改進的抗lgE抗體以及改進多肽的方法

2023-09-18 05:12:20

專利名稱：改進的抗lgE抗體以及改進多肽的方法
背景技術：
本發明設計免疫球蛋白E(IgE)、IgE拮抗劑、能結合人IgE的抗IgE抗體，以及一種改進多肽(包括抗IgE抗體)的方法。
IgE是介導變應性應答(如廣泛遭受的哮喘、食物過敏、I型超敏反應和家族性(familiar)竇炎)的免疫球蛋白家族中的一個成員。IgE由B細胞或B淋巴細胞分泌並表達在細胞表面。IgE通過其針對低親和力IgE受體(稱為FcεRII)的Fc區域結合B細胞(以及單核細胞、嗜酸性粒細胞和血小板)。在哺乳動物接觸變應原時，攜帶對抗原特異性的、表面結合的IgE抗體的B細胞被「激活」並發育成分泌IgE的漿細胞。然後，產生的變應原特異性的IgE通過血液循環，通過高親和力受體(也稱為FCεRI)結合到組織中肥大細胞以及血液中的嗜鹼性粒細胞的表面上。從而，使肥大細胞和嗜鹼性粒細胞對變應原致敏。隨後與變應原的接觸引起嗜鹼性粒細胞和肥大細胞的FcεRI交聯，從而導致釋放出引起臨床超敏反應和過敏症狀的組胺、白細胞三烯和血小板激活因子、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞趨化因子和細胞因子IL-3、IL-4、IL-5和GM-CSF。
病理學超敏症狀的特徵是，如果存在相當大量的變應原或如果體液和細胞免疫狀態處於增強水平，對變應原的過度免疫應答將導致大量組織變化。
過敏性超敏反應的生理性變化可以包括肺細支氣管和支氣管強烈收縮、平滑肌收縮和毛細管擴張。然而，該病徵的誘因似乎是遺傳因素和環境因素之間的相互作用而引起的。誘導過敏性超敏反應的常見環境性變應原見於花粉、食物、屋塵蟎、動物毛髮皮屑、真菌孢子和昆蟲毒液。特應性變應原與過敏性超敏反應有關，並誘導了諸如哮喘、變應性關節炎和結膜炎(枯草熱)、溼疹、蕁麻疹和食物過敏。然而，昆蟲叮咬或非腸胃道藥物治療(parental medication)通常會激發過敏性休克，一種威脅生命的有害的過敏性反應。
最近，對I型超敏反應或過敏性超敏反應已經獲得一種治療方案，它試圖阻斷IgE與嗜鹼性粒細胞以及肥大細胞上發現的高親和力受體(FcεRI)結合，從而防止組胺和其它過敏性因子的釋放而導致產生病理狀態。
1993年3月4日公開的WO93/04173描述了人IgE/IgG1嵌合體，其中IgG1殘基被類似的IgE殘基替代。申請人的待批申請USSN08/405,617描述了人源化的抗IgE抗體，其中用針對人IgE的鼠抗體(MaE11)來提供CDR區域代替到IgG1免疫球蛋白框架(rhuMaE25)內。Reichman，L.等人(1988)Nature 332323和Jones，P.T.等人(1986)，Nature 321522中描述了人源化技術。
儘管已經建立了人源化的鼠抗體來提供抗IgE分子(它提供了與鼠MaE11相似的對IgE的親和力，而後者不會引發免疫原性應答(Shields等人，(1995)，Int.Arch.Allergy Immunol.107308-312))，然而這仍然沒有構建出對IgE的親和力明確優於MaE11或鼠抗IgE的抗IgE。
重組單克隆抗體將經歷影響所有多肽或蛋白的降解反應，例如天冬氨酸和天冬醯胺殘基的異構化。如下圖A所示，-Asp-Gly-序列中的天冬氨酸殘基(I)能通過環狀醯亞胺中間產物(II)異構化成異天冬氨酸(III)(Geiger Clarke，J.Biol.Chem.262785-794(1987))。天冬氨酸(I)的羧酸側鏈和毗鄰甘氨酸的醯胺氮反應，形成環狀的天冬氨酸中間物(II)，進而形成-異天冬氨酸-甘氨酸-殘基(III)。該反應的平衡、速率以及pH依賴性已經在通過反向高效液相層析分離的模型肽中進行了研究(Oliyai Borchardt，Pharm Res.10，95-102(1993))。據信，經歷異構化作用的趨勢還取決於含有-Asp-Gly-序列的分子部分的局部柔韌性(Geiger Clarke，同上)。
經歷了天冬氨酸異構化的一種已知的抗體例子是稱為rhuMabE-25的強效抗IgE抗體E-25(E-25)。該行為可能自發產生，也可以使E25於37℃培育21天來誘導產生。最後的結果是抗體多肽骨架中插入一個額外的甲基，這能導致構型變化和結合親和力減少。用帶有VL32-33位的-c-Asp-Gly-以及-異-Asp-Gly-變體的E-25研究表明，儘管用丙氨酸或甘氨酸替代殘基VL32可以最大程度地減小異構化行為，但是替代本身會導致結合力減少3倍。Cacia等人，同上。
因此，迫切需要產生改進的多肽(包括抗體)，它不僅不表現出天冬氨酸異構化的「失活」行為，而且應顯示出與靶分子(例如抗原)的親和力等於或大於未改進多肽親和力。
概述本發明涉及通過多步組合來改進對靶分子有親和力的多肽的方法，該方法包括(1)鑑定易異構化的天冬氨醯殘基；(2)用其它殘基替代，並篩選所產生的對靶分子有親和力的突變體。在一個較佳的實例中，替代殘基的方法是用噬菌體展示親和力成熟(affinity maturation)(AMPD)。在另一個較佳的實例中，多肽是抗體，靶分子是抗原。在另一個較佳的實例中，抗體是抗IgE，靶分子是IgE。
在還有一個更佳的實例中，本發明涉及一種改進抗IgE抗體E-25親和力的方法，該方法是用Glu取代VL CDR-L1殘基32Asp，以及將VL CDR-L1殘基27Gln，28Ser和31Tyr分別修飾成Lys，Pro和Gly。在還有一個更佳的實例中，E-25抗IgE抗體在VH CDR2殘基中有額外的修飾53Thr變成Lys，55Asp變成Ser，57Ser變成Glu，以及59Asn變成Lys。
在另一個實例中，本發明涉及對IgE的親和力有所改進的抗IgE抗體。
在一個較佳的實例中，抗IgE抗體包含重鏈和輕鏈殘基，它們包含圖2中標記為「e27」和「e26」的序列片段。或者，抗IgE抗體包含

圖12中標記為「E27」或「E26」的全長重鏈和輕鏈序列。
本發明還涉及一種具有藥物用途的親和力改進的抗IgE或其功能性片段的組合物。本發明還涉及包含親和力改進的抗IgE抗體的產品。
在還有一個實例中，本發明涉及一種減少或抑制IgE介導組胺產生的方法。
在還有一個實例中，本發明還涉及一種治療IgE介導疾病的方法，該方法是給予本發明的抗體或其功能性片段。
本發明的其它方面將從下列詳細描述和權利要求中明顯看出。
附圖簡述圖1是鼠抗體MAE11、人重鏈亞型III(humIII)以及輕鏈κ亞型I(humκI)的共有序列以及片段F(ab)-2(一種具有CDR殘基、且某些框架殘基被修飾成鼠殘基的修飾的人抗體片段)之間VH和VL結構域的比較。
圖2是rhuMabe25，e426和序列e26和e27之間輕鏈和重鏈CDR結構域之間的不同的比較。本文的殘基編號是連續的，與Kabat等人的不同。還應注意，這些序列只是片段，而不是真實的全長重鏈和輕鏈殘基。
圖3是FACS為基礎的試驗，該圖表明了受測試抗體抑制FITC偶聯的IgE結合表達在CHO 3D10細胞上的高親和力FcεRI受體α鏈的能力。圖中示出了鼠單抗MaE11(□)、陰性對照人源化的單抗4D5(■)、F(ab)-2(○)、F(ab)-9(●)、F(ab)-11(△)和F(ab)-12(▲)的抑制百分數。數據點是三次實驗的平均值，除單抗mAb4D5外，它是一次實驗的數值。結果表明，MaE11和測試的F(ab)阻斷了FITC-IgE與表達FcεRIα鏈的CHO 3D10細胞的結合。
圖4是FACS為基礎的試驗的圖，它測定了受測試抗體與CHO 3D10細胞上表達的高親和力受體FcεRI的α亞基所載的IgE的結合。圖中示出了鼠單抗MaE11(○)、人源化變體12(▲)、陽性對照鼠單抗MaE1(●)、陰性對照抗體鼠MOPC21(△)、以及陰性對照人源化單抗4D5(□)的結合百分數。在算術/線性規模上，0.1μg/ml時的平均通道螢光數值為MPOC21，7.3；MaE1，32.1；MaE11，6.4；hu4D5，4.7；和huMaE11，4.6。所有三種鼠單抗是鼠同種型IgG1，二種人源化單抗是人同種型IgG1。數據點是三個實驗的平均值。結果表明，MaE11和F(ab)-12不結合載有IgE的表達FcεRIα鏈的CHO 3D10細胞。
圖5是抗IgE對豚草誘導的組胺釋放的抑制百分數的摩爾比。圖中顯示了E-25(●)和e-26(○)。結果表明，e26的F(ab)形式以劑量依賴方式很好地抑制了豚草誘導的組胺釋放，最大半數抑制的摩爾比為44∶1(抗IgE∶RSIgE)。
圖6示出了實施例4部分II中描述的各輪親和力選擇後的親和力富集情況。圖中顯示了每一合併物的結合富集物與野生型之比(Emut/Ewt)。結果表明，VL文庫(用＂a＂＂b＂表示)連續展示了改進的相對富集，在5-6輪富集後比野生型高大約10倍。另外，VH文庫(＂c＂和＂d＂)在約3輪後表現出提高大約3倍。注意，＂a＂對應於在VL CDR-1殘基27、28、30和31位突變的Fab-噬菌體文庫，而＂b＂對應於30、31、32和34位突變，而＂c＂和＂d＂是在殘基101、102、103、105和107有突變的獨立F(ab)文庫。
圖7顯示了在最終變體的噬菌體ELISA競爭性研究中，觀察到的光密度對IgE競爭性抗體的濃度，該最終的變體通過e26中VL CDR1突變和克隆235-5.1、235-5.2、235-5.3和235-5.4中VH CDR2突變組合而得，分別重新命名為e27，e695，e696和e697(如實施例4部分V所述)。
圖8顯示了各種濃度水平的e25，e26和e27抗IgE抗體在實施例4部分VI中描述的生物素平板試驗中的490nm吸收值。
圖9表示了e25，e26和e27d F(ab)表觀結合親和力，用BIAcore TM-2000表面等離子體激元(plasmon)共振系統來測定。將PBS/Tween緩衝液(0.05％Tween-20，以磷酸鹽緩衝液配)作1.5倍連續稀釋的F(ab)抗體片段，於25℃以20微升/分鐘的流速注射在IgE晶片上。所示的平衡解離常數(Kd)從每個Fab變體觀察到的kon/koff比值計算得到。
圖10是質粒p426的序列表，該質粒在實施例4中作為模板用來構建文庫特異性終止模板。
圖11。A.質粒pDH188插入物的框圖，它含有的DNA編碼針對HER-2受體的Fab人源化抗體的輕鏈和重鏈(可變區和恆定區1)。VL和VH分別是輕鏈和重鏈的可變區。Cκ是人κ輕鏈的恆定區。CH1G1是人γ1鏈的第一恆定區。兩個編碼區均從細菌stII信號序列開始。
B.含有11A所述插入物的整個質粒pDH188的示意圖。在將質粒轉化入大腸桿菌SR101細胞中並加入輔助噬菌體後，質粒被包裝入噬菌體顆粒中。這些顆粒中一些展示了Fab-pIII融合(其中pIII是M13基因III DNA編碼的蛋白質)。
圖12表示抗IgE抗體E25、E26和E27的全長重鏈和輕鏈殘基。
圖13表示抗IgE抗體e26和e27的F(ab)片段。
圖14表示抗IgE抗體e26和e27的sFV片段。
圖15表示抗IgE抗體e26和e27的F(ab)′2片段。
SEQ ID NO1表示用於本發明的表達質粒e426的序列，另如圖10所示。
SEQ ID NO2表示圖1所示的MaE11的可變重鏈序列。
SEQ ID NO3表示圖1所示的F(ab)-2的可變重鏈序列。
SEQ ID NO4表示圖1所示的humIII的可變重鏈序列。
SEQ ID NO5表示圖1所示的MaE11的可變輕鏈序列。
SEQ ID NO6表示圖1所示的F(ab)-2的可變輕鏈序列。
SEQ ID NO7表示圖2所示的humIII的可變輕鏈序列。
SEQ ID NO8表示圖2所示的e26和e27的可變輕鏈序列。
SEQ ID NO9表示圖2所示的e426的可變輕鏈序列。
SEQ ID NO10表示圖2所示的e25的可變輕鏈序列。
SEQ ID NO11表示圖2所示的e27的可變重鏈序列。
SEQ ID NO12表示圖2所示的e25，e26和e426的可變重鏈序列。
SEQ ID NO13表示圖12所示的e25的全長可變輕鏈序列。
SEQ ID NO14表示圖12所示的e25的全長重鏈序列。
SEQ ID NO15表示圖12所示的e26的全長輕鏈序列。
SEQ ID NO16表示圖12所示的e26的全長重鏈序列。
SEQ ID NO17表示圖12所示的e27的全長輕鏈序列。
SEQ ID NO18表示圖12所示的e27的全長重鏈序列。
SEQ ID NO19表示圖13所示的e26和e27的可變輕鏈Fab片段。
SEQ ID NO20表示圖13所示的e26的可變重鏈Fab片段。
SEQ ID NO21表示圖13所示的e27的可變重鏈Fab片段。
SEQ ID NO22表示圖14所示的e26的sFv片段。
SEQ ID NO23表示圖14所示的e27的sFv片段。
SEQ ID NO24表示圖15所示的e26和e27的可變輕鏈F(ab)′2片段。
SEQ ID NO25表示圖15所示的e26的可變重鏈F(ab)′2片段。
SEQ ID NO26表示圖15所示的e27的可變重鏈F(ab)′2片段。
較佳實例詳述整篇本申請中提及的特定文獻、專利申請和專利應被視為納入本說明書作為參考。
定義整篇申請中採用的術語應被理解成具有本領域普通技術人員通常所知的典型的意義。然而，申請人希望給予下列術語如下特定定義術語「蛋白質」或「多肽」可互換使用。它們指通過肽鍵或醯胺鍵連接在一起的兩個或多個胺基酸的鏈，無論是否經過翻譯後修飾(例如，糖基化或磷酸化)。該定義範圍中特別提到了抗體。
本發明的多肽可包含一個以上的亞基，每個亞基一條由分開的DNA序列編碼。
關於抗體多肽序列的短語「基本上相同」應理解成，抗體表現出與參照多肽序列至少70％的序列相同(較佳的為80％，更佳的90％，最佳的為95％)。關於核酸序列的短語應理解成，核苷酸序列表現出和參照核酸序列至少有約85％的序列相同(較佳的90％，更佳的95％，最佳的為97％)。對於多肽，比較序列的長度通常至少為25個胺基酸。對於核酸，長度通常至少為75個核苷酸。
術語「相同性」或「同源性」應理解成是指，在序列排列對齊並引入空隙(如果需要)從而使整個序列達到最大的序列相同百分比之後，並且不考慮保守替代作為序列相同性的一部分時，候選序列中和與其比較的對應序列中殘基相同的胺基酸殘基的百分數。N端或C端延伸或插入不應被理解成是減少了相同性或同源性。用於序列排列對比的方法和電腦程式是本領域所熟知的。用序列分析軟體(例如，序列分析軟體包，Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Ave.，Madison，WI 53705)可以測定序列相同性。該軟體通過指定不同替代、缺失和其它修飾同源度來相容類似的序列。
術語「抗體」被最廣義地使用，並且具體地包括單克隆抗體(包括全長的單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它們表現出所需的生物活性。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結構性質的糖蛋白。抗體對特定抗原表現出結合特異性，而免疫球蛋白則包括抗體以及缺失抗原特異性的其它抗體樣分子。後一類多肽(例如)由淋巴系統低水平產生，由骨髓瘤高水平產生。
天然抗體和天然免疫球蛋白通常是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與一條重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端是恆定區。輕鏈的恆定區與重鏈的第一恆定區相對排列，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對排列。據信特殊的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界面(Clothia等人，J.Mol.Biol.186，651-66，1985；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，4592-4596(1985))。
「分離的」抗體是經鑑定的和分離的和/或回收自產生它的環境組分的抗體。其產生環境中的汙染性組分是會干擾抗體的診斷或治療性用途的物質，可能包括酶、激素和其它蛋白質類或非蛋白質類溶質。在較佳的實例中，抗體純化用至少三種不同方法測定1)經Lowry法測定，按抗體重量計高於95％，最好高於99％；2)其純度足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15個N末端殘基或內部胺基酸序列；或3)用考馬斯藍或較佳的用銀染法，在還原或非還原條件下作SDS-PAGE測定時達到均質。分離的抗體包括存在於重組細胞內的原位抗體，因為該抗體的天然環境的至少一種組分是不存在的。但是，通常，分離的抗體經至少一步純化步驟製得。
「依賴於動物種類的抗體」，例如哺乳動物抗人IgE抗體，是這樣一種抗體，它對來自第一種哺乳動物的抗原的結合親和力比其對來自第二種哺乳動物的該抗原同源物更強。通常，依賴於動物種類的抗體「特異性結合」人抗原(即，結合親和力(kd)數值不超過大約1×10-7，較佳的不超過大約1×10-8，最佳的不超過1×10-9M)，但是對第二種非人哺乳動物抗原同源物的結合親和力比其對人抗原的結合親和力至少弱50倍、或至少弱約500倍、或至少弱約1000倍。依賴於動物種類的抗體可以上述的任何類型的抗體，但是較佳的是人源化抗體或人抗體。
術語「抗體突變體」指抗體的胺基酸序列變體，其中一個或多個胺基酸殘基已被修飾。這些突變體與原胺基酸序列的相同性或相似性必定低於100％，與抗體的重鏈或輕鏈可變區的胺基酸序列的胺基酸序列相同性或相似性至少為75％，較佳的至少80％，更佳的至少85％，還要佳的至少90％，最佳的至少95％。由於本發明的方法同樣適用於多肽、抗體和其片段，因此這些術語有時可互換。
在抗體可變區中術語「可變」指這樣一個事實可變區的某些部分在不同抗體序列中有很大的不同，這些部分用於每個特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分布在抗體可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中稱為互補決定區(CDR)(也稱為超變區)的三個節段中。測定CDR至少有兩種技術(1)以物種交叉序列變異性為基礎的方法(即，Kabat等人，免疫學感興趣的蛋白的測序(National Institute of Health，Bethesda，MD 1987))；和(2)以抗原-抗體複合物的晶體圖學研究為基礎的方法(Chothia，C.等人(1989)，Nature 342877)。關於本申請人的抗IgE抗體，某些CDR是通過Kabat等人和Chothia等人的方法的組合來確定的。可變區中更高度保守的部分稱為構架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區各包含四個FR區，它們大多數採取β摺疊構型，由三個形成環的CDR連接β摺疊結構(在某些情況下形成β摺疊的一部分)。每條鏈中的CRD通過FR區和另一條鏈的CDR緊密毗鄰在一起，形成抗體的抗原結合部位(見Kabat等人)。恆定區不直接參與抗體和抗原的結合，但是表現出不同效應功能，例如參與抗體的抗體依賴型細胞毒性。
