小鼠原位左肺移植模型及其構建方法
2023-09-17 14:54:20
專利名稱：小鼠原位左肺移植模型及其構建方法
技術領域：
本發明屬於醫學動物模型技術領域，具體涉及一種小鼠原位左肺移植模型及其構建方法。
背景技術：
在動物實驗中，小鼠比大鼠有諸多優點，不僅試劑資源豐富、可選品系眾多、實驗消耗低，而且基因操控性更好，可以方便獲得多種轉基因和基因敲除品系。相對於其他小鼠肺病模型，例如呼吸機肺損傷、脂多糖吸入損傷，本模型所複製的急性肺損傷、慢性免疫損傷、肺纖維化過程具有起始點明確、背景噪聲更易控制等優點。這些優點可滿足一些實驗設計的特殊要求，使其在肺移植領域以及病理生理學和免疫學等的一些基礎研究領域具有更好的應用前景[1-2]。1971年Asimacopoulos等報導了大鼠原位肺移植模型，Mizuta等1989年報導了套管法改良技術，將建模時間由4小時縮短到2小時之內[3-4]。此後，套管法大鼠原位肺移植模型很快取代犬、豬肺移植模型，成為最常用的單肺移植模型。隨著基因敲除技術等新技術的成熟，小鼠原位肺移植模型有了現實而迫切的需求。大鼠和小鼠解剖結構相似，但由於體重相差懸殊(250g 300g vs. 25g 30g)，小鼠原位肺移植對顯微外科技術的要求更高。美國Washington University的研究者於2007年首次報導了小鼠原位肺移植技術，並於2009年報導了改良方案[5-6]。2009年，瑞士 University Hospital ^irich的研究者報導了類似的模型製作方法[7]。截至2011年4月，僅此兩家實驗室報導過這項技術。小鼠原位肺移植模型的技術流程與大鼠模型一致，技術關鍵點在於如何處理比大鼠更為細微的肺門結構。儘管美國和瑞士的研究者都提出了各自的解決方案，但都沒有達到「簡便、可重複性好」的建模要求。
發明內容
本發明的目的在於提供一種操作簡單、可重複性好、效果優異的小鼠原位左肺移植模型及其構建方法。本發明提供的小鼠原位左肺移植模型有下述方法構建獲得。構建方法的具體步驟如下
1、製備套管(CUff)
要求左肺支氣管、肺靜脈、肺動脈所用套管分別由18/20G、20G、24G血管導管 (angiocatheter)製備；支氣管、肺靜脈套管體長1. 0mm，肺動脈套管體長0. 5mm ；套管延伸柄長1. Omm,寬度佔1/4 1/3管壁周徑。操作血管導管用砂紙打磨後，24G導管切成1. 5mm小段，其餘型號切成2. Omm小段；將顯微血管鑷的一個尖頭插入小段管腔，以其內側面為切割平面，用刀片橫向和縱向切割，做出套管的延伸柄。2、建立供肺灌洗系統(perfusion system)要求穩定提供與正常肺動脈壓相當的灌洗壓力。操作依次連接50ml針筒、輸液器、22G血管套管，針筒固定於15--25cm高度(例如為20cm)，注入肺保存溶液(例如為30ml)的冰水混合物，並使其充滿管路。3、小鼠麻醉、氣管內插管與機械通氣
要求適度麻醉，經口氣管插管，建立機械通氣；插管位置恰當，不損傷供肺及所屬血管、支氣管。操作腹腔注射麻醉。用「兩端固定、中間拉開」法快速經口氣管插管，小鼠上顎用橡皮筋固定於泡沫塑料板，胸骨上部用左手環指抵住，左手拇指和食指牽拉舌頭，暴露聲門；右手持20G血管導管接近聲門，在其開啟瞬間輕輕插入；連接呼吸機輸出管路，根據小鼠體重大小提供0. 5 1. 0 ml潮氣量，呼吸頻率120 140/min。4、供者手術，獲取供肺
