食品中四種致敏原麩質成分實時螢光pcr檢測引物和探針、試劑盒及檢測方法

2023-09-13 23:11:55

專利名稱：食品中四種致敏原麩質成分實時螢光pcr檢測引物和探針、試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及食品致敏原成分的基因檢測方法。尤其是食品致敏原麩質成分的實時 螢光PCR檢測方法及其中所涉及的特異性引物、探針和相關試劑盒。
背景技術：
食品成分中存在的天然致敏原成分會引起6% 8%的兒童和2%的成人的過敏 反應，嚴重的會危及生命。其中，麩質是大麥、小麥、燕麥、黑麥等糧食中存在的天然成分，也 是最主要、最常見的致敏原成份之一。麩質是穀物特別是小麥中的一組蛋白質。小麥與黑 麥、大麥，還有燕麥十分相近。因此這些穀類也含有麩質。麩質使麵團具有堅固的結構。在 麵包加工時的醒發過程中麩質蛋白形成網狀結構，如果沒有麩質就不能形成這樣的結構， 麵包也就不能發酵。對於大多數人來說麩質是很普通的蛋白質，容易被胃腸道消化。然而少 部分人卻不能消化麩質蛋白。這些人有麩質蛋白不適應症——最常見的病症是乳糜瀉。麩 質是一系列單一蛋白質的混合物，這些蛋白質可被劃分為兩組——醇溶谷蛋白和谷蛋白。 主要的醇溶谷蛋白，也就是麩朊，似乎是乳糜瀉或麩質蛋白不適應症的主要原因，通常在患 有這種病症的免疫體中能夠發現麩朊抗體。患有這種疾病的人食用含有麩質蛋白的食物 時，他們的免疫系統就會通過損害小腸來做出反應。特別是對小腸內層的茸毛的破壞。食 物中的營養成分都是經過這些茸毛被吸收並進入血液循環的，沒有它們的幫助，不管吃進 去多少食物，人都會營養不良。因為人體自身免疫系統造成的損害，乳糜瀉被認為是自身免 疫功能紊亂，也可以看作是一種吸收障礙性疾病，因為營養物質不能被吸收。乳糜瀉還被稱 為自發性吸收不良綜合症、非熱帶性口炎性腹瀉和谷蛋白敏感性腸病。該疾病無法治癒，但 避免食用麩質可以消除其症狀，減輕並可能逆轉其損害，並降低相關的健康風險。為了確保 患有乳糜瀉的人獲得應有的警示和不被誤導，以及為食品的"無麩質"類標籤的使用提供真 實和準確的信息，準確嚴格的檢驗方法是必不可少的。 目前針對食品致敏原的檢測方法，主要有體內檢測的皮膚試驗和雙盲安慰劑對照 激發試驗，體外檢測的血清1，試驗和組胺釋放試驗、PCR檢測等。傳統的體內檢測試驗直接 檢測是否存在過敏蛋白質，由於過敏蛋白質通常痕量存在而被食品基質掩蓋，造成試驗結 果假陰性。DNA比蛋白質更耐受熱處理和壓力作用，尤其是對於一些過敏原很難獲得相應的 血清抗體。PCR方法中，在熱變性條件下目標DNA可以有效提取而不像蛋白提取時受食物基 質的影響較大，它的另一個優點是穩定性，不像蛋白質組成那樣受地理條件和季節變化的 影響。但是常規的PCR特異性較低，且存在汙染問題。 實時螢光PCR技術於1996年由美國A卯lied Biosystems公司推出，它通過在PCR 擴增過程中檢測產物的螢光信號積累實時監測整個PCR進程。由於該技術不僅實現了 PCR 從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異準確、可有效解決PCR汙染問題、自 動化程度高等特點，目前已廣泛應用於各種基因的檢測。

發明內容
本發明的目的即在於提供方便、快速、靈敏地定量檢測食品中致敏性麩質成分的
實時螢光PCR方法，以及檢測中所使用的包含特異性引物及探針序列的試劑盒。 為實現上述目的，本發明首先提供食品中四種致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測
引物和探針，它們分別是 ①大麥(Barley)Hordein基因的檢測引物和探針序列
正向引物(SEQ ID NO. 1) :5' -AACAGCTAAACCCATGCAAGGTA—3'，
反向引物(SEQ ID NO. 2) :5' -GTTCGGGGATTTGGGGTAGTTG—3'，
探針(SEQ ID NO. 3): 5' -FAM-TCCTCCAGCAGCAGTGCAGCCCT-Eclipse-3';
②小麥(Wheat)Gliadin基因的檢測引物和探針序列
正向引物(SEQ ID NO. 4) :5' -CCCAAAGTACGACGCAACGAC—3'，
反向引物(SEQ ID NO. 5) :5' -GGATTCGGTTATGCCTTCGTG—3'，