術語「抗體片段」指全長抗體的一部分，通常是抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗體產生了兩個相同的抗原結合片段(稱為Fab片段，每個片段有單個抗原結合部位)，以及一個殘餘的「Fc」片段(如此稱呼是因為它很容易結晶)。用胃蛋白酶處理產生一個F(ab′)2片段(它具有兩個能與抗原交聯的抗原結合片段)以及一個殘餘的其它片段(稱為pFc′)。其它片段可包括二抗體(diabody)、線性抗體、單鏈抗體分子和抗體片段形成的多特異性抗體。如本文所用的，關於抗體的術語「功能性片段」是指Fv，F(ab)和F(ab′)2片段。
「Fv」是最小的抗體片段，它含有全部抗原識別和結合位點。該區域由緊密、非共價關聯的一個重鏈和一個輕鏈可變區的二聚物(VH-VL二聚物)組成。在該構型中，各可變區中的三個CDR相互作用，確定了VH-VL二聚物表面上的抗原結合位點。6個CDR共同賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或Fv的一半，只包含對抗原有特異性的三個CDR)也能識別並結合抗原，只是其親和力比整個結合位點低。
Fab片段(還稱為F(ab))還含有輕鏈的恆定區和重鏈的第一個恆定區(CH1)。由於在重鏈CH1區的羧基端增加了幾個殘基(包括來自鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸)，使Fab′片段和Fab片段不相同。Fab′-SH在本文命名為Fab′，其中恆定區的半胱氨酸殘基有一個游離的巰基。通過F(ab′)2胃蛋白酶消化產物的鉸鏈半胱氨酸處二硫鍵的斷裂，產生Fab′片段。抗體片段的其它化學偶聯方式也是已知的。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」可根據其恆定區的胺基酸序列歸為明顯不同的兩類(稱為κ和λ)中的一類。
根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，「免疫球蛋白」可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-1，IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-1和IgA-2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是眾所周知的。用於本發明的較佳的免疫球蛋白是免疫球蛋白E。
本文所用的術語「單克隆抗體」指從一群基本均一抗體獲得的抗體，即該群體中包含的各個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單克隆抗體是高特異性的，針對單個抗原位點。而且，與常規(多克隆)抗體製劑(通常是包括針對不同的決定簇(表位)的不同抗體)相反，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的優點還在於它們是通過雜交瘤培養來合成的，不會被其它免疫球蛋白汙染。修飾語「單克隆」表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。例如，用於本發明的單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等人，Nature，256495(1975)首先提出)製得，或可用重組DNA方法(例如參見美國專利No.4,816,567)製得。用於本發明的單克隆抗體也可用例如Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技術從噬菌體抗體文庫中分離獲得。
本文的單克隆抗體具體包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)(其中重鏈和/或輕鏈的一部分與特定動物種類衍生的、或是屬於特定的抗體類或亞類的抗體的對應序列相同或同源，而鏈的其餘部分則與另一動物衍生的、或是屬於另一抗體類或亞類的抗體的對應序列相同或同源)以及這些抗體的片段，只要這些片段具有所需的生物活性即可(US4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。
「人源化」形式的非人(如鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗體的其它抗原結合性亞序列)，它們含有非人免疫球蛋白的最小序列。對於大多數情況，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者的互補決定區(CDR)殘基被非人(供者抗體)(例如有所需特異性、親和力和活性的小鼠、大鼠或兔抗體)的CDR殘基代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架區(FR)殘基被對應的非人殘基代替。另外，人源化的抗體可包括既不存在於受者抗體、又不存在於導入的CDR或構架序列中的殘基。作這些修飾能進一步提高和優化抗體性能。通常，人源化抗體包含了基本上所有的(至少一個、通常兩個)可變區，其中所有或基本上所有的CDR區對應於非人免疫球蛋白的CDR區，所有或基本上所有FR區是人免疫球蛋白共有序列的FR區。人源化抗體最好還包括免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的Fc部分。更詳細的情況參見Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
「單鏈Fv」或＂sFv＂抗體片段包括抗體的VH和VL區，其中這些區在一條多肽鏈中。通常，Fv多肽還包括VH和VL區間的多肽接頭，該接頭可使sFv形成結合抗原所需的結構。關於sFv綜述可見Pluckthun在《單克隆抗體藥理學》(ThePharmacology of Monoclonal antibodies)，113卷，Rosenburg和Moore編輯，Springer-Verlag，New York，269-315頁(1994)。
術語「二抗體」指有兩個抗原結合位點的小抗體片段，該片段包括重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)連接在同一多肽鏈(VH-VL)中。由於採用一個短得無法使同一鏈上兩可變區間產生配對的接頭，使此二區域與另一鏈中的互補區配對，形成了兩個抗原結合位點。二抗體在例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中有更詳細的描述。
術語「抗體的功能性片段或類似物」是指一種化合物具有與全長抗體相同的定性的生物活性。例如，抗IgE抗體的功能性片段或類似物是能結合IgE免疫球蛋白從而阻止或大大減少該分子結合高親和力受體FcεRI的能力的片段或類似物。
術語「胺基酸」指所有天然存在的L-α-胺基酸。胺基酸的確定見下文章節A「抗體製備(iv)突變型抗體的產生」中的描述。術語「胺基酸」變體指與天然的胺基酸序列相比其胺基酸序列有一些不同的分子。
「替代型」變體是指天然序列中的至少一個胺基酸殘基被除去並在相同位置插入不同胺基酸的那些變體。替代可以是單個，即分子中只有一個胺基酸被替代，或可以是多個，即同一分子中有兩個或多個胺基酸被替代。「插入型」變體是天然序列中在緊靠特定位置處的胺基酸插入一個或多個胺基酸的那些變體。緊靠一個胺基酸是指，與該胺基酸的α羧基或α氨基官能團相連。「缺失型」變體是天然胺基酸序列中的一個或多個胺基酸被除去的那些變體。通常，缺失型變體在分子特定區域內有一個或兩個胺基酸缺失。
術語「細胞」、「細胞系」和「細胞培養」可互換使用，所有這些命名均包括子代。也應理解，由於有意或無意的突變，所有子代也許在DNA內容上不精確相同。其包括了在原始轉化細胞中篩選出具有相同功能或生物活性的突變型子代。
本發明所用的「宿主細胞」通常是原核或真核宿主。章節B「載體、宿主細胞和重組方法(vii)宿主細胞的選擇和轉化」中描述了合適的宿主細胞的例子。
「轉化」指將DNA導入生物體內，從而使該DNA能複製成染色體外元件或整合到染色體內。
「轉染」指宿主細胞攝取表達載體，不論是否實際上表達了任何編碼序列。
術語「轉染的宿主細胞」和「轉化的」指將DNA導入細胞內。該細胞被稱為「宿主細胞」，它可以是原核或真核細胞。典型的原核宿主細胞包括各種大腸桿菌菌株。典型真核宿主細胞是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞或人源細胞。導入的DNA序列可以與宿主細胞種類相同或不同，或可以是雜交的DNA序列，含有一些外來DNA和一些同源DNA。
術語「可複製的表達載體」和「表達載體」指一段DNA序列，通常是雙鏈，其中可能插入了一段外來DNA。外來DNA定義成異源DNA，它不能在天然的宿主細胞中發現。載體用來將外來或異源DNA運輸入合適的宿主細胞。一旦進入宿主細胞，載體能不依賴於宿主染色體DNA而獨立複製，可能會產生幾個拷貝的載體及其插入(外來)的DNA。
術語「載體」指一種DNA構建物，它含有的DNA序列與能使DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列操作性相連。這些控制序列包括實現轉錄的啟動子、控制該轉錄的任選的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列，以及控制轉錄和翻譯終止的序列。載體可以是質粒、噬菌體顆粒、或簡單地是潛在的基因組插入物。一旦轉化到合適宿主中，該載體能不依賴於宿主基因組進行複製和起作用，或在一些情況下，其本身整合入基因組中。在本說明書中，「質粒」和「載體」有時可互換使用，因為質粒是目前最常用的載體形式。然而，本發明還包括起等價功能的其它形式的載體，它們是本領域中已知的。哺乳動物細胞培養表達的典型的表達載體例如以pRK5(EP307,247)，pSV16B(WO91/08291)和pVL1392(Pharmingen)為基礎。
「脂質體」是由不同種類的脂質、磷酯和/或表面活性劑組成的小的囊泡，它可用來相哺乳動物輸送藥物(例如本文公開的抗體突變體，以及任選的一種化療劑)。脂質體的組分通常排列成雙層形式，其與生物膜的脂質排列相似。
表達「控制序列」指在特定宿主生物體中表達DNA序列所必需的操作性相連的編碼序列。適用於原核生物的控制序列例如包括啟動子，任選的操縱子序列、和核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號和增強子。
「分離的」核酸分子是經鑑定並與抗體核酸天然來源中通常與其伴隨的至少一種汙染性核酸分子分開的核酸分子。一種分離的核酸分子與其天然發現的形式或環境中不同。因此，當其存在於天然細胞中時，分離的核酸分子能和核酸分子區分開來。然而，分離的核酸分子包括包含在通常表達抗體的細胞內的核酸分子(例如核酸分子在與其天然細胞中不同的染色體位置上)。
當核酸和另一核酸序列置於功能上相關的位置時，則稱核酸「操作性相連」。這可以是基因和調控序列，它們相連後允許在合適分子(轉錄激活蛋白)結合調控序列時表達基因。例如，如果它表達成前蛋白(preprotein)參與多肽的分泌，則將前序列(presequence)或分泌性前導序列的DNA與多肽DNA操作性相連；如果它影響序列的轉錄，則啟動子或增強子與編碼序列操作性相連；或如果它影響序列的轉錄，則核糖體結合位點與編碼序列操作性相連；或如果它放置的位置能促進翻譯，則核糖體結合位點和編碼序列操作性相連。通常，「操作性相連」指相連的DNA相連是毗鄰的，就分泌性前導序列而言，是毗鄰且在讀框內的。然而，增強子不一定要毗鄰。連接通過常規限制性位點處的連接來實現。如果這種位點不存在，則根據常規實踐採用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
「處理」指治療性處理和預防性措施。需要處理的患者包括已經患有疾病以及有待預防疾病的那些人。
「疾病」是可從本文多肽的處理獲益的任何病徵。這包括慢性和急性失調或疾病，包括使哺乳動物容易患該疾病的病理學症狀。
本文所用的用於輔助治療的術語「免疫抑制劑」指能抑制或掩蔽植入移植物的宿主的免疫系統的物質。這將包括抑制細胞因子產生、下調或抑制自身抗原表達、或掩蔽MHC抗原的物質。這些抗原的例子包括2-氨基-5-芳基-5-取代的嘧啶(見美國專利4,665,077)、咪唑硫嘌呤(或環磷醯胺，在咪唑硫嘌呤有副反應的情況下)；溴隱亭(bromocryptine)；戊二醛(掩蔽了MHC抗原，如美國專利No.4,120,649中所述)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環孢菌素A；類固醇如糖皮質類固醇，例如強的松、甲基強的松和地塞米松；細胞因子或細胞因子受體拮抗劑，包括抗幹擾素γ、β或α的抗體；抗腫瘤壞死因子α抗體；抗腫瘤壞死因子β抗體；抗白細胞介素-2抗體和IL-2受體抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；pan-T抗體，較佳的是抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LAF-3結合域的可溶性肽(WO90/08187，1990年7月26日公開)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素；納巴黴素；T細胞受體(美國專利5,114,721)；T細胞受體片段(Offner等人，Science 251430-432(1991)；WO90/11294；和WO91/01133)；和T細胞受體抗體(EP340,109)如T10B9。這些試劑可同時給予，或和CD11a抗體分開給予，並採用和現有技術描述的相同或較少的劑量。較佳的輔助性免疫抑制劑將取決於許多因素，包括待處理疾病的類型(包括進行移植的類型)、以及患者的病史，但是總體上來說，優先選擇環孢菌素A、糖皮質類固醇(最佳的是強的松或甲基強的松)、OKT-3單克隆抗體、咪唑硫嘌呤、溴隱亭、異源抗淋巴細胞球蛋白或它們的混合物。
術語「癌」或「癌的」是描述哺乳動物中典型特徵為無控制性的細胞生長的生理性症狀。癌症例子包括，但不局限於，癌、淋巴瘤、胚母細胞瘤、肉瘤和白血病。更特定的癌症例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腸胃癌、胰癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳房癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝細胞癌和各種類型的頭頸癌。
需要治療的「哺乳動物」指任何分類為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和農場動物、非人靈長類、以及動物園、運動場動物，或寵物，如狗、馬、貓、奶牛等。
本文所用的術語「標記的表位」指多肽與「表位標記」融合。表位標記多肽具有足夠的殘基來提供一個表位，針對該表位能夠製得抗體，但是該表位又短得足以不幹擾該多肽的活性。較佳的，表位標記也是相當獨特的，從而使針對它的抗體基本上不會和其它表位發生交叉反應。合適的標記多肽通常具有6個胺基酸殘基，通常在大約8-50個胺基酸殘基之間(較佳的在大約9-30個殘基之間)。例子包括flu HA標記多肽及其抗體12CA5(Field等人，Mol.Cell.Biol.82159-2165(1988))；c-myc標記和針對它的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體(Evan等人，Mol.Cell.Biol.5(12)3610-3616(1985))；以及單純性皰疹病毒糖蛋白D(gD)標記及其抗體(Paborsky等人，Protein Engineering 3(6)547-552(1990))。在某些實例中，表位標記是「補救受體結合表位」。
本文所用的術語「補救受體結合表位」指IgG分子(如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)Fc區的一個表位，它負責提高IgG分子的體內血清半衰期。
術語「細胞毒劑」在此指抑制或阻止細胞功能和/或導致細胞破壞的物質。該術語包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90、和Re186)、化療劑和毒素(例如來自細菌、真菌、植物或動物的酶促活性毒素或其片段)。
「化療劑」是用於治療癌症的化合物。化療劑包括例如阿黴素(Adriamycin)、阿黴素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(「Ara-C」)、環磷醯胺、塞替派、Taxotere(docetaxel)、Bulsulfan、細胞毒素(cytoxin)、紅豆杉醇、甲氨蝶呤、順氯銨鉑、美法侖、長春鹼、博來黴素、依託泊甙、異環磷醯胺、絲裂黴素C、米託蒽醌、長春新鹼、長春瑞賓(vinorelbine)、卡鉑、替尼泊甙、道諾黴素、洋紅黴素、氨基蝶呤、更生黴素、絲裂黴素、Esperamicins(參見美國專利4,675,187)、美法侖以及其它相關的氮芥。
本申請所用的術語「前體藥物(prodrug)」指藥學活性物質的前體或衍生形式，其對腫瘤細胞的細胞毒性低於親代藥物，並且能夠被酶促激活或轉化成較高活性的親代形式。例如參見Wilman，「癌症化療中的前體藥物」(Prodrugs in CancerChemotherapy)，Biochemical Society Transaction 14，375-382頁，第615次會議，Belfast(1986)和Stella等人，「前體藥物定靶藥物釋放的化學方法」(ProdrugAChemical Approach to Targeted Drug Delivery)，Directed Drug Delivery，Borchardt等編輯，247-267頁，Humana Press(1985)。本發明的前體藥物包括(但不限於)含磷酸鹽的前體藥物、含硫代磷酸鹽的前體藥物、含硫酸鹽的前體藥物、含肽的前體藥物、經D-胺基酸修飾的前體藥物、糖基化的前體藥物、含β內醯胺的前體藥物、含任選地取代的含苯氧基乙醯胺的前體藥物或任選地含取代的苯乙醯胺的前體藥物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前體藥物，它們可以被轉化為細胞毒性更高的游離藥物。可以衍生成為本發明所用前體藥物形式的細胞毒性藥物的例子，包括但不限於前文所述的化療劑。
本文所用的詞語「標記」指直接或間接與抗體偶聯的可檢測化合物或組合物。標記自身可以被檢測到(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或者，如果是酶標記，它們可催化化合物或組合物底物發生可檢測的化學轉變。
