作用；夕卜源激動齊啲改變的特異性；以及RGS-蛋白-介導的效應子活性的阻滯調控(Neubig和Siderovski， 2002， Nat. Rev. Drug Discov. 1(3): 187-97， B。x l:Zhong Sc Neubig， 2001， J. Pharmacol. Exp. Ther. 297:837-45)。
已經在中樞神經系統(CNS)中發現了一些RGS基因，其掛共了潛在的藥物 革巴標用TCNS疾病的RGS抑希躋啲臨床應用，戸脫的CNS疾病例如阿爾茨海默氏 病、抑鬱症、癲癇症、帕金森氏症、疼痛和僵直(Neubig和Siderovski， 2002， Nat. Rev. Drug Discov. 1 (3) : 187-97，表3和4)。然而，因為RGS蛋白的高 度多樣性和複雜性，^^RGS蛋白的作用可能取決^t寺定結構域的功能，戶;M特 定結構域包括RGS-盒、非RGS-盒基序和/或其它的功能組件(Ne油ig和 Siderovski， 2002， Nat. Rev. Drug Discov. 1 (3) : 187—97)。
味覺細胞裝配成舌表面上的味蕾(Lindemaim， 1996， Physiol. Rev. 76:718-66)。在味覺細胞中已經鑑定了GPCR的兩個家族:介導甜味和鮮味的GPCR T1R^J矣，以及介導苦味的GPCRT2R家族(Nelson等人，2001， Cell 106:381-90; Nelson等人，2002， Nature 416:199—202; Li等人，2002， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:4692-96; Zhao等人，2003， Cell 115:255-66; Adler等人，2000， Cell 100:693-702; Chandrashekar等人，2000， Cell 100:703—11; Bufe等人， 2002， Nat Genet. 32:397—401)。已經表明所有這毀體的下遊信號繊甜、 鮮和苦味轉導的關鍵效應子酶、磷脂歐亞型P2 (PLCP2)以及色氨酸途^M 型m5 (TRPM5) (Zhang等人，2003， Cell 112: 293-301)。
Buccholtz等人鑑定了另一種RGS蛋白RGS21，並且證明RGS21在葉狀、真菌 狀和有觸毛的味蕾細胞中特異表達，其與苦味受體(T2R)、鮮味受體
(T1R1/T1R3)、甜味受體(T1R2/T1R3) 、 a-味蛋白和磷脂酉lce 2 (PLC 3 2) 共定位。Buchholtz等人還表明RGS21蛋白可與Ga^仏、G^議和a -味蛋白結合。 ARGS21的序列分析表明其包含單個RGS-盒結構域並且沒有其它功能域。此外， RGS21的RGS盒與RGS2 (Gi,J口G屋白的GAP)的RGS盒的序列同源M—步支持了 RGS21類似調控這些蛋白的可能性(圖3) 。 ilii與其它的RGS蛋白類推，雖然 尚未證明，倒艮可會歐GS21蛋白M^了 a-味蛋白和/或參與味覺細胞信號的其它 相^Ga蛋白。
7本領鄉萬需要的是鑑定可用於調節味覺信號轉導的化合物的方法。還需要調節味覺信號轉導的化合物和^S這樣的化合物來調節味覺信號轉導的方法。
發明小結
; 鑑於RGS21蛋白在味覺組織中選擇性地皿，並且其與甜味信號轉導成分共
表達，並且鑑於RGS21蛋白具有調節甜味轉導過程的潛力，本發明提供了調節RGS21活性的化合物的鑑定方法。本發明還提供了當結合於碳水化合物和/或非熱能甜i^f鬥時，這樣的RGS21調節化合物增強甜喊調節甜味劑的瞬時輪廓的用途。
> 本發明提供了用於篩選大量化合物的方法和/或生物化學試驗，以便能夠發現甜味敏感味蕾細胞信號的增強子和調節子。特別地，本發明掛共了在味蕾細胞中的替代蛋白耙標，其3te於甜味劑受體，用於發現甜n雜強子和調節子。在一個 實施方案中，本發明劍共了用於篩選大量化，的方法和/或生物化學i離，戶脫化合物選擇性和特異地與RGS21蛋白相互作用，並且抑帝URGS21蛋
;白的活性。RGS21蛋白是甜P未信號的負調節子。RGS21蛋白功能以限定和短暫的方式的抑制通過增加每一活化甜味劑受體的信號輸出來增強甜味信號。此外，由RGS21蛋白抑制劑來增強甜味敏感味蕾細胞信號，相對^l^於這種經由甜味劑受體活性的正變構調節的增強。
在一個雌的實施方案中，本發明掛共了在宿主細胞中篩選抑制或增強
,RGS2謹因教的大量化合物的方法。在另一個雌的實施方案中，本發明掛共了在宿主細胞中篩選抑制或增強RGS21蛋白泰翻勺大量化合物的方法。在又一個雌的實施方案中，本發明掛共了用於篩選妨礙劍娜GS21蛋白與飽的G蛋白相互作用的大量化合物的方法。如果由本發明的方法所鑑定的所有化合物結合到RGS21蛋白、妨礙或增強與相應G蛋白的相互作用，則認為題GS21蛋白抑制
;劑和/或調節子。因此，鑑定的調節化合物導致抑制或增弓敬GS21蛋白活性，分別例如GTPM進(GM)活性或GTP酶活化蛋白(GAP)活性，用TGPCR介導的信號轉導。
本發明衝共了用於鑑定特異性調節G蛋白信號21調節子(RGS21)蛋白活性的化合物的方法，包含掛共分離的RGS21蛋白或其生物學活性片段，以及分離的
> Gcl蛋白；在缺少和存在測試化合物的割牛下將分離的RGS21蛋白或其生物學活
8性片段與分離的Gci蛋白結合；在缺少和存在測試化合物的剝牛下領啶分離的G a蛋白上的RGS21 GTP酶活化蛋白(GAP)活性的水平；以及鑑定調節RGS21 GAP
活性7K平的測試化糊。在一個雌實施方案中，本發明掛共了用於在細菌、 酵母、昆蟲和哺乳動物細胞中重組^i和提鄉頓GS21蛋白和G(i蛋白的方法。這
種方^^別包含克隆編碼RGS21蛋白和適當的G a蛋白的cDNA，以及製備編碼 RGS21和Ga蛋白的重組cDNA。在一個雌的實施方案中，魏的Ga蛋白包括但 不限於從由a-味蛋白、Gail-3、 Gaz、 Gct0、 Gas、 Gaolf、 Gat、 Gaq、 G a 11-14和Ga 16鄉賊的組中選出的Ga i蛋白。在特定的^M方案中，RGS21蛋 白、Ga蛋白或兩者在昆蟲細胞、酵母細胞、細菌細胞和哺乳動物細胞中魏， 並由其中純化。本發明表明蛋白還可在味覺細胞中表達，並從中純化。在一個 優選的實施方案中，蛋白還可在AHuTu-80細胞中表達，並從中純化。本發明進 一步提供了編碼JtM蛋白的特定重組構建體，以及能皿重組構建體的細胞宿 主。
用於鑑定調URGS21活性的化合物的方 雄括在存在或缺少化合物的條件 下測定RGS21 GAP活性的水平。將純化的RGS21加入結^GTP的Gai蛋白，增加了 GTP的水解率。因此，本發明l^f共了測定GTP水解的方法。在一個雌實施方案 中，如果來自膜結^Ga蛋白的方婦寸性損失掛共了GTP水解的測定方法的話，本 發明掛共了結合的方J(I寸性GTP的水解。在另一個雌實施方案中，如果當加入 RGS21時來自Ga蛋白的BODIPY螢光激寸的損失掛共了GTP水解的測定方法的話， 本發明Mf共了BODIPYFL^TP的螢光光譜法。在又一個雌實施方案中，如果抑 制G a和RGS21的相互作用的調節化糊降低了TR-FRET信號的話，本發明^f共了 用TGa和RGS21相互作用的時間^f辛FRET試驗(time-resolved FRET assay)。
本發明提供了用於篩選妨礙RGS21蛋白與，的G a蛋白相互作用的大量化 合物的方法。這種肅跑含製備^iRGS21蛋白或其生物學活性片段和Gci蛋白 的宿主細胞；將宿主細胞與測試化^/接觸；測定在宿主細胞中的RGS21活性水 平；以及鑑定在細胞中調節RGS21活性的化合物。在優選的實施方案中，適當的 Ga蛋白包括但不限雅自由a—味蛋白、Gail—3、 Gaz、 Ga0、 Gas、 Ga0lf、 Gat、 Gaq、 G a 11-14和G a 16所組成的組的G a i蛋白。在怖先的實施方案中，
宿主細胞是味覺細胞。在更雌的實施方案中，味覺細lt^源於人味蕾細胞或 是選自由STC-1細胞、NCI-H716細胞挪uTu-80細胞戶形且成的組的模式味覺細胞。在其它的實施方案中，宿主細胞是細菌、昆蟲、酵母或哺乳動物細胞。
本方糹跑括領啶戰鑑定的調節化合物對於味覺細胞中的RGS21 GAP活性
的作用。在 的實施方案中，使用了監控甜味受體活化的標準信號i微。這
種i離包括但不限於測定a)在第二信使方面的變化(例如鈣(Ca2+) 、 IP3、 DAG、 PIP2、 c鍵、cGMP等)，b)在蛋白激酶話性方面的變化(例如PKA、 PKC、 GRK、 ERK、 Akt、 Src、 RTKs等)，c)在胃腸肽分泌方面的變化和/或d)在神經
遞質分泌方面的變化。特別地，將僅有甜味劑對於這對言號"讀數"之一的作 用與同撤則的RGS21調節化合物相結合的甜味劑的作用相比。本發明表明RGS21
蛋白抑制劑增強了觀測到的甜味劑的作用。例如，如果僅有甜味劑增強了胞內 鈣的釋放，則甜味劑和RGS21抑帝躋啲組合將使銬釋放增加高於僅有甜味劑。在 另一個雌實施方案中，本發明還樹共了用於篩^RGS21蛋白抑制劑和調節鮮味 與苦味的調節子的方法。
本發明提供了鑑定增強甜味的化合物的方法，包含鑑定抑制RGS21活性的 化合物；觀啶由甜味劑受體活化的甜信號7jC平，戶腿甜味劑受體僅有甜味劑， 以及與化合物結合；以及鑑定將由戶腐甜味劑活化的甜信號水平增強至犒於僅 有甜味劑所測定的水平的化合物。在雌的實施方案中，甜味劑選自由碳水化 合物甜味劑、化學合成的高效甜味劑、天然的高效甜味劑、多元醇和胺基酸組 成的組。
此外，本發明掛共了證實RGS21調節子對於人甜味以及鮮嚇陪味的作用的 方法。在一個雌的實施方案中，本發明掛共了與蟲品嘗測試甜味劑所感覺的 甜度與測試甜味劑和RGS21調節化合物組合所感覺的甜度的比較。本發明規定 RGS21抑制劑增強了測試甜味劑所感覺的甜度，而RGS21增強子斷氐了測試甜味 劑所感覺的甜度。
