霍亂弧菌ctxAB基因的質粒克隆菌株以及製備方法和應用的製作方法

2023-09-18 04:19:00 1

專利名稱：霍亂弧菌ctxAB基因的質粒克隆菌株以及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及霍亂弧菌全基因組DNA提取和ctxAB基因的質粒克隆菌株、其製備方法及應用。
背景技術：
霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的烈性腸道傳染病，能引起霍亂流行的霍亂弧菌主要有兩種血清型，既01群和0139群，霍亂弧菌的強致病作用主要是由其分泌的霍亂腸毒素導致嚴重腹瀉所致，因此準確、快速的檢測霍亂弧菌，特別是產毒霍亂弧菌，對於預防霍亂弧菌感染具有重要意義。隨著分子生物學研究的發展，人們對細菌的侵襲素和毒力島等毒力基因認識的不斷深入，細菌的檢測方法已經從傳統的一般表型特徵鑑定深化為遺傳特徵基因的鑑定。霍亂弧菌hlyA基因編碼具有溶血-溶細胞的蛋白，是弧菌屬高度保守的管家基因；霍亂弧菌rfb-01基因和rfb-0139基因分別是01群霍亂弧菌和0139群霍亂弧菌菌體抗原編碼基因，ctxAB基因是分泌霍亂腸毒素的毒力標誌，具有高度保守性。由於霍亂弧菌的相關毒力基因、管家基因和功能基因總是成簇的位於染色體上，一般都在幾kb到幾十kb之間，難以用一般的PCR方法擴增並克隆這些基因。基因組文庫(genomic library)是上世紀70年代末發展起來的一種分離基因組基因的新技術,它包含了基因組的全套遺傳信息(即全部基因)，人們可用相應的基因探針從文庫中釣取出任一特定的基因片段加以研究。目前宏基因組學的應用已成為研究已有基因和尋找新基因及其產物的一條新途徑，載體包括C osmid、Fosmid和BAC等,平均插入片段大於40Kb, Fosmid載體是一種替代Cosmid載體構建大片段文庫的新載體，與BAC文庫構建相比,Fosmid文庫穩定性、隨機性好、技術成熟、構建更簡單快速。Fosmid載體由於插入了大腸埃希菌致育因子F一因子，所以它在宿主菌中以單拷貝形式存在，穩定性好。並且載體上有一個可誘導的oriV高拷貝複製起始點，需要時可誘導達到高拷貝(50個左右)。另外，Fosmid文庫隨機性好，保證了每段DNA在文庫中出現的頻率均等。為了防止「生物安全事故」而引發「公共衛生事件」，國內外均一致要求在PIII或PII生物安全實驗室內對霍亂弧菌可疑樣品進行檢測，通過構建霍亂弧菌Fosmid文庫的目的就是要把霍亂弧菌染色體的全部基因克隆到易於培養的大腸桿菌中，篩選出霍亂弧菌hlyA基因、rfb-01基因、rfb-0139基因和ctxAB基因單克隆菌株，霍亂弧菌克隆基因的宿主菌為大腸桿菌，不需要培養活的霍亂弧菌菌株，所以可以在PI生物安全實驗室進行操作，有利於生物安全防護；同時也是研究霍亂弧菌的致病機理、潛伏機制、血清學變異機理、基因疫苗的製備和基因結構及功能等分子生物學特性的前提；而且有利於進行霍亂弧菌的基因功能的研究和滿足地方基層實驗室應對霍亂疫情和疫源地疫情檢測時快速檢測霍亂弧菌的需要。

發明內容
本發明的目的在於提供霍亂弧菌(Vibrio cholerae)全基因組DNA提取方法和霍亂弧菌(Vibrio cholerae) ctxAB基因的單克隆菌株，主要用於霍亂弧菌相應基因檢測的陽性對照樣品，進行質量控制，也可用來考核檢驗人員的技術水平，以保證檢驗工作質量；並且可以對不同的分析方法和不同的鑑定儀器進行檢驗和校準，使之具有準確性、統一性、可比性和規範性。本發明的一方面在於提供一種霍亂弧菌(Vibrio cholerae) ctxAB基因的質粒克隆菌株，其以大腸桿菌PCC1F0S為載體，轉化了霍亂弧菌的ctxAB基因的質粒克隆菌株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC NO. 7000。