要求完全灌洗清除供肺血管床內血液，在雙肺半充氣狀態下完整取出心肺塊；不損傷供肺及所屬血管、支氣管。操作建立機械通氣後，胸腹正中切口開胸；將100U/0. Iml肝素鈉稀釋液在供者心尖處注入右心室；左手持顯微蚊式鉗夾住心臟下1/3左右處、但不上齒，小指勾住供肺灌洗系統的輸液器下端、使22G導管尖端恰好抵在右心上；打開輸液器控制裝置，將噴湧肺保存液的22G導管插入右心室；用眼科剪迅速剪開膨脹的左右心耳、腹腔動靜脈，使灌洗液和血液快速流出；兩肺數秒鐘之後變白，在半充氣狀態下用顯微蚊式鉗夾閉氣管，自上而下銳性解剖，將心肺塊完整取出，生理鹽水衝洗後置於鋪有紗布的培養皿中，肺保存液製成的冰塊恰使紗布浸透。保持灌洗流速和適當的雙肺通氣幅度、灌洗液流出暢通是保證供肺灌洗質量的三個要素。一旦灌洗初期未能將供肺血管床內的血液衝洗乾淨，則延長灌洗無益於改善灌洗質量。5、放置套管，準備移植肺
要求切下左肺，保留儘可能長的血管和支氣管，並為其分別放置套管；不損傷供肺及所屬血管、支氣管。操作在手術顯微鏡下，左肺靜脈、動脈、支氣管全長游離、在儘可能靠近總幹處切斷；顯微鑷兩尖併攏穿過肺靜脈套管，牽拉肺靜脈殘端，在另一把顯微鑷的協助下將套管套上並推向左肺靜脈遠端，延伸柄指向後肺門；左手顯微鑷夾住肺靜脈，儘可能靠近其遠端， 右手用微血管夾把套管柄及肺靜脈一併夾住，蚊式鉗夾住微血管夾尾部並擱在培養皿邊沿上，以穩定微血管夾；將肺靜脈殘端像捲袖口那樣翻轉，套在套管的外面，然後用10-0單纖尼龍線固定；用同樣方法給肺動脈放置套管，然後心肺塊用紗布覆蓋後4°c冰箱保存；冷藏期間供肺保持半充氣狀態、整個氣道保持完全封閉狀態，以維持供氧、並防止保存液流入供肺；在吻合操作前，同樣方法放置支氣管套管。6、受者手術，胸腔內左肺原位移植
要求快速、準確吻合左肺血管及支氣管，不損傷供肺及所屬血管、支氣管。操作受者以同樣方法麻醉並建立機械通氣，左胸後外側切口，第3肋間進胸，將受者左肺從切口後部牽出胸腔，在肺血管進入肺實質處用顯微蚊式鉗夾住，以作牽拉之用； 從肺門前入路，全程游離左肺門血管及支氣管，用3-0絲線打活結暫時阻斷血管、微血管夾阻斷支氣管，儘可能靠近根部；移植肺放入下胸腔，使供肺套管結構在無張力狀態下貼近受者肺門；用10-0線環繞肺靜脈並預留一個線結，先切開肺靜脈遠端前壁1/3周徑、做橫切口，然後縱向切開切口遠端的肺靜脈前壁，做成「T」形切口 ；切口內注入肝素稀釋液，用顯微鑷將「T」形切口的橫切緣牽開、使之呈袋狀，用顯微鑷持住供者肺靜脈套管的延伸柄，沿著「T」形切口的縱切口輕輕滑入，將套管結構送入一個合適的位置；在收緊線結之前，血管壁自身彈性可使肺靜脈套管保持原位；肺靜脈吻合成功後，依次吻合支氣管和肺動脈；全部吻合成功後，剪掉套管延伸柄，依次開放肺靜脈、肺動脈和支氣管，然後切斷肺血管支氣管吻合時未剪斷的後壁，將移植肺納入胸腔；清理胸腔內積液及組織碎屑，在深吸氣屏氣狀態下關閉胸腔。注意三個套管結構的相對位置應保持同一水平，以免相互交錯而出現套管擠壓血管的現象；操作準確、快速，避免誤傷，儘可能減少吻合時間(即熱缺血時間)。受者甦醒後拔管，允許進食進水。觀察期結束後重新麻醉，獲取組織標本。與現有方法的比較
小鼠和大鼠的解剖學差異僅在於大小有別，因此二者的手術流程完全一致，小鼠原位左肺移植模型的關鍵在於如何應對更為嚴苛的顯微外科操作要求。除去基本類似的流程， 小鼠原位移植模型主要有4項關鍵技術。我們提出的方法顯著優於現有方法。(一)經口氣管內插管