本文所用的術語「固相」指本發明抗體可粘附於其上的非水性基質。固相的例子在此包括部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和矽氧烷形成的固相。在某些實例中，根據上下文，固相可能包括測試板的孔；而在其它實例中，可能是純化柱(例如親和層析柱)。該術語還包括分散的顆粒構成的不連續固相，如美國專利No.4,275,149中所述的。
本文所用的術語「抗人IgE抗體」指能結合人IgE從而抑制或大大減少該IgE與高親和力受體FcεRI結合的抗體。較佳的該抗IgE抗體是E-25。
本文所用的術語「IgE介導的疾病」指特徵為過量產生IgE和/或對免疫球蛋白IgE超敏的症狀或疾病。它應被具體理解成包括與過敏性超敏反應和特應性過敏反應有關的，例如包括哮喘、變應性關節炎和結膜炎(枯草熱)、溼疹、蕁麻疹和食物過敏。然而，該術語的範圍也包括通常由於蜜蜂或蛇叮咬或母代藥物治療引起的嚴重的過敏性休克的生理性症狀。
「用噬菌體展示的親和力成熟(AMPD)」在此指Lowman等人在Biochemistry30(45)10832-10838(1991)中描述的方法，另見Hawkins等人，J.Mol.Biol.254889-896(1992)。儘管不嚴格局限於下列描述，該方法簡單如下使幾個超變區位點(例如6-7位點)突變，產生在每個位點所有可能的胺基酸替代。以單價方式從絲狀噬菌體顆粒中將如此產生的抗體突變體展示和包裝作為每個顆粒的M13的基因III產物的融合物。表達不同突變體的噬菌體可以循環通過多輪的結合選擇，然後對展示高親和力的那些突變體進行分離並測序。該方法在WO92/09690(1992年6月11日授權)中另有描述。Cunningham，B.C.等人在EMBO J.13(11)，2508-2515(1994)中描述包括合併親和力展示的改進的方法。
該方法提供了選擇新的結合性多肽的方法，該方法包括a)構建一個可複製的表達載體，該載體包含編碼多肽的第一基因，編碼至少一部分天然或野生型噬菌體包被蛋白的第二基因(其中第一和第二基因是異源的)，以及與第一和第二基因操作性相連的轉錄調控元件，從而形成編碼融合蛋白的基因融合物；b)在第一基因中一個或多個選定位置使載體突變，從而形成相關質粒的一個家族；c)用質粒轉化合適的宿主細胞；d)用具有編碼噬菌體包被蛋白基因的輔助噬菌體感染轉化的宿主細胞；e)在適合形成重組噬菌粒(該噬菌粒含有質粒的至少一部分並能轉化宿主)的條件下，培養轉化的感染的宿主細胞，，調節該條件使少量噬菌粒顆粒在顆粒表面上展示一個以上拷貝的融合蛋白；f)使噬菌粒顆粒和靶分子接觸，從而使噬菌粒顆粒的至少一部分結合靶分子；和g)分開結合與未結合的噬菌粒顆粒。較佳的，該方法還包括用結合靶分子的重組噬菌粒顆粒轉化合適的宿主細胞，並重複步驟d)至g)一次或多次。
另外，該方法包括由多個亞基組成的多肽，其中可複製表達載體包含的轉錄調控元件與編碼感興趣亞基的DNA操作性相連，將該亞基與噬菌體包被蛋白融合。
本文所用的術語「抗體噬菌體文庫」指用於上述以及Hawkins等人，J.Mol.Biol.254889-896(1992)、以及Lowman等人，Biochemistry 30(45)10832-10838(1991)中描述的親和力成熟方法的噬菌體文庫。每個文庫包含一個超變區(例如6-7個位點)所產生的所有可能的胺基酸替代。在絲狀噬菌體顆粒中以單價形式將這樣產生的抗體突變體展示成與包裝入每個顆粒並在噬菌體外部表達的M13的基因III產物的融合物。
本文所用的術語「室溫」或「環境溫度」應為23-25℃。
本文所用的術語「結合性多肽」指以可選擇的親和力結合靶分子的任何多肽。較佳的是，多肽將是最好含有超過約100個胺基酸殘基的蛋白。通常，多肽是激素或抗體或其片段。
本文所用的術語「高親和力」指在生理條件下，親和常數(Kd)小於10-5，較佳的是小於10-7M。
本文所用的術語「靶分子」指任何分子，不一定是蛋白質，希望針對該分子產生抗體或配體。然而，較佳的靶是蛋白，最佳的靶是抗原。然而，受體(例如激素受體)應特別包括在該術語範圍內。
如本文所用的，免疫球蛋白胺基酸殘基的所有編號(包括對應於IgE、突變型IgE分子以及本文出現的嵌合IgE分子的特異性部分的肽的胺基酸編號)是根據Kabat等人，感興趣的免疫球學蛋白的序列(National Institute of Health，Bethesda，MD 1987)中的免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統來進行編號的。
發明實施方式I.提高靶分子親和力的方法A.可異構化的天冬氨醯殘基的鑑定在實施本發明時，容易異構化的可異構化天冬氨醯殘基可用本領域普通技術人員已知的任何技術來鑑定。例如Cacia等人，Biochemistry 35，1897-1903(1996)中描述了一種方法，其中在37℃培育抗IgE抗體E-25(它含有-Asp-Gly-殘基)21天。對未經處理的和經蛋白酶處理的片段進行色譜和質譜分析，鑑定出異構化的-Asp-Gly-。由於已經報導天冬醯胺醯殘基會發生異構化(T.Geiger和S.Clarker，J.Biol.Chem.262(2)，785-794(1987))，本發明最好還進行系統性評價和改進含天冬醯胺醯殘基的多肽。
B.提高靶分子親和力的替換殘基的選擇本領域技術人員可以用許多技術來優化受體親和力。通常，這些技術全部涉及感興趣位點處的各種胺基酸殘基的替代，然後篩選分析突變型多肽的受體親和力。用於本發明的較佳的方法是採用噬菌體展示的親和力成熟(Hawkins等人，J.Mol.Biol.254889-896(1992)；Lowman等人，Biochemistry 30(45)10832-10838(1991))。簡言之，使幾個超變區位點(例如6-7個位點)發生突變，在每個位點產生所有可能的胺基酸替代。從絲狀噬菌體顆粒中以單價方式將如此產生的抗體突變體展示和包裝作為每個顆粒中的M13的基因III產物的融合物。表達不同突變體的噬菌體可循環通過數輪結合選擇，然後分離展示高親和力的那些突變體並測序。
選擇新的結合性多肽的方法宜採用結構上相關的多肽的文庫。和噬菌體包被蛋白融合的結構上相關的多肽的文庫通過誘變來產生，較佳的是，將單拷貝的每個相關多肽展示在含有編碼該多肽的DNA的噬菌粒顆粒表面上。然後使這些噬菌粒顆粒接觸靶分子，將對靶親和力最高的那些顆粒與親和力較低的顆粒分開。然後通過感染細菌宿主擴增高親和力結合物，並重複競爭性結合步驟。重複該方法直至獲得具有所需親和力的多肽。
另外，還可用多價噬菌體(McCafferty等人，(1990)，Nature 348，552-554；Clackson等人，(1991)，Nature 352，624-628)來表達隨機的點突變(用易錯DNA聚合酶)，以產生噬菌體抗體片段文庫，然後通過對抗原的親和力來篩選。Hawkins等人，(1992)，J.Mol.Biol.254889-896。
較佳的是，在親和力成熟方法中，可複製表達載體是在轉錄調控元件牢牢控制，並調節培育條件使顆粒表面展示多拷貝融合蛋白的噬菌粒顆粒數量或數目低於1％。另外較佳的是，展示多拷貝融合蛋白的噬菌粒顆粒數量少於展示單拷貝融合蛋白的噬菌粒顆粒數量的10％。最佳的該數量低於20％。
通常，在本發明的方法中，表達載體還含有與編碼多肽各亞基的DNA融合的分泌性信號序列，轉錄調控元件將是啟動子系統。較佳的啟動子系統選自LacZ，λPL，TC，T7聚合酶、色氨酸和鹼性磷酸酶啟動子以及它們的組合。
另外，第一基因通常編碼哺乳動物蛋白，較佳的是，蛋白是抗IgE抗體。II.A.＂抗體製備，(vi)多特異性抗體＂部分中列舉了其它抗體(但是應注意，該抗體不一定是多特異性的)。其它多肽包括人生長激素(hGH)、N-甲硫氨醯基人生長激素、牛生長激素、甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素原、鬆弛素A鏈、鬆弛素B鏈、鬆弛素原、糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(THS)和促黃體素(LH)、糖蛋白激素受體、降鈣素、胰高血糖素、因子VIII、肺表面活性物質、尿激酶、鏈激酶、人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、鈴蟾肽、因子IX、凝血酶、造血生長因子、腫瘤壞死因子α和β、腦啡肽酶、人血清白蛋白、米勒抑制性物質、小鼠促性腺素相關肽、微生物蛋白，如β內醯胺酶、組織因子蛋白、抑制素、活化素、血管內皮生長因子、激素或生長因子的受體、整聯蛋白、血小板生成素、蛋白A或D、類風溼因子、神經生長因子(如NGF-β)、血小板生長因子、轉化生長因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)、胰島素樣生長因子I和II、胰島素樣生長因子結合蛋白、CD-4、DNA酶、潛伏相關肽(latency associated peptide)、促紅細胞生成素、骨誘導因子(osteoinductive factor)、幹擾素(如幹擾素α、β和γ)、集落刺激因子(CSF)(如M-CSF、GM-CSF和G-CSF)、白細胞介素(IL)(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4)、超氧化物歧化酶、衰變加速因子、病毒抗原、HIV包膜蛋白如GP120、GP140、心鈉素A、B或C、免疫球蛋白、和上述任一蛋白的片段。
較佳的是，第一基因編碼的多肽具有一個或多個亞基，它含有大約100個以上的殘基並摺疊形成多個剛性二級結構，展示了多個胺基酸能和靶相互作用。較佳的是，第一基因將僅僅在對應於能和靶相互作用的胺基酸的密碼子處發生突變，這樣將能保留剛性二級結構的完整性。
通常，本發明的方法採用的輔助噬菌體選自M13KO7、M13R408、M13-VCS和Phi X 174。較佳的輔助噬菌體是M13KO7，較佳的包被蛋白是M13噬菌體基因II包被蛋白。較佳的宿主是大腸桿菌，以及蛋白酶缺陷的大腸桿菌株。已經檢測了本發明方法選出的新的hGH變體。構建噬菌粒表達載體，該載體含有可抑制的終止密碼子，其功能性地位於編碼多肽以及噬菌體包被蛋白的核酸之間。
1.展示在噬菌體表面上的多肽的選擇用重複的「多肽」選擇循環來選出越來越高的結合親和力，方法是用噬菌粒選擇多個胺基酸變化，用多個循環選擇來選擇。在第一輪噬菌粒選擇(涉及配體或抗體多肽中第一選擇區的胺基酸)後，在配體的其它區域或胺基酸上進行其它輪噬菌粒選擇。重複噬菌粒選擇循環，直至獲得所需的親和性質。為了描述該方法，實施例4中噬菌體展示以循環方式進行。合併親和力從不同CDR的組合突變等。
從上文可以理解，多肽結合結構域的胺基酸殘基不是連續連接的，可能在多肽的不同亞基上。即，結合區域與結合位點處的特定二級結構(而不是一級結構)相符。因此，通常是將突變導入編碼特定二級結構中從多肽內部指向外部的位點處胺基酸的密碼子，因此它們有和靶相互作用的可能。
然而，選擇作為針對靶分子的配體或抗體的通常不需要能和該靶結合。因此，例如，可選擇糖蛋白激素如TSH作為FSH受體的配體，在本發明的方法中用突變型TSH分子的文庫來產生新的候選藥物。
因此，本發明考慮了結合靶分子的任何多肽，尤其是抗體。較佳的多肽是具有製藥用途的那些多肽。抗體的例子在II.A.＂抗體的製備(iv)多特異性抗體＂部分(注意，抗體不必是多特異性的)中有所描述。更佳的多肽包括生長激素(包括人生長激素、脫-N-甲硫氨醯基人生長激素和牛生長激素)、甲狀旁腺激素、促甲狀腺激素、甲狀腺素、胰島素A鏈、胰島素B鏈、鬆弛素原、小鼠促性腺素相關肽、微生物蛋白(如β內醯胺酶)、組織因子蛋白、抑制素、活化素、血管內皮生長因子、激素或生長因子的受體、整聯蛋白、血小板生成素、蛋白A或D、類風溼因子、神經生長因子(如NGF-β)、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子(如aFGF和bFGF)、外皮生長因子、轉化生長因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β)、胰島素樣生長因子I和II、胰島素樣生長因子結合蛋白、CD-4、DNA酶、潛伏相關肽(latency associated peptide)、促紅細胞生成素、骨誘導因子(osteoinductive factor)、例如，HIV包膜蛋白的一部分、免疫球蛋白、和上述任一蛋白的片段。另外，例如多肽上的一個或多個預定的胺基酸殘基可以被替代、插入或缺失，產生生物性能改進的產物。另外，還包括這些多肽的片段，尤其是生物學活性片段。本發明的其它更佳的多肽是人生長激素和心鈉素A、B和C、內毒素、枯草溶菌素、胰蛋白酶和其它絲氨酸蛋白酶。
另外較佳的多肽激素是如下定義的任何胺基酸序列，它們產生於第一細胞中，特異性結合同一類細胞上的受體(自分泌激素)或第二種細胞的受體(非自分泌)，並引起攜帶受體的細胞特徵性生理應答。這些多肽激素是細胞因子、淋巴因子、神經營養激素和腺垂體多肽激素如生長激素、催乳素、胎盤催乳激素、促黃體素、促卵泡激素、β-促脂解素、γ-促脂解素和內啡肽、下丘腦釋放抑制激素如促皮質素釋放因子、生長激素釋放-抑制激素、生長激素-釋放因子；和其它多肽激素如心鈉素A、B或C。
2.獲得編碼所需多肽的第一基因(基因1)編碼所需多肽(如抗體)的基因可用本領域已知的方法獲得(大致參見，Sambrook等人，分子生物學實驗指南，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，(1989))。如果基因序列是已知的，則可用化學方法合成編碼基因的DNA(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149(1963))。如果基因序列未知，或如果該基因以前未被分離，則可從cDNA文庫(從表達所需基因的合適組織獲得的RNA製得)或合適的基因組DNA文庫克隆獲得。然後用合適的探針分離基因。對於cDNA文庫，合適的探針包括單克隆或多克隆抗體(只要該cDNA文庫是表達文庫)、寡核苷酸、以及互補的或同源的cDNA或其片段。可用來從基因組DNA文庫中分離感興趣基因的探針包括編碼相同或相似基因的cDNA或其片段、同源的基因組DNA或DNA片段、以及寡核苷酸。用Sambrook等人(同上)第10-12章描述的標準程序，用所選探針篩選cDNA或基因組文庫。
分離編碼感興趣多肽(例如抗體)的基因的另一種方法是用Sambrook等人(同上)14章中描述的聚合酶鏈反應方法(PCR)。該方法需要採用與感興趣基因雜交的寡核苷酸，因此，為了產生寡核苷酸，必須知道該基因的至少一些DNA序列。
在分離得到基因後，可將其插入擴增用合適載體(較佳的是質粒)，如Sambrook等人(同上)大致描述的那樣。
3.構建可複製的表達載體儘管可獲得幾種類型的載體並可用來實施本發明，但是質粒載體是此處所用的較佳的載體，因為它們的構建相對容易，並容易擴增。質粒載體通常含有各種組件，包括啟動子、信號序列、表型選擇基因、複製起始位點、以及本領域普通技術人員所知的其它必需的組件。
原核載體中最常用的啟動子包括lacZ啟動子系統、鹼性磷酸酶phoA啟動子、噬菌體λPL啟動子(溫度敏感型啟動子)、tac啟動子(受lac阻遏子調控的雜交的trp-lac啟動子)、色氨酸啟動子、以及噬菌體T7啟動子。關於啟動子的通常描述，參見Sambrook等人(同上)第17章。儘管這些是最常用的啟動子，但是也可採用其它合適的微生物啟動子。
用於實施本發明的較佳的啟動子是能牢牢調控從而控制融合基因表達的那些啟動子。如果表達不受控制，在噬菌粒表面上將產生多拷貝的融合蛋白，則可能靶和噬菌粒多點附著。認為該多點附著(也稱為「親合性」或「螯合效應」)會導致選出假的「高親和力」多肽(由於展示在噬菌粒顆粒上的多拷貝融合蛋白相互緊密毗鄰，從而「螯合」靶)。當發生多點附著時，有效或表觀Kd可能和每一拷貝的展示的融合蛋白的單個Kd的乘積一樣高。
通過牢牢調控融合蛋白的表達，從而使不超過少量(即少於約1％)的噬菌粒顆粒含有多拷貝融合蛋白，就克服了「螯合效應」，使得能合適地選擇高親和力多肽。因此，根據啟動子，調節宿主的培養條件使含有單拷貝融合蛋白的噬菌粒顆粒數最大，並使含有多拷貝融合蛋白的噬菌粒顆粒數最小。
用於實施本發明的較佳的啟動子是lacZ啟動子和phoA啟動子。lacZ啟動子受lac阻遏蛋白lac i調控，因此融合基因的轉錄能通過調節lac阻遏蛋白的水平來加以控制。通過此描述方法，使含有lac Z啟動子的噬菌粒在含有一拷貝lac i阻遏基因(lacZ啟動子的阻遏物)的細胞株中生長。含有lac i基因的典型的細胞株包括JM101和XL-1 blue。另外，宿主細胞可用含有阻遏物lac i和lac Z啟動子的質粒共同轉染。有時，上述兩種技術可同時採用，即使含有lac Z啟動子的噬菌粒顆粒在含有lac i基因的細胞株中生長，並用含有lac Z和lac i基因的質粒共轉染細胞株。通常當希望表達一個基因時，在上述轉染的宿主中加入一個誘導物如異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。然而，在本發明中，該步驟被刪除，以便(a)最大程度地減少每個噬菌粒數的基因III融合物的表達和(b)防止誘導物(如IPTG)即使在低濃度下引起的較差的或不合適的噬菌粒包裝。通常，在沒有加入誘導物時，每個噬菌粒顆粒的融合蛋白數量高於0.1(堆積(bulk)噬菌粒顆粒的融合蛋白數)。用來實施本發明的最佳的啟動子是pho A。認為該啟動子受細胞中無機磷酸鹽水平的調控，其中磷酸鹽起下調啟動子活性的作用。因此，通過損耗細胞中的磷酸鹽，啟動子的活性可以增加。通過使細胞在富含磷酸鹽的培養基(如2YT或LB)中生長來獲得所需的結果，從而控制基因III融合物的表達。
用於實施本發明的載體中另一個有用的組件是信號序列。該序列通常位於緊靠編碼融合蛋白基因的5′端，因此將轉錄到融合蛋白的氨基端。然而，在某些情況下，已經證實該信號序列位於除編碼待分泌蛋白的基因5′端外的其它位置。該序列使其連接的蛋白靶向通過細菌細胞的內膜。編碼信號序列的DNA可以從編碼具有信號序列的蛋白的任何基因中以限制性內切核酸酶片段的形式獲得。合適的原核信號序列可以從編碼(例如)LamB或OmpF(Wong等人，Gene 68；193(1983))，MaIE，PhoA的基因和其它基因獲得。實施本發明的一種較佳的原核信號序列是大腸桿菌熱穩定的腸毒素II(STII)信號序列(如Chang等人，Gene 55189(1987)中所述)。
用來實施本發明的載體的另一個有用的組件是表型選擇基因。典型的表型選擇基因是編碼的蛋白能賦予宿主細胞抗生素抗性的那些基因。作為描述，為了該目的可採用氨苄青黴素抗性基因(amp)和四環素(tet)抗性基因。
用Sambrook等人(同上)中描述的標準重組DNA程序製得包含上述組件以及編碼所需多肽的基因(基因1)的合適載體構建物。切割待組合而形成載體的分離的DNA片段、修飾並以特定次序和方向連接，產生所需的載體。
DNA用合適緩衝液中的合適限制性反應酶切割。通常，在大約20微升的緩衝液中，將大約1-2單位的合適的限制性酶用於大約0.2-1μg的質粒或DNA片段。合適的緩衝液、DNA濃度、以及培育時間和溫度由限制性酶的生產商指定。通常，37℃培育1至2小時就足夠了，但是有幾種酶需要更高的溫度。在培育後，用苯酚和氯仿混合液抽提消化溶液，除去酶和其它汙染物，通過乙醇沉澱從水性組分中回收DNA。