本發明的另一方面在於提供一種霍亂弧菌ctxAB基因檢測試劑盒，其包括上文所述的保藏編號為CGMCC NO. 7000的質粒克隆菌株作為陽性對照，及上下遊引物與探針SEQIDN0. 10 ；SEQ ID NO. 11 ；SEQ ID NO. 12。此外，試劑盒中還可以包括用於PCR擴增的2XPCR Taqman GEx酶預混液等試劑，本領域技術人員可依據試劑盒所應用的PCR反應類型，確定所需的緩衝液或擴增酶等試劑種類。本發明的再一方面在於提供一種非疾病診斷目的霍亂弧菌ctxAB基因的多重PCR檢測方法，其利用上文所述霍亂弧菌ctxAB基因檢測試劑盒，對樣品DNA進行多重PCR方法檢測。對於上述技術方案中，優選的情況下，所述的多重PCR方法檢測的條件為①反應體系總體積為20ii L，其中
濃度為10 100 ng/mL的樣晶DNA2
10 ^iM上下遊引物各0.8 nL
10卜lM探針0.4 uL
2xPCR Taqman GEx 酶 預混液IOpL
水餘量②以上各組分混勻，5000r/min，離心IOs後，進行多重PCR方法檢測950C /IOmin, I 個循環；95°C /15s，60°C /lmin，40 個循環。對於上述技術方案中，所述保藏編號為CGMCC NO. 6997、CGMCC NO. 6998、CGMCCNO. 6999、CGMCC NO. 7000的霍亂弧菌質粒克隆菌株的構建方法為採用低熔點瓊脂糖包埋法提取霍亂弧菌總基因組DNA、構建霍亂弧菌Fosmid文庫、提取甘油菌DNA和PCR方法篩選目的基因，具體包括如下步驟利用低熔點瓊脂糖包埋法，分別提取01和0139兩種血清型霍亂弧菌(N16961和M045)完整基因組，用隨機剪切法將基因組進行片段化處理，脈衝電泳分離片段化的DNA並切膠回收38 48Kb之間的DNA片段，然後對回收的DNA片段進行末端平滑化和磷酸化處理後，再與pCClFOS質粒載體連接，經包裝、轉染後構建霍亂弧菌Fosmid文庫。從建好的文庫中取少量甘油菌進行單克隆純培養和提取DNA，並用PCR方法篩選出霍亂弧菌的毒力基因ctxAB、管家基因hlyA和01及0139菌體抗原基因rfb，最終篩選出具有良好穩定性的霍亂弧菌hlyA基因、rfb-01基因、rfb-0139基因和ctxAB基因的單克隆菌株，宿主菌為大腸桿菌pCClFOS載體。
本發明中，所使用的引物和探針分別是申請號為201110281129.0中具有很高特異性的01群霍亂弧菌的rfb基因(SEQ ID NO. 13)的檢測引物和探針(SEQ ID NO. 1、2和3)，霍亂弧菌hlyA基因(SEQ ID NO. 14)的檢測引物和探針(SEQ ID NO. 4、5和6)以及0139群霍亂弧菌的rfb基因(SEQ ID NO. 15)的檢測引物和探針(SEQ ID NO. 7、8和9)和檢測方法；基於此，本發明進一步公開了霍亂弧菌毒力基因ctxAB (SEQ ID NO. 16)的引物和探針序列(SEQ IDN0. 10、11 和 12)。


圖1不同OD值菌懸液提取的總基因組DNA脈衝電泳圖，其中M2:Low Range PFGEMarker ；1-3:N169610D4, 6，81/2 膠塊；4_6:M0450D4, 6，81/2 膠塊。圖2Not I 酶切分析 Fosmid 文庫插入片段大小，DNA MWM XV Marker (200ng)；圖3普通電泳法檢測陽性質粒克隆菌株穩定性其中，Ml為 X-Hind III Marker ( IOOng) ;1. SYFW296-29 (0 代)；2. SYFW296-29 (50 代);3. SYFW296-29 (100 代);4. SYFW296-49 (0 代);5. SYFW296-49 (50代)；6.SYFW296-49(100 代)；7.SYFW296-165-1(0 代)；8.SYFW296-165-1(50 代)；9. SYFW296-165-1 (100 代);10. SYFW296-192-1 (0 代);11. SYFW296-192-1 (50 代)；12. SYFW296-192-1 (100 代);13.SYFW296-195 (0 代);14. SYFW296-195 (50 代);