這項操作雖小，卻是整個模型建立過程中第一個關鍵步驟。我們原先在做通氣機肺損傷模型時採用的是蚊式鉗壓舌法暴露聲門，操作繁瑣，誤傷和失敗率較高。插管失誤可能導致整個移植手術連貫性的中斷，影響移植肺缺血時間的控制。我們改進了經口插管方法，通過「固定兩端」(上顎與上段胸骨)、「牽拉中點」(舌頭)的方法暴露聲門，符合解剖學原理， 所以暴露效果很好。同時，由於要領明確，該操作易於掌握、可重複性高、費時少，單人操作一般能在5 IOs內完成。根據美國Washington University的報導，他們在供者手術中採用經氣管造口插管，受者則在手術顯微鏡下經口插管[5-6]。瑞士 University Hospital ^lrich的報導未寫明方法[7]。經氣管造口插管一般需要5min方可完成，如果不是他們所用的經口插管法更費事的話，則不會推薦使用氣管造口法。(二)供肺灌洗方法
供肺灌洗質量嚴重影響再灌注損傷程度。供肺灌洗的壓力控制，傳統上一直沿用流體靜壓，例如大鼠採用的是20ml灌洗液以20cm H20的壓力灌洗[8]。瑞士 University Hospital ^lrich採用「2ml灌洗液、IOcm H20壓力」，應該也是承接這種理念[7]。但是，灌洗時起作用的是流體動壓，而非流體靜壓。小鼠心輸出量大致在22 32ml/min [9]，故我們選擇 BD 公司標準流速為 ^ml/min 的 22G 導管(BD Angio, Becton Dickinson Medical Devices Co Ltd., China)作為灌注管。我們用心輸出量來取代流體靜壓作為關係壓力控制的標尺，理論基礎更合理。在操作上，我們的方法也更加簡便、效果更好。我們的方法是，在直視下將22G導管插入小鼠右心室，操作簡單，且因流速恆定而灌洗效果穩定。瑞士 University Hospital ^lrich所採用的方法是，在肺動脈根部做橫切口，然後經該切口灌洗[7]。除操作複雜外， 該方法存在效果不穩定的可能。水柱高度確定只能保證靜水壓恆定，灌洗壓力還受到管路長度、走向和灌洗導管口徑等因素的影響。灌洗壓力過大、易損傷肺血管床，過小則影響灌洗效果。美國Washington University所採用的方法是，用3ml注射器經27G針頭直接將 3ml肺保存液推注到心臟中[5-6]。這種方法很簡單，但即使同一人操作，也無法保持推注壓力的大小與恆定，這可能是文獻所示照片中肺灌洗質量差強人意的原因。至於全身肝素化，我們的方法是在心尖部直接注射到右心室中，隨後用顯微蚊式鉗夾住心臟下1/3，肝素化效果快速、直接，注射處也不會有很多出血。而文獻中所提的下腔靜脈內注射、肝葉內注射、甚至陰莖血管內注射，操作都要複雜得多，全身肝素化效果也不及心內注射好[5-7，10]。(三)套管放置
美國Washington University所採用的方法是，用血管夾先將套管延伸柄夾住，然後固定在自製的架子上；調整支架，使套管懸在血管上方3mm處，然後把血管塞進套管中，從上端拉出[5-6]。瑞士 University Hospital ^lrich未詳細說明其操作方法。我們曾試用上述方法，發現兩個問題。首先，套管懸空高度很難調整。如果太低，影響下一步操作；如果太高，則在卷折血管袖時張力很大，不易成功。其次，如果先用血管夾夾住套管柄，則套管管腔常被遮擋，影響顯微鑷操作。因此，我們改變方案，套管先放置、後固定，其優點在於①操作簡單，操作時只要儘可能將套管推向外周端即可，不必精確調整相對距離；②成功率高，由於血管和套管柄被夾在一起，所以袖套卷折時血管的張力幾乎沒有，基本能一次成功。(四)吻合術的手術入路與吻合口製作