本發明進一步掛共了用於增強甜味信號的包含抑帝擠卿/或RGS21蛋白調節 化合物的組合物。本發明還掛共了包含用於調節其它味覺(例如鮮口賴n苦味) 的RGS21蛋白的抑制劑和/或調節化合物的組合物。
附圖
簡述
圖l說明了由GPCRs和RGS21蛋白對於^M三聚J批蛋白信號的調節。GPCRs 通逝，DP轉換為GTP來活化Ga蛋白。其i!3lG a亞基以及釋放的P Y亞基來
10鵬下遊信號。RGS21蛋白通過，a蛋白的內在GTP水解舌fi^鈍化GcL蛋白。
期各活性G a ^TP返回到非活性G a ^DP形式，其同3 Y亞基再聚合，從而由這
兩種機制來終止信號。
圖2說明了RGS蛋白的結構域構造。RGS蛋白進一步分成八個亞類。所有的RGS ;蛋白包含至少一個稱為"RGS-盒"的大約120個胺基酸的保守結構域，該結構域
導iOM察到的RGS蛋白的GAP活性(Neubig和Siderovski， 2002， Nat. Rev. Drug
Discov. 1:187-97)。
圖3題GS蛋白的RGS盒的系統演化樹。應用SMART軟體來預測RGS蛋白的RGS
盒結構域，應用CLUSTALW軟體來t瀏，並利用比對來產驕列的基礎系統演化 >樹。本圖表明RGS21的RGS盒的序列與RGS2的RGS盒的序列最相似，其是用TG a i、
Gao和Gaq蛋白的GAP (細ains等人，2004， Methods in Enz. 389: 71_88中
的綜迷)。RGS2與RGS21的序列相似性支持了RGS21對於調節來自與Gai家族成
員(包括味蛋白(gustduein)和轉導蛋白)相結合WT1R和T2R受體的G-蛋白信號的作用。
; 圖4說明了用於鑑定hRGS21調節化合物的單個核苷酸結合與轉換篩選試驗。
發明詳述
本發明掛共了用於鑑定在味覺細胞中調飾GS21蛋白活性的化合物，以便通 過G蛋白偶聯的味覺受體來調節甜味、鮮味和苦味。特別地，本發明提供了用於 i篩選特異性調飾GS21基因表達、RGS21蛋白，和/鄉GS21同Ga蛋白相互作 用，掛共了在味覺細胞中對於RGS21活性(例如RGS21 GAP活性)的調節作用， 並從而增強甜味敏感味覺細胞信號的方法和/或生物化學試驗。
如本文所用，化合物文庫是生理活性試劑，例如天然存在的化合物、生物 力籲、蛋白質、肽、寡肽、多糖、核苷酸或多聚核苷酸。換句話說，化合物是 ;小分子。如本文所用，"味蕾細胞"或"味覺細胞"可交割吏用，其包括組織 成群而形成舌頭上味蕾的神^i:皮細胞，例如葉狀、真菌狀以及有觸毛的細 胞(Roper等人，1989， Ann， Rev. NeuroscL 12:329-353)。還在上顎及其它 組織，例如食管、腸和胃中發現了味覺細胞。
如本文所用，包括M種語法形式的術語"調節(modulatory)"、"調 ,節(modulation)"、"調節子(modulator)"、"抑制(inhibitory)"、"抑制(inhibiting)"、"抑帝躋U (inhibitors)"、"活化(activating)" 和"活化劑(activators)"可交#[頓來 酎周節、抑制和/或活^RGS21蛋白 好，例如配基、激動劑、拮抗劑及其影響RGS21基因或蛋白的同系物和模擬 體，或其包含生物學活性部分的片段。調節賴括例如改變在GPCR信號轉導中 RGS21基因或蛋白或其包含生物學活性部分的片段，與G a蛋白及其它效應子的 相互作用；以及阻止、鈍化和退敏RGS21基因或蛋白的化合物。調節子可包括具 有改變活性的RGS21基因或蛋白的遺傳，形式，以及天然存在和化學合成的配 基拮抗劑、激動劑、小化學好等。"調節作用"指上調、誘導、剌激、增 強、減弱和/或抑制的解除，以及抑制和/或下調或抑壓。抑制劑是例如結合、 部分或完全阻翻l撒、降低、ffiih、延遲活化、.鈍化、退敏或下調RGS21基因或 蛋白的化合物，例如拮抗劑。活化劑是例如結合、鵬、增加、打開、活化、 利於、增強活化、敏《域上調RGS21基因或蛋白的化合物，例如激動劑。
如本文所用，術語"RGS"或"RGS蛋白"包括目前己知或親ffi描述的G蛋白 信號蛋白的調節子，其能夠抑帝蜮結合到Gcii類蛋白或其它的Gci蛋白上。這種 RGS蛋白包括，但不限^GAIP、 RGSzl、 RGS1、 RGS2、 RGS3、 RGS4、 RGS5、 RGS6、 RGS7、 RGS8、 RGS9、 RGSIO、 RGSll、 RGS13、 RGS14、 RGS16、 RGS17、 RGS21、 D—AKAP2、 pll5RhoGEF、 PDZ-RhoGEF、 bRET-RGS、 Axin和mCONDUCTIN，以及任何目前已知 或茅腿描述的亞型或同系物。另外，如本文所用，術語"RGS蛋白"包括含鬱GS 核心結構域的目前己知或新近描述的蛋白，戶娜GS楊O結構域含WRGS盒結構 域、非RGS盒結構^^任何其它的功能性結構敏基序，有或沒有一個或多個突 變、缺失或添加。在一個雌實施方案中，RGS蛋白指RGS21蛋白、其亞型或同 系物。在又一4im實施方案中，RGS21蛋白核心結構域與野生型RGS21蛋白核 心結構鵬有至少60%同源性，雌75%同源性，更雌85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多同源性。如本文所用，RGS21蛋白核心結構域包含蛋白的 生物學活性部分。
如本文所用，RGS蛋白(自GS21蛋白)的"生物學活性部分"包括含有 足夠同源於或來源於該蛋白的氨基Mi^列的蛋白片段，其包括比^:蛋白少的 胺基酸，並M示出錄蛋白的至少一種活性。一1 說，生物學活性部他 括具有蛋白的至少一種話性的結構域或基序。蛋白的生物學活性部分可以是多 肽，其長度例如IO、 25、 50、 100、 200頓多個胺基酸。在一個實施方案中，可將RGS21蛋白的生物學活性部分用作耙點來開發調飾GS21與G a蛋白相互作 用的製劑。
本發明提供了用於在宿主細胞中重組^ii和純^扭GS21蛋白和相應物和/或 適當的Ga蛋白的方法，戶;f^宿主細胞包括但不限於細菌、酵母、昆蟲和哺乳動 物細胞。在一個雌的實施方案中，方^^別從克隆並分離編碼RGS21和適當的 Ga i蛋白的cDNA開始。然後分別將編碼RGS21和適當的G a i蛋白的分離的d)NA克 隆A^ii載體中，並Ua—步轉化並在宿主細胞中親來製備重組RGS21和Ga i蛋白。
如本文所用，"重組體"指合成或體外操作的多聚核苷酸(例如"重組 多聚核苷酸")，指j頓重組多聚核苷自在細胞或其它生物學體系中制^ 因產物的方法，或指由重組多聚核苷MMI碼的多肽("重組蛋白")。"重 組體"還包含將來自不同來源的各種編碼區或結構域或啟動子序列的核苷酸連 接入用於融合蛋白的毅(例如誘導性或組成性敲)的^ii盒或載體，所 述融合蛋白包含本發明的移位結構域和應用本發明的引物擴增的核,列。
如本文所用，術語"Go "或"Gcl蛋白"包括目前已知或茅ffi描述的Gci i 類的鄉成員，包離不限TGail-3、 Gaz、 Ga0、 Gas、 Gaolf、 Gat、 G aq、 Gall-14和Gal6。如本文所用，術語"相應和/或適當的G a蛋白"指在 f頓的細胞、篩選逸驗或體系中會魏狩妾觸目的RGS蛋白(例如RGS21蛋白)的G a蛋白。在特定的實施方案中，Ga蛋白可包含一個或多個突變、缺失或添加。 在這種實施方案中，Ga蛋白與野生型Ga蛋白具有至少6(Fo同源性，雌75%同 源性，更^^85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更多同源性。如本文所用， 術語"相應和/或適當的Ga蛋白"指在4頓的細胞、篩選i^^或體系中會辦接 觸目的RGS蛋白(例如RGS21蛋白)的Ga蛋白。更雌地，適當的Ga蛋白能 ^t妾角艦GS21蛋白。在使用的細胞、篩選i^^或體系中還將相應的Ga蛋白結合 至UGPCR和/或結合至UGTP上，以便G a蛋白會^^數蟲GPCR和/或GTP，或能夠轉導應 答結合至IJGPCR的激動劑的信號。如本文所用，術語"結合到GPCR的激動劑"包 括結合到GPCR並弓跑反應的樹可^ 或試劑。
如本文所用，術語"cDNAs"包括互補於存在於細胞或有柳輛A中的mRNA
的DNA，戶;f^mRNA可由酶(例如反轉錄酶)轉化為cDNA。在一個，實施 方案中，應用本鄉縱; 周知的RT-PCR方法從人味蕾細&RNA中分離編碼RGS21
13的cDNA。
如本文所用，術語"多聚核苷酸"、"核^/核苷酸"和" 核苷酸"可 交割OT，並且包括任何長度的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其 類似物的多聚體形式。多聚核苷酸可具有倒可三維結構，並且可表現ftf可已知 ;或未知的功能。以下是多聚核苷酸的非限帝勝實例基因或基因片段、外顯子、
內含子、信j效NA (niRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、DNA、 cDNA、基因組 DNA、重組體多聚核苷酸、分支多聚核苷酸、質粒、載體、倒可序列的分都NA、 ftf可序列的分敲NA、核酸探針和引物。多聚核苷酸可為天然存在物、化學合成 物、重組體或其任意組合。多聚核苷酸可包含傲布的核苷酸，例如甲謝措亥苷
)酸和核苷酸類似物。如果存在的話，可在聚合物裝配前後給予對於核苷酸構建 體的斷布。可扭瞎苷酸組^^中斷核苷,列。可在聚合後進一步傲布多聚 核苷酸，例如M與^i己組分結合。該術語還包括雙鏈和單鏈好。蹈一另作 說明或要求，本發明的{對可實施方案中多聚核苷,含雙鏈形式和已知或預測 的兩個互補單娜式來組成雙鏈形式。
; 如本文所用，術語"多聚核苷,列"是多聚核苷酸分子的字母皿式。
多聚核苷酸由四種核苷酸ltt的特定序列組成腺嘌呤(A);胞嘧啶(C);
鳥嘌呤(G);胸腺嘧啶(T);並且當多聚核苷酸^RNA時尿嘧啶(U)代替了
胸腺嘧啶。可將該字母^^;輸入 庫，並用於生物信息申請，例如功
倉針生基因組和同源性檢索。
> 如本文所用，術語"分離的多聚核苷m/cDNA分子"包括分離自存在於天然