15.SYFW296-195(100 代);使用篩選得到的四種目的基因陽性質粒克隆菌株，它們是hlyA基因陽性單克隆菌SYFW296-29 和 SYFW296-49、rfb_01 基因陽性單克隆菌SYFW296-165、rfb_0139 基因陽性單克隆菌SYFW296-192和ctxAB基因`陽性單克隆菌SYFW296_195共五株菌.。陽性質粒克隆菌株分別接種於3mL含氯黴素的2YT液體培養基中，37°C 200r/min下過夜培養，再從過夜培養的菌液中吸取5 ill接種於3mL含氯黴素的2YT液體培養基中，37 °C 200r/min下過夜培養。重複以上步驟培養至第5天。提取第I天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的單克隆菌株DNA，進行普通電泳確認。其中，泳道Ml為入-Hind III Marker,泳道I 6分別表示hlyA質粒陽性克隆培養0代、培養50代和培養100代的單克隆菌株DNA ;泳道7 9分別表示rfb-01質粒陽性克隆培養0代、培養50代和培養100代的單克隆菌株DNA ;泳道10 12分別表示rfb-0139質粒陽性克隆培養0代、培養50代和培養100代的單克隆菌株DNA ;泳道13 15分別表示ctxAB質粒陽性克隆培養0代、培養50代和培養100代的單克隆菌株DNA。圖4脈衝電泳法檢測陽性質粒克隆菌株穩定性其中，M2為 DNA MffM XV Marker (200ng),1. SYFW296-29 (0 代);2. SYFW296-29 (50 代);3. SYFW296-29 (100 代);4. SYFW296-49 (0 代);5. SYFW296-49 (50代)；6.SYFW296-49(100 代)；7.SYFW296-165-1(0 代)；8.SYFW296-165-1(50 代)；9. SYFW296-165-1 (100 代);10.SYFW296-192-1 (0 代);11.SYFW296-192-1 (50 代)；12. SYFW296-192-1 (100 代);13. SYFW296-195 (0 代);14. SYFW296-195(50 代);15. SYFW296-195(100 代)；使用篩選得到的四種目的基因陽性質粒克隆菌株，它們是hlyA基因陽性單克隆菌SYFW296-29 和 SYFW296-49、rfb_01 基因陽性單克隆菌SYFW296-165、rfb_0139 基因陽性單克隆菌SYFW296-192和ctxAB基因陽性單克隆菌SYFW296_195共五株菌。陽性質粒克隆菌株分別接種於3mL含氯黴素的2YT液體培養基中，37°C 200r/min下過夜培養，再從過夜培養的菌液中吸取5 ill接種於3mL含氯黴素的2YT液體培養基中，37 °C 200r/min下過夜培養。重複以上步驟培養至第5天。提取第I天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的單克隆菌株DNA，提取的DNA經Not I酶切後跑脈衝場電泳。其中，泳道M2為DNA MWM XV Marker (200ng),泳道I 6分別表示hlyA質粒陽性克隆培養0代、培養50代和培養100代的單克隆菌株DNA ;泳道7 9分別表示rfb-01質粒陽性克隆培養0代、培養50代和培養100代的單克隆菌株DNA ;泳道10 12分別表示rfb-0139質粒陽性克隆培養0代、培養50代和培養100代的單克隆菌株DNA ;泳道13 15分別表示ctxAB質粒陽性克隆培養0代、培養50代和培養100代的單克隆菌株DNA。