文獻採用的手術入路是，將受者左肺拉向切口前方，供肺放在受者自體肺上，從肺門後方進行吻合操作[5-6]。由於自體肺通常拉到胸腔外，置於其上的供肺通常距縱膈更遠，吻合張力較大，所以文獻建議供者套管結構插入受者血管/支氣管之後，先用血管夾夾住受者血管/支氣管和套管柄，再用結紮線固定。但在有張力情況下，將供者套管結構插入受者結構本身就有難度，而且在上血管夾之前供者套管結構常常因彈性回縮力而自行跳出。有鑑於此，我們改後入路為前入路，把移植肺放入下胸腔，這樣使供受者肺門結構緊密接觸， 吻合時幾乎沒有張力。吻合術的另一個關鍵是吻合口製作，切口太小不易插入供者套管結構，而太大則不宜維持吻合口的張開狀態。美國Washington University所採用的方法是，先在受者血管或支氣管上剪開一個小口，然後用顯微鑷輕柔擴張W]。這是一個模糊的描述，可操作性差，小切口往往在不希望的地方擴大，結果往往靠運氣。有鑑於此，我們將橫切口長度限定在1/3周徑，以保證吻合口的張開度；然後將橫切口遠端縱行剪開，形成一個「T」形切口，確保入口直徑足夠大。由於事先選定了切口延伸的方向，插入套管結構時一般不會造成意外方向的撕裂。「T」形切口使吻合口的口徑和張開度都能最大化，效果優於單純的橫切口。通過降低吻合張力和改良吻合口形態，吻合操作更容易。而且，如果操作順利，則每例實驗所需時間差異不大，人為因素造成的個體差異可降至最低。綜上所述，我們創立的方法具有操作方法簡單、確切、合理等優點，比現有方法更容易掌握、操作，受個人因素的影響也很低，更加接近動物模型「操作簡單、可重複性好」的理想狀態。本發明作為一種研究工具，可複製急性肺損傷、慢性免疫損傷、肺纖維化等疾病過程，主要用於肺移植領域，也可用於免疫學、病理生理學等學科中涉及肺泡與肺血管的一些領域。
具體實施例方式(一)設備儀器
1、手術顯微鏡1臺，放大倍數5 45X
2、嚙齒類動物呼吸機1臺
3、普通手術器械手術無影燈，眼科剪1把，彎頭眼科鑷2把。4、顯微外科手術器械顯微蚊式鉗(直)2把，顯微蚊式鉗(彎)1把；尖頭直徑
0.05mm 的顯微剪(Vannas spring scissors)l 把；頭寬 0. Imm 的顯微攝(micro forceps) 2把；頭寬0. 3mm的顯微結紮鑷(suture tying forceps) 2把
5、耗材
微血管夾(顎長5mm、夾寬0. 75mm)，動脈血管夾(顎長15mm)；
10-0單纖尼龍線，3-0編織絲線；
Iml注射器，20ml注射器，50ml注射器，輸液器，輸液架；
18G,20G,22G,24G 血管導管(Angiocatheter)；
培養皿，紗布，橡皮筋，泡沫塑料板，刀片；
肺保存液，生理鹽水，肝素鈉。(二)實驗動物
根據實驗設計，選擇小鼠品系。一般情況下，小鼠在清潔級環境中飼養。除非特別要求， 術前正常供給食水。小鼠體重一般應> 25g，供、受者體重大致相當。小鼠的飼養、使用遵守《實驗動物管理條例》，保護實驗動物權益。實驗中，供受者採用8周齡雄性ICR小鼠(體重約30 32g)，購自上海史萊克公司，飼養於清潔級環境中。製備支氣管、肺靜脈、肺動脈套管的材料分別選用BD公司的18G、 20G和 24G血管導管(BD Angio, Becton Dickinson Medical Devices Co Ltd. , China)。皆用腹腔注射戊巴比妥鈉(0. 2 mg/kg)麻醉，經口氣管內插管(20G)，連接小鼠呼吸機(Model 683 Harvard Rodent Ventilator, Harvard Apparatus, South Natick, MA), Bf ^ ^ 潮氣量1.0 ml、呼吸頻率120/min。肺保存液採用低價右旋糖酐液(Perfadex solution, Vitrolife, Sweden)。(三)操作方法 1、製備套管
要點支氣管、肺靜脈、肺動脈所用套管分別由18/20G、20G、24G血管導管制備。支氣管、肺靜脈套管體長1. 0mm，肺動脈套管體長0. 5mm。套管延伸柄長1. 0mm，約佔1/3周徑。 套管表面打磨粗糙(必要時可加淺切痕)、以增加摩擦力，套管邊緣切割整齊、以防尖端刺破