探針(SEQ ID NO. 6): 5' -FAM-CATGCCGACACACATCAAGGTTGAC-Eclipse-3'; ③黑麥(Rye)Secl基因的檢測引物和探針序列 正向引物(SEQ ID NO. 7) :5' -AAAAGAACAATCATATCCGCAGCA-3'， 反向引物(SEQ ID NO. 8) :5' -GAATTGGCTGTTGGGGCTGG—3'， 探針(SEQ ID NO. 9): 5' -FAM-TCACACCAACCATTTCCCACACCGC-Eclipse-3'; 燕麥(Oat)Avenin基因的檢測引物和探針序列為 正向引物(SEQ ID NO. 10) :5' —CGGCGATGTGCGATGTATACG—3'， 反向引物(SEQ ID NO. 11) :5' -AGCCCTTGTAGTGTTCTTAGAAGC-3'， 探針(SEQ ID NO. 12): 5' -FAM-CCCACCGCAGTGCCCTGTCGC-Eclipse-3'。 在此基礎上，本發明還提供食品中這四種致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測試劑 盒，所述的試劑盒包括檢測溶液，該檢測溶液中含有10mM Tris*Cl、50mM KCl、25mM MgCl2、 d證(dATP、 dGTP、 dCTP和dTTP)各2. 5mM、 Taq DNA聚合酶5U/ ii L以及上述四種致敏原麩 質成分檢測引物對和探針，它們分別是 大麥Hordein基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 1， SEQ ID NO. 2)和探針(SEQ ID NO. 3)各10 ii M ; 小麥Gliadin基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 4， SEQ ID NO. 5)和探針(SEQID NO. 6)各10 ii M ; 黑麥Seel基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 7， SEQ ID NO. 8)和探針(SEQID NO. 9)
各lOilM ; 燕麥Avenin基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 10， SEQ ID NO. 11)和探針(SEQ ID NO. 12)各lOiiM。 本發明進一步提供了利用上述試劑盒檢測食品中四種致敏原麩質成分的實時熒 光PCR檢測方法，該方法使用上述試劑盒，包括如下步驟
①提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液； ②反應體系取1 yl步驟①製得的模板DNA溶液，加入10 ii 1上述試劑盒中的檢 測溶液和14 y 1滅菌超純水，總體積25ul ;將以上各組分加入至0. 2mL實時螢光PCR反應 管中，混勻，5000r/min，離心10s ; ③步驟②的反應體系按下述條件進行實時螢光PCR檢測
95°C /10s， 1個循環；95。C /5s， 52°C /10s， 72°C /34s， 40個循環;
每次循環的退火時收集螢光，檢測結束後，根據擴增曲線和Ct值判定結果。
本發明是採用T叫Man探針技術，對麩質致敏原基因進行鑑定。實時螢光檢測系統 能夠實時監測反應進程，無需電泳，閉管操作，防止汙染，並能夠對結果進行快速判定，顯著 提高了檢測效率及靈敏度，降低檢測成本。本發明所述的上述檢測引物和探針、試劑盒及檢 測方法適用於食品(醬油、酒精等精加工食品除外)及其原料中致敏原麩質(大麥、小麥、 燕麥、黑麥)成分的檢測。本方法在測定植物源性食品時參考的測定低限量(LOD)為50mg/ kg，在測定植物原料產品時參考的測定低限量(LOD)為lmg/kg。
具體實施例方式
下面為本發明的具體實施例，它對本發明技術方案的建立及其應用作進一步的說 明，但並不以任何形式限制本發明的內容。 若無特殊說明，本部分試驗所用大麥、燕麥、小麥、黑麥、白芝麻、高粱、綠豆、玉米、 花生、飯豆等25份樣品由大連農業科學院和瀋陽農業大學等單位提供；DNA提取試劑盒 (貨號D9093)購於寶生物工程(大連)有限公司；ABI7500實時螢光PCR儀(ABI公司，美 國)，高速離心機centrifuge 5804(E卯endorf公司，德國)。
實施例1 —、食品致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測引物和探針的設計 根據同源性基因篩查比較結果，選擇具有很高特異性的大麥管家基因
Hordein(SEQ ID NO. 13)、小麥管家基因Gliadin (SEQ ID NO. 14)、黑麥管家基因Seel (SEQ
ID NO. 15)及燕麥管家基因Avenin(SEQ ID NO. 16)為檢測擴增的目標基因。據NCBI上已