具體實施例方式下面為本發明的具體實施例，對本發明技術方案的建立及其應用作進一步的說明，下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。本發明實施例中所使用的化學試劑或溶劑溶液，如無特殊說明，均可以由常規方法製備或者由商業途徑獲得。若無特殊說明，本發明所用生物樣品來自丹東出入境檢驗檢疫局微生物實驗室。細胞懸濁液(CSB)10mlIM Tris-HCl (pH8. 0)和 20ml0. 5M EDTA (pH8.0)，用滅菌的超純水稀釋到100mL。文庫構建使用Epicentre 公司的 copycontrol fosmid library production kit,載體為pCClFOS，宿主菌為大腸桿菌；低熔點瓊脂糖凝膠(SeaPlague GTG Agarose)購自美國Lonza公司；Xho I,Barn H1、X-Hind II1、蛋白酶 K、DNA MWM XV Marker、DNA 純化試劑盒和平端化加磷試劑盒均購自大連寶生物公司；N-甲基甘氨酸鈉鹽購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；PMSF (苯甲基磺醯氟)購自美國sigma公司；TSA(大豆酪蛋白瓊脂培養基)購自美國Oxoid公司；PFGE膠和一次性制膠模具均購自美國Bio-Rad (伯樂)公司；2YT(胰蛋白腖酵母提取物肉湯)購自美國Oxoid公司；質粒DNA提取使用AxyPr印Easy-96質粒DNA試劑盒購自美國Axygen Bioscience公司；引物和探針由美國應用生物系統公司合成； 2 X PCR Taqman GEx酶預混液購自美國應用生物系統公司；主要儀器有BioMerieux Vitek Colorimeter菌濃度測定儀、Bio-Rad公司的脈衝場電泳儀和成像儀、ABI7300實時螢光PCR儀和ABI PRISMTM3730XL DNA Analyzer。實施例1霍亂弧菌全基因組DNA的提取DNA提取方法有 很多，但只有採用低熔點瓊脂糖包埋法對DNA機械損傷最小，片斷最完整而且能一次大量提取，提取的DNA能長期保存不會被降解，所以本發明採用低熔點瓊脂糖包埋法提取的DNA最適合用於購建Fosmid基因組文庫。具體操作步驟如下從TSA培養基上刮取培養18h 24h的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)M045和N16961菌體(國家疾病預防控制中心惠贈)，分別均勻懸濁於2ml細胞懸濁液(CSB)中，用BioMerieux Vitek Colorimeter測定菌濃度分別為4、6、8三個OD值梯度,優化最優細胞懸濁液濃度。取400 ill細菌懸濁液於相應的1. 5ml Eppendorf管中，並加入置於45°C水浴中的400 ill的2%的低熔點瓊脂糖，混勻後立即加入可製成膠塊的一次性模具中，放在4°C凝固30min，取出膠塊，置於10倍體積的ESP緩衝液(0. 4mol/L EDTA中含有終濃度為2%N_甲基甘氨酸鈉鹽和lmg/ml的蛋白酶K)中，50°C水浴中裂解48h左右，其間24h左右更換一次ESP緩衝液，裂解後觀察膠塊，呈透明狀時可以先切小塊凝膠跑普通電泳觀察裂解情況，如果電泳結果不理想繼續放在50°C中裂解，裂解結束後用等體積的含有0. lmmol/L PMSF的I X TE室溫溫浴2h，再用I X TE洗滌包埋塊兩次，將包埋塊保存於0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)中，4 °C保存，此時，凝膠塊中包含純化的總基因組DNA。三個OD值梯度的菌體懸濁液經包埋法提取基因組DNA後跑脈衝場電泳，上樣量均為1/2膠塊，上Low Range PFG Marker，其電泳圖如圖1。由圖1可知，對於兩種血清型的霍亂弧菌O1和0139，OD值為8的菌體懸濁液，裂解48h後提取的基因組DNA含量最大，因此選用這個OD值提取的DNA來構 建Fosmid文庫。