血管壁。血管套管用砂紙打磨後，24G導管切成1. 5mm小段、其餘型號導管切成2. Omm小段。將顯微血管鑷的一個尖頭插入導管小段的管腔中，內表面朝上、尖端露出。在距離遠端
1.Omm處橫切，直到刀片碰到顯微血管鑷分枝的內表面。刀片抵在顯微血管鑷分枝的尖端， 緊貼其內表面，縱向切割，直至橫切口處。2、建立供肺灌注系統
要點提供穩定的、壓力與正常肺動脈壓相當的肺循環灌流。
拔去50ml針筒的內芯，置於高度約20-30cm的輸液架上。剪去輸液器的金屬針頭， 與50ml針筒對接，另一頭接駁22G血管套管。在50ml針筒內注入30ml肺保存溶液，並添加由肺保存溶液製備的冰塊1塊。打開輸液器閥門排氣，使管路內充滿溶液。3、小鼠麻醉與機械通氣
要點適度麻醉，不損傷口腔組織條件下快速經口氣管內插管，維持穩定人工機械通氣。小鼠腹腔內注射戊巴比妥鈉(0. 2 mg/kg)麻醉。泡沫塑料板(2X IOX 15cm) —端箍上橡皮筋，將小鼠置於其上，橡皮筋拉起後勒住小鼠上顎。豎起泡沫塑料板，將無影燈燈光從前上方投射至其頸部。術者左手環指抵住小鼠胸骨上段，與橡皮筋固定的上顎形成兩個固定點，然後用左手拇指和食指捏住小鼠舌頭輕拉，暴露咽喉部。此時可見聲門隨呼吸做 「關閉-張開」運動，右手持20G血管導管(無針芯)，緩慢接近聲門，在其開啟瞬間輕輕插入。 連接呼吸機輸出管路，根據小鼠體重大小提供0. 5 1. 0 ml潮氣量，呼吸頻率120 140/
mirio4、供者手術(獲取供肺)
要點供肺徹底灌洗、血管床無血液殘留，供肺及所屬血管、支氣管無損傷。建立機械通氣後，供者小鼠取仰臥位，從劍突下開始做胸腹正中聯合切口，用2把顯微蚊式鉗(直)分別鉗夾胸骨兩邊，起到止血和協助暴露的作用。用動脈血管夾拉起胸腺， 暴露右心室流出道及主動脈起始部。用Iml針筒將100U/0. Iml肝素鈉稀釋液在心尖處注入右心室。左手用1把顯微蚊式鉗(彎)夾住心臟下1/3處、但不上齒，左手小指勾住供肺灌注系統的輸液器下端，並使22G血管導管的尖端恰好抵在右心上。打開輸液器控制裝置，迅速將噴湧肺保存液的22G血管導管插入右心室。此時可見左右心耳立即膨脹。輕輕抬起左手，使左右心耳暴露更好，然後用眼科剪迅速剪開左右心耳、剪斷腹腔動靜脈。灌洗液和殘留血液快速流出，兩肺數秒鐘之後變白。在充氣狀態下用顯微蚊式鉗(彎)夾閉氣管，自上而下剪開，將心肺塊整塊取出，生理鹽水衝洗後放置在鋪有紗布的培養皿內。紗布浸透肺保存液，並放置肺保存液製成的冰塊以保持低溫。保持灌洗流速和適當的雙肺通氣幅度、灌洗液流出暢通是保證供肺灌洗質量的三個要素。一旦灌洗初期未能將供肺血管床內的血液衝洗乾淨，則延長灌洗無益於改善灌洗質量。5、放置套管(移植肺準備)
要點套管位置恰當，不損傷供肺及所屬血管、支氣管。在5 45X手術顯微鏡下，解剖左肺門，全長游離左肺靜脈、動脈、支氣管。必須清除這些結構上附著的脂肪與結締組織，否則線結容易滑脫。在左肺靜脈與左心房、左肺動脈與肺動脈幹交界處切斷，保留儘可能長的血管用於放置套管。顯微鑷先穿過肺靜脈套管， 再提住肺靜脈殘端，在另一把顯微鑷的協助下將套管套在左肺靜脈上，套管的延伸柄指向後肺門。左手所持顯微鑷夾住儘可能長的肺靜脈殘端，右手持彎頭眼科鑷、把微血管夾夾在套管的延伸柄及肺靜脈上。1把顯微蚊式鉗(彎)夾住微血管夾尾部，擱在培養皿邊沿上，通過自身重力使微血管夾相對固定。用2把顯微鑷交替，將肺靜脈殘端像捲袖口那樣翻轉，套在套管的外面，然後用10-0單纖尼龍線固定。返折後的肺靜脈殘端必須超越結紮線固定的位置，否則吻合之後漏血。用同樣方法給肺動脈放置套管，然後心肺塊用紗布覆蓋後4°C冰箱保存。冷藏期間供肺保持半充氣狀態、整個氣道保持完全封閉狀態，以維持供氧，並防止保存液流入供肺。在移植操作前，放置支氣管套管。6、受者手術(三套管法左單肺移植)