公布的上述基因的核酸序列，並通過對檢測引物和探針的退火溫度的一致性以及GC含量
的相似性等因素的綜合考慮，設計了如下特異性引物和探針 ①大麥(Barley)Hordein基因的檢測引物和探針序列為 正向引物(SEQ ID NO. 1) :5' -AAC AGC TAA ACC CAT GCA AGG TA—3' 反向引物(SEQ ID NO. 2) :5' —GTT CGG GGA TTT GGG GTA GTT G_3'探針(SEQ ID NO. 3) :5' -FAM-TCC TCC AGC AGC AGT GCA GCC CT-Eclipse-3' ②小麥(Wheat)Gliadin基因的檢測引物和探針序列為 正向引物(SEQ ID NO. 4) :5' -CCC AAA GTA CGA CGC AAC GAC-3' 反向引物(SEQ ID NO. 5) :5' -GGA TTC GGT TAT GCC TTC GTG-3'探針(SEQ ID NO. 6) :5' -FAM-CAT GCC GAC ACA CAT CM GGT TGAC-Eclipse-3' ③黑麥(Rye) Seel基因的檢測引物和探針序列為 正向引物(SEQ ID NO. 7) :5' -AAA AGA ACA ATC ATA TCC GCA GCA-3' 反向引物(SEQ ID NO. 8) :5' -GAA TTG GCT GTT GGG GCT GG-3'
6
探針(SEQ ID NO. 9) :5' -FAM-TCA CAC CM CCA TTT CCC ACA CCGC-Eclipse-3' 燕麥(Oat)Avenin基因的檢測引物和探針序列為 正向引物(SEQ ID NO. 10) :5' -CGG CGA TGT GCG ATG TAT ACG-3' 反向引物(SEQ ID NO. 11) :5' -AGC CCT TGT AGT GTT CTT AGA AGC-3'探針(SEQ ID NO. 12) :5' -FAM-CCC ACC GCA GTG CCC TGTCGC-Eclipse-3' 二、食品致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測試劑盒的構建 在獲得的上述特異性引物對及探針基礎上，設計用於食品中四種致敏原麩質成分 實時螢光PCR檢測試劑盒，該試劑盒檢測溶液中含有lOmM Tris*Cl、50mM KCl、25mM MgCl2、 dNTP各2. 5mM、 T叫DNA聚合酶5U/ y L以及四種致敏原麩質成分檢測引物對和探針，分別
為 大麥Hordein基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 1， SEQ ID NO. 2)和探針(SEQ ID NO. 3)各10 ii M ; 小麥Gliadin基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 4， SEQ ID NO. 5)和探針(SEQID NO. 6)各10 ii M ; 黑麥Seel基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 7， SEQ ID NO. 8)和探針(SEQID NO. 9)
各lOilM ; 燕麥Avenin基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 10， SEQ ID NO. 11)和探針(SEQ ID NO. 12)各lOiiM。 三、食品致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測方法的建立
1、DNA樣品製備 本實施例基因組DNA的抽提採用寶生物工程(大連)有限公司生產的DNA提取試 劑盒(貨號D9093)並按其操作說明進行抽提樣品DNA。 DNA濃度和純度的測定取5 ii L製得的DNA溶液加ddH20梯度稀釋至lmL，使用核 酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值。DNA的濃度按照如下公 式計算獲得 C = AXNX50/1000，式中
C為DNA濃度(y g/ y L);
A為260nm處的吸光值；
N為核酸稀釋倍數；
10D260nm = 50 ii g/mL雙鏈DNA ; 當OD26。/OD28。比值在1. 7 1. 9之間時，適宜於PCR擴增。