為了將DNA片段連接在一起形成功能性載體，DNA片段的末端必須相互相容。在某些情況下，末端在內切核酸酶消化後直接相容。然而，可能需要將內切核酸酶消化通常產生的粘性末端首先轉變成平頭來使它們適用於連接。為了使末端變平，用合適的緩衝液以及10單位DNA聚合酶I的Klenow片段(Klenow)在四種脫氧核苷三磷酸存在下15℃處理DNA至少15分鐘。然後用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉澱純化DNA。
經切割的DNA片段可用DNA凝膠電泳來作大小來分離和選擇。DNA可以電泳通過瓊脂糖或聚丙烯醯胺基質。基質的選擇取決於待分離DNA片段的大小。在電泳後，用電泳洗脫從基質中抽提出DNA，或如果已經用熔點低的瓊脂糖作為基質，則可融化瓊脂糖並從中抽提出DNA(如Sambrook等人(同上)6.30-6.33章所述)。
將大約等摩爾量的待連接在一起的DNA片段(先用合適的限制性酶消化，使得待連接的每個片段的末端相容)放入溶液中。該溶液中還含有ATP、連接酶緩衝液以及連接酶(如T4 DNA，10單位/0.5μgDNA)。如果要將DNA片段連接入載體中，則首先用合適的限制性內切核酸酶切割使載體線性化。然後用鹼性磷酸酶或小牛腸磷酸酶處理線性化的載體。磷酸化防止了連接步驟期間載體自身連接。
在連接後，將現在插入了外來基因的載體轉化入合適的宿主細胞中。對於本發明來說，原核細胞是較佳的宿主細胞。合適的原核宿主細胞包括大腸桿菌株M101、大腸桿菌株294(ATCC號31,446)、大腸桿菌株W3110(ATCC號27,325)、大腸桿菌X1776(ATCC號31,537)、大腸桿菌XL-1 Blue(stratagene)和大腸桿菌B；然而，也可採用大腸桿菌的其它許多菌株例如HB101、NM522、NM538、NM539以及其它許多種屬的原核細胞。除了上述的大腸桿菌株系外，也可用桿菌如枯草芽胞桿菌、其它腸桿菌如鼠傷寒桿菌或粘質沙雷菌以及各種假單胞菌屬作為宿主。
原核細胞的轉化很容易用Sambrook等人(同上)1.82章節描述的氯化鈣方法來實現。或者，可用電穿孔來轉化這些細胞(Neumann等人，EMBO J.1841(1982))。通過在抗生素(通常是四環素(tet)或氨苄青黴素(amp))上的生長來選擇轉化的細胞，由於載體上存在的tet和/或amp抗性基因而賦予轉化細胞抗性。
在選出轉化的細胞後，使這些細胞在培養基中生長，然後分離質粒DNA(或插入了外來基因的其它載體)。質粒DNA可用本領域已知的方法來分離。兩種合適的方法是如Sambrook等人(同上)1.25-1.33章節中描述的小規模DNA製備和大規模DNA製備方法。然後用本領域已知的方法(如Sambrook等人(同上)1.40章節中描述的方法)純化分離的DNA。然後用限制性圖譜和/或DNA測序分析該純化的質粒DNA。DNA測序通常用Messing等人，Nucleic Acids Res.9309(1981)中的方法或用Maxam等人，Meth.Enzymol.65499(1980)中的方法來進行。
4.基因融合本發明的噬菌體親和步驟打算將包括所需多肽的基因(基因1)和第二個基因(基因2)融合，從而在轉錄時產生融合基因。基因2通常是噬菌體的包被蛋白基因，較佳的是噬菌體M13包被蛋白基因III或其片段。基因1和2的融合可通過將基因2插入含基因1質粒中特定位點內來實現，或通過將基因1插入含基因2質粒中特定位點內來實現。
將基因插入質粒內需要使質粒在插入基因的精確位置處切開。因此，在該位點必須有限制性內切核酸酶位點(較佳的是一個唯一的位點，這樣質粒在被限制性內切核酸酶消化時只有一個位置被切開)。如上所述對質粒進行消化、磷酸化和純化。然後將兩個DNA連接在一起，將基因插入該線性化質粒內。如果質粒的末端與待插入基因的末端相容，則實現連接。如果用相同的限制性酶切割質粒以及分離的待插入的基因，則用連接酶(如噬菌體T4 DNA連接酶)並在ATP和連接酶緩衝液存在下於16℃培育混合物1-4小時，就可將DNA直接連接在一起(如Sambrook等人(同上)1.68章所述)。如果末端不相容，則必須首先用DNA聚合酶I的Klenow片段或噬菌體T4DNA聚合酶將它們變成平頭，這兩種聚合酶均需要四種脫氧核糖核苷三磷酸來填平消化的DNA的懸垂的單鏈末端。或者，可以用核酸酶(如核酸酶S1)或綠豆核酸酶將末端變平，這兩種酶的功能是將DNA懸垂的單鏈切去。然後如上所述用連接酶重新連接DNA。在某些情況下，可能不能將待插入基因的末端變平，因為這樣會改變編碼區的讀框。為了克服這個問題，可採用寡核苷酸接頭。接頭作為橋梁來連接質粒和待插入基因。這些接頭可用標準方法合成製成雙鏈或單鏈DNA。接頭的一個末端與待插入基因的末端相容；首先用上述連接方法連接接頭和該基因。設計接頭另一末端使其和連接用質粒相容。在設計接頭時，必須小心不要破壞待插入基因的讀框或質粒中所含基因的讀框。在某些情況下，可能需要設計接頭，從而使它們編碼胺基酸的一部分或編碼一個或多個胺基酸。
在基因1和基因2之間可以插入終止密碼子，例如終止密碼子UAG(琥珀)、UAA(赭石)和UGA(乳白)(Microbiology，Davis等人，Harper Row，New York，1980，237頁，245-247頁以及274頁)。終止密碼子在野生型宿主細胞中的表達導致合成基因1蛋白產物而沒有連接基因2蛋白。然而，在抑制性宿主細胞中的生長導致合成可檢測量的融合蛋白。該抑制性宿主細胞含有tRNA，該tRNA經修飾在mRNA的終止密碼子位置中插入了一個胺基酸，從而導致產生可檢測量的融合蛋白。這些抑制性宿主細胞是眾所周知的，並且在Bullock等人，BioTechnologies 5，376-379(1987)中有所描述，例如大腸桿菌抑制性菌株。可採用任何可接收的方法將終止密碼子放入編碼融合多肽的mRNA中。
在編碼多肽的第一基因以及編碼至少一部分噬菌體包被蛋白的第二基因之間可以插入可抑制密碼子。或者，通過取代多肽中最後一個胺基酸三聯體或噬菌體包被蛋白中第一個胺基酸，將可抑制的終止密碼子插入毗鄰融合位點處。當含有可抑制密碼子的噬菌粒在抑制性宿主細胞中生長時，它產生可檢測量的含有多肽以及包被蛋白的融合多肽。當噬菌粒在非抑制性宿主細胞中生長時，由於插入的可抑制的三聯體密碼UAG、UAA或UGA的終止作用，合成的多肽基本上不和噬菌體包被蛋白融合。在無抑制性細胞中，由於不存在融合的噬菌體包被蛋白，合成的多肽從宿主細胞中分泌出來(否則它會附著在宿主細胞上)。
5.基因1在選定位置上的改變(突變)編碼所需多肽的基因1的一個或多個所選密碼子可以改變。然而，對應於可異構化的天冬氨酸殘基的密碼子必須改變。改變定義為編碼多肽的基因中一個或多個密碼子發生替代、缺失或插入，從而導致多肽的胺基酸序列與未改變的相同多肽的天然序列相比有所改變。較佳的是，這種改變是用其它任何胺基酸代替分子一個或多個區域中的至少一個胺基酸。改變可用本領域已知的各種方法來產生。這些方法包括(但不局限於)寡核苷酸介導的誘變以及盒式誘變。
a.寡核苷酸介導的誘變寡核苷酸介導的誘變是用來製備基因1的替代型、缺失型和插入型變體的較佳的方法。該技術是本領域所熟知的，如Zoller等人，Nucleic Acids Res 196487-6504(1987)所述。簡言之，基因1這樣來改變使編碼所需突變的寡核苷酸與DNA模板雜交，該模板是單鏈形式的質粒，含有基因1的未改變的或天然的DNA序列。雜交後，用DNA聚合酶合成模板的整個第二條互補鏈，從而摻入了該寡核苷酸引物並編碼基因1中所選的變化。
通常，採用的寡核苷酸的長度至少為25個核苷酸。最優的寡核苷酸是在突變的核苷酸編碼兩側均有12至15個和模板完全互補的核苷酸。這確保寡核苷酸能與單鏈DNA模板分子合適地雜交。用例如Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA755765(1978)中描述的本領域已知的技術很容易合成寡核苷酸。
DNA模板只能用從噬菌體M13載體(通常獲得的M13mp18和M13mp19載體是合適的)衍生的那些載體、或是含有單鏈噬菌體複製起點的那些載體來產生(如Viera等人，Meth.Enzymol.1533(1987)中所述)。因此，待突變的DNA必須插入這些載體之一內以便產生一個單鏈模板。單鏈模板的產生在Sambrook等人(同上)4.21-4.41章節中有所描述。
為了改變天然的DNA序列，在合適的雜交條件下使寡核苷酸和單鏈模板雜交。然後加入DNA聚合酶(通常是DNA聚合酶I的Klenow片段)，用寡核苷酸作為合成引物，合成模板的互補鏈。這樣形成了異源雙鏈體，一條DNA鏈編碼突變型基因1，另一條鏈(原來的模板)編碼天然的未改變的基因1的序列。然後將該異源雙鏈體分子轉化入合適的宿主細胞(通常是原核細胞如大腸桿菌JM-101)。在細胞生長後，將它們接種到瓊脂糖平板上，用32P放射性標記的寡核苷酸引物篩選，以鑑定含有突變DNA的細菌菌落。
可對上面描述的方法進行修改，從而產生一個同源雙鏈體分子，其中質粒的兩條鏈含有突變。修改如下如上所述使單鏈寡核苷酸和單鏈模板退火。將三種脫氧核糖核苷酸(脫氧核糖腺苷酸(dATP)、脫氧核糖鳥苷酸(dGTP)和脫氧核糖胸苷酸(dTTP))和經修飾的硫代脫氧核糖胞苷酸(稱為dCTP-(aS)，Amersham)合併。將該混合物加入模板寡核苷酸複合物中。在該混合物中加入DNA聚合酶後，產生了除突變鹼基外與模板相同的DNA鏈。另外，這條新的DNA鏈將含有dCTP-(aS)代替dCTP，其作用是保護它以免限制性內切核酸酶消化。在異源雙鏈體的模板鏈被合適的限制性酶切開後，可以用ExoIII核酸酶或其它合適的核酸酶消化模板鏈通過含有已誘變位點的區域。然後終止反應，留下只有部分單鏈的分子。然後用DNA聚合酶在所有四種脫氧核糖核苷三磷酸、ATP以及DNA連接酶存在下形成完全雙鏈的DNA同源雙鏈體。然後可以如上所述將該同源雙鏈體分子轉化入合適的宿主細胞(如大腸桿菌JM101)中。
一個以上胺基酸被替代的突變體可用幾種方法來產生。如果胺基酸在多肽鏈中緊靠在一起，可用一條編碼所有所需胺基酸替代的寡核苷酸同時進行突變。但是，如果胺基酸相互之間相隔一定距離(相隔超過10個胺基酸)，則更難產生一條編碼所有所需變化的寡核苷酸。而是，可以用一種或兩種替換方法。
第一種方法是，對於每個待替代的胺基酸各產生一條分開的寡核苷酸。然後使諸寡核苷酸和單鏈模板DNA同時退火，從模板上合成的第二鏈DNA將編碼所有所需的胺基酸替代。另一種方法涉及用兩輪或多輪誘變來產生所需的突變體。第一輪如單突變體所述那樣用野生型DNA作為模板，使編碼第一個所需胺基酸替代的寡核苷酸和該模板退火，然後產生異源雙鏈體DNA分子。第二輪誘變採用第一輪誘變中產生的突變的DNA作為模板。因此，該模板已經含有一個或多個突變。然後使編碼其它所需胺基酸替代的寡核苷酸和該模板退火，現在得到的DNA鏈編碼了第一和第二輪誘變的突變。該所需的DNA可用作第三輪誘變中的模板，如此類推。
b.盒式誘變該方法也是一種製備基因1的替代型、缺失型、和插入型變體的較佳的方法。該方法根據的是Wells等人，Gene 34315(1985)中描述的方法。起始材料是包含基因1(待突變的基因)的質粒(或其它載體)。鑑定待突變的基因1中的密碼子。在鑑定的突變位點的兩側必須有一個唯一的限制性內切核酸酶位點。如果沒有這樣的限制性位點存在，則可以用上述寡核苷酸介導的誘變方法來產生，以將它們導入基因1中合適的位置內。在限制性位點已經導入質粒內後，在這些位點切割質粒，使其線性化。用標準程序合成編碼限制性位點之間DNA序列(但含有所需的突變)的雙鏈寡核苷酸。分開合成兩條鏈，然後用標準技術將它們雜交在一起。該雙鏈寡核苷酸稱為盒。該盒被設計成3′和5′端與線性化質粒末端兩相容，這樣它能直接連接質粒。現在該質粒含有基因1的突變的DNA序列。
6.獲得編碼所需蛋白的DNA在另一個實例中，本發明包括產生含有一個或多個亞基的所需蛋白的變體。每個亞基通常由分開的基因編碼。編碼每個亞基的每個基因能用本領域已知的方法獲得(例如見部分II)。在某些情況下，可能需要用選自本文章節II中所述方法的分離技術來獲得編碼不同亞基的基因。
在構建含有一個以上亞基的感興趣蛋白可複製表達載體時，所有亞基可由相同的啟動子來調控(該啟動子通常位於編碼亞基的DNA的5′)，或每個亞基可以由相同的啟動子來調控(該啟動子通常位於編碼亞基的DNA的5′)，或每個亞基可以由在載體中合適取向的分開的啟動子來調控，使得每個啟動子和待調控的DNA操作性相連。啟動子的選擇如上文章節III中所述那樣進行。
在構建含有編碼具有多個亞基的感興趣蛋白的DNA的可複製表達載體時，讀者可參看圖11，該圖通過描述圖示了該載體，圖中顯示了編碼抗體片段每個亞基的DNA。該圖大致表明，感興趣蛋白的一個亞基將和噬菌體包被蛋白(如M13基因III)融合。該基因融合物通常含有其自身信號序列。分開的基因編碼其它的亞基，顯然每個亞基通常都具有其自身的信號序列。圖11還顯示單個啟動子能調控兩個亞基的表達。或者，每個亞基可以受不同啟動子獨立調控。感興趣蛋白亞基-噬菌體包被蛋白融合構建物可以如上文章節IV所述那樣製得。
在構建所需多亞基蛋白變體家族時，載體中編碼各亞基的DNA可以在各亞基的一個或多個位置上發生突變。在構建多亞基抗體變體時，較佳的誘變位點對應於編碼位於輕鏈、重鏈或兩條鏈互補決定區(CDR)內胺基酸殘基的密碼子。CDR通常指超變區。誘變編碼感興趣蛋白各亞基DNA的方法基本上如上文章節V所述那樣進行。
7.製備靶分子並和噬菌粒結合靶蛋白(如受體)可以分離自天然來源，或用本領域已知的程序用重組方法製得。通過描述，糖蛋白激素受體可用McFarland等人，Science 245494-499(1989)中描述的技術製得，大腸桿菌中表達的非糖基化形式如Fuh等人，J.Biol.Chem.2653111-3115(1990)中所述那樣。其它受體可用標準方法製得。
純化的靶蛋白可以和合適的基質(如瓊脂糖珠、丙烯醯胺珠、玻璃珠、纖維素、各種丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸羥烷酯凝膠、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龍、中性和離子性載體等)連接。靶蛋白和基質的連接可用如Methods in Enzymol.44(1976)中描述的方法或本領域已知的其它方法來實現。
在靶蛋白連接基質後，在適合噬菌粒顆粒的至少一部分與固定化靶標結合的條件下，使固定化的靶標與噬菌體克隆文庫接觸。通常，該條件(包括pH、離子強度、溫度等)將模擬生理條件。
對固定化靶標高親和力的結合的噬菌粒顆粒(「結合物」)通過洗滌和低親和力的那些分開。結合物可用各種方法從固定化靶標上解離下來。這些方法包括用各種方法從固定化靶標上競爭性解離下來。這些方法包括用野生型配體的競爭性解離、改變pH和/離子強度以及本領域已知的方法。
用結合物和輔助噬菌體感染合適的宿主細胞，在適合擴增噬菌粒顆粒的條件下培育該宿主細胞。然後收集噬菌粒顆粒，重複該選擇步驟一次或多次，直至收集到對靶分子具有所需親和力的結合物。
任選地，噬菌粒顆粒文庫可以依次和多個固定化靶標接觸，以提高對特定靶標的選擇性。例如，通常的情況是，配體(如hGH)具有多個天然受體。在hGH的例子中，生長激素受體和催乳素受體均結合hGH配體。可能希望使hGH對生長激素受體的選擇性高於對催乳素受體的選擇性。這可以這樣實現首先使噬菌粒顆粒文庫接觸固定化的催乳素受體，洗脫出對催乳素受體親和力低(即低於野生型hGH)的那些，然後使催乳素親和力低的「結合物」或未結合物與固定化的生長激素受體接觸，然後選擇高親和力的生長激素受體結合物。在這種情況下，對催乳素受體親和力較低的hGH突變體將具有治療用途，即使其對生長激素受體的親和力稍微低於野生型hGH。相同的策略也可用來使特定激素或蛋白對其一級功能受體的選擇性高於對其清除性受體的選擇性。
在本發明的另一個實例中，可以獲得一種改進的底物胺基酸序列。它們可用來為蛋白接頭製得更佳的「切割位點」，或用於更佳的蛋白酶底物/抑制劑。在該實例中，將固定化分子(如hGH)受體、生物素-親和素、或能和基質共價連接的分子通過一個接頭和基因III融合。該接頭的長度宜為3-10個胺基酸，它將作為蛋白酶的底物。噬菌粒將如上所述那樣構建，其中使編碼接頭區域的DNA隨機突變，以產生連接位點有不同胺基酸序列的隨機化的噬菌粒顆粒文庫。然後將該噬菌粒顆粒文庫固定在基質上，並接觸所需的蛋白酶。在線性區域內具有所需蛋白酶的較佳底物胺基酸序列的噬菌粒顆粒將被洗脫出來，首先產生編碼較佳接頭的噬菌粒顆粒的富集合併物。然後使這些噬菌粒顆粒循環幾次，產生編碼共有序列的顆粒的富集合併物。
II.抗體的產生起始抗體可用本領域中可獲得的技術或產生這種抗體的技術製得。產生抗體的典型方法在下文中有更詳細的描述。
抗體針對感興趣的抗原。較佳的，抗原是在生物學上重要的多肽，將其抗體給予患某種疾病或失調的哺乳動物會導致在該哺乳動物體內產生治療效果。然而，本發明還包括針對非多肽抗原(如腫瘤相關糖脂抗原，見美國專利5,091,178)的抗體。
當抗原是多肽時，它可以是跨膜分子(如受體)或配體(如生長因子)。典型的抗原包括分子如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；胰高血糖素；凝血因子如蛋白C；心鈉素；肺表面活性物質；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活劑(tPA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α和β；腦啡肽酶；RANTES趨化因子(活化後可調節的、正常T細胞表達並分泌的因子)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；米勒抑制性物質；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺素相關肽；微生物蛋白；如β內醯胺酶；DNA酶；IgE，一種細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D；類風溼因子、神經營養因子(如骨衍生神經神經營養因子BDNF)、神經營養蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神經生長因子如NGF-β、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細胞生長因子(如aFGF和bFGF)；外皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)(如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5)；胰島素樣生長因子I和II(IGF-1和IGF-11)，des(1-3)-IGF-1(腦IGF-1)；胰島素樣生長因子結合蛋白；CD-4蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD9和CD20；促紅細胞生成素；骨誘導因子(osteoinductive factor)；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；幹擾素如幹擾素-α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細胞介素(Il)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；整聯蛋白如CD11a，CD11b，CD11c，CD18和ICAM，VLA-4和VCAM；腫瘤相關抗原如HER2、HER3或HER4受體；上述任一肽的片段。