實施例2Fosmid文庫的構建(鑑定和末端測序)用隨即剪切法將基因組DNA進行片段化處理，跑脈衝電泳後分離片段化的DNA，脈衝電泳條件為14°C，6V/cm，脈衝I 10s，16h。電泳結束後切膠回收38 48kb之間的DNA片段，回收的DNA片段通過普通電泳和脈衝電泳確認,利用copycontrol Fosmid libraryproduction kit中的試劑補平粘性末端，再用平端化加磷試劑盒進行磷酸化處理，將處理後的DNA片段連接到pCClFOS載體上，4°C過夜，根據試劑盒提供的方法將連接液進行包裝、轉染、塗布平板。從由上述方法獲得的平板中隨機選取16個白色單菌落，培養提取Fosmid DNA，用NotI進行酶切，因Not I可以識別8個鹼基，按概率約40Kb左右會有酶切位點，但是也有可能插入片段中有不止一個酶切位點。從圖2(Not I酶切分析Fosmid文庫插入片段大小)可以看出，16個白色陽性菌落的酶切產物都有一條同樣大小的條帶，此條帶即代表pCClFOS載體，插入片段有一個酶切位點的片段35Kb 40Kb之間，有多個酶切位點的片段加和也在35Kb以上，Fosmid最適插入長度在35Kb左右，所以酶切結果均符合要求。對以上16個克隆隨機挑選8個Fosmid DNA進行雙末端測序，測序結果經BLAST後，證實均為霍亂弧菌相關序列，說明文庫製備正確。分別挑取陽性白色菌落保存在96孔板上，以每孔一個單克隆進行製作，37°C過夜培養，將培養後的板用含有30%甘油的LB培養基進行懸浮並移至新96孔板中，-70°C下貯存獲得的甘油菌。實施例3從實施例2獲得的甘油菌中篩選陽性克隆菌株，操作方法如下取2 IOii L甘油菌加入含有氯黴素的終濃度為12. 5ng/ii L的IOOiiL LB中，37 0C 1800rpm振蕩過夜培養後，往培養液中添加500 y L2YT (含有氯黴素的終濃度為12.5ng/u L) 1/1000 量的誘導劑(1000 X Induction)，37°C 1800rpm 振蕩培養 5h。使用試劑盒AxyPr印Easy-96質粒DNA試劑盒進行DNA提取，對提取的質粒DNA進行實時螢光多重PCR擴增，篩選出hlyA基因、rfb-01基因、rfb-0139基因和ctxAB基因的單克隆菌株，具體PCR方法操作步驟如下1、各基因的PCR檢測使用以下引物和探針rfb-01 :正向引物5，-GCCCGTTTTGCATTATGGAT-3，(SEQ ID NO.1)反向引物5，-CCTTTTACCGCCGCAATACGA-3』(SEQ ID NO. 2)探針5，FAM-TGATCCGACAAGCCCAAATGCCACTA(Eclipse)-3，(SEQID NO. 3)hlyA:正向引物5，-GAGAAATTTGAGCGCAAAGAGGTTT-3，；(SEQ ID NO. 4)反向引物5，-ACTTCCACCCCACCAGTCA-3』(SEQ ID NO. 5)探針5，NED-CCAAGCTCAAAACCTG(MGB)-3，(SEQID NO. 6)rfb-0139 :正向引物5』 -AGTTACCTGTTATGTACGATGAACC-3』 (SEQ ID NO. 7)反向引物5』-CCATCACCAGACAAGCATACAG-3』 (SEQ ID NO. 8)探針5，VIC-TGCTGACGCCTCTCAAGTGCCTACG(Eclipse)-3，(SEQID NO. 9)ctxAB :正向引物5』 -CTCATCCAGATGAACAAGAAGTTTCTG-3』 (SEQ ID NO. 10)反向引物5』-CTATCTCTGTAGCCCCTATTACGATGT-3』 (SEQ ID NO. 11)探針5，FAM-AAGCCCCCAAAATGA(MGB)-3，(SEQID NO. 12)2、多重PCR反應體系總體積20ul，包括步驟③製得的模板DNA溶液2iiL，2XPCR Taqman GEx酶預混液IOii L，rfb-01基因和ctxAB基因上下遊引物各0. 