多聚核苷酸的資源的其它多聚核苷酸^^的多聚核苷酸^f 。例如，就基因組 DNA而言，術語"分離的"包括分離自基因組D皿天然結合的^體的多聚核苷
酸分子。iM地，"分離的"多聚核苷酸不包含^;人中得到多聚核苷酸的有機
體的基因組DNA中多聚核苷酸天然側面的序列(g卩位於目的多聚核苷酸的5'和 ;3'端的序列)。例如，在各種的實施方案中，本發明的分離的多聚核苷酸勿籲， 或編碼本發明的多肽的多聚核苷酸分子，可以包含少於大約5kb、 4kb、 3kb、 2kb、 lkb、 0. 5kb或0. lkb核苷辦列，戶脫核苷,列位於在從中得至眵聚核苷酸的 細胞的基因組DNA中多聚核苷酸天然偵靦。此外，當由重組技術製備時，"分離 的"多聚核苷酸^f ，例如cDNA好，可以基本上不含其它的細胞物質或培養 >基或者當用化學合成時，可以基本上不含化學帝糊前體或其它化學製劑。如本文所用，術語"基因"包括含有至少一個開放讀碼框的多聚核苷酸， 戶/M開放讀碼框能夠在轉錄和翻譯之後編石執寺定的多肽或蛋白。本文阮逸的任 意多聚核苷,列還可用於鑑定與其結合的基因的較大片段或全長編碼序列。 本領域技術人員已知分離更大片，列的方法。如本文所用，"天然存在的"
多聚核苷酸分子包括，例如具有在自然界存在的核苷,列的RNA或DNA^^
(例如編碼天然蛋白)。
如本文所用，術語"多肽"或"蛋白"可交替，並且包括兩個或更多個亞 基胺基酸、胺基酸類似物或多肽模擬體。亞基可由肽鍵連接。在另一個實施方 案中，亞基可由其它鍵(例如酉旨、醚等)連接。如本文所用，術語"胺基酸" 包括天然和/或非天然的或化學合成的胺基酸，戶，甘氨酸和D孤光學異構體， 以及氨基^^似物和多肽模擬體。通常將三個或更多個 酸的肽認為是寡肽。 將大於三個，多^^氨^^的肽鏈認為是多月太或蛋白。
在優選的實施方案中，本文所用的RGS蛋白指在味覺細胞和/或宿主細胞中 天然和/或重組皿的RGS蛋白。更，地，在味覺細胞和/或宿主細胞中天然和 /或重組表達的RGS21蛋白或編碼RGS21多肽的多聚核苷酸。如本文所用，
(express)"或(expression)"包括將多聚核苷酸,成RNA和/或翻 譯成多肽的步驟。如果多聚核苷^^源於基因組DNA，則若選擇適當的真核宿主 的話，鋭可包括RNA的^I妾。需要載的調控元件包括結合RNA聚合酶的啟動
子序列和用於核糖體結合的轉錄起始序列。例如，細菌^ii載體包括啟動子(例 如lac啟動子)禾口用於轉錄起始的SD序列，以及起始密碼子AUG。類j跟也，^t亥 ，載體包括RNA聚合酶工I的異源或同源啟動子、下遊多聚腺苷酸信號、起始密 碼子AUG禾,於核糖體分離的終止密碼子。可在商4Lh獲得這種載體，,過本 領域已知的方法(例如如下戶腿用於構建一般載體的方法)所描述的序列組 合來得到這種載體。如本文所用，術語"載體"包摘 入的多聚核苷酸轉移 入和/或宿主細胞之間的自我複製核酸^f 。該術語要包括功會注要用於將核酸 ^f插A^ffl胞的載體、功旨註要用於核酸複製的載體和功能用於DNA或RNA的轉 錄和/或翻譯的,載體。還包括掛共，一個以上功能的載體。
如本文所用，"宿主細胞"包括粗可單個細胞或細胞培養物，其可以或已 經是載體的接受者翻於結合外來的多聚核苷酸和/或多肽。其還包括單個細胞 的子代。由於天然、隨機或有意的突變，子代可不必與原來的母細胞完全相同(在形態學上或在基因組或總DNA互補上)。細胞可為原核或真核的，並且包括 但不限於細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞和哺乳動物細胞，包括但 不限於鼠、大鼠、猿或人細胞。如本文所用，"宿主細胞"還包 趟糊針布的 細胞。術語"遺傳銜布的細胞"包括含有和/或親外來漱卜源性的基因或多聚 核苷 列的細胞，其依次<針布細胞或其子代的基因型或表現型。"遺傳{針布" 還包括含有或，已導A^胞的基因或多聚核苷M^列的細胞。例如，在該實 施方案中，將對於細鵬說是內源的基因導AiI衙針布的細胞中。術語"遺傳 {針布"還包括對於細胞的內源核苷酸的倒可添加、缺失或斷裂。如本文所用，
"宿主細胞"還包括味覺細胞。在一個優選的實施方案中，味覺細胞是人味覺 細胞。在雌的實施方案中，味覺細K^源於人味蕾細胞。在另一個雌的實
施方案中，味覺細胞是味覺細胞典型，例如:STC-1細胞、NCI-H716細胞細uTu-80 細胞。
更，地，本文所用的RGS21蛋白包括由多聚核苷酸編碼的RGS蛋白，所述 多聚核苷酸在嚴謹斜牛下與編碼RGS21蛋白的多聚核苷^^交。如本文所用，"雜 交"包括一個或多個多聚核苷酸反應形成複合物的反應，所述複合物經由在核 苷酸殘基的 之間的氫鍵鍵合來保持穩定。可M:Watson"Crickg^酉樹、 Hoogstein結合或以倒可其它的序列"4寺異性方^^^fi鍵鍵合。該複合物可包 含形成複合結構的雙鏈，形成多鏈複合物的三鏈，多鏈，單個自雜交鏈，或 其任意組合。雜交反應可構成更廣Si程中的一步，例如PCR反應的起始，或
m核酶的多聚核苷酸的酶切割。
可在不同的嚴謹^#下進行雜交反應。本發明包括能夠在降低的嚴謹斜牛
下，更,在嚴謹劍牛下，並且最,在高度嚴謹剝牛下與編碼本文戶;M的
RGS21蛋白的多聚核苷,交的多聚核苷酸。如本文所用，術語"嚴謹條件"指 在60。C、 10XDenhart氏溶液、6XSSC、 0. 5%SDS和IOOu g/ml變性的鮭魚精DNA 中雜M夜。繼續將印跡以3XSSC/0.1% SDS，隨後以1XSSC/0.1% SDS，並最 後以O. 1XSSC/0.1o/oSDS，在62。C下每次衝洗30辦中。也如本文所用，在雌的 實施方案中，短語"嚴謹剝牛"指在6XSSC溶液中65。C下雜交。在另一個實施 方案中，"高度嚴謹^#" ^65。C下在10XDenhart氏溶液、6XSSC、 0.5%SDS 和100ng/ml變性趟精DNA中雜效夜。繼^對各印跡以3XSSC/0.1%SDS，隨後 以1XSSC/0.1%SDS，並最後以O. 1XSSC/0.1%SDS，在65。C下每次衝洗30^H中。
16御einkoth禾nWahl， 1984， Anal. Biochem 138:267—284; Current Protocols in Molecular Biology,敷章，Ausubel等人編輯，Greene Publishing and Wiley-Interscience，紐約，1995;以及Tyssen， 1993， Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid
;Probes.第I部分，第2章，Elsevier,紐約，1993中描述了核麟交的方法。因 此，由本文所用的核酸編碼的RGS21蛋白包括與在SEQ ID NO: l中所列的多聚核 昔,列具有至少60%同源性，雌75%同源性，更^^85%同源性，優選90%同 源性，最雌95%、 96%、 97%、 98%、 99%同源性的核酸，所述多聚核苷,列編 碼具有如在SEQ ID N0: 2中所歹啲氨基辦列的RGS21蛋白。'
! 此外，本文所用的RGS21蛋白還可以是嵌合蛋白或融合蛋白。如本文所用，
"嵌合蛋白"或"融合蛋白"包含有效與第二多肽相連的第一多肽。嵌合蛋白 可選擇性地包含與第一職二多肽有效相連的第三、第四鄉五或其它多肽。 嵌合蛋白可包含兩個或更多個不同的多肽。嵌合蛋白可包含同樣多肽的多個拷 貝。嵌合蛋白還可在一個或多個多肽中包含一個或多個突變。在本領域中已知
:用於製備嵌合蛋白的方法。在本發明的一個實施方案中，嵌合蛋白^RGS21蛋白 與其它的RGS蛋白的嵌合體。在本發明的又一個實施方案中，嵌合蛋白匙ai和 其它Gci蛋白的嵌合體。
本發明掛共了篩選大量化合物的方法，戶;M化合物選擇性並特異性地與
RGS21蛋白相互作用來調節味覺信號。這種方fefe含從宿主細胞中分離並純化 ,RGS21蛋白；體外測定純化的RGS21蛋白與測試化合物的結合；在有結舒純化 的RGS21蛋白的測試化合物存在的情況下領啶純化的RGS21蛋白與純化的G ci蛋 白的結合；進一步在有結合於純化的RGS21蛋白並調節純化的RGS21蛋白與純化 的G a蛋白的結合的測試化合物存在的情況下測定RGS21蛋白對於純化的G a蛋 白的活性；以及鑑定結合於純化的RGS21蛋白、改變純化的RGS21蛋白與純化的G ;a蛋白的結合而腿一步調鄰GS21蛋白活性的測試化^tl。在一個雌實施方 案中，RGS21蛋白活性是RGS21 GAP話性。
在又一^KM實施方案中，本發明提供了在宿主細胞中篩選抑制RGS21基因 皿的大量化合物的方法。這種射跑含製備選擇性^iRGS21基因的宿主細 胞；在缺少和存在測試化合物的剝牛下測定RGS21基因在戶;M宿主細胞中的表 i達；以及鑑定抑制RGS21基因^^M宿主細胞中載的化合物。可以如von
17Buchholtz等人，2004， Eur. J. Neurosci. ， 19， 1535—1544戶/j^Z用反轉錄酶 PCR來測定RGS21基因的皿。
在又一個i^的實施方案中，本發明樹共了在宿主細胞中篩選抑制RGS21 蛋白皿的大量化合物的方法。這種方t^含審恪選擇性^iiRGS21基因的宿 主細胞；在缺少禾口存在測試化合物的^f牛下測定RGS21蛋白^^腿宿主細胞中的 表達；以及鑑定抑制RGS21蛋白在戶;f^宿主細胞中表達的化合物。
如本文所用，"分離的"或"純化的"蛋白多聚核苷酸或^T指除掉其天 然存在的環境，或基本上不含細胞物質，例如來自取得蛋白多聚核苷酸或^f 的細胞或組織凍源的其它汙染蛋白，或當化學合成時基本上不含化學製劑前體 或其它化學製劑。術語"基本上不含細胞物質"包括從細胞的細胞組分中分離 的帝劍，其中細胞組分為分離的或重組製備的^AX合成的。在一個實施方案 中，術語"基本上不含細胞物質"包括與其它蛋白(此^h^稱為"汙染蛋白") 具有小於大約30。Z。(以乾重計)的目的蛋白，更雌小於大約20%，進一步更優 選小於大約蔑，並且最雌小於大約5%的其它蛋白的製劑。當重組製備蛋白或 多聚核苷酸時，還i^t^^:上不含培l^基，艮口培養基表現為小於大約20°/0，更 雌小於大約腦，並且最雌小於大約5%的目的蛋白製劑的量。