本發明包括的抗體的較佳分子靶包括CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；ErbB受體家族成員，如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細胞附著分子，如LFA-1、Mac12、p150，95，VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整聯蛋白，包括其α或β亞基(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗體)；生長因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flk3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4；蛋白C等。一種特別佳的靶標是IgE。
抗體針對從第一種哺乳動物衍生的抗原而產生。較佳的，第一種哺乳動物是人。然而，也可考慮其它哺乳動物，如農場動物、寵物或動物園動物，例如在要用這種抗體用來治療這些哺乳動物時。第一種哺乳動物的抗原可以從其天然來源分離獲得，以便產生針對它的抗體。然而，如下所述，可用包含該抗原的細胞作免疫原來製備抗體。在其它實例中，抗原用重組方法或其它合成方法製得。選出的抗體通常對抗原有足夠強的結合親和力。例如，抗體可以不超過約1×10-7M(較佳的不超過1×10-8，最佳的不超過約1×10-9M)的結合親和力(Kd)數值結合第一種哺乳動物的抗原。抗體親和力例如可用飽和結合；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)；以及競爭性試驗(如RIA)來測定。
另外，可對抗體作其它生物活性試驗，例如來評價其作為治療劑的效力。這些試驗是本領域已知的，取決於靶抗原和抗體的預期用途。例子包括角化細胞單層粘附試驗和針對CD11a的混合淋巴細胞應答(MFR)試驗(在下文實施例中均有描述)；腫瘤生長抑制試驗(如WO98/06692中描述的)；抗體依賴型細胞毒性(ADCD)和補體介導的細胞毒性(CDC)試驗(美國專利5,500,362)；以及拮抗劑活性或血細胞生成試驗(見WO95/27062)。
為了篩選能結合感興趣抗原特定表位的抗體(例如封閉MHM24抗體結合的那些)，可進行如《抗體實驗指南》Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow和David Lane編輯(1988)中描述的常規的交叉封閉試驗。或者，可進行如Champe等人，J.Biol.Chem.2701388-1394(1995)中描述的表位圖譜，來確定抗體是否結合感興趣的表位。
然後測定抗體對動物種類的依賴性。用上述技術評估抗體對用來產生抗體的抗原的同系物(該同系物來自第二種哺乳動物)的結合親和力。在較佳的實例中，第二種哺乳動物是非人哺乳動物，在臨床前期研究中將抗體給予該動物。因此，第二種哺乳動物可以是非人靈長類，如恆猴、獼猴、狒狒、黑猩猩和短尾猿。在其它實例中，第二種哺乳動物例如可以是嚙齒類動物、貓或狗。通常，依賴於動物種類的抗體對第二種非人哺乳動物抗原的結合親和力比其對第一種哺乳動物抗原的結合親和力至少弱大約50倍、或至少弱大約500倍或至少弱大約100倍。該結合親和力通常是不能有效應用的依賴於動物種類的那類抗體對於第二種哺乳動物體內的臨床前期研究。
儘管本發明中測定動物種類依賴性(以及評價具有改進性能的抗體突變體；見下文)的較佳的方法是定量測定抗體結合親和力，但是在本發明的其它實例中，除了或代之以結合親和力測定外，還評價了依賴於動物種類的抗體和抗體突變體的一種或多種生物性質。典型的這些生物試驗如上所述。當這些試驗指明了抗體的治療效力時，它們是特別有用的。通常，在這些試驗中顯示出性能有所改進的抗體也會具有增強的結合親和力(但不一定)。因此，在本發明的一個實例中，當所選試驗是結合親和力試驗以外的生物活性試驗時，採用第二種哺乳動物的「材料」(例如抗原、細胞、組織、器官或整個動物)時依賴於動物種類的抗體通常具有「生物活性」，該活性的效果比其在採用來自第一種哺乳動物的製劑的對應試驗中生物活性低至少約50倍，或至少低500倍，或至少低約1000倍。
然後改變依賴於動物種類的抗體，以產生對第二種哺乳動物抗原的結合親和力比依賴於動物種類的抗體更強的抗體突變體。較佳的是，該抗體突變體對非人哺乳動物抗原的結合親和力比依賴於動物種類抗體對抗原的結合親和力強至少約10倍，較佳的強至少約20倍、更佳的強至少約500倍，有時至少強約100倍或200倍。所需的結合親和力的增強將取決於依賴於動物種類的抗體的最初的結合親和力。然而，所用的試驗是生物活性試驗，較佳的是抗體突變體在所選試驗中的生物活性比依賴於動物種類的抗體在該試驗的生物活性至少高大約100倍，較佳的至少好約20倍，更佳的至少好大約50倍，有時至少好大約100倍或200倍。
為了產生抗體突變體，在依賴於動物種類的抗體的構架區殘基中可以導入一個或多個胺基酸變化(例如替代)(例如替代被導入一個或多個變化中)，其結果是抗體突變體對第二種哺乳動物抗原的結合親和力有所改進。用來修飾的構架區殘基的例子包括直接非共價結合抗原的殘基(Amit等人，Science 233747-753(1986))；與CDR構型相互作用或影響該構型的殘基(Chothia等人，J.Mol.Biol.196901-917(1987))；和/或參與VL-VH界面的殘基(EP239400B1)。在某些實例中，一個或多個這些構架區殘基的修飾導致抗體針對第二種哺乳動物的抗原的結合親和力有所增強。例如，在本發明的該實例中，約1至5個構架區殘基可以改變。有時，這足以產生適合用於臨床前期試驗的抗體突變體，即使沒有一個超變區殘基發生改變。但是，抗體突變體通常將包括額外的超變區變化。
發生改變的超變區殘基可以隨機變化，尤其是當依賴於動物種類的抗體對第二種哺乳動物的初始結合親和力是能容易篩選出隨機產生的抗體突變體的那類親和力。
下文描述了用來產生依賴於動物種類因而需要修飾的抗體技術A.抗體的製備(i)抗原的製備任選地偶聯於其它分子的可溶性抗原或其片段，可用作產生抗體的免疫原。對於跨膜分子(如受體、這些受體的片段(例如受體的胞外結構域))可用作免疫原。或者，表達跨膜分子的細胞可用作免疫原。這些細胞可以從天然來源(例如癌細胞系)衍生獲得，或可以是經重組技術表達跨膜分子的轉化細胞。用來製備抗體的其它抗原及其形式對於本領域技術人員來說是顯而易見的。
(ii)多克隆抗體多克隆抗體宜通過多次皮下(sc)注射或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑在非人哺乳動物中產生。用雙功能或衍生化試劑可以將相關抗原和在待免疫接種動物中有免疫原性的蛋白(例如匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)偶聯，這些衍生試劑例如是馬來醯亞胺苯甲醯硫代琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、亞硫醯氯或R1N＝C＝R(其中R和R1是不同的烷基基團)。
用抗原、免疫原性偶聯物或衍生物免疫動物混合100微克或5微克蛋白或偶聯物(分別針對家兔或小鼠)和3體積的弗氏完全佐劑，並將溶液注射入真皮內多個部位。1個月後，用弗氏完全佐劑中肽或偶聯物初始用量的1/5至1/10皮下多點注射加強免疫動物。7-14天後，對動物取血，測定血清的抗體滴度。對動物加強免疫，直至達到滴度平穩。較佳的是，用相同抗原、但偶聯了不同蛋白和/或通過不同交聯劑偶聯的偶聯物對動物加強免疫。偶聯物還可在重組細胞培育蛋白融合物中製得。另外，可適當採用聚集試劑(如明礬)來增強免疫應答。
所選的哺乳動物抗體通常對抗原有足夠強的結合親和力。例如，抗體能以不高於大約1×10-7M(較佳的不高於大約1×10-8，最佳的不高於大約1×10-9M)的結合親和力(Kd)數值結合人抗IgE抗原。抗體親和力可用飽和結合；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)以及競爭性試驗(例如放射性免疫試驗)來測定。
為了篩選人抗IgE抗體，可以進行如《抗體實驗指南》Cold Spring HarborLaboratory，Harlow和David Lane編輯(1988)中描述的常規的交叉連接試驗。或者，可進行如Champe等人，J.Biol.Chem.2701388-1394(1995)中描述的表位圖譜來確定結合。
儘管測定多肽或抗體效力的較佳的方法是通過定量測定抗體結合親和力，但是除了或代之以結合親和力測定外，其它實例預計也能評價抗體的一種或多種性質。當這些試驗指明了抗體的治療效力時，它們是特別有用的。通常，在這些試驗中顯示出性能有所改進的抗體也會具有增強的結合親和力(但不一定)。
(iii)單克隆抗體單克隆抗體是識別單個抗原性位點的抗體。它們均一的特異性使得單克隆抗體比通常含有識別各種不同抗原性位點的抗體的多克隆抗體有用得多。
單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等人，Nature，256495(1975)首先提出)製得，或可用重組DNA方法(例如參見美國專利No.4,816,567)製得。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動物(如倉鼠或獼猴)，以誘導淋巴細胞，而淋巴細胞產生或能產生特異性結合免疫接種用蛋白的抗體。或者，淋巴細胞可在體外受免疫。然後用合適的融合劑(如聚乙二醇)來融合淋巴細胞和骨髓瘤細胞，形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，59-103頁(Academic Press，1986))。
將這樣製得的雜交瘤細胞接種到合適的培養基中，使其生長，該培養基中最好含有一種或多種抑制未融合親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺少次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤培養基中通常加入了次黃嘌呤、氨基碟呤和胸苷(HAT培養基)，這些物質抑制了HGPRT缺陷型細胞的生長。
較佳的骨髓瘤細胞是能有效融合、支持所選抗體生成細胞穩定而高水平產生抗體、且對諸如HAT培養基之類的培養基敏感的那些細胞。其中較佳的骨髓瘤細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系，如從MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤(購自Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California USA)衍生的細胞系和SP-2或X63-Ag8-653細胞(購自美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland USA)。另外，用來生產人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細胞系也已有所描述(Kozbar，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal antibody Production Techniques andApplications，51-63頁(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
測定雜交瘤細胞生長的培養液中有無針對抗原的單克隆抗體產生。較佳的是，雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性宜通過免疫沉澱或體外結合試驗(如放射性免疫試驗(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA))來測定。
在鑑定出產生具有所需特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細胞後，可通過有限稀釋程序亞克隆該克隆，並用標準方法使其生長(Goding，《單克隆抗體理論和實踐》，59-103頁，Academic Press，1986)。用於此目的的合適的培養基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可作為動物體內腹水腫瘤在體內生長。
用常規的免疫球蛋白純化步驟(如蛋白A-Sepharose，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析)，將亞克隆分泌的單克隆抗體適當地從培養基、腹水體液或血清中分離出來。
很容易分離獲得編碼單克隆抗體的DNA並用常規步驟對其測序(例如，用能與編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是此類DNA的較佳來源。一旦分離出後，可將DNA放入表達載體中，然後將該載體轉移到宿主細胞(如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞)中，在重組宿主細胞中獲得合成的單克隆抗體。抗體的重組生產在下文有更詳細地描述。
在另一個實例中，可以採用McCafferty等人，Nature，348552-554(1990)所述的技術從產生的抗體噬菌體文庫中分離獲得抗體或抗體片段。Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫來分離鼠和人抗體。以後的出版物描述了通過鏈改組(Marks等人，Bio/Technology，10779-783(1992))、以及組合性感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))，來生產高親和力(nM範圍)的人抗體。因此，這些方法是分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的可行的變化方案。
也可對DNA進行修飾，例如通過用人重鏈和輕鏈恆定區的編碼序列來代替同源的鼠序列(美國專利No.4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851(1984))，或共價連接到免疫球蛋白多肽。
通常，這些非免疫球蛋白多肽取代了抗體的恆定區，或者它們取代了抗體中一個抗原結合位點的可變區，產生了一個嵌合的二價抗體，該抗體包含對一個抗原有特異性的抗原結合位點和對一不同抗原有特異性的另一個抗原結合位點。
(iv)抗體突變體的產生一旦鑑定並分離了依賴於動物種類的抗體，它通常被用來產生抗體變體或突變體，其中哺乳動物抗體中一個或多個超變區中的一個或多個胺基酸殘基發生改變。或者，或另外，在哺乳動物抗體中可導入一個或多個構架區殘基變化(例如替代)，而這些變化導致抗體突變體對人IgE的結合親和力有所改進。用來修飾的構架區殘基的例子包括直接非共價結合抗原的殘基(Amit等人，Science 233747-753(1986))；與CDR構型相互作用或影響該構型的殘基(Chothia等人，J.Mol.Biol.196901-917(1987))；和/或參與VL-VH界面的殘基(EP239 400B1)。在某些實例中，一個或多個這類構架區殘基的修飾導致抗體針對人抗原的結合親和力有所增強。例如，在本發明的該實例中，約1至5個構架區殘基可以改變。有時，這足以產生適合用於臨床前期試驗的抗體突變體，即使沒有一個超變區殘基發生改變。但是，抗體突變體通常將包括額外的超變區變化。
發生改變的超變區殘基可以隨機變化，尤其是當依賴於動物種類的抗體的初始結合親和力是能容易篩選出隨機產生的抗體突變體的那些。
一種有用的產生抗體突變體的方法稱為「丙氨酸掃描誘變」(Cunningham，B.C.和Wells，J.A.Science 2441081-1085(1989)；Cunningham，B.C.和Wells，J.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，6434-6437(1991))。在此，用丙氨酸或聚丙氨酸殘基取代一個或多個超變區殘基，來影響胺基酸和第二種哺乳動物抗原的相互作用。那些在功能上表現出對替代敏感的超變區殘基再通過在替換位點處引入進一步的或其他的突變來精製(refine)。這樣，儘管引入胺基酸序列變異的位點是預先確定的，但是突變本身的性質不必預先確定。如本文所述，篩選以這種方式產生的丙氨酸突變體是否有生物活性。用其它胺基酸可嘗試類似的替代，這取決於掃描殘基能否賦予的所需的性能。
本發明還提供了更系統性的方法來鑑定待修飾的胺基酸殘基。根據該方法，鑑定處依賴於動物種類的抗體中涉及結合第一種哺乳動物抗原的超變區殘基以及涉及結合第二種哺乳動物的該抗原同系物的那些超變區殘基。為了實現這個目的，可以用丙氨酸掃描依賴於動物種類的抗體的超變區殘基，測試每個丙氨酸突變體與第一和第二種哺乳動物抗原的結合。從而鑑定出涉及結合第一種哺乳動物(例如人)抗原的超變區殘基和涉及結合第二種哺乳動物(例如非人)此抗原同系物的那些超變區殘基。較佳的是，選擇明顯參與結合第二種哺乳動物(如非人類哺乳動物)抗原、但不結合第一種哺乳動物(如人)抗原的那些殘基作為修飾的候選物。在另一個實例中，選擇明顯參與結合第一和第二種哺乳動物抗原的那些殘基來進行修飾。在還有一個但不是較佳的實例中，選擇參與結合人IgE抗原、但不結合同系的哺乳動物(非人)IgE的那些殘基進行修飾。這些修飾可包括殘基缺失或毗鄰感興趣殘基處插入一個或多個殘基。然而，修飾通常涉及用另一胺基酸替代該殘基。
通常，可以從表A標題「較佳的替代」中所示的那些保守性替代開始。如果這種替代導致生物活性(如結合親和力)改變，那麼可引入表A中「典型替代」所命名的、或如下文按胺基酸類型進一步描述的更充實的改變，然後篩選產物。
表A胺基酸殘基的保守性替代
通過選擇在下列方面效應明顯不同的替代來在抗體生物性質中實現更充實的修飾(a)維持替代區域中多肽骨架的結構，例如摺疊或螺旋構型；(b)維持靶位置處分子的電荷或疏水性；或(c)維持側鏈體積。根據共同的側鏈性質，天然存在的殘基被分成下列幾類(1)疏水的正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水的cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性的asp，glu；(4)鹼性的his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基gly，pro；和(6)芳香類的trp，tyr，phe.