8 ii L、探針0. 4 ii L，hlyA基因和rfb-0139基因上下遊引物各0. L、探針0. 2 y L，根據實驗需要選擇不同引物對和探針進行擴增實驗，補充滅菌超純水至總體積為20ii L ;其中引物和探針的濃度均為10iiM。以上各組分加入至0. 2mL PCR反應管中，混勻，5000r/min，離心IOs ；上述反應體系按下述條件進行PCR檢測950C /IOmin, I 個循環；95°C /15s,60°C /lmin, 40 個循環；每次循環的退火時收集螢光，檢測結束後，根據擴增曲線和Ct值判定結果。Ct值≥40，可判斷該基因篩選結果為陰性；Ct值< 40，可判斷該基因篩選結果為陽性。實施例4一.陽性單克隆菌株穩定性檢測使用實施例3中篩選得到 的四種目的基因陽性質粒克隆菌株，它們是hlyA基因陽性單克隆菌SYFW296-29和SYFW296-49、rfb-01基因陽性單克隆菌SYFW296_165、rfb-0139基因陽性單克隆菌SYFW296-192和ctxAB基因陽性單克隆菌SYFW296_195共五株菌，分別接種於3mL含氯黴素的2YT液體培養基中，37°C 200r/min下過夜培養。分別從過夜培養的菌液中吸取5iU接種於3mL含氯黴素的2YT液體培養基中，37°C 200r/min下過夜培養，重複以上步驟培養至第5天。提取第I天(0代)、第3天(50代)、第5天(100代)的單克隆菌株DNA，進行普通電泳確認，經Not I酶切後進行瓊脂糖脈衝電泳，檢測克隆穩定性。提取的陽性單克隆菌株DNA普通電泳結果見圖3 (提取的Fosmid DNA普通電泳)；圖中所示結果可知圖譜無明顯差異，沒有發現插入片段的丟失或重排，說明所構建的陽性質粒克隆菌株是穩定的。陽性單克隆菌株DNA經Not I酶切，酶切產物脈衝場電泳結果見圖4 (提取的Fosmid DNA Not I酶切脈衝場電泳)。圖中所示結果可知圖譜無明顯差異，沒有發現插入片段的丟失或重排，說明所構建的陽性質粒克隆菌株是穩定的。二.菌種保藏將篩選的陽性質粒克隆菌株於2012年12月17日，分別保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101，具體信息如下大腸桿菌pCClFOS載體，轉化了霍亂弧菌的rfb-0139基因的質粒克隆菌株SYFW296-192，即轉化了霍亂弧菌rfb-0139基因克隆質粒的大腸桿菌，命名為VC-rfb-0139，保藏號為CGMCC NO. 6997 ；大腸桿菌pCClFOS載體，轉化了霍亂弧菌的rfb-01基因的質粒克隆菌株SYFW296-165，即轉化了霍亂弧菌rfb-01基因克隆質粒的大腸桿菌，命名為VC_rfb_01，保藏號為CGMCC NO. 6998 ；大腸桿菌pCClFOS載體，轉化了霍亂弧菌hlyA基因的質粒克隆菌株SYFW296-29，即轉化了霍亂弧菌hlyA基因克隆質粒的大腸桿菌，命名為VC-hlyA，保藏號為=CGMCCNO. 6999 ；大腸桿菌pCClFOS載體，轉化了霍亂弧菌的ctxAB基因的質粒克隆菌株SYFW296-195，即轉化了霍亂弧菌 ctxAB基因克隆質粒的大腸桿菌，命名為VC_ctxAB。保藏號為CGMCC NO. 7000。實施例5一.實驗分組分別利用實施例4所述方法製備獲得的轉化了霍亂弧菌的rfb-0139 (CGMCCNO. 6997)、rfb-01 (CGMCC NO. 6998)、hlyA (CGMCC NO. 6999)、ctxAB (CGMCC NO. 7000)基因的質粒克隆菌株，做下述實驗。