2、實時螢光PCR檢測 使用本實施例所建立的試劑盒，採用實時螢光PCR檢測方法檢測食品中四種致敏 原麩質成分，包括如下步驟 ①反應體系取liU步驟1製得的模板DNA溶液，加入10 試劑盒中的檢測溶 液和14 ii 1滅菌超純水，總體積25ul ; ②將以上各組分加入至0. 2mL實時螢光PCR反應管中，混勻，5000r/min，離心 10s ; ③將離心後的實時螢光PCR反應管放入實時螢光PCR檢測系統內，記錄樣本擺放順序；④實時螢光PCR反應程序為95。C/10s，l個循環；95°C/5s，52°C/10s，72°C/34s，
40個循環，在每次循環的退火時收集螢光； ⑤檢測結束後，根據擴增曲線和Ct值判定結果，其中Ct值(cycle threshold)是 指每個反應管內的螢光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數； ⑥每個樣品設置兩個平行的反應體系；檢測過程中應分別設立陽性對照、陰性對
照和空白對照用已知含麩質成分的樣品作陽性對照，用已知不含麩質成分的樣品作陰性
對照，用等體積的ddH20代替模板DNA作空白對照。 3、結果判斷 (1)對照結果 空白對照無螢光增幅現象； 陰性對照無螢光增幅現象； 陽性對照有螢光增幅現象； 否則，實驗視為無效； (2)檢測結果的判定 ①同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品無螢光增幅現象，判 斷樣品中未檢出致敏原麩質成分； ②同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品有明顯的螢光增幅曲 線，且Ct值《35，判斷樣品中檢出致敏原麩質成分； ③同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，若檢測樣品螢光增幅曲線的Ct 值在35 40之間，則應重新進行實時螢光PCR反應，再次擴增後的結果Ct值仍在35 40 之間，可判斷樣品中檢出致敏原麩質成分，否則可判斷樣品中未檢出致敏原麩質成分；
④在四組引物與探針中，任何一組的檢測結果為陽性，以及上述實時螢光PCR檢 測步驟⑥的兩個平行樣中有一個樣品檢測結果為陽性，即可判斷該樣品中檢出致敏原麩質 成分。 檢測過程中按照GB/T 27403操作防止交叉汙染。
實施例2、特異性試驗 採用實施例1的含有特異性引物和探針的檢測試劑盒及檢測方法檢測大麥、小 麥、燕麥和黑麥等麩質致敏原成分的樣品。同時檢測白芝麻、糙米、綠豆、玉米、黑大豆、雪 豆、泰國香米、花豆、黑小豆、黃豆、豌豆、飯豆、黑大米、胡蘿蔔、大白菜、韭菜、油菜、花生米、 高粱、薏米等非麩質致敏原成分DNA樣品，以對方法的特異性進行評估，檢測結果如下。
陰性對照結果顯示，FAM通道無螢光信號檢出，說明反應結果正常，反應體系無汙 染。陽性對照結果顯示，FAM通道有螢光信號檢出，反應結果正常。 對大麥中麩質致敏原基因進行檢測結果顯示，在Ct值為15. 5左右時，出現螢光曲 線增幅現象，檢測結果為陽性。 對小麥中麩質致敏原基因進行檢測結果顯示，在Ct值為16左右時，出現螢光曲線 增幅現象，檢測結果為陽性。 對黑麥中麩質致敏原基因進行檢測結果顯示，在Ct值為16. 5左右時，出現螢光曲 線增幅現象，檢測結果為陽性。
對燕麥中麩質致敏原基因進行檢測結果顯示，在Ct值為16左右時，出現螢光曲線 增幅現象，檢測結果為陽性。 其他非麩質致敏原基因檢測結果顯示，FAM通道均無螢光信號檢出，檢測結果均為 陰性。 由上述實驗結果可見，本發明具有很好的特異性。
實施例3、靈敏度試驗 —、植物源性食品中麩質過敏原檢測靈敏度 以米粉(麩質濃度為50mg/kg)為麩質過敏原參考物質，應用實施例1的方法檢測
方法靈敏度。檢測結果顯示，陰性對照檢測結果顯示，FAM通道無螢光信號檢出，說明反應
結果正常，反應體系無汙染；陽性對照檢測結果顯示，FAM通道有螢光信號檢出，反應結果
正常；樣品檢測結果顯示，濃度為50mg/kg的麩質過敏原參考物質均能很好檢出。 結果表明該標準方法對植物源性食品中麩質致敏原成分的檢測靈敏度較高，達到
50mg/kg。 二 、植物原料產品中麩質過敏原檢測靈敏度 應用實施例1的特異性引物和探針，及相關的試劑盒和檢測方法，採用過敏原陽 性物質添加的方法，進行植物原料產品中麩質過敏原測定低限的研究。 以不同質量的麩質樣品，研磨樣品處理後，分別添加到不含麩質致敏原成分的植 物為原料的米粉基質中，製備成20mg/kg、 10mg/kg、5mg/kg、2mg/kg、 lmg/kg共5個梯度添加 樣品，從高到低逐份添加原料。應用本發明方法分別進行檢測，以確定本發明方法的檢測靈 敏度。製備好的樣品分別進行檢測，結果顯示陰性對照檢測結果顯示，FAM通道無螢光信 號檢出，說明反應結果正常，反應體系無汙染；陽性對照檢測結果顯示，FAM通道有螢光信 號檢出，反應結果正常；植物原料產品中麩質致敏原成分敏感度檢測結果顯示，濃度分別為 20mg/kg、 10mg/kg、5mg/kg、2mg/kg、 lmg/kg的麩質過敏原添加產物均能很好檢出。結果表明 該標準方法對植物原料產品中麩質致敏原成分的檢測靈敏度較高，可以達到lmg/kg。