非保守性取代需要用這些類別中一類的某種胺基酸替換另一類的某種胺基酸。
編碼胺基酸序列突變體的核酸分子可用本領域中已知的各種方法來製得。這些方法包括，但不局限於，對早期製得的突變體或非突變型依賴於動物種類的抗體進行寡核苷酸介導的(定點)誘變、PCR誘變或盒式誘變。製備突變體的較佳的方法是定點誘變(見Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488，1985)。
在某些實例中，抗體突變體只有單個超變區殘基被替代，例如從大約2個到515個超變區替代。
通常，生物性質有所改進的抗體突變體的胺基酸序列和哺乳動物抗人IgE抗體重鏈或輕鏈可變區的胺基酸序列有至少75％的胺基酸序列相同性或相似性(較佳的至少80％，更佳的至少85％，還要佳的至少90％，最佳的為至少95％)。該序列的相同性或相似性在此定義成在序列排列對齊並引入空隙(如果需要)從而達到最大的序列相同百分比之後，候選序列中和依賴於動物種類的抗體殘基中相同(即同一殘基)或相似(即根據上文共同側鏈性質的同一組中的胺基酸)的胺基酸殘基百分數。
或者，抗體突變體可通過抗IgE抗體重鏈和輕鏈的CDR區域系統性突變來產生。產生這些抗體突變體的較佳的方法包括採用噬菌體展示的親和力成熟(Hawkins等人，J.Mol.Biol.254889-896(1992)和Lowman等人，Biochemistry 30(45)10832-10838(1991))。已經知道，噬菌體包被蛋白融合可用來關聯展示的蛋白或肽的表型和編碼它們的噬菌體顆粒基因型(Smith，Science 2281315(1985)；Scott和Smith，Science249386(1990)；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8309(1990)；Devlin等人，Science 249404(1990)；Wells和Lowman，Curr.Opin.Struct.Biol.2597(1997)中的回顧；美國專利5,223,409(1990))。抗體的F(ab)結構域也已經被展示在噬菌體上(McCafferty等人，Nature 348552(1990)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA887978(1991)；Garrard等人，Biotechnol.91373(1991))。
單價噬菌體展示包括將一組蛋白變體展示成和噬菌體包被蛋白的融合物，從而將變體的展示限制在僅僅幾個噬菌體顆粒才有一個拷貝(Bass等人，Proteins8309(1990))。以前已經通過連續應用誘變、單價噬菌體展示、功能性分析以及加入有利的突變而實現了親和力成熟或改進了各種蛋白的平衡結合親和力，例如以人生長激素(Lowman Wells，J.Mol.Biol.234564-578(1993)；美國專利5,534,617)，或以抗體的F(ab)結構域(Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA913809(1994)；Yang等人，J.Mol.Biol.254392(1995))為例子。
在噬菌體顆粒上可以構建許多(106)蛋白變體(它們在序列中不同的指定位置上有所不同)的文庫。每一個顆粒含有編碼該特定蛋白變體的DNA。在親和力純化多輪後，用固定的抗原分離出個別噬菌體克隆，從它們的DNA推導出它們展示的蛋白的胺基酸序列。
(a)人源化和人抗體人源化是一種製備嵌合抗體的技術，其中基本上不到一個完整的人可變區被非人種類的對應序列替代。人源化抗體中導入了一個或多個非人源胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基通常被稱為「導入的」殘基，它們通常取自「導入的」可變區。人源化可基本上根據Winter及其合作者(Jones等人，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，2391534-1536(1988))所述的方法來進行，用嚙齒類互補決定區(CDR)或CDR序列來取代人抗體的對應序列。因此，這些「人源化」抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567)，其中基本上不到一個完整的人可變區被非人動物的對應序列取代。如本發明所實踐的，人源化抗體有一些CDR殘基以及可能還有一些FR殘基被鼠抗體中類似部位的殘基取代。
選擇人輕鏈和重鏈可變區用來製備人源化抗體對於降低抗原性來說是非常重要的。根據所謂的「最佳配合」方法，用已知的人可變區序列的整個文庫來篩選嚙齒類抗體的可變區序列。然後，採用最接近嚙齒類的人序列作為人源化抗體的人構架區(Sims等人，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法採用衍生自所有人抗體輕鏈或重鏈特定亞組共有序列的特定構架。同一構架區可用於幾個不同的人源化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等人，J.Immnol.，1512623(1993))。
更重要的是，抗體的人源化應保留對抗原的高親和力以及其它有利的生物性能。為達到這一目的，一個較佳方法是，通過親代序列和人源化序列的三維模型分析親代序列和各種概念上(conceptual)的人源化產物來製得人源化抗體。根據具有相似序列的F(ab)結構，分別從共有序列構建特定抗體結構域(例如VH和VL結構域)的模型。免疫球蛋白的三維模型是本領域技術人員通常能獲得的和熟知的。可得到能描述和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式。觀察這些顯示結果，就能分析殘基在候選免疫球蛋白序列中可能起的作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合能力的殘基。例如，在實施例2中製作片段F(ab)-12的模型時，用鼠MAE11作為模板來啟發待修飾的CDR和構架殘基的靈感，並結合分子模型來獲得突變體序列。
可以提到的另一個例子是對照抗體Mab4d5。在這裡，以Brookhaven蛋白資料庫的幾個Fab結構為基礎構建了該模型(條目1FB4、2RHE、2MCP、3FAB、1FBJ、2HFL和1REI)。首先，選擇F(ab)片段KOL(Marquart，M等人，J.Mol.Biol.141369-391(1980))作為VL和VH結構域的模板，然後利用它們的主鏈原子坐標(INSIGHT程序，Biosym Technologies)將另外的結構疊加在該結構上。利用類似的程序和技術來製作所需抗體的模型。
採用分子模型的一種典型分析可如下進行對每個給定的殘基位置計算各疊加結構中模板Cα和類似物Cα之間的距離。通常，如果對於給定的殘基而言，所有(或幾乎所有)的Cα-Cα距離均小於等於1，那麼該位置被包括在共有結構內。在某些情況下，β摺疊構架殘基將滿足這些標準，而CDR環卻不能。對每個這些選定殘基計算個別N、Cα、C和O以及Cβ原子的平均坐標，用商業上可獲得的程序(例如DISCOVER程序(Biosym Technologies))和AMBER力場通過50輪能量減到最小法的校正所得到的與非標準鍵幾何結構的偏差(Weiner，S，J，等人，J.Amer.Chem.Soc.106765-784(1984))，然後固定Cα坐標。然後將高度保守殘基的側鏈(例如二硫鍵橋半胱氨酸殘基)摻入所得的共有結構中。然後，摻入特定抗體VL和VH結構域的序列，以CDR殘基為開始，用Chothia等人(Chothia，C.等人，Nature 342877-883(1989))的CDR構型列表作為指南。根據Fab晶體結構、旋轉異構體文庫(Ponder，J.W.Richards，F.M.，J.Mol.Biol.193775-791(1987))以及填充因素來選擇側鏈構型。由於VH-CDR3不可能用上述標準來指定，因此可以用INSIGHT程序搜尋大小相似的環來產生模型，用堆積和溶劑接觸因素(solvent exposure consideration)來衍生，或用其它常規的和商業上能獲得的技術來產生。較佳的是使該模型經歷能量減到最小法5000輪。
這樣，可以從接受序列和導入序列選擇獲得構架殘基並組合，從而獲得所需的抗體性能，例如對靶抗原的親和力提高。通常，CDR殘基直接並最基本地參與影響抗原結合。在實施例2中產生F(ab)-12時採用了該技術，其中使用了鼠CDR殘基的組合，與分子模型結合產生人源化的鼠抗IgE抗體片段。
另外，現在已經可以生產能在免疫後產生人抗體全部組成但不產生內源性免疫球蛋白的轉基因動物(例如小鼠)。例如，已經描述了嵌合的和種系突變型小鼠中抗體重鏈連接區(JH)純合缺失導致內源性抗體產生完全被抑制。將人種系免疫球蛋白陣列轉移到這些種系突變型小鼠中會在抗原攻擊時導致產生人抗體。Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.733(1993)；和Duchosal等人，Nature 355258(1992)。人抗體也可從噬菌體展示文庫衍生獲得(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222581-597(1991)；Vaughan等人，NatureBiotech 14(1996))。
(b)額外的修飾在產生抗體突變體後，測定該分子相對於依賴於動物種類的抗體的生物活性。如上所述，這可能包括測定抗體的結合親和力和/或抗體的其它生物活性。在本發明的一個較佳的實例中，如上製得一組抗體突變體，並篩選其對第二種哺乳動物抗原的結合親和力。對從該初次篩選選出的一種或多種抗體突變體任選地進行一個或多個生物活性試驗，以確認具有增強的結合親和力的抗體突變體確實可用於(例如)臨床前期研究。在較佳的實例中，抗體突變體保留了結合第一種哺乳動物抗原的能力，此結合親和力與依賴於動物種類的抗體相似。這可通過避免改變參與抗人抗體結合抗原的可變區殘基來實現。在其它實例中，抗體突變體對第一種哺乳動物(抗原)的結合親和力明顯改變(例如對該抗原的結合親和力最好是比依賴於動物種類的抗體好，但也可能比它差)。
可對這樣選出的抗體作進一步修飾，這通常取決於抗體的預期用途。這些修飾可包括進一步改變胺基酸序列、與異源多肽融合和/或共價修飾(如下文所述的)。關於胺基酸序列變化，上文描述了典型的修飾。例如，未參與維持抗體突變體合適構型的任何半胱氨酸殘基也可以被替代(通常被絲氨酸替代)，以改進分子的氧化穩定性並防止異常的交聯。相反，(a)抗體中可以加入半胱氨酸鍵以改進其穩定性(特別是當抗體是抗體片段(如Fv片段)時)。另一類胺基酸突變體具有改變的糖基化方式。這可通過抗體中發現的一個或多個糖部分缺失，和/或加入抗體中不存在的一個或多個糖基化位點來實現。抗體的糖基化通常是N或O相連。N相連指糖部分連接在天冬醯胺殘基的側鏈上。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸以及天冬醯胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何胺基酸)是糖部分酶促連接到天冬醯胺側鏈上的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列的存在產生了一個潛在的糖基化位點。O相連的糖基化是指，糖通過醚氧連接；例如，N-乙醯葡糖胺、半乳糖、巖藻糖或木糖與羥基胺基酸(最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但是也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸)鍵合。在抗體中加入糖基化位點可通過改變胺基酸序列，從而使其含有一個或多個上述三肽序列(對於N相連的糖基化位點來說)來方便地實現。改變還可通過在原來抗體序列中加入或代之以一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來製得(對於O相連的糖基化位點來說)。
(v)抗體片段製備抗體片段的各種技術已經發展起來。在傳統上，這些片段是通過完整抗體的蛋白酶消化來獲得的(例如參見，Morimoto等人，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan等人，Science，22981(1985))。然而，現在這些片段可用重組宿主細胞來直接製得。例如，如上所述，抗體片段可從抗體噬菌體文庫中分離獲得。或者，可從大腸桿菌中直接回收得到F(ab′)2-SH片段，並化學交聯形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology 10163-167(1992))。根據另一種方法，F(ab′)片段可直接從重組宿主細胞培養中分離獲得。製備抗體片段的其它方法對於本領域技術人員來說是顯而易見的。在其它實例中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。(PCT專利申請WO93/16185)。
(vi)多特異性抗體多特異性抗體對至少兩種不同抗原有結合特異性。儘管這些分子通常只結合兩種抗原(即為雙特異性抗體，BsAb)，但是具有額外特異性的抗體如三特異性抗體也包括在本文所用的該表達含義內。BsAb的例子包括一個臂針對某腫瘤細胞抗原、另一個臂針對細胞毒性觸發分子的那些抗體，如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗惡性B細胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗腎細胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗結腸癌)、抗CD3/抗促黑素細胞激素類似物、抗EGF受體/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神經細胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗葉酸結合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛(pan)癌相關抗原(AMOC-31)/抗CD3；一個臂特異性結合腫瘤抗原、一個臂結合毒素的雙特異性抗體，如抗皂草素/抗ID-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻蛋白A鏈、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻蛋白A鏈、抗幹擾素-α(IFN-α)/抗雜交瘤獨特型、抗CEA/抗長春花生物鹼；轉變酶激活前體藥物的雙特異性抗體，如抗CD30/抗鹼性磷酸酶(催化絲裂黴素磷酸前體藥物變成絲裂黴素醇)；可用作纖溶劑的雙特異性抗體，如抗纖維蛋白/抗組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、抗纖維蛋白/抗尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)、用來將免疫複合物靶向細胞表面受體的雙特異性抗體，例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受體(如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)、用來治療感染性疾病的雙特異性抗體，如抗CD3/抗單純皰疹病毒(HSV)、抗T細胞受體CD3複合物/抗流感病毒、抗FcγRI/抗HIV、用來體外或體內腫瘤檢測的雙特異性抗體，如抗CEA/抗-EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作為疫苗佐劑的雙特異性抗體；以及用作診斷工具的雙特異性抗體，如抗家兔IgG/抗轉鐵蛋白、抗辣根過氧化物酶(HRP)/抗激素、抗抑生長素/抗P物質、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β半乳糖苷酶。三特異性抗體的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。雙特異性抗體可以製成全長抗體或抗體片段(例如F(ab′)2雙特異性抗體)。
製備雙特異性抗體的方法是該領域中已知的。製備全長雙特異性抗體的傳統方法是根據兩個具有不同特異性的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對共同表達(Millstein等人，Nature，305537-539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四雜交物)可能產生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種有正確的雙特異性結構。正確分子的純化通常採用親和層析方法，這是相當費力的，且產物得率很低。WO93/08829以及Traunecker等人，EMBO J.103655-3659(1991)公開了類似的方法。
根據不同的方法，使具有所需結合特異性的抗體可變區(抗體-抗原結合位點)與免疫球蛋白恆定區序列融合。最好與免疫球蛋白重鏈恆定區融合，至少包括部分鉸鏈區、CH2和CH3區。最好是至少在一個融合物中有含輕鏈結合所需位點的第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及免疫球蛋白輕鏈(如果需要)的DNA插入分開的表達載體中，並且共同轉染入合適的宿主生物體中。在構建時採用不相等比例的三種多肽鏈來提供最優得率的實例中，這為調節三個多肽片段相互比例提供了很大的靈活性。然而，當至少兩個多肽鏈以相等比例表達導致高產率，或比例無關緊要時，可以將兩個或所有三個多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
在該方法的一個較佳實例中，雙特異性抗體由一個臂中具有第一結合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈和另一臂中的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。發現這種不對稱的結構有利於將所需的雙特異性抗體從不需要的免疫球蛋白鏈組合物中分離出來，因為免疫球蛋白輕鏈只存在於雙特異性分子的一半中，這提供了容易分離的方式。該方法公開在WO94/04690中。關於產生雙特異性抗體的更詳細的情況例如可參見Suresh等人，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據WO96/27011中描述的另一種方法，一對抗體分子間的界面可經工程改造成使得從重組細胞培養中回收穫得的異二聚物達到最大的百分數。較佳的界面包含抗體恆定區CH3結構域的至少一部分。在該方法中，第一抗體分子界面上的一個或多個胺基酸小側鏈被較大的側鏈(如酪氨酸或色氨酸)代替。通過用較小的側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)來代替大的胺基酸側鏈，在第二抗體分子的界面上形成與大側鏈大小相同或相似的補償「空穴」。這樣就提供了一個使得異二聚物的產率高於其它不需要產物(如均二聚物)的方法。
雙特異性抗體包括交聯的或「異偶聯」的抗體。例如，異偶聯物中的一個抗體可以與親和素結合，另一個與生物素結合。例如，已有建議用這種抗體來使免疫系統細胞靶向不需要的細胞(美國專利No.4,676,980)以及用來治療HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。異偶聯抗體可用任何方便的交聯方法來製得。合適的交聯劑是本領域中已知的，美國專利No.4,676,980中公開了合適的交聯劑以及許多交聯技術。
從抗體片段製備雙特異性抗體的方法在文獻中也已有所描述。例如，可通過化學鍵來製備雙特異性抗體。Brennan等人，Science，22981(1985)描述了這樣一種方法，其中將完整的抗體蛋白水解斷裂成F(ab′)2片段。在二巰基複合試劑亞砷酸鈉存在下還原這些片段，使連位(vincinal)二巰基穩定，並防止分子間形成二硫鍵。然後將產生的Fab′片段轉變成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然後，通過巰基乙胺還原將一個Fab′-TNB衍生物重新轉變成Fab′-巰基，再與另一個Fab′-TNB衍生物等摩爾量混合形成雙特異性抗體。製得的雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。
最近的進展實現了從大腸桿菌中直接回收穫得可化學交聯形成雙特異性抗體的Fab′-SH片段。Shalaby等人，J.Exp.Med.，175217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的製備過程。使各Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來，然後在體外進行定向化學交聯，形成雙特異性抗體。這樣形成的雙特異性抗體能結合過度表達ErbB2受體的細胞和正常的人T細胞，並觸發人細胞毒性淋巴細胞對人乳房腫瘤靶的裂解活性。
直接從重組細胞培養製備和分離雙特異性抗體片段的各種方法已有描述。例如，利用亮氨酸拉鏈可製得雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。通過基因融合，使Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩個不同抗體的Fab′部分連接。在鉸鏈區還原抗體均二聚物，形成單體，然後重新氧化形成抗體異二聚物。該方法也可用來製備抗體均二聚物。Hollinger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中描述的「二抗體」技術為製備雙特異性抗體片段提供了另一種機制。這些片段包括通過一個接頭將重鏈可變區(VH)連接到輕鏈可變區(VL)，該接頭非常短，使得同一鏈上的兩個結構域之間不能發生配對。因此，一個片段上的VH和VL結構域被迫與另一片段上的互補VL和VH結構域配對，從而形成了兩個抗原結合位點。採用單鏈Fv(sFv)二聚物製備雙特異性抗體片段的另一種策略也已有報導。見Gruger等人，J.Immunol.，1525368(1994)。
也可考慮採用具有兩價以上的抗體。例如，可製得三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol.14760(1991)。