將待檢測樣品分別標記已知含有霍亂弧菌N16961和M045的陽性對照樣品標記為PC ；樣品水標記為NC ；霍亂弧菌的rfb-0139基因的質粒克隆菌株凍幹菌CGMCC NO. 6997 :標記為A ；霍亂弧菌的rfb-01基因的質粒克隆菌株凍幹菌CGMCC NO. 6998 :標記為B ；霍亂弧菌的hlyA基因的質粒克隆菌株凍幹菌CGMCC NO. 6999 :標記為C ；霍亂弧菌的ctxAB基因的質粒克隆菌株凍幹菌CGMCC NO. 7000 :標記為D ；將分別標記的待檢測樣品作為盲樣，分給檢驗員檢測，檢測方法和結果如下檢驗員1:利用引物和探針SEQ ID NO. 1、2和3，做如下實驗。檢驗員2 :利用引物和探針SEQ ID NO. 4、5和6，做如下實驗。檢驗員3 :利用引物和探針SEQ ID NO. 7、8和9，做如下實驗。檢驗員4 :利用引物和探針SEQ ID NO. 10、11和12，做如下實驗。二.檢驗方法
對上述待檢的樣品，分別提取DNA，方法如下①稱取300mg已製備好的樣品於2mL離心管中，加入1. 5mL CTAB緩衝液和10 y L濃度為20mg/ iiL蛋白酶K,65°C 30min振蕩混勻；12000r/min離心5min,吸取上清液至一新離心管中，加400 y L的體積比為24 1的三氯甲烷異戊醇，充分混勻；②12000r/min離心5min，吸取上清液至一新離心管中，加入0. 8倍體積異丙醇，室溫下沉澱I 2h ;③12000r/min離心IOmin,棄上清液；70%乙醇洗漆一次，晾乾；加入50iiL TE,溶
解DNA沉澱；④DNA濃度和純度的測定取步驟③獲得的DNA溶液加水稀釋，至濃度為10 U g/mL 100 u g/mL, A260/A280 比值在1. 7 1. 9 之間，備用。三.檢驗結果利用實施例3中所述的實時PCR篩選方法，分別對提取DNA的樣品進行檢測，每個樣品4次重複，其結果如下
權利要求
1.一種霍亂弧菌ctxAB基因的質粒克隆菌株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC NO. 7000。
2.一種霍亂弧菌ctxAB基因檢測試劑盒，其特徵在於包括權利要求1所述的保藏編號為CGMCC NO. 7000的質粒克隆菌株，及上下遊引物與探針SEQ ID NO. 10 ；SEQ ID NO. 11 ；SEQ ID NO. 12。
3.一種非疾病診斷目的霍亂弧菌ctxAB基因的多重PCR檢測方法，其特徵在於利用權利要求2所述霍亂弧菌ctxAB基因檢測試劑盒，對樣品DNA進行多重PCR方法檢測。
4.根據權利要求3所述的非疾病診斷目的霍亂弧菌ctxAB基因的多重PCR檢測方法，其特徵在於所述的多重PCR方法檢測的條件為 ①反應體系總體積為20iiL，其中濃度為IO IOO ng/mL的樣品DNA2 ^iLIOpM丄下遊引物各0.8pL·10 uMU 4 |,lL 2xPCR Taqman GEx 酶預混液IO pL 水餘量 ②以上各組分混勻，5000r/min，離心IOs後，進行多重PCR方法檢測 ·950C /10min，l 個循環；95°C /15s，60°C /lmin，40 個循環。
全文摘要
本發明公開了一種霍亂弧菌ctxAB基因的質粒克隆菌株、其製備方法，及其在非疾病診斷目的方面的應用,其以大腸桿菌pCC1FOS為載體，轉化了霍亂弧菌的ctxAB基因的質粒克隆菌株，保藏編號為CGMCC NO.7000。主要用於霍亂弧菌相應基因檢測的陽性對照樣品，進行質量控制，也可用來考核檢驗人員的技術水平，以保證檢驗工作質量；並且可以對不同的分析方法和不同的鑑定儀器進行檢驗和校準，使之具有準確性、統一性、可比性和規範性。具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12Q1/04GK103060253SQ20131002748
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月24日 優先權日2013年1月24日
發明者麻麗丹, 黃大亮, 王殿夫, 高世光, 楊維儀 申請人:麻麗丹, 黃大亮, 王殿夫, 高世光, 楊維儀