實施例4、應用於實際樣品檢測 採用實施例1的含有特異性引物和探針的檢測試劑盒及檢測方法，對實際樣品進 行檢測。實際檢測樣品包括麵粉、麥片、麵條及小食品等共432份。檢測結果如下表所示
表l
檢測結果樣品名稱樣品' 總數不含麩質致 敏原成分的 樣品數含有麩質致 敏原成分的 樣品數含有麩質致敏原 成分，但與標識 不符的樣品數
麵粉790790
麥片、麵條15701570
小食品1961514511 結果顯示，所檢測實際樣品共432份，其中 檢測麵粉樣品79份，檢測麩質致敏原陽性率為100% ;
檢測麥片、麵條等含麩質製品樣品157份，檢測出含有麩質致敏原成分157份，檢 測麩質致敏原成分陽性率為100% ; 檢測小食品196份，檢測出含有麩質致敏原成分45份，其中有11份樣品含有麩質 致敏原成分，但樣品標識顯示為"不含麩質致敏原"，檢測結果與樣品標識不符；其餘151份 樣品不含有麩質致敏原成分，與樣品標識相符。 對上述檢測結果，採用麩質的酶聯免疫定量快速檢測方法檢測進行驗證，結果相 符。 由大量的實際應用結果可見，應用本發明方法檢測麩質致敏原成分成分，具有較
好的應用結果。 SEQUENCE LISTING
〈110〉曹際娟，鄭秋月，徐君怡
〈120〉食品中四種致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測引物和探針、試劑盒及檢測
方法
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〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>23
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈400>1
朋c3gcte朋cccatgc朋g gte 23
〈210>2
〈211>22
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈400>2
gttcggggat ttggggtagt tg 22
〈210>3
〈211>23
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈400>3
tcctccagca gcagtgcagc cct 23
〈210>4
〈211>21
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈400>4
ccca肌gtec gacgcaacgac〈210>5〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>5ggattcggtt atgccttcgtg<210〉6〈211〉256C3tgccgac3 cacatcaaggttgac〈210〉7〈211〉24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉7aaaag肌c朋tcatatccgc〈210>8〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉8gaattggctg ttggggctgg〈210〉9〈211〉25〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>9tcacaccaac catttcccacaccgc〈210〉10DNA〈213〉人工序列〈400〉10cggcgatgtg cgatgtatacg11〈211>21
21
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219/10頁 cggcgatgtg cgatgtetec gtcccaccgc agtgccctgt cgccaccgcc cctctcggtg 60
gcttcteaga acactecaag ggct 8權利要求