本發明進一步提供了測定RGS21 GAP活性的方法。如本文所用，術語"GAPs" 能TP酶活化蛋白。包才舌RGS21蛋白的所^RGS蛋白是異^^三聚傲蛋白的Gi和/或 Gq類的ct亞基的GAP。在本領域已知測定RGS GAP活性的方法，並且已經 ^1 過磷脂酸(PA)、溶血磷脂酸(LPA)和磷脂鸝醇3， 4， 5-三磷鵬醇(PIP3)， 而不;^I31其它的磷脂、磷醒醇或甘油二酯來抑制RGS GAP活性。
在一個,實施方案中，iMl啶GTP水解來體外測定RGS21 GAP活性。本 發明表明將純化的RGS21加入結合至ijGTP的Gd i蛋白中增加了GTP的水解率。因 此，本發明掛共了體外測定GTP水解的方法。在本領域已知體外測定GTP水解的 方法。在一個iM的實施方案中，如果來自膜結部a蛋白的方婦寸性損失樹共了 GTP7K解的觀啶的話，本發明掛共了結合M"性GTP的水解方法。在又一個雌 實施方案中，本發明提供了一種用於RGS結構域GTP斷足進活性的直接基於螢光 的試驗(Willard等人，2005， Anal Biochem. 15; 340 (2) : 341-51)。該方 齒頓核糖共軛的螢光鳥苷酸類似物BODIPYFL^TP作為光譜探針來測定由Ga 的固有和RGS蛋白催化的核苷酸水解(Wiilard等人，2005， Anal Biochem. 15;340 (2) : 341-51)。本發明表明當加ARGS21時，從Ga蛋白^l寸的B0DIPY熒 光的損失提供了GTP水解的測定。在又一個 實施方案中，本發明提供了用於 G a和RGS21相互作用的時間女，辛的螢光，能量轉移(TR-FRET)試驗(Leifert 等人，Ami Biochem.印刷中)。TR-FRETi離表JIffi於激酶活性定量的髙靈敏 和加強的高il量篩選(HTS)方法(Moshinsky等人，2003， J. BiornoL Sere. 8 (4) : 447-452)。本發明表明了抑制Ga和RGS21相互作用的調節化合物斷氐 了TR-FRET信號。本發明進一步表明了MU定GTP水解來測定RGS21 GAP活性的
方法不限於本文所介紹的方法，用於測定GTP7jC解的其它X^f周知的方^&適於 測定由於RGS21 GAP活性的GTP水解。
本發明進一步掛共了篩選調1 RGS21 GAP活性的化^t/的文庫的方法，艮P: 本發明提供了鑑定RGS21蛋白調節子的方法或篩選試驗。RGS21蛋白調節，括 含有以下部分(例如肽、模擬肽、對太、多聚核苷酸、小^ 或其它藥物) 的化合物或試劑(a)結合到如上定義的RGS21基因或蛋白，或(b)對於RGS21 蛋白與其一個或多個其天然基質(例如Gcii)的的相互作用有調節作用，或 (c)對於如上定義的RGS21基因或蛋白的毅有抑帝U作用。這種逸驗一般包含 在RGS21基因或蛋白與一種或多種試驗組分之間的反應。另一個組分可為測試化 合物自身，或測試化合物與RGS21基因或蛋白的結合伴侶的組合。
本發明的測試化合物通常是小^T或生理活性試劑。在一個tt^實施方案 中，測試化合物是小分子。在另一個雌實施方案中，測試化合物是生理活性 試劑。生理活性試劑包括但不限於在哺乳動物中具有生物活性的天然存在或化 學合成的化合物或^^ ("生物5)^")，以及蛋白、肽、寡肽、多糖、核苷 酸和多聚核苷酸。雌地，生理活性試劑是蛋白、多聚核苷酸或生物^T。本 領域技術人員懂得該測試化，盼I4M可,由RGS21基因戶満碼的蛋白或如
上定義的蛋白盼f頓而改變。可從倒可可利用的資源(包括天然和/或化學合成 的化合物的系統文庫)中獲得本發明的測試化合物。
一般而言，用於篩選蛋白抑制劑或活化劑的方法和組分，以及體外和/或體 內的蛋白-蛋白和蛋白-配體結合的研究為本領Mff知，並可與本發明的方法組 合應用。在一個實施方案中，本發明掛共了篩選能抑制RGS21蛋白與Ga蛋白結 合的測試化，的方法，所述方法M31將測試化合物、分離和/或純化的RGS21 蛋白和分離和/或純化G a蛋白^^在一起，和測定在測i式化合物存在的條4牛下
19RGS21蛋白禾口G CC蛋白的結合是否發生和/或改變。測試化合物可為小^或生理
活性試劑。如以下所述，可由本鄉i^;;f周知的各種文庫掛共測試化合物。在
又一個實施方案中，本發明掛共了涉及檢測測試化合物抑制RGS21蛋白結合至ljGa蛋白的能力的篩選試驗。在又一個實施方案中，本發明也樹共了RGS21敏、活性或結合能力的抑制子/調節子用於調控RGS21所調節的味覺信號。
在又一^tte的實施方案中，本發明掛共了篩選倉嫩千^RGS21蛋白與Ga蛋白結合的測試化合物的方法。該肅跑括將分離和/或純化的RGS21蛋白、測試化合物和分離和/或純化的G ct蛋白組合；測定RGS21蛋白與G a蛋白的結合；
以及關聯測試化合物幹涉結合的能力，其中同缺少測試化合物相比較，在有測試化合物存在的剝牛下RGS21蛋白與Ga結合M^、，表明測試化合物能W蹄U結合。在一個,實施方案中，在達到TR-FRET平衡同時或之後，將測試化合物在體外加入到分離和/或純化的Ga i和RGS21蛋白，或其包含如上所定義的蛋白的生物學活性部分的功能性片段的孵化中。然後測定TR-FRET信號。本發明表明抑制G ct和RGS21相互作用的調節化合物斷氐了TR-FRET信號。
本發明還提供了實施高通量篩選倉詢柳制RGS21基因和/或如上所述的蛋白的活性或毅的測試化合物的方法。在一個具體實施方案中，高通量篩選的方法涉及在有適當的G a蛋白存在的條件下將測試化合物與RGS21基因和/或蛋白組合，並應用如上戶腿的功能性試驗來檢測測試化合物對於RGS21基因禾口/或蛋
白的作用。可將本領fem^f周知的各種高通量功能性試徵且合用於篩選和/或研究不同類型活化測試化合物的活性，但是因為該結合體系常常難以預測，所以可能需要i體大量i微來檢測各種結合機制。本領域已知各種基於螢光的技術，並能高通量和極高通Kt行活性篩選。以高靈i(S來ff^大量和各種測試化合物的能力容W^析潛在的RGS21抑制劑。本發明樹共了M在本領域已知的高通量試驗或基於螢光的試驗中將測試化合物與基因禾口/或蛋白組合，高通量篩選能抑制RGS21基因和/或蛋白的活性的測試化合物的方法。在一個實施方案中，高通量篩選微檢測了大量測試化合物結合RGS21基因禾口/或蛋白的能力。在另一個實施方案中，高通量篩選i離檢測了大量測試化^W制RGS21蛋白結合伴侶(例如Gd蛋白)結合到RGS21蛋白的會旨力。在又一個實施方案中，高通魏選試驗檢測了大量測試化合物調節艦味覺信號轉導的味覺信號的能力。
在又一^M^實施方案中，本發明掛共了篩選大量化合物來增強甜味的方
20法。這種方 跑含鑑定抑制RGS21蛋白活性的化合物(RGS21蛋白抑審躋U);測定由甜味劑斜蟲的和與化合物(RGS21蛋白抑制劑)組合時m甜味劑受體活化的甜味信號；以及鑑定增加戶腿甜味劑的甜味信號的化^J (RGS21蛋白抑制劑)。
本發明進一步掛共了測定以上鑑定的調節化合物對於味覺細胞中的RGS21GAP活性的作用的方法。在雌的實施方案中，應用了監測甜味劑受體活化的標準信號i微。這種方 跑括但不限於測定a)在第二信使(例如！丐、IP3、 DAG、PIP2、 cAMP、 cGMP等)的變化，b)在蛋白激酶活性(例如PKA、 PKC、 GRK、 ERK、Akt、 Src、 RTKs等)的變化，c)在甜味劑受體定位的變化，以及d)在味覺細!fil莫電位的變化。如本文所用，"甜味劑受體"指涉及味覺信號轉導途徑的目前已知的以及f^發現的受體蛋白，包括但不限TGPCR的T1R家族和GPCR的T2R家族以及其亞型和同系物。
如本文戶脫，"甜味劑"包括但不限於a)碳水化合物甜味劑，包括但不限於蔗糖、葡萄糖、果糖、HFCS、 HFSS、 IH荅格糖、海藻糖、卜半乳糖、鼠李糖；b)化學合成的高效甜味劑，包括但不限於阿斯巴特、紐甜、乙醯磺胺酸鉀、三氯半乳蔗糖、環戰氨基磺酸鄰、糖精、新橙皮武二氫査爾酮；c)天
然的高效甜味劑，包括但不限於萊imwu、萊鮑迪抑、萊ttt武c、萊m
BtD、萊鮑迪遊、豐i/爾可苷A、豐±/爾可部、甜茶武、甜葉菊苷、羅漢果武IV、羅漢果武V、莫那亭(Monatin)、仙茅甜蛋白、甘草甜素、輞州竹芋甜素、莫那靈、馬模柳甜蛋白、Brazzein、莫那亭(Monatin) 、 Hernandulcin、甘茶素；d)多元醇，包括但不限於赤蘚醇、麥芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、乳糖醇、機醇、異麥^H醇；以及e)胺基酸，包括但不限於甘氨酸、卜孤-丙氨酸、
D"色氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸。
特別地，將如上定義的甜味劑對於這對言號"讀數"的作用與同摘則的RGS21
調節化^t/相結合的甜味劑的作用相比較。本發明表明RGS21蛋白抑制齊贈強了觀察到的甜味劑的作用。例如，如果^^蟲甜味劑增加了胞內鈣的釋放，貝娜味齊脷RGS21抑制齊啲組合與^^蟲的甜味劑相比將增加f!釋放。在另一個雌實施方案中，本發明還掛共了用於篩淑GS21蛋白抑制齊御調節鮮嚇口苦味的調節子的方法。
此外，本發明提供了在人體中證實RGS21調節子對於人的甜味感覺以及鮮味和苦味感覺的作用的方法。在一個雌實施方案中，本發明提供了單獨品嘗測
試甜味劑所感覺的甜度與品嘗測試甜味劑和RGS21調節化合物的組合所感覺的甜度的比較。本發明表明RGS21抑制劑增加測試甜味劑所感覺的甜度，而RGS21增強子降低測試甜味劑所感覺的甜度。