(vii)效應器功能的工程改造在效應器功能方面可能希望改進本發明的抗體，以增強抗體(例如)結合IgE的效果。例如，可在Fc區域中引入半胱氨酸殘基，從而在該區域中形成鏈間二硫鍵。這樣製得的均二聚抗體可能有改進的內化能力和/或提高的補體介導細胞殺傷能力和依賴於抗體的細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1993)。或者，可將抗體工程改造成具有雙Fc區，從而可能增強的補體裂解和ADCC能力。見Stevenson等人，Anti-Cancer DrugDesign 3219-230(1989)。
(viii)免疫偶聯物本發明還涉及包含與細胞毒性製劑偶聯的本文所述抗體的免疫偶聯物，細胞毒性製劑例如是化療劑、毒素(如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，或其片段)、或放射活性同位素(即放射偶聯物)。
用來產生這些免疫偶聯物的化療劑在上文已有描述。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠濃桿菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、α-八疊球菌、Aleurites fordii蛋白、香石竹(dianthin)蛋白、Phytolaca americana蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、momordica charantia抑制劑、箭毒素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、gelonin、mitogellin、局限麴黴素、酚黴素、伊諾黴素和tricothecenes。各种放射性核素可用來製備放射性偶聯的抗體。例子包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
抗體與細胞毒性劑的偶聯物可用各種雙功能蛋白偶聯劑製得，偶聯劑例如是N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亞氨酸酯的雙功能衍生物(如己二亞氨酸二甲酯(dimethyl adipimidate)HCL)、活性酯(如辛二酸琥珀醯亞胺酯)、醛(如戊二醛)、二疊氮化合物(如二-對-(疊氮苯甲醯基)己二胺)、二重氮衍生物(如二-對-(重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可根據Vitetta等Science2381098(1987)所述的那樣製備蓖麻毒素免疫毒素。C-14標記的1-異硫氰酸基苯基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用來偶聯放射性核苷酸與抗體的典型的螯合劑。見WO94/11026。
在另一個實例中，抗體可以與「受體」(如鏈黴親和素)偶聯，用來預先靶向腫瘤，其中將抗體-受體偶聯物給予患者，然後用清除劑從循環中除去未結合的偶聯物，再給予與細胞毒性試劑(如放射性核苷酸)偶聯的「配體」(如親和素)。
(ix)免疫脂質體本文公開的抗體突變體也可配製成免疫脂質體。含有抗體的脂質體的製備方法是本領域中已知的，如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；和美國專利No.4,485,045和4,544,545。美國專利No.5,013,556中公開了循環時間增加的脂質體。
特別有用的脂質體可通過反向蒸發方法用包含卵磷脂、膽固醇和PEG衍生的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物製得。將脂質體擠壓通過限定孔徑的濾膜，獲得有所需直徑的脂質體。本發明抗體的Fab′片段可如Martin等人，J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所述的那樣通過二硫鍵互換反應與脂質體偶聯。脂質體中可以任選地含有化療劑(如阿黴素)。見Gabizon等人，J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
(x)依賴於抗體的酶介導的前體藥物治療(ADEPT)將抗體與激活前體藥物的酶(能將前體藥物(如肽基化療劑，見WO81/01145)轉變成有活性的抗癌藥)偶聯，本發明的抗體還可用於ADEPT。例如參見WO88/07378和美國專利No.4,975,278。
用於ADEPT的免疫偶聯物的酶成分，包括能作用於前體藥物將其轉變成更具活性和細胞毒性形式的酶。
用於本發明方法的酶包括(但不局限於)用於將含磷酸酯的前體藥物轉變成游離藥物的鹼性磷酸酶；用於將含硫酸酯的前體藥物轉變成游離藥物的芳基硫酸酯酶；用於將無毒性5-氟胞嘧啶轉變成抗癌藥物(5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脫氨酶；用於將含肽前體藥物轉變成游離藥物的蛋白酶，如鋸齒(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)；用於轉變含D-胺基酸取代基的前體藥物的D-丙氨醯羧肽酶；用於將糖基化前體藥物轉變成游離藥物的糖斷裂酶，如β-半乳糖苷酶和神經氨酸酶；用於將β-內醯胺衍生的藥物轉變成游離藥物的β-內醯胺酶；以及用於將胺基氮分別經苯氧乙醯基或苯乙醯基衍生的藥物轉變成游離藥物的青黴素醯胺酶，如青黴素V醯胺酶或青黴素G醯胺酶。或者，可用具有酶活性的抗體(也稱為抗體酶(abzyme))將本發明的前體藥物轉變成游離的活性藥物(Massey，Nature 328457-458(1987))。抗體-抗體酶偶聯物可如本文所述的那樣製得，以將抗體酶遞送至腫瘤細胞群中。
利用本領域已知的技術(如用上述的異雙功能交聯劑)使本發明的酶與抗體突變體共價結合。或者，利用本領域中熟知的重組DNA技術(Neuberger等人，Nature，312604-608(1984))，可以構建出融合蛋白，它包含本發明抗體的至少抗原結合區和與之相連的本發明酶的至少一個功能活性部分。
(xi)抗體補救性受體結合表位融合在本發明的某些實例中，可能希望採用抗體片段而不是完整的抗體，例如來提高腫瘤穿透(penetration)。在這種情況下，可能希望對抗體片段進行修飾，以提高其血清半衰期。例如，這可通過在抗體片段中摻入補救受體結合表位來實現(例如，通過抗體片段中合適區域內的突變，或通過在肽尾端中摻入此表位，然後通過DNA或肽合成融合入抗體片段末端或中部)。
較佳的，補救受體結合表位宜構成一個區域，其中Fc區的一個或兩個環的任何一個或多個胺基酸殘基被轉移到抗體片段的類似位置上。更佳的是，Fc區中一個或兩個環的三個或更多殘基被轉移。還要佳的是，此表位取自(例如IgG的)Fc區中CH2區，並被轉移到抗體CH1、CH3或VH區、或一個以上的此類區域中。或者，此表位取自Fc區的CH2區，並被轉移到抗體片段的CL區或VL區或這兩者中。
(xii)抗體的其它共價修飾抗體的共價修飾包括在本發明的範圍內。它們可以通過化學合成製得或通過抗體的酶促或化學斷裂製得(如果適用的話)。通過使抗體所靶向的胺基酸殘基和能與所選側鏈或N或C端殘基反應的有機衍生劑反應，將抗體其它類型的共價修飾導入該分子內。
最通常是使半胱氨醯殘基與α-滷代乙酸酯(以及對應的胺)(如氯乙酸或氯乙醯胺)起反應，產生羧甲基或羧基醯胺基甲基衍生物。半胱氨醯殘基還可通過和下列物質反應來衍生溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對-氯汞基苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚、或氯-7-硝基苯並-2--1，3-二唑。
組氨醯基殘基通過和二乙基焦碳酸(diethylpyrocarbonate)在pH5.5-7.0下反應來衍生，因為該試劑對組氨醯基側鏈有相對特異性。還可用對溴苯甲醯甲基化溴；該反應宜在pH6.0的0.1M卡可酸鈉中進行。
賴氨醯基和氨基端殘基和琥珀酸酐或其它羧酸酸酐反應。這些試劑的衍生處理具有逆轉賴氨醯基殘基電荷的效應。衍生處理含α氨基的殘基的其它合適試劑包括亞氨酸酯，如吡啶亞氨酸甲酯(methyl picolinimidate)、吡哆醛磷酸、吡哆醛、氯氫硼化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2，4-戊二酮和轉氨酶催化的和乙醛酸反應。
精氨醯基殘基通過與一種或幾種常規試劑反應來修飾，它們是苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環己二酮和水合茚三酮。精氨酸殘基的衍生處理需要反應在鹼性條件下進行，因為胍官能團的pKa高。另外，這些試劑可以和賴氨酸基團以及精氨酸的ε氨基基團反應。
酪氨醯基殘基的特異性修飾可以這樣進行，特別感興趣的是通過和芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記導入酪氨醯基殘基內。最常見的是，分別用N-乙醯咪唑和四硝基甲烷來形成O-乙醯酪氨醯基種類和3-硝基衍生物。用125I或131I使酪氨醯基殘基碘化，來製備用於放射性免疫試驗的標記蛋白。
羧基側基團(天冬氨醯基或穀氨醯基)通過和碳化二亞胺(R-N＝C＝C-R′)反應來選擇性修飾，其中R和R′是不同的烷基基團，例如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-(4-氮-4，4-二甲基苯基)碳化二亞胺。另外，天冬氨醯基和穀氨醯殘基通過和銨離子反應轉變成天冬醯胺醯基和穀氨醯胺醯基殘基。
穀氨醯胺醯基和天冬醯胺醯基有時會脫醯胺化，分別變成對應的穀氨醯基和天冬氨醯基。這些殘基在中性或鹼性條件下脫醯胺。這些殘基的脫醯胺形式在本發明的範圍內。
其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化、絲氨醯基或蘇氨醯基殘基的羥基磷酸化、賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈α氨基的甲基化(T.E.Creighton，《蛋白質結構和分子性質》，W.H.FreemanCo.San Francisco，79-86頁(1983))、N端胺的乙醯化、以及任一C端羧基的醯胺化。
其它類型的共價修飾包括用化學和酶方法偶聯糖苷於抗體。這些程序的優點在於，它們不需要在宿主細胞中產生具有N或O相連糖基化能力的抗體。根據採用的偶聯方式，糖可以和下列物質連接(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離的羧基；(c)游離的巰基，如半胱氨酸的巰基；(d)游離的羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的羥基；(e)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的芳族殘基；或(f)穀氨醯胺的醯胺基團。這些方法在1987年9月11日公開的WO87/05330中，以及Aplin和Wriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，259-306(1981)中有所描述。
除去抗體中的糖部分可用化學方法或酶方法來實現。化學去糖基化需要抗體接觸化合物三氟甲烷磺酸或等價的化合物。該處理導致大多數或除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)外所有的糖均斷裂，同時保持抗體完整。Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)以及Edge等人，Anal.Biochem.118131(1981)中描述了化學去糖基化。酶法斷裂抗體上的糖部分可以用Thotakura等人，Meth.Enzymol.138350(1987)中描述的各種外切和內切糖苷酶來實現。
抗體的其它類型的共價修飾包括以美國專利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中描述的方式連接抗體和各種非蛋白類聚合物之一(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)。
B.載體、宿主細胞和重組方法本發明還提供了編碼本文公開的抗體突變體的分離的核酸、包含該核酸的載體和宿主細胞，以及用來製備該抗體突變體的重組方法。
抗體突變體的重組生產方法是，分離獲得編碼抗體的核酸並插入可複製的載體中作進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼單克隆抗體突變體的DNA很容易分離並用常規步驟來測序(如，利用能特異性結合編碼抗體突變體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。可採用許多種載體。載體組件通常包括(但不局限於)下列中的一種或多種信號序列、複製起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。
(i)信號序列組件本發明的抗體突變體不僅可以通過重組方法直接製得，還可以製成和異源多肽(最好是信號序列，或成熟蛋白或多肽的N端有特異性斷裂位點的其它多肽)的融合多肽。所選的異源信號序列最好是能被宿主細胞識別並加工(如被信號肽酶斷裂)的序列。由於原核宿主細胞不能識別和加工天然的抗體信號序列，所以用例如選自鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列的原核生物信號序列來代替抗體信號序列。對於酵母菌分泌，天然的信號序列可以用例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括酵母菌屬和克魯維酵母屬α因子前導序列)或酸性磷酸酶前導序列、C.albicans葡糖澱粉酶前導序列或WO90/13646中描述的信號取代。在哺乳動物細胞中表達時，可採用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導序列(如單純皰疹gD信號)。
將該前體區域的DNA與讀框中編碼抗體突變體的DNA相連。
(ii)複製起點組件表達和克隆載體均含有能使該載體在一種或多種所選宿主細胞中複製的核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列是能使載體不依賴宿主染色體DNA獨立複製的序列，它包括複製起點或自主複製序列。對於各種細菌、酵母和病毒的這些序列是熟知的。質粒pBR322的複製起點適用於大多數革蘭陰性細菌，2μ質粒(複製)起點適用於酵母，各種病毒(複製)起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用於哺乳動物細胞中克隆載體。通常，哺乳動物表達載體不需要複製組件起點(通常用SV40起點只是因為它含有早期啟動子)。
(iii)選擇基因組件表達和克隆載體可以含有選擇基因(也稱為可選擇標記物)。典型的選擇基因編碼出的蛋白(a)提供了對抗生素或其它毒素(如氨苄青黴素、新黴素、氨甲碟呤或四環素)的抵抗力；(b)彌補了營養缺陷型；或(c)提供了不能從複合培養基獲得的關鍵的營養物，如編碼桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
篩選方案的一個例子採用藥物來使宿主細胞生長停滯。異源基因成功轉化的那些細胞產生了抵抗藥物的蛋白，從而在篩選方案中存活下來。這些顯性選擇例子採用的藥物是新黴素、黴酚酸和潮黴素。
用於哺乳動物的合適的可選擇標記的另一個例子是能鑑定感受態細胞攝取抗體突變體核酸的那些標記物，如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II(較佳的是靈長類金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
例如，將所有轉化體培養在含氨甲碟呤(Mtx，一種DHFR的競爭性拮抗劑)的培養基中，首先鑑定出DHFR選擇基因轉化的細胞。在採用野生型DHFR時，合適的宿主細胞是DHFR活性缺失的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
或者，使細胞在含有針對可選擇標記物的選擇劑(如氨基糖苷抗生素，如卡那黴素、新黴素或G418)的培養基中生長，可選擇出轉化或共轉化了編碼抗體、野生型DHFR蛋白和另一可選擇標記物(如氨基葡糖苷3′-磷酸轉移酶(APH))的DNA序列的宿主細胞(尤其是含有內源DHFR的野生型宿主細胞)。見美國專利No.4,965,199。
適用於酵母的選擇基因是酵母質粒Yrp7中的trp1基因(Stinchcomb等人，Nature，28239(1979))。trp1基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變株(例如，ATCC No.44076或PEP4-1)提供了選擇標記物。Jones，Genetics，8512(1977)。酵母宿主細胞基因組中的trp1損毀為在沒有色氨酸存在下生長時檢測轉化提供了有效的環境。同樣，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)可用已知攜帶Leu2基因的質粒來彌補。
此外，從1.6μm環狀質粒pKD1獲得的載體可用來轉化克魯維酵母屬酵母。另外，已經報導了在K.lactis中大規模製備重組小牛凝乳酶的表達系統(Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990))。利用克魯維酵母屬工業菌株來分泌成熟的重組人血清白蛋白的穩定多拷貝表達載體也已被公開。Fleer等人，Bio/Technology，9968-975(1991)。
(iv)啟動子組件表達和克隆載體通常含有被宿主生物體識別並與抗體核酸操作性相連的啟動子。適用於原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶和乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統和雜交的啟動子如tac啟動子。然而，其它已知的細菌啟動子也是適用的。用於細菌系統的啟動子還含有與編碼抗體的DNA操作性相連的Shine-Dalgarno(SD)序列。
真核細胞的啟動子序列也是已知的。基本上所有的真核基因在轉錄起始位點上遊約25-30鹼基處有富含AT的區域。在許多基因的轉錄起始點上遊70至80個鹼基處發現的另一個序列是CNCAAT區，其中N可以是任何核苷酸。大多數真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是在編碼序列的3′端加入polyA尾區的信號。所有這些序列均能適當地插入真核表達載體中。
用於酵母宿主細胞的合適的啟動子序列例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶(如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡糖異構酶和葡糖激酶)的啟動子。
其它酵母啟動子(是可誘導的啟動子，其額外優點是轉錄受生長條件的控制)是下述酶的啟動子區是醇脫氫酶2、同種細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮新陳代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和利用麥芽糖和半乳糖的酶。用於酵母表達的合適的載體和啟動子在EP73,657中有進一步的描述。酵母增強子還可與酵母啟動子一起使用有好處。
通過從病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B肝病毒和最佳的猴病毒40(SV40))基因組獲得的啟動子，從異源哺乳動物啟動子(如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)，從熱休克啟動子，可以控制載體在哺乳動物宿主細胞中的抗體轉錄，只要這些啟動子與宿主細胞系統相容。
可以另含SV40病毒複製起點的SV40限制性片段的形式方便地獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子。人巨細胞病毒的立即早期啟動子可以HindIII E限制性片段的形式方便地獲得。美國專利No.4,419,446中公開了用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統。美國專利No.4,601,978中描述了該系統的一種改進方案。另外，人β-幹擾素cDNA可在單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子控制下，在小鼠細胞中表達。另外，Rous肉瘤病毒的長末端重複序列可用作啟動子。
(v)增強子元件組件在載體中插入增強子序列通常能增強編碼本發明抗體的DNA在高級真核細胞的轉錄。現已從哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)知道了許多增強子序列。但是，通常採用的是真核細胞病毒的增強子。例子包括複製起始區(bp100-270)晚期側(late side)上的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起始區晚期側上的多瘤增強子和腺病毒增強子。另見Yaniv，Nature，29717-18(1982)關於激活真核啟動子的增強元件部分。增強子可剪接入載體中抗體編碼序列的5′或3′位上，但是較佳的是在啟動子的5′位。
(vi)轉錄終止組件用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或其它多細胞生物的帶核細胞)的表達載體還含有轉錄終止和mRNA穩定化所需的序列。這些序列通常從真核或病毒DNA或cDNA的5′端(有時是3′)非翻譯區獲得。這些區域含有的核苷酸節段轉錄成編碼抗體的mRNA非翻譯部分的聚腺苷酸化片段。一種有用的轉錄終止組件是牛生長激素聚腺苷酸化區域。見WO94/11026和該文公開的表達載體。
(vii)宿主細胞的選擇及轉化用於克隆或表達本文所述的載體中DNA的合適宿主細胞是上述的原核細胞、酵母或高級真核細胞。用於此目的的合適的原核細胞包括真細菌類，如革蘭陰性或革蘭陽性菌，例如腸桿菌科如埃希桿菌屬(如大腸桿菌、腸桿菌、歐文菌、克雷伯桿菌)、沙門菌屬(如，鼠傷寒沙門菌)、沙雷菌屬(如，粘質沙雷菌屬)、志賀菌屬，和桿菌屬(如枯草芽胞桿菌和蘚樣芽胞桿菌(如DD266,710，1989年4月12日公開的蘚樣芽胞桿菌41P))、假單胞菌(如綠膿假單胞菌)和鏈黴菌。一個較佳的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31446)，但是其它菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31537)和大腸桿菌W3110(ATCC27325)也是適用的。這些例子只用於描述，沒有限制性。