食品中四種致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測引物和探針，其特徵在於是①大麥(Barley)Hordein基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQ ID NO.1)5′-AACAGCTAAACCCATGCAAGGTA-3′，反向引物(SEQ ID NO.2)5′-GTTCGGGGATTTGGGGTAGTTG-3′，探針(SEQ ID NO.3)5′-FAM-TCCTCCAGCAGCAGTGCAGCCCT-Eclipse-3′；②小麥(Wheat)Gliadin基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQ ID NO.4)5′-CCCAAAGTACGACGCAACGAC-3′，反向引物(SEQ ID NO.5)5′-GGATTCGGTTATGCCTTCGTG-3′，探針(SEQ ID NO.6)5′-FAM-CATGCCGACACACATCAAGGTTGAC-Eclipse-3′；③黑麥(Rye)Sec1基因的檢測引物和探針序列正向引物(SEQ ID NO.7)5′-AAAAGAACAATCATATCCGCAGCA-3′，反向引物(SEQ ID NO.8)5′-GAATTGGCTGTTGGGGCTGG-3′，探針(SEQ ID NO.9)5′-FAM-TCACACCAACCATTTCCCACACCGC-Eclipse-3′；④燕麥(Oat)Avenin基因的檢測引物和探針序列為正向引物(SEQ ID NO.10)5′-CGGCGATGTGCGATGTATACG-3′，反向引物(SEQ ID NO.11)5′-AGCCCTTGTAGTGTTCTTAGAAGC-3′，探針(SEQ ID NO.12)5′-FAM-CCCACCGCAGTGCCCTGTCGC-Eclipse-3′
2. 食品中四種致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測試劑盒，包括檢測溶液，其特徵在於該檢測溶液中含有10mM Tris Cl、50mM KCl、25mM MgCl2、 dNTP各2. 5mM、 Taq DNA聚合酶5U/y L以及四種致敏原麩質成分檢測引物對和探針，分別是大麥Hordein基因的檢測引物對(SEQ ID NO. l，SEQ ID NO. 2)和探針(SEQ ID NO. 3)各lOiiM ;小麥Gliadin基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 4， SEQ ID NO. 5)和探針(SEQID NO. 6)各lOiiM ;黑麥Seel基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 7， SEQ ID NO. 8)和探針(SEQID NO. 9)各lOiiM ;燕麥Avenin基因的檢測引物對(SEQ ID NO. 10， SEQ ID NO. 11)和探針(SEQ ID NO. 12)各lOiiM。
3. 食品中四種致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於使用權利要求2所述的試劑盒，包括如下步驟① 提取待測樣品DNA，得到模板DNA溶液；② 反應體系取lPl步驟①製得的模板DNA溶液，加入10iU試劑盒中的檢測溶液和14iU滅菌超純水，總體積25ul ;將以上各組分加入至O. 2mL實時螢光PCR反應管中，混勻，5000r/min，離心10s ;③ 步驟②的反應體系按下述條件進行實時螢光PCR檢測95°C /10s， 1個循環；95。C /5s，52。C /10s，72。C /34s，40個循環;每次循環的退火時收集螢光，檢測結束後，根據擴增曲線和Ct值判定結果。
全文摘要
本發明涉及食品中四種致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測引物和探針、試劑盒及檢測方法。該引物和探針分別是序列為SEQ ID NO.1～3的大麥Hordein基因的檢測引物和探針、序列為SEQ ID NO.4～6的小麥Gliadin基因的檢測引物和探針、序列為SEQ ID NO.7～9的黑麥Sec1基因的檢測引物和探針和序列為SEQ ID NO.10～12的燕麥Avenin基因的檢測引物和探針。基於此，本發明公開了包含上述引物和探針序列的食品致敏原麩質成分實時螢光PCR檢測試劑盒及相應的檢測方法。本發明的探針和引物特異性強，檢測試劑盒及方法簡便易用，結果準確，具有很高的特異性和靈敏度。
文檔編號G01N21/64GK101724707SQ201010100428
公開日2010年6月9日 申請日期2010年1月21日 優先權日2010年1月21日
發明者徐君怡, 曹際娟, 鄭秋月 申請人:曹際娟;鄭秋月;徐君怡