此外，本發明提供了在味覺細胞中篩選特異性與RGS21蛋白相互作用或抑制RGS21蛋白的大量化^tJ的方法。這種方^^括製備天然^&一種或多種味覺信號蛋白的味覺細胞，戶脫味覺信號蛋白包 翻甘味劑受體，例如T1R2/T1R3，包含a亞基a-味蛋白的相應G-蛋白，效應子，例如PLC02，以及RGS21蛋白；i^腿味覺細胞中分離並純^RGS21蛋白；須啶純化的RGS21蛋白與測試化合物的體外結合；須啶在有結合到純4teGS21蛋白並調節純^RGS21蛋白與純化Gci蛋白結合的測試化合物存在的劍牛下，純4teGS21蛋白與純化Gd蛋白的結合；進一步測定在有結合到純^RGS21蛋白並調節純^RGS21蛋白與純化G a蛋白結合的測試化合物存在的割牛下，RGS21蛋白對於純化Gct蛋白的活性；以及鑑定結合到純^RGS21蛋白、調節純4tRGS21蛋白與純化Ga蛋白結合併進一步調節RGS21蛋白活性的領賦化合物。在一個雌的實施方案中，RGS21蛋白活性^GAP活性。在另一個雌的實施方案中，味覺細鵬源於人味蕾細胞。在另一個優選的實施方案中，味覺細胞是味覺細胞典型，例如STC-1細胞、NCI-H716細胞細uTu-80細胞。
本發明進一步掛共了包含用於增強甜味信號的RGS21基因禾口/或蛋白的抑制齊,/或調節化合物的組合物。本發明還掛共了包含用於調節鮮嚇口苦味，而不僅僅是甜味的RGS21基因和/或蛋白的抑帝躋脷/或調節化合物的組合物。
當閱讀了附加的說明和實施例時，本發明的這些和許多其它的變化和實施方^於本領m術人員來說是顯而易見的。
實施例鄉例l尺GS2]和G a蛋^的重組，如von Bucholte等人(2004， Eur. J. Neurosci. 19:1535—44)戶腿，應用RT—PCR從人l5ftmRNA中分離編碼RGS21的cDNA (GenBank登錄號NM—001039152)。如Willard等人(2005， Anal， Biochem. 340:341-51)戶脫，將編石^r^RGS21蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO: 1，其編碼SEQ ID NO: 2)或編碼RGS21的RGS盒的cDNA序列(編碼在SEQ ID NO: 2的位點21至(J137的胺基酸)克隆入用於重組蛋白表達和純化的適當載體，例如適當的pGEX載體(GE Healthcare)中。在該實施例中，在大腸桿菌中毅重組RGS21，並加AN-彩g胱甘肽S-轉移酶標己來便;於蛋白純化。
如Willard等人(2005， Anal. Biochem. 340:341-51)戶腿，將編碼適當Gal蛋白(例如a-味蛋白、Gcii2等)的cDNA克隆入pPROEXHTb原核皿載體(Invitrogen公司)。將可切除的的六組氮酸iH己(His6)力瞎廿Ga蛋白的N-末
端上，並便於蛋白的純化。' 用如上戶/M的^i質粒轉4teL21細菌，並用於製備RGS21禾口Ga蛋白。 <辦
化的細菌在30-37'C下生長，並與異丙基3 -D-硫代半乳M^起孵育來誘導蛋白的皿。通,續的犯2+-次氮基三乙酸酯(HiTrap Chelating HP， Amersham)、陰離子交換(Source 15Q， Amersham)和體積排阻色i普法(HiPr印26/60 S印hacrylS200， Amersham)純^His^ci蛋白。應用穀胱甘肽瓊脂糖和#%口、排阻色譜法純《七GST—RGS21 (Willard等人，2005， Anal. Biochem. 340:341—51)。
將RGS21和G a蛋白二者擇一地在感染杆^毒群，載體的Sf9昆蟲細胞(von Buchholtz等人，2004， Eur. J， Neurosci. 19: 1535-44)鋼適當的表達質粒轉化的酵母細胞(Leifert等人，2006， Anal. Biochem. 355， 201-212)中，。在所有情況下，應用如上戶，的色徵辣從誘導的細胞溶解產物中分'離重組蛋白。
郷例2
G4P活性離扁柳膨J調,化鑌麟選純化的RGS21與結合有GTP的Ga屋白的相互作用增加了GTP的水解率。應用以下方^^測定GTP的水解
方法l.結合方爐性GTP的水解
在如Snow等人(1998， J. Biol. Chem. ， 273: 17749—55)戶脫，在溶液中領a定Gct GTP酶活性。簡短來說，通過在有[Y」2p]—GTP (500cpm/pmol)存在的^^牛下2(TC下在以下緩衝液(150iil最終容積)中孵化Ga蛋白3小時來製備載'有GTP的Gcu—3和Ga幡白10mMGTP、 5. 5mMCHAPS、 50mMHEPES鈉、pH7. 5， lmMDTT、
23lmMEDTA、 0. lmg/ml牛血清白蛋白、30nM (NH2) 2304和4%甘油。在負載之後，通過S印hadexG-25色譜法將反應混合物交駄lmM CHAPS、 50mM HEPES5 pH7. 5、lnMDTT、 lmMEDTA、 0.018mg/ml牛血清白蛋白中。然後將蛋白洗脫液用冰冷的OG緩衝液中(0.1%辛烷基葡萄糖苷、20mMHEPES鈉，pH7. 5， 80mMNaCl、 lmMDTT、lmM EDTA、 0. 01mg/ml牛血清白蛋白禾口lmM GTP)稀釋4倍。
在存在或缺少撫則的RGS21調節化合物和0G緩衝液(補充有9mM MgS04)的^j牛下M^Ga"GTP加ARGS21蛋白樣品來起^GAP活性。定時，取100p1，並朋900ml 50mM關2 04中5% (w/v) NoritA活條的懸濁液終止反應。沉澱活't^^粒，並且計數包f 2Pi的上清液。在上清液中增加附2P表現出增強的GTP酶活性。
方》去2. BODIPYFL"GTP的螢光光i普學
當結合到G a蛋白時，BODIPYFL^TP顯示了在螢光劍寸上翻基腔(m的增加，而當結合至ljGa蛋白時，由水解產生的BODIPYFL^DP僅《XM示了在螢光戱矛上超過基7但7%的增加(Willard等人，2005， Anal Biochem_ 340:341-51)。當加ARGS21時來自Ga蛋白的BODIPY螢光對寸的損失^f共了GTP水解的領啶方法。將Willard等人(2005， Anal Biochem. 340:341-51)所述的單個核苷酸結合和轉換逸驗形OT於篩淑GS21調節化，(圖4)。
方法3.用TG a和RGS21相互作用的時間分辨的FRETit驗RGS21蛋白必須物理地結合到Ga丄棘lt激TP酶活性(Neubig和Siderovski， 2002， Nat. Rev. Drug Discov. 1: 187-97)。該i纖應用時間^fJ柏勺FRET逸驗(TR-FRET)來監測RGS21禾口G a蛋白的物理結合。女、別亍頓相對於蛋白五倍摩爾過量的螢光染料，應用Alexa546氟和鋱穴狀化合物(Tb) 物來iHeHis6禾gi己的RGS21禾nHis6禾gi己的Gai蛋白(Leifert等人，2006， Anal.Biochem. 355:201-12)。將固定細i-NTA柱上的重組RGS21和G a蛋白與Alexa546順丁烯二酉tt胺或鋱穴狀化糊順丁烯二酉tt胺在室溫下孵^2-3小時。在孵化之後，將包鄰cl蛋白的棚包含5mM咪唑和300mMNaCl (pH8. 0)的緩衝液A (20mMH印es、 lOmMNaCl、 lmM MgCl2、 10nMP-巰基乙醇、0.5% (w/v)聚氧乙烯-10-十二烷基醚和10iiMGDP， pH8.0)衝絲除去未結合的Alexa546或鋱。應用緩衝廊(20慮H印es， pH8.0， 50mM NaCl， l(MP巰基乙醇、IO"MGDP、 P/。 (w/v)月旦麟、50mM MgC12、 150 mM咪唑、10mM NaF和30uM A1C13)從ftJ^5fcl兌iH己
24的Ga蛋白。將包含His6"Gd蛋白的 劃兌部分匯聚，並用^M兌緩衝》磁析(20mMH印es， pH8.0， 3mMMgCL、 10nM NaCl、 30mMP-巰基乙醇、luMGDP和0.10/0(w/v)膽酸鹽)。將^H己的His6-RC-S21蛋白從柱上用100mM NaCl、 300mM咪唑、2mM2-統基乙醇、50mMNaH2P04， pH6. O洗脫。將包含His6-Ga蛋白的洗脫部分匯
聚，並用洗脫緩衝鵬斤。
將Atexa546-RGS21在室溫下在多孔盤中(例如96孔等)與撤則的調節化合物預孵化至少10併中。同時，在FRET緩衝液(50nMTris， pH8. 0， 10諸NaCl，lmM MgCl2和lmM DTT)中將Tb""G a蛋白與30 u M AlCl3和l關NaF—起孵化至少10^H中，來形j^Tb吒cL i .GDP 'AIF4-^^度態的"活化"複合物。在裝^TR-FRET測量系統的螢光讀板儀內，通過將Tb《c^ .GDP .AIF4—與Alexa546-RGS21蛋白混合於100ul反應容積的50mMTris、 pH8. 0、 100mMNaCl、 lmMMgCl2、 30yMAlCl3、l(M NaF和lmM DTT中起始TR-FRET反應，並孵化0-30^H中來。用以下儀器體進行時間^fjf的螢光測定激發光340nm， ^!寸光572nm，延遲50us，並計數持續900us。讀數直到螢光糊穩定。在那個時候，加入其它組分例如未標己的Ga蛋白或RGS21，然後繼續螢光讀M:到螢光再次穩定為止。M向孵育緩衝液中加A^當濃度的牽舒斜己的蛋白來測定本底螢光，並暴露於相同的TR-FRET條件。將鋪娜減去本底螢光以便測定動力學參數。在缺少倒可調節化合物的斜牛下，在該時間段內達到飽和結合，可I鈔見測為FRET信號的平臺期作為作用時間(Leifert等人，2006， Anal. Biochem. 355:201-12)。抑制Ga和RGS21的相互作用的調節化合物將斷氏TR-FRET信號，而增強Gci和RGS21的相互作用的調節化合物將增強TR-FRET信號。
實施例3
基於細胞的^^鑑定iS^改變味覺受^^^/源敏作歷來調鄰GS2]活性
雌合物
為了測定推測的RGS2l調節化合物在識細胞中的作用，4頓標準信號i微來監控包 ，味、鮮味和苦味受體的G-蛋白偶聯受體信號。本文所用的更iM的標準信號試驗可選自由以下方法鄉滅的組:a)第二信4頓化(例如:鈣(Ca20、環核苷酸、月旨券代謝產物等)，b)蛋白激酶活性的變化(例如PKA、 PKC、GRK、麼激酶、Akt、 Src、受體酪氨醱敫酶等)，c)味覺受體定位方面的變化