除了原核細胞外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適於用作編碼抗體載體的克隆或表達宿主。釀酒酵母菌(即常見的麵包酵母)是低級真核宿主微生物中最為常見的。然而，通常可得到和採用其它許多種、屬和菌株，裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克魯維酵母屬宿主，如乳克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wicheramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、K.thermotolerans和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；yarrowia[EP402,226]；巴士德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；念珠菌屬；Trichoderma reesia[EP244,234]；粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和絲狀真菌如鏈孢黴屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、Tolypocladium和麴黴屬(Aspergillus)如構巢麴黴(A.nidulans)和黑麴黴(A.niger)。
用於表達糖基化抗體的合適宿主細胞從多細胞生物獲得。理論上，任何高級真核細胞培養均可工作，無論是脊椎動物還是無脊椎動物培養。無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲的細胞，Luckow等人，Bio/Technology 6，47-55(1988)；Miller等人，Genetic Engineering，Setlow等人編輯，第8卷，277-279頁(Plenam publishing 1986)；Mseda等人，Nature 315，592-594(1985)。各種杆狀病毒株和變體和對應的來自宿主如草地夜蛾、埃及伊蚊、白紋伊蚊、黑尾果蠅和家蠶的相應的允許昆蟲細胞已被鑑定。感興趣的特定細胞系是昆蟲細胞系sf9。用於轉染的各種病毒株(例如，苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1變體和家蠶的Bm-5株)是公眾可獲得的，這些病毒可用作本發明中所述的病毒，尤其可用於轉染草地夜蛾細胞。另外，也可用棉、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和菸草的植物細胞培養作為宿主。
然而，最感興趣的是脊椎動物細胞，且脊椎動物細胞在培養(組織培養)中的繁殖已經成為常規手段。見《組織培養》，Academic Press，Kruse和Patterson編輯(1973)。有用的哺乳動物宿主細胞系例子是SV40轉化的猴腎細胞CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚腎細胞系(293或在懸浮培養中生長的293亞克隆細胞，Graham等人，J.Gen.Virol.3659(1977))；乳倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL75)；人肝細胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，38344-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌細胞系(Hep G2)。
為了生產抗體用上述表達或克隆載體轉化宿主細胞，並將宿主細胞培養在常規的營養培養基中，培養基經適當變化以適合誘導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼所需序列的基因。
(viii)培養宿主細胞用來生產本發明抗體突變體的宿主細胞可在各種培養基中培養。商業上可獲得的培養基如Ham′s F10(Sigma)、極限必需培養(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM，Sigma)適用於培養宿主細胞。此外，Ham等人，Meth.Enz.，5844(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.，102255(1980)，美國專利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO87/00195；或美國專利Re.30,985中所述的任一培養基可用作(本發明)宿主細胞的培養基。所有這些培養基中可以按需添加入激素和/或其它生長因子(如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如X氯化物，其中X是鈉、鈣、鎂；和磷酸鹽)、緩衝劑(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM藥)、微量元素(定義為最終濃度通常在微摩爾範圍內的無機化合物)以及葡萄糖或等價能源。另外也可加入合適濃度的本領域技術人員已知的其它必需補充物。培養條件，如溫度、pH等，與前述選擇宿主細胞表達時所用條件一樣，這對本領域普通技術人員來說是顯而易見的。
(ix)抗體純化當採用重組技術時，抗體突變體可產生在細胞內(周質空間內)或被直接分泌到培養基中。如果抗體突變體產生在細胞內，則第一步是(例如)通過離心或超離心除去宿主細胞或裂解片段的顆粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了分泌入大腸桿菌周質空間的抗體的分離過程。簡言之，在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下凍融細胞漿狀物約30分鐘。離心除去細胞碎片。若抗體突變體被分泌到培養基中，則通常首先用商業上購得的蛋白濃縮濾膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)濃縮該表達系統的上清液。在前述任何步驟中均可加入抑制蛋白水解的蛋白酶抑制劑(如PMSF)，還可加入抗生素來防止外來汙染物的生長。
例如，可用羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化從細胞中製得的抗體組合物，其中親和層析是較佳的純化方法。蛋白A作為親和配體的合適性取決於抗體突變體中免疫球蛋白Fc區的種類和同種型。蛋白A可用來純化以人γ1、γ2或γ4重鏈為基礎的抗體(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。對於所有小鼠同種型和人γ3，建議採用蛋白G(Guss等人，EMBO J.51567-1575(1986))。用作親和配體附著的基質通常是瓊脂糖，但是也可採用其它基質。機械上穩定的基質(如控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)能達到比瓊脂糖更快的流速，操作時間更短。當抗體突變體包含CH3區時，可用Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)來純化。根據待回收的抗體突變體，還可採用其它蛋白純化方法，如在離子交換柱上分級、乙醇沉澱、反向HPLC、矽膠層析、陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬氨酸柱)上的肝素SEPHAROSETM層析、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱。
在初步純化後，可對包含感興趣的抗體突變體和汙染物的混合物進行低pH疏水作用層析，採用pH約2.5-4.5的洗脫緩衝液，最好是在低鹽濃度(如約0-0.25M鹽濃度)下進行。
C.藥物製劑將具有所需純度的多肽與本領域中採用的任選的「藥學上可接受」的載體、賦形劑或穩定劑(所有這些均稱為「賦形劑」，例如緩衝劑、穩定化劑、防腐劑、等滲劑、非離子性洗滌劑、抗氧化劑和其它雜類添加劑)混合，製成多肽或抗體的水性溶液形式的治療劑或凍幹製劑保藏(見Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.編輯(1980))。這些添加劑必須在所採用的劑量和濃度下對接受者沒有毒性。
緩衝劑有助於維持pH在大致為生理條件的範圍內。它們的濃度最好在大約2mM至50mM內。適用於本發明的緩衝劑包括有機和無機酸及其鹽，例如檸檬酸鹽緩衝液(例如檸檬酸鈉-檸檬酸二鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物，檸檬酸-檸檬酸鈉等)、琥珀酸鹽緩衝液(例如琥珀酸-琥珀酸鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉等)、延胡索酸鹽緩衝液(例如延胡索酸-延胡索酸鈉混合物)、延胡索酸鹽緩衝液(例如延胡索酸-延胡索酸鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸單鈉-延胡索酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩衝液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)、以及乙酸鹽緩衝液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。因此，還提出了磷酸鹽緩衝液、組氨酸緩衝液和三乙胺鹽如(Tris)。
加入防腐劑以阻止微生物生長，加入量在0.2-1％(w/v)範圍內。用於本發明的合適的防腐劑包括苯酚、苄醇、間甲酚、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯基氯化銨、亞苄基野芹(benzalconium)滷化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、氯化己烷雙胺、對羥苯甲酸烷酯(如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯)、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。
等滲劑有時稱為「穩定劑」，其存在是為了確保本發明的液體組合物的等滲性，包括多羥基糖醇，較佳的是三羥或更多羥基的糖醇，例如甘油、丁四醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多元醇存在的量在0.1-25％(重量)之間，較佳的在1-5％之間(將其它成分的相對量考慮在內)。
穩定劑指廣義的賦形劑，其功能從填充劑到使治療劑溶解或有助於防止變性或粘附在容器壁上的添加劑。典型的穩定劑可以是多羥基糖醇(如上所述)；胺基酸，如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙氨酸、穀氨酸、蘇氨酸等，有機糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、木蘇糖、甘露糖、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括環多醇如環己六醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，如尿素、穀胱苷肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即小於10個殘基)；蛋白質，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮單糖、如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖、蔗糖和三糖如蜜三糖；多糖如葡聚糖。穩定劑的含量範圍為每份重量活性蛋白中有0.1-10,000重量份。
非離子表面活性劑或洗滌劑(也稱為「潤溼劑」)的存在有助於溶解治療劑以及保護治療劑避免受攪動引起的凝集，它還允許製劑接觸遭受應力的剪切表面而不會引起蛋白變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯山梨糖醇單醚(吐溫-20、吐溫-80等)。非離子性表面活性劑的含量約為0.05毫克/毫升至1.0毫克/毫升，較佳的約0.07毫克/毫升至約0.2毫克/毫升。
其它各種賦形劑包括填充劑(如澱粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。
本文的製劑還含有待治療特定病徵所需的多種活性化合物，較佳的是相互間沒有不利影響的有互補活性的那些化合物。例如，可能還希望提供一種免疫抑制劑。這種分子宜以組合形式存在，其量對期望目的有效。
活性組分還可包裹在(例如)通過團聚技術或界面聚合製得的微膠囊中，例如分別在羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中，在膠態藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微珠、微乳劑(microemulsion)、納顆粒和納膠囊)或巨乳劑(macroemulsion)中。這些技術公開在Osol，A.編輯的Remington′s PharmaceuticalSciences 16版(1980)中。
用於體內給藥的製劑必須無菌。這很容易通過無菌濾膜過濾來實現。
可以製得緩釋製劑。緩釋製劑的合適例子包括含有抗體突變體的固體疏水聚合物半滲透基質，其中基質是成形製品，如薄膜或微膠囊。緩釋基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚-(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919)、L-穀氨酸和L-穀氨酸乙酯的共聚物、不能降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯組成的可注射的微珠)、和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸的聚合物能持續釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當膠囊化的抗體長時間停留在體內時，它們會由於暴露在37℃水分下而變性或凝聚，從而導致生物活性損失，且免疫原性可能會改變。可以根據涉及的機理來設計合理策略以穩定化。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代-二硫鍵互換而形成了分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、自酸性溶液中凍幹、控制溼度程度、採用合適的添加劑和開發特殊的聚合物基質組合物來達到穩定化。
在治療特定疾病或狀況中，治療性多肽、抗體或其片段的有效量將取決於疾病或狀況的性質，並且能用標準臨床技術來測定。在可能的時候，希望首先在體外測定本發明藥物組合物的劑量反應曲線，然後在人體內測試前在有用的動物模型系統中測定。然而，根據本領域常規知識，有效促進感覺神經元存活的藥物組合物可提供在大約5至20ng/ml之間的局部治療劑濃度，較佳的在大約10-20ng/ml之間。在本發明的另一個具體實例中，有效促進視網膜神經元生長和存活的藥物組合物可提供在大約10-100ng.ml之間的局部治療劑濃度。
在一個較佳的實例中，通過皮下注射給予治療性多肽、抗體或其片段的水溶液。每劑的範圍在大約0.5微克至50微克/千克體重，或更佳的，在3微克至30微克/千克體重。
皮下給藥的劑量方案可以從一周一次到每日一次，這取決於許多臨床因素，包括疾病類型、疾病嚴重程度以及患者對治療劑的敏感程度。
D.抗體突變體的非治療性應用本發明的抗體突變體可用作親和純化試劑。在該方法中，用本領域已知的方法將抗體固定在固相(如Sephadex樹脂或濾紙)上。使固定的抗體突變體與含待純化抗原的樣品接觸，然後用合適的溶劑洗滌載體，除去樣品中除與固定化抗體突變體結合的抗原外基本上所有的物質。最後，用另一合適的溶劑(如甘氨酸緩衝液pH5.0)洗滌，將抗原從抗體突變體上釋放下來。
抗體突變體也可用於診斷試驗，例如檢測具體細胞、組織或血清中感興趣抗原的表達。
對於診斷性應用，抗體突變體通常用可檢測物質作標記。可採用許多標記，它們通常分成下列幾類
(a)放射性同位素，如36S、14C、125I、3H和131I。抗體突變體可根據(例如)《現代免疫學方法》(Current Protocols in Immunology)，第1和2卷，Coligen等編輯，Wiley-Interscience，New York，Pubs.，(1991)中所述的方法用放射性同位素作標記，放射活性可用閃爍計數來測定。
(b)螢光標記，例如可採用稀土螯合劑(銪螯合劑)或螢光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺醯、麗絲胺、藻紅蛋白和Texas紅。例如可用《現代免疫學方法》(同上)所述的方法來偶聯螢光標記和抗體突變體。螢光可用螢光計來定量分析。
(c)可採用各種酶-底物標記，美國專利No.4,275,149綜述了其中的一些標記。酶通常能催化顯色底物發生化學變化，該變化可用各種方法來測定。例如，酶可以催化底物，使其發生能用分光光度計來測定的顏色變化。或者，酶可以改變底物的螢光或化學發光。定量測定螢光變化的方法如上所述。化學發光底物通過化學反應被電激發，然後可發射可測定(例如通過化學發光計)的光或提供能量給螢光接受器。酶標記的例子包括螢光素酶(如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利No.4,737,456)、螢光素、2，3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶(如辣根過氧化物酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。O′Sullivan等人在《酶學方法》(Method in Enzym.)(J.LangoneH.Van.Vunakis編輯)，Academic press，New York，73147-166(1981)的「製備酶抗體偶聯物用於酶免疫試驗的方法」(Method for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)中描述了偶聯酶和抗體的方法。
酶-底物組合的例子包括，例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)和作為底物的過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料前體(如鄰苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(TMB))；(ii)鹼性磷酸酶(AP)和作為顯色底物的對硝基苯磷酸；以及(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和顯色底物(如對硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或螢光底物4-甲基傘形基-β-D-半乳糖苷酶。
本領域技術人員還可採用其它各種酶-底物組合。關於這些組合的綜述參見美國專利No.4,275,149和4,318,980。
有時，標記可以間接地與抗體突變體偶聯。本領域技術人員應該知道實現這一目的的各種方法。例如，抗體突變體可以與生物素偶聯，而上述三大類標記則與親和素偶聯，或兩者互換。生物素選擇性地結合親和素，從而通過這一間接的方式將標記和抗體突變體偶聯起來。另外，為了間接地偶聯標記和抗體突變體，可使抗體突變體與小的半抗原(如洋地黃毒苷(digloxin))偶聯，而上述不同類型的標記中的一種則與抗半抗原抗體突變體(如抗洋地黃毒苷抗體)偶聯。這樣，就間接地將標記和抗體突變體偶聯起來。
在本發明的另一個例子中，不必對抗體突變體作標記，它的存在可用與抗體突變體結合的標記的抗體來檢測。
本發明的抗體可用於任何已知的測試方法，如競爭性結合試驗，直接和間接夾心試驗和免疫沉澱試驗。Zola，《單克隆抗體技術手冊》(Monoclonal AntibodiesAManual of Techniques)，147-158頁(CRC Press，Inc.1987)。
競爭性結合試驗取決於標記的標準品與測試樣品競爭結合有限量抗體突變體的能力。試樣中抗原的量與結合抗體的標準品的量成反比。為了測定已結合標準品的量，抗體通常在競爭前後為不溶性的。這樣就能方便地將已結合抗體的標準品和測試樣品從仍未結合的標準品和測試樣品中分離出來。
夾心試驗包括採用兩種抗體，每種抗體能結合待檢測蛋白的不同的免疫原性部分或表位。在一個夾心試驗中，待分析的測試樣品與固定在固相載體上的第一抗體結合，然後，第二抗體與測試樣品結合，從而形成了不溶性的三組分複合物。例如見美國專利No.4,376,110。第二抗體本身可用可檢測物質標記(直接夾心試驗)，或可利用標記了可檢測物質的抗免疫球蛋白抗體來測定(間接夾心試驗)。例如，一類夾心試驗是ELISA試驗，在該種情況下，可檢測物是酶。
對於免疫組織化學，腫瘤樣品可以是新鮮的或冷凍的，或可包埋在石蠟中並用防腐劑(例如福馬林)來固定。
抗體也可用於體內診斷試驗。通常，抗體用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)標記，這樣通過免疫閃爍顯影可確定腫瘤的位置。
E.診斷用試劑盒為方便起見，本發明的多肽或抗體可以試劑盒形式提供，即將預定劑量的試劑與進行診斷試驗的說明書組合包裝。當抗體突變體用酶作標記時，試劑盒將包括酶所需的底物和輔因子(如提供可檢測發色團或螢光團的前體底物)。另外，還可包括其它添加劑，如穩定劑、緩衝液(如封閉緩衝液或裂解緩衝液)等。各種試劑的相對量可以差別很大，溶液中提供的試劑濃度能使試驗靈敏度基本達到最優。特別是，試劑可以乾粉形式(通常是凍幹的)提供，包括在溶解時能提供濃度合適的試劑溶液的賦形劑。
F.多肽或抗體的體內應用預計本發明的多肽或抗體可用來治療哺乳動物。在一個實例中，將抗體給予非人哺乳動物以獲得(例如)臨床前期數據。待處理的典型的非人哺乳動物包括非人靈長類、狗、貓、嚙齒類動物和其它能進行臨床前期研究的哺乳動物。這些哺乳動物可以是已經建立的待用抗體治療疾病的動物模型、或可用來研究感興趣抗體的毒性的動物模型。在每個實例中，可在哺乳動物中進行劑量逐步增加的研究。
抗體或多肽可通過任何合適的方法給予，這些方法包括腸胃外、皮下、腹膜內、肺內、和鼻內給藥，如果需要局部免疫抑制治療，可以是病變區內給藥。腸胃外灌輸包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、或皮下給