要點準確、快速操作，避免誤傷，儘可能減少吻合時間(即熱缺血時間)。建立機械通氣後，受者小鼠取右側臥位，左後外側開胸切口，經第3肋間進胸。切口上下緣肋骨各縫1根3-0絲線，用於牽開切口。將受者左肺從切口後部牽出胸腔，在肺血管進入肺實質處用纖維蚊式鉗(彎)夾住，從肺門前入路，全程游離左肺門血管及支氣管。用 3-0絲線套在肺靜脈、肺動脈基底部，打一滑結並收緊，暫時阻斷血管。用微血管夾在儘可能靠近隆突處夾住左肺支氣管。把移植肺放入下胸腔內，使供肺肺門套管結構在無張力狀態下貼近受者肺門。用10-0線環繞肺靜脈並預留一個線結，先切開肺靜脈遠端前壁1/3周徑、做橫切口，然後縱向切開切口遠端的肺靜脈前壁，做成「T」形切口。切口內注入肝素稀釋液，左手持1把顯微鑷將「T」形切口的橫切緣輕輕牽開、使之呈袋狀，右手顯微鑷持住供者肺靜脈套管的延伸柄，沿著「T」形切口的縱切口輕輕滑入，將套管結構送入一個合適的位置。在收緊線結之前，血管壁自身彈性可使肺靜脈套管保持原位。肺靜脈吻合成功後，依次吻合支氣管和肺動脈。不同的一點是，吻合支氣管時不注射肝素，而是清理其中的積液與組織碎屑。注意三個套管結構的相對位置應保持同一水平，以免相互交錯而出現套管擠壓血管的現象。全部吻合成功後，剪掉套管延伸柄，依次開放肺靜脈、肺動脈和支氣管，然後切斷肺血管支氣管吻合時未剪斷的後壁，將移植肺納入胸腔。清理胸腔內積液及組織碎屑，在深吸氣屏氣狀態下關閉胸腔。受者甦醒後拔管，允許進食進水。觀察期結束後重新麻醉，獲取組織標本。參考文獻,Gelman AE, Okazaki M, Lai J, Kornfeld CG, Kreisel FH, et al. CD4+ T lymphocytes are not necessary for the acute rejection of vascularized mouse lung transplants. J Immunol. 2008 Apr 1;180(7):4754-62. PMID: 18354199.Kreisel D, Sugimoto S, Tietjens J, Zhu J, Yamamoto S, et al. Bcl3 prevents acute inflammatory lung injury in mice by restraining emergency granulopoiesis. J Clin Invest. 2011 Jan 4;121(1):265-76. PMID: 21157041.Asimacopoulos PJ, Molokhia FA, Pegg CA, Norman JC. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 1971 Mar;3(1):583-5. PMID: 4937944.MizutaT, Kawaguchi A, Nakahara K, Kawashima Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J Thorac Cardiovasc Surg 1989; 97 (4) :578 - 81..Okazaki M, Krupnick AS, Kornfeld CG, Lai JM, Ritter