25和d)神經3IM的釋放(例如ATP、 GLP-1、 CCK、 5-羥色胺、PYY等)。本領域已知這些標準方法，並且詳述如下。以下戶脫基於細胞的技術適用於彌性表達重組T1R2禾口T1R3味覺受體的細胞(例如HEK293細胞、CH0細胞、C0S細胞、BHK細胞、HeLa細胞等)，並且也適用於天然^iiTIR2和TlR3的細胞(例如培養的味蕾細胞、老鼠STC-1腸內分泌細胞、ANCI-H716腸內分泌細胞和AHuTu-80腸內分泌細胞等)。
基本i^設計是將甜味劑對於這對言號"讀數"之一的作用與甜味劑同推須啲RGS21調節化激相結合的作用相比較。RGS21蛋白抑制劑顯示觀測至啲甜
味劑的作用的增強。例如，如果#4蟲的甜味劑增加了胞內鈣的釋放，貝娜味劑和RGS21抑制齊啲組合使f丐釋放增加的7X平高於對蟲的甜味劑。A基於細胞的胞麟二信使i微
環核苷frt的測定可m應用市售的非方婦寸'(^Alphascreen cAMP試劑(Perkin-Elmer)測量，細胞提取物中的數量來確定在環核苷酸(例如cAMP和cGMP)方面的變化。AlphaScreen cAMP試劑被設計用來直接測定當M:GPCR調節腺苷酸環化酶活性時產生的c層的水平。該i纖是基於內源的cAMP和夕卜源加入的生物素fei己的cAMP之間的競爭。M31應用共軛到受體珠的特異性抗體來實現cAMP的捕獲。該試艦於測定激動齊訴口拮抗劑對刊a i-和G a s-結偶聯的GPCR都有效。GPCR的T1R和T2R家族活化味蛋白，其為一種Ga i家方銀蛋白。
將皿味覺受體和RGS21的細胞(例如AHuTu-80腸內分泌細胞、味蕾細胞、轉染的HEK細胞等)與結合受體珠的抗cAMP抗體一起放在多孑L板的刺激緩衝液，pH7.4 (包鄰.5mM IBMX、 5nM HEPES、 0.1% BSA)中。然後用經驗濃度的佛司可林處理細胞使得皿30射種寸產生5(F遺大量的cAMP。不同濃度的促味劑(例如蔗糖、天冬甜素等)與佛司可術n推測的RGS21調節化合物一起加入。在黑暗中孵化細胞30併中，然後在黑暗中在細胞溶解緩衝液中與結合有生物素禾斜己的c鍵(0.25U/nl)的鏈親和素包被珠的混溯一起孵育4小時。在Perkin—Elmer Envision平板讀數器中測定螢光信號。在該試驗系統中，預計促味劑濃度升高將由於抑制腺苷醯環化酶而增力DAlphascreen信號，戶腐腺苷醯環化KM少了有效與生物素iH己的cAMP和抗cAMP抗體珠競爭的胞內cAMP。
可選擇的，可穩定地用質茅如NA轉染典型味覺細胞，戶誠質茅如NA包含在含有cAMP敏感元件(CRE)的啟動子序列的控制下編碼轉錄報告蛋白(例如螢光
26素酶、e-半乳H^酶等)。該i纖監控由cAMP-敏感轉錄因子、CAMP敏感元件 結合蛋白(CREB)活化的轉錄作用。所以，轉染的細胞載的轉錄報告蛋白與 細胞中有效的c鮮量成比例。如Nguyen等人，2004， Cellular Signaling 16:1141—51; Lee等人，2004， MoL Endocrin. 18:1740—55臓，將鋭味覺 受體和RGS21的細胞(例如AHuTu-80腸內分泌細胞、味蕾細胞、轉染的HEK細 胞等)鋪在24孔平IO:，並應用Lipofectamine試劑(Invitrogen)共轉鄰RE-螢光素酶(螢火蟲)報告子質粒(0.4yg)禾口pRL—Tk (O.lug)，其組成性表 淑enilla螢光素酶來作為轉染效率對照。然後在包含10mM HEPES和O. 1% BSA， pH7. 4的PBS中用經驗濃度的佛司可林處tt使，5-12小時後產生50。/。最大量 的cAMP。在5-12小時內，不同濃度的促味劑(例如蔗糖、天冬甜素等)隨佛 司可林和撒則的RGS21調節化合物一起加入。將細 解，應用市售可得的雙熒 光素酶i^i式劑盒(Promega)按製造商的說明書來測定螢光蟲螢光素,口 Renilla螢光素酶的活性。將螢光蟲螢光素酶活性除以Renilla螢光素酶活, 使不同的轉染效^f準化，並且作為促味劑濃度敝og』勺參i^會圖。
胞內鈣的測定可 #模型的味覺細胞中 監控1丐敏感染料(例如 FURA-2， Fluo-3等)的螢光弓驢和激才光的變化來測定胞內鈣的改變；這些染 料是市售可得的。簡矢跌說，將親味覺受體和RGS21的細胞(例如AHuTu-80 腸內分泌細胞、味蕾細胞、轉染的HEK細胞等)鋪在96孔平肚生松4小時，然 後用補充WHEPES (pH7. 4) 、 1. 26nMCaCl2、 0. 5mMMgCl2、 0. 4mMMgS04和0.1%BSA
(稱為Ca"緩衝液)的Hank氏平衡鹽液(G1BC(HBRL)漂洗兩次，並在37。C下在 含有l.OyM fura 2-扁的lml相同緩衝液中孵化15麼H中。然後用Ca"緩衝液衝洗 培養物三次，並在Perkin-Elmer螢光平板讀數器內在達到螢光反應(480nm皿 光和535nm激寸光)平均水平之鵬存在或缺少撮則的RGS21調節化合物的劍牛 下與不同濃度的促味劑(例如庶糖、denatonium等)孵育20到30秒。在加入 化合物之前校正測定本底螢光的,，然後根據對轉離預體ion呵cin (1 u M， Calbiochem)的反應標準化。
可選擇的，可以艦用編蹄丐敏感的螢光蛋白水母發光蛋白的質粒轉染 ，味覺受體和RGS21 (例如AHuTu-80腸內分泌細胞、味蕾細胞、轉染的HEK 細胞等)來測定胞內轉釋放的變化，戶脫蛋白在存在底物腔腸動物螢光素
(coelenterazine)的^f牛下當結合韓時螢光m增加。水母發光蛋白對於韓
27的親合力處於低 爾的範圍，並且酶的活性與在生理學範圍內的l丐濃度(50nM 到50iiM)成正比(Brini等人，1995， J. BioL Chem 270: 9896-9903; Rizzuto 等人，1995， Biochcm Biophys. Res. Cornmun. 126: 1259—1268)。
用傳統方法對於磷f艦醇的測定甜味齊特致在典型味覺細胞中,LO後2 的活化。該酶^都鄰旨酉劃/l醇二磷酸(PIP2)裂解為第二信使肌醇三磷酸(IP3) 和二脂醯甘油(DAG)。可以應用陰離子交換色譜法(Paing等人，2002， J.Biol. Chem. 277:1292-1300)通過測量方婦射生^i己的磷MI幾醇的水解來監控在P工P2上 的變化。用[3H]^H己的肌HHRIIiH己毅味覺受體和RGS21的細胞(例如人 HuTu-80腸內分泌細胞、味蕾細胞、轉染的HE咖胞等)，並且將細胞培養基替 換為10mM HEPES緩衝液和包含lmg/ml BSA的20mM氯化鋰。然後在37C下用各種濃 度的促味劑3對數單位)剌激細M:至30^I中，在室溫下用50mM甲酸提 取45併中，然後用150mM肌0H中和。然後直接將細胞提取物上陰離子交換AG1-X8 樹脂(100-200粒度，Bio-Rad)柱，用恥衝洗，然後用5(M甲^I安衝洗，並且 用l. 2M甲^I安、0. 1M甲酸洗脫。用閃爍計iC法量化在該i微中洗脫的肌醇單、 1口三磷鵬。
可選擇地，可應用訊alphascreeni力驗來測量IP3的產量，其類似於如上所 述的c鮮Aiphascreen試驗。IP3 alphascreeni纖測定細胞IP3的育旨力，其經由 PLC- P 2的甜味劑受術刮七而應答產生，與生物素f莉己的IP魂競爭結合包含IP3 結合蛋白的受體珠。從而，預計增加甜味劑濃劇維高IP3的細胞濃度，其然後 將導致alphascreen信號的齊U量j繊性下降。將放在96孔平fci:生長的，味覺 受體和RGS21的細胞(例如AHuTu-80腸內分泌細胞、味蕾細胞、轉染的HEK細 胞等)在存在或缺少推測的RGS21調節化合物的斜牛下用提高濃度的促味劑(例 如蔗糖、denatonium等)孵育30秒(敘BS/H印es pH7. 4中)。然後裂解細胞， 並按製造商的說明書用alphascreen試劑孵育，並用PerkinElmer螢光平板讀數 器測定螢光信號。
醜蛋白激藤活性的基於紉胞旅微
已經表明甜味劑受體的活化是活^M由的絲氨M/蘇氨酸激酶，ERKs l和2 (Ozeck等人，2004， Eur. J. Pharm. 489: 139-49)。除EICi外，很多其它 的激酶也經由Gi信號途徑活化，包括絲氨斷蘇氨酸激酶，例如Akt和受體酪氨酸 激酶，如表皮生長因子受體(EGF-R)酪氨酸激酶。可在實驗上測定的許多激酶活化中的主要步驟是激酶自身的磷酸化作用。例如，測定ERK1和2活化禾號的最
普遍方式是4頓特異於磷酸化的和因此活化形式艦RK的抗體，M免疫測定或
免疫印跡方法測定。
所以，為了測定甜味劑受J初舌化作用對於ERK1、 ERK2、 Akt、 MEK和EGF-R
活性的作用，m平板免疫^iii免疫印跡4頓磷酸化激酉敏體研棘自處理
過的典型味覺細胞的細胞提取物。在由用甜味劑處理的典型味覺細胞製備的細 胞提取物中發現的磷酸化激酶量與甜味劑濃度成正比。所以，該體系對於測定 推測的RGS21調節化合物對於甜味劑受術刮七的作用也有用，其m用甜味劑和 推測的RGS21調節化^tJ處理典型味覺細胞，然後JOT特異於磷酸化激酶的抗體 來測定磷酸化激酶在結果細胞提取物中的謝魏實現。 C.味覺受體定針鵬棚澱
大多數GPCR (例如腎上腺素受體、胰高血糖素樣肽受體和GABA (B) 受體)的激動劑剌激誘導其經由胞吞作用內^/iffl胞(Moore等人，2007， Annu. Rev. Physiol， 69:451-482)，並且受體內化作用已經廣泛用作受體活化的方 法。可以應用各種方法測定T1R2/T1R3的內化，包括基於熒腿獻的影像、內 涵體的亞細胞分級分離以及細胞表面受體的不同生物化學修飾(例如用放射 性碘的細胞表面生物素iH己、碘化作用等)。
M熒爐駄來測定味覺受體定位作為基於螢光顯財的影像方法的 實例，將T1R2和/^T1R3與螢光蛋白融合(例如鄉絶螢光蛋白(GFP)、紅色 螢光蛋白(DsRed)或這種螢光蛋白的^i可光學變體(例如黃色螢光蛋白、青 色螢光蛋白等))。然後將遺傳上^t布的TlR2/TlR3受體對在適當的哺乳動物細 胞(例如HEK293、 CH0、 HeLa、 C0S、 MDCK、 H印G2等)中異源，。這些細胞 頓微f鯛載斷驢玻片上生長，然後在37。C下在存在或缺少推測的RGS21調 節化合物的剝牛下用甜味劑刺激0-3小時。〗頓活細胞或固定細胞的螢光顯棘 來測定螢光素iH己的TlR2和/敢lR3的定位。在未剌激的細胞中，T1R2/T1R3主 要定位於質膜，其可用各種螢光染料(例如FM1-43等)禾斜己。在甜味劑剌激 之後，將T1R2/T1R3再分布到內涵體，其可在用活細胞孵化10-30麼H中之後用熒 光素iH己的鐵傳遞蛋白iH己。
可選^i也，用螢光素iH己的探針(例如抗體、配基等)來fei己細胞表面 T1R2和/敬1R3。該方法適用於異源^iiTlR2/TlR3的細胞^^然^TlR2/TlR3
29的細胞。在這種情況下，在顯微鏡用載玻片或蓋斷上培養細胞，並在化下用
螢光素iH己的探針孵化0-60^l中。然後在存在或缺少推測的RGS21調節化合物的 ^fTF將細胞與甜味劑一起加熱到37'C 0-3小時。使用活細胞或固定細胞的熒 光顯微術(例如落射螢光、共聚焦等)來確定螢光素tH己的TlR2和/節lR3的 定位。在未刺激的細胞中，T1R2/T1R3主要定位於質膜，其可用各種螢光染料(例 如FM1-43等)iH己。在甜味劑娜lfct後，將T1R2/T1R3再分配給內涵體，其可 在用活細胞孵化10-30併中之後用螢光素iH己的鐵傳遞蛋白標己。
艦亞細胞分級分離來測定味覺受體定位在一個實施方案中，艦亞細 胞分級分離來測定T1R2/T1R3對內涵體的定位，其中通過機f麟切來破碎，並通 過高低速離心的組合以及與密度基質(例如蔗糖、聚蔗糖等)的應用的可能 結合來分離靴1R2/T1R3 (例如異種敬或天然敲)的細胞。從離心管中 收集片段(fraction)，並MilSDS-PAGE和免疫印跡研究TlR2和/^TlR3蛋白的 存在。
艦細胞表面受體的差別化學傲布來測定味覺受體定位在一個實施方案
中，在用甜味劑加或不加撒則的RGS21調節化合物孵化(0-3小時)之前(時間 零點)和之後，用細胞不通透化學試劑(例如功能化生物素交聯劑、放射性 碘化劑、t斜己的甜味劑等)直接iH己細胞表面TlR2/TlR3受體。M如免疫沉澱 技術分離T1R2/T1R3受體，並且研究^i己的味覺受體的分布量。在休眠細胞中， 味覺受體主要存在於細胞表面，而因此預計這些細胞包^iH己的表面味覺受體 的量最大。當甜味劑刺激時，味覺受體的內化作用將降低細胞表面味覺受體的 數值，並且在從休眠細胞(時間零點)中和從用甜味劑處理的細胞中獲得的信 號之間的差異而提供了受體內化作用的測量方法。
監控螢光禾莉己的g -抑帝隨白易位至U質膜上.-大多數GPCR變得鈍化，並且不 會旨激魏一步的胞內信號(Moore等人，2007， Annu. Rev. Physiol.， 69:451-482)。兩個主要步驟低駐了GPCR的脫敏作用受體磷酸化和與多功能 支架蛋白3-抑制蛋白的結合。在休眠細胞中，P-抑制蛋白主要存在於細胞的 細鵬中，但在激動劑刺激之後幾iH中內移位到質膜上與磷酸化GPCR結合。在 親螢光素iH己的P-抑帝暖白(例如3-抑制蛋白KFP嵌合蛋白)的細胞中 可以觀察到這種P-抑制蛋白向質膜的移位。在一個實施方案中，用編碼P-抑 制蛋白"GFP的質粒穩定轉染皿T1R2/T1R3的細胞(例如，這些味覺受體的HEK293細胞、培養的味蕾細胞、培養的AHuTu-80腸內分泌細胞等)。這種細胞 在顯微用載玻片或蓋玻片上生長，並且在存在或缺少推測的RGS21調節化合物的 ^#下用甜味劑刺#0-3小時。通過fOT螢光顯微術在活細胞或固定細胞中確定 P -抑制蛋白的定位。將g -抑制蛋白^FP從細臓向質膜的銜姚作甜味劑受 體活化的測量方法。
".鄉定贈遞質柳激的釋放
已經證明味覺細艦其它細胞類型(例如腸內分泌細胞)應答於促味劑 而釋放神糹剄太(包括GLP-1、 CCK、 PYY和5-羥色胺)；除ATP之外。4頓螢光 素/螢光素酶螢光i纖體系來定量ATP分泌。^頓競爭性ELISA/RIA方法定量神經 肽分泌，並51私LP-l而言^j列描述如下。
ATP分泌的測定味覺細胞信號中最後和駐要的步驟是神^IM的釋放， 其進一步刺激傳入神經纖維。Kinnamon和同事已經表明ATP是關鍵的"神鄉SII 質"，其從味覺細胞分泌，並與特異嘌呤源，ATP-結合的，神經纖維上的受體 相互作用(Finger等人，2005， Science 310:1495-99)。將載味覺受體和RGS21 的細胞(例如AHuTu-80腸內分泌細胞、味蕾細胞、轉染的HE咖胞等)放在 96孔平fei:生長，用包含10mM HEPES和O. 1% BSA， PH7. 4的PBS漂洗，然後在37 "下在存在或缺少摘則的RGS21調節化合物的斜牛下在相同的緩衝液中用各種 濃度的促味劑(M2-3對數單位)刺激0-306H中。收穀職細胞的培養基的樣 品，然後^頓用於ATP的市售可得的螢光i，(例如ATPlitei^驗、 Perkin-Eimer)測^ATP的濃度。
胃腸肽分泌的測定已知腸內分泌細胞(例如HuTu-80細胞)應答於味覺受 體刺激而分泌胃腸肽(例如肽YY (PYY)、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)、胃促胰島素肽(GIP)等)(Rozengurt， 2006， Am J. Physiol G astrointest Liver Physiol. 291: G171^G177)。為了測定Gl月^AHuTu-80細 胞中的分泌，可以使用競爭性的ELISA頓IA。舉例來說，可以使用市售可得的 競爭性I割足免疫測定來測定GLP-l的分泌(例如Cosmo Bio有限公司)。簡短 來說，HuTu-80細胞在多孔板(例如6孔、12孔等)中生長，在包含10raMHEPES 和0.1。/必SA的PBS， pH7. 4中漂洗，然後在37。C下在存在或缺少^i怕勺RGS21調節 化，的剝牛下在相同的緩衝液中用各種濃度的促味劑(鵬-3對數單位)刺 激0-30^H中。收穀lj細uTu-80細胞的培養基的樣品，並加入96孔平板上，所述
31平板的表面包被有山羊抗glp-1抗體、以及生物素禾莉己的glp-i標準物和兔子抗 GLP-1抗體。在4"下黑暗中孵化平板16-18小時過夜。用PBS， pH7. 4衝洗孔，並 在室溫下黑暗中用f餘和素-HRP孵化1小時。在除去鏈親和素-HRP並用PBS， pH7. 4衝ife後，加入o-間苯二胺鹽M^物溶液，並在室溫下黑暗中進行反應 30^H中。終止反應，並在492nra處測定孔的光吸收值。與標準曲線相比來測定分 泌的glp-i的數值，戶;M標準曲線由平行做的已知量的重組glp-l來產生。
鄉例4
應藶基於都應遊試驗鑑定il^被^M^2蛋^-蛋^的遊互作歷來源節
腦諧性離合物 應用FRET領j定味覺受體、Ga和g y蛋白的相互作用可f糊螢光共振會糧 傳遞(FRET)方法在活細胞中監控蛋白-蛋白的相互作用。FRET的基礎是當兩種 包含適當的FRET供體和受體螢光團(例如YFP和CFP)的蛋白彼此結合或彼此 在10-100A的區域之內時，在螢光團之間存在育糧的輻射傳遞以致於來自供體熒 光團的輻射能量(例如CFP)剌激受體螢光團(例如YFP)。結果^E察到
受體螢光團(例如YFP)的螢光激寸應答於由供體螢光團(例如CFP)的激
發。因此，正FRET信號表現出兩個蛋白之間的緊密的相互作用。因為RGS21必須 與活化G d蛋白相互作用刺^SGTP水解，所以FRET可用於監控在RGS21和G a的 活化形式之間的相互作用。
在一個實施方案中，將齡帶有用於FRET分析的適當的螢光團(例如G a-YFP+RGS21-CFP等)的一對蛋白相互作用對在適當的細胞體系中共表達(例 如HEK293、 CHO、 HeLa、 C0S、 BHK、 Sf9昆蟲細胞、酵母等)。寸頓本領嫩 術人員己知的標準好生物學方》錸製備嵌合蛋白，藉此將YFP融合至IJGa頓白， ^CFP融合至IJRGS21中，並將嵌合蛋白克隆AM當的蛋白載載體(例如 pcDNA3. l等)。將蛋白對穩定i也轉染入宿主細胞中。f私a頓白-YFP+RGS21—CFP 而言，休眠細胞預計產生低的FRET信號，因為G a-,將處^GDP結合狀態，從 而與G P 3G y i3形成結合體而非與RGS21形成結合體。用促味劑或用AlFf刺激的細 胞預計顯示出FRET信號上的增加。
在顯微鏡用載玻片或多孔平皿中培養韃G a幡白-YFP《P 3~CFP+G Y 13的細 胞，並在37。C下用撒則的RGS21調節化合物預孵化至少10^H中。然後在存在和缺少ffi^則的RGS21調節化合物的^f牛下用30uM AlCl3和10mM NaF (A1F4—)翻各 種濃度的促味劑(ffl2-3對數單位)剌激細胞。就單細胞而言，在裝有適當的 光學濾鏡的熒^M微鏡下測定FRET來檢測活細胞，並且M31用m^當的圖像 分析軟^權制敝賴啲CCD攝像機測定產4FRET的螢光信號來定量FRET信號。就 中到高通量化合物篩選而言，將在螢光平板讀數器中研究多孑L板(例如96孔 等)中細胞的生長。
酵母雙雜交it驗測定味覺受體、Ga和e y蛋白的相互作用在另一個實施 方案中，可應用酵母雙雜交i纖在酵母細胞中測定G ci鵬與G 3 13 Y』勺相互作用 (Young等人，2004， Methods Enzymol， 389:277—301)。在一個實施方案中， 將RGS21的cDNA插入缺乏內M^母RGS蛋白Sst2的酵母菌株(例如 S. cerevisiae)中，所述內,母RGS蛋白Sst2通常使酵衝a亞敏pal失活。