JH, et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 2007 Jun；7(6):1672-9..Krupnick AS, Lin X, Li W, Okazaki M, Lai J, et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 2009;4(1):86-93. PMID: 19131960.Jungraithmayr WM, Korom S, Hillinger S, Weder W. A mouse model oforthotopic, single-lung transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. 2009 Feb; 137(2) :486-91..Sugimoto Rj Nakao A，Nagahiro I，Kohmoto J，Sugimoto S，Okazaki M， Yamane M，Inokawa H，Oto T，Tahara K，Zhan J，Sano Y，McCurry KR. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surg Today. 2009;39 (7):641-5. PMID: 19562458..Zanotti-CavazzoniSLj Guglielmi M， Parrillo JEj Walker T， Dellinger RPj Hollenberg SM. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 2009 Apr; 35 (4) :748-54.
Li W, Sugimoto S，Lai J，Patterson GAj Gelman AEj Krupnick AS, Kreisel D. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010 Jun;139(6):1637-43. PMID: 20219214 。
權利要求
1. 一種小鼠原位左肺移植模型構建方法，其特徵在於具體步驟如下(1)、製備套管左肺支氣管、肺靜脈、肺動脈所用套管分別由18/20G、20G、24G血管導管制備；支氣管、 肺靜脈套管體長1. 0mm，肺動脈套管體長0. 5mm ；套管延伸柄長1. Omm,寬度佔1/4 1/3管壁周徑；具體操作是血管導管用砂紙打磨後，24G導管切成1. 5mm小段，其餘型號切成2. Omm 小段；將顯微血管鑷的一個尖頭插入小段管腔，以其內側面為切割平面，用刀片橫向和縱向切割，做出套管的延伸柄；(2)、建立供肺灌洗系統穩定提供與正常肺動脈壓相當的灌洗壓力；具體操作是依次連接50ml針筒、輸液器、22G血管套管，針筒固定於15--25cm高度， 注入肺保存溶液的冰水混合物，並使其充滿管路；(3)、小鼠麻醉、氣管內插管與機械通氣適度麻醉，用「兩端固定、中間拉開」法快速經口氣管插管，建立機械通氣；具體操作是腹腔注射麻醉；小鼠上顎用橡皮筋固定於泡沫塑料板，胸骨上部用左手環指抵住，左手拇指和食指牽拉舌頭，暴露聲門；右手持20G血管導管接近聲門，在其開啟瞬間輕輕插入；連接呼吸機輸出管路，根據小鼠體重大小提供0.5 1.0 ml潮氣量，呼吸頻率 120 140/min ；(4)、供者手術，獲取供肺採用獨特的供肺灌洗系統，藉助簡單操作完全清除供肺血管床內血液；具體操作是建立機械通氣後，胸腹正中切口開胸；將100U/0. Iml肝素鈉稀釋液在供者心尖處注入右心室；左手持顯微蚊式鉗夾住心臟下1/3處、但不上齒，小指勾住供肺灌洗系統的輸液器下端、使22G導管尖端恰好抵在右心上；打開輸液器控制裝置，將噴湧肺保存液的22G導管插入右心室；用眼科剪迅速剪開膨脹的左右心耳、腹腔動靜脈，使灌洗液和血液快速流出；兩肺數秒鐘之後變白，在半充氣狀態下用顯微蚊式鉗夾閉氣管，自上而下銳性解剖，將心肺塊完整取出，生理鹽水衝洗後置於鋪有紗布的培養皿中，肺保存液製成的冰塊恰使紗布浸透；(5)、放置套管，準備移植肺游離、切斷血管和支氣管，用「先套管、後固定」法為其分別放置套管；具體操作是在手術顯微鏡下，左肺靜脈、動脈、支氣管全長游離、在儘可能靠近總幹處切斷；顯微鑷兩尖併攏穿過肺靜脈套管，牽拉肺靜脈殘端，在另一把顯微鑷的協助下將套管套上並推向左肺靜脈遠端，延伸柄指向後肺門；左手顯微鑷夾住肺靜脈，儘可能靠近其遠端，右手用微血管夾把套管柄及肺靜脈一併夾住，蚊式鉗夾住微血管夾尾部並擱在培養皿邊沿上，以穩定微血管夾；將肺靜脈殘端像捲袖口那樣翻轉，套在套管的外面，然後用10-0 單纖尼龍線固定；用同樣方法給肺動脈放置套管，然後心肺塊用紗布覆蓋後4°C冰箱保存； 冷藏期間供肺保持半充氣狀態、整個氣道保持完全封閉狀態，以維持供氧、並防止保存液流入供肺；在吻合操作前，同樣方法放置支氣管套管；(6 )、受者手術，胸腔內左肺原位移植採用吻合張力最低的前肺門入路、吻合口的口徑和張開度俱佳的「T」形吻合口，依次吻合左肺靜脈、動脈和支氣管；具體操作是受者以同樣方法麻醉並建立機械通氣，左胸後外側切口，第3肋間進胸， 將受者左肺從切口後部牽出胸腔，在肺血管進入肺實質處用顯微蚊式鉗夾住，以作牽拉之用；從肺門前入路，全程游離左肺門血管及支氣管，用3-0絲線打活結暫時阻斷血管、微血管夾阻斷支氣管，儘可能靠近根部；移植肺放入下胸腔，使供肺套管結構在無張力狀態下貼近受者肺門；用10-0線環繞肺靜脈並預留一個線結，先切開肺靜脈遠端前壁1/3周徑、做橫切口，然後縱向切開切口遠端的肺靜脈前壁，做成「T」形切口 ；切口內注入肝素稀釋液，用顯微鑷將「T」形切口的橫切緣牽開、使之呈袋狀，用顯微鑷持住供者肺靜脈套管的延伸柄， 沿著「T」形切口的縱切口輕輕滑入，將套管結構送入一個合適的位置；在收緊線結之前，血管壁自身彈性可使肺靜脈套管保持原位；肺靜脈吻合成功後，依次吻合支氣管和肺動脈； 全部吻合成功後，剪掉套管延伸柄，依次開放肺靜脈、肺動脈和支氣管，然後切斷肺血管支氣管吻合時未剪斷的後壁，將移植肺納入胸腔；清理胸腔內積液及組織碎屑，在深吸氣屏氣狀態下關閉胸腔。
2. 一種由權利要求所述方法構建的小鼠原位左肺移植模型。
全文摘要
本發明屬於醫學動物模型技術領域，具體為一種小鼠原位左肺移植模型及其構建方法。作為一種研究工具，該模型複製急性肺損傷、慢性免疫損傷、肺纖維化等疾病過程，主要用於肺移植領域，也可用於免疫學、病理生理學等學科中的一些領域。該模型的構建步驟包括製備套管；建立供肺灌注系統；小鼠麻醉、氣管內插管與機械通氣；供者手術，獲取供肺；供肺放置套管；受者手術，胸腔內左肺原位移植。本發明在建立供肺灌洗系統，在小鼠氣管內插管、供肺灌洗、放置套管、套管法吻合肺血管支氣管等方面均進行重要改進。實踐表明，本發明比現有方法更容易掌握、操作，受個人因素的影響也更低，更接近動物模型「操作簡單、可重複性好」的理想狀態。
文檔編號A61D1/00GK102247219SQ201110104989
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月26日 優先權日2011年4月26日
發明者王興安, 白春學, 高文 申請人:同濟大學附屬上海市肺科醫院