OTl應用本領敏支術人員^^f周知的M生物學方法，設計該酵母菌株來表 達在FUSl啟動子控制下的Renilla螢光素斷艮告子基因。在該體系中，經由酵母 a -因子受^GPCR的酵母信息素信號途徑活化導致信號途徑的刺激作用，其{ 4 了FUS1驅動的螢光素酶蛋白的表達。對於親代Sst2缺失菌株的比較表明當信息 素刺激作用時，RGS21給予的抑制水平鈍化了在親代菌株中觀察到的螢光素酶的 去P腿活化作用。因此，將^iRGS21禾nFUSl-螢光素酉敏NA構建體的細胞與推測 的RGS21調節化合物(例如化學製劑文庫、天然產物文庫等) 一起孵育，然後 用a -因子信息素刺激。RGS21的抑制劑預計減輕信息素誘導的螢光素酶的抑制。 在另一個實施方案中，將RGS21與Gal4轉錄活化結構嫩隨蟲合，荊鄰ct頓 白的鄉賊性活化突變體(Q204L)與Gal4的DNA結合結構嫩目融合。將這些DNA構 建^^定地整合A^ii報告子基因(例如螢光素酶、3-半乳m酶、CAT等) 的酵母菌株中，所述報告子基因的皿由基礎啟動子和一些上御al4結^M立 控制。預i和a味蛋白Q204L形成與RGS21的組成性結合，從而產生高水平的報告 子基因活性。所以，預計倒可降低報告子基因活性的化^t/匙GS21的抑制劑。
實施例5
肺化合物在乂味覺鄉試中離鵬證實
比較了^^蟲品嘗測試促味劑(例如甜味劑、味香的化合物或苦味、促味
劑)所感覺的強度同品嘗測試促味劑和RGS21調節化合物的組合所感覺的強度。預計f魏的RGS21增強子降低了測試促味劑所感覺的弓驢，而預計RGS21抑帝擠iJ 增強了測試促味劑所感覺的強度。在一^f寺定實施方案中，使用評判小組來測 量測試促味劑溶液的弓驢。簡失魏說，^/人樣品最初MA口開始直至iJ其吐出之 後3力H中內的一些時間點上，評判小組(通常8至lJ12人)被訓練來i啊介口碟弓驢 ;感受，並測定3驢。應用統計分析，在包含添加劑的樣品和不包含添加齊啲樣 品之間比較結果。在樣品清理口腔之後則定的時間點上得分下降，表明存在促 味劑感受的降低。
可應用本領fe:^)^周知的禾i^來訓練評判小組。在特定的實施方案中，應
用SPECTRUM描述性分析方法(SPECTRUM Descriptive Analysis Method)訓練 i 評判小組(Meilgaard等人，Sensory Evaluation Techniques,第三版，第ll 章)。訓練的中心理想地應該識別並測定基本B總；具體地說，甜、鹹、酸、
在^^n:M:n土水7rfe/口處田iV7性齒^門古:nTLK4^^;yfO亞必l S、l々々4^rf^Mrh說口
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定促味劑^it大約三到大約五次，在每次重複和/或樣品之間間隔至少五^H中， 並用^c衝細青洗口腔。
: 通常，測量促味劑3驢的方 跑含取10mL樣品方j(A口腔，保持樣品在口腔
中5秒，並使樣品在口腔中輕輕形繊渦。在5秒之後刑古感覺到的促味劑^驢， 吐出樣品(在吐出樣品後不吞咽)，喝一口水衝洗口腔(例如像漱口一樣在 口腔中有力地使水流動)然後吐出衝洗的水。當吐出衝洗的水時立即評估感覺 至啲促味劑弓驢，等待45秒；當等待45秒時，鑑定感覺出的口趟弓艘最大量的
i時間，並泡口個時候評估這個3驢(通常移動口腔並按需要吞咽)。在樣品之 間，取5iH中的間隔，用水衝^^清洗口腔。
附錄
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3權利要求
1、一種鑑定特異性調控G-蛋白信號21調節子(RGS21)蛋白的活性的化合物的方法，包含a)製備分離的RGS21蛋白或其生物學活性片段，以及分離的Gα蛋白；b)在缺少和存在測試化合物的條件下將分離的RGS21蛋白或其生物學活性片段與分離的Gα蛋白組合；以及c)在缺少和存在測試化合物的條件下測定RGS21 GTP酶活化蛋白(GAP)對於分離的Gα蛋白的活性水平；以及d)鑑定調控RGS21 GAP活性水平的測試化合物。
2、 權利要求l所述的方法，其中分離的Ga蛋白選自由a-味蛋白、Gail、 Gai2、 Gai3、 Gaz、 Ga0、 Gas、 Gaolf、 Gat、 Gaq、 Gall、 Gal2、 Ga 13、 Gal4和Gal6糹賊的組。
3、 權利要求l所述的方法，其中分離的G ci蛋白是a -味蛋白。
4、 權利要求l戶脫的方法，其中RGS21蛋白、Ga蛋白或兩種蛋白者P分離自 味覺細胞。
5、 權利要求1戶/M的方法，其中RGS21蛋白、Ga蛋白或兩種蛋白者盼離自 選自由細菌細胞、昆蟲細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞戶形賊的組的細胞。
6、 權利要求l戶腿的方法，其中通逾則SGTP的水解量來測定RGS21 GAP活 性，其中用方爐性^H己或螢光iH己來iH己GTP。
7、 權利要求6戶，的方法，其中Ml糧釋方i(A上清液的放射性標記的無 機磷麟(32Pi)的量來測定RGS21 GAP活性。
8、 權利要求6所述的方法，其中由螢光光譜測定RGS21 GAP活性。
9、 權利要救戶脫的方法，其中由時間^^的螢光共振會讀轉移(TR-FRET) 試驗測定RGS21 GAP活性。
10、 一種鑑定特異性調控G蛋白信號21調節子(RGS21)蛋白活性的化合物 的方法，包含a) 審恪^iiRGS21蛋白或其生物學活性片段以及Ga蛋白的宿主細胞；b) 用測試化合物，數蟲宿主細胞；c) 領陡在宿主細胞中的RGS21活I^K平；以及d)鑑定調控細胞中RGS21活性水平的化合物。
11、 權利要求10所述的方法，其中Ga蛋白選自由a-味蛋白、Get il、 Get i2、 Gai3、 Gaz、 Ga0、 Gas、 Gaolf、 Gat、 Gaq、 Gall、 Gal2、 Gal3、 Gal4和Gal6糹賊的組。
12、 權利要求10戶脫的方法，其中Ga蛋白是a-味蛋白。
13、 權利要求10臓的方法，其中戶脫宿主細胞是味覺細胞。
14、 權利要求13所述的方法，其中所述味覺細胞影忠自由STC-1細胞、 NCI-H716細胞郝uTu-80腸內分泌細胞所組成的組的典型味覺細胞。
15、 權利要求10所述的方法，其中所述宿主細胞是AHuTu-80腸內分泌細胞。
16、 權利要求13戶腐的方法，其中戶腐味覺細M源於人味蕾細胞。
17、 權禾腰求10戶脫的方法，其中戶腐宿主細鵬自由細菌細胞、昆蟲細 胞、酵母細胞和哺乳動物細ffi^組成的組。
18、 權利要求10所述的方法，其中所述宿主細胞是自然毅功能性味覺受 體、G蛋白、RGS21蛋白和效應子的真核細胞。
19、 權利要求18戶誠的方法，其中戶脫功能性味覺受體選自由甜味劑受體、 苦味受體和f羊味受體所組成的組。
20、 權利要求18戶脫的方法，其中所述 M子是磷脂歐P 2 (PLCP2)。
21、 權利要求10戶脫的方法，其中iMJ啶細胞中胞內第二信使的7K辨 測定RGS21活性的水平。
22、 權利要救l所述的方法，其中胞內第二信使是cAMP。
23、 權利要救2戶腿的方法，其中艦直接測量c層的數lt^測定c鍵水平。
24、 權利要救2戶;M的方法，其中M測量在包含cAMP應答元件的啟動子 序列控制下的報告子基因的載量來測定cAMP7K平。
25、 權利要求10所述的方法，其中iffil測定方婦寸活性iH己的磷^m醇的水 解^C棟則定RGS21活脈平。
26、 權利要救l戶腿的方法，其中胞內第二信使娜醇三磷鵬(IP3)或 二脂醯甘油(DAG) o
27、 權利要求10戶脫的方法，其中M測定細胞中磷酸化激酶的水平來測 定RGS21活脈平。
28、 權利要救7所述的方法，其中磷酸化激酶選自由ERK1、 ERK2、 Akt、 MEK 和表皮生長因子受體(EGF-R)糹M的組。
29、 權利要求10戶脫的方法，其中M測定細胞中甜味受體內化作用水平 來測敘GS21活脈平。
30、 權利要救9戶脫的方法，其中M螢光顯W:、 SfflE細胞分級分離、 M甜味受體的差別化學^t布或iMS糧3 -抑制蛋白的易^i/K平來測定甜味 受體內化作用水平。
31、 權利要求io戶腿的方法，其中mu定神^M、神鄉剄太或胃腸肽的^K平來測定RGS21活脈平。
32、 權利要求31阮述的方法，其中神經遞質^ATP。
33、 權利要求31所述的方法，其中胃腸肽選自由肽YY (PYY)、胰高血糖素、 胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)和胃i^夷島素肽(GIP)糹賊的組。
34、 權利要求10戶腐的方法，其中艦測定Ga亞基和RGS21的相互作用水 TO則定RGS21活脈平。
35、 權利要求34戶脫的方法，其中應用螢光共振育糧轉移或酵母雙雜交試 驗來測定相互作用水平。
36、 一種鑑定增強甜味的化合物的方法，包含a) 鑑定抑制RGS21活性的化糊；b) 測定由甜味劑受體活化的甜信號水平，戶腿甜味劑受體僅具有甜味劑， 以及與化合物結合；以及c )鑑定將由戶誠甜味劑活化的甜信號水平增強到高於僅有甜味劑所測定的 水平的化合物。
37、 權利要求36戶服的方法，其中戶誠甜味劑選自由齢K化合物甜味劑、 化學合成的高效甜味劑、天然的高效甜味劑、多元醇和 酸組成的組。
38、 一種用於調控味覺的組合物，其中組合物包含一種ita權利要求l戶;M 的方法鑑定的化合物。
39、 一種用於調控味覺的組合物，其中該組合物包含一種Mt又利要求lO戶;M的方法鑑定的化合物。
40、 一種用於調控味覺的組合物，其中該組合物包含一種M^又利要求36 戶皿的方法鑑定的化合物。
全文摘要
本發明提供了用於鑑定在味覺信號轉導中選擇性並特異性調節RGS21基因表達、RGS21蛋白表達和/或RGS21與G蛋白相互作用的化合物的方法。特別地，本發明提供了用於鑑定RGS21活性調節子來增加甜味或其它味覺的方法。還提供了包含用於調節味覺信號轉導的RGS21活性調節子的組合物。
文檔編號C12Q1/48GK101495648SQ200780028711
公開日2009年7月29日 申請日期2007年7月26日 優先權日2006年7月26日
發明者哈裡什·拉達克瑞施那, 格蘭特·E·杜波依斯, 麥可·D·布朗 申請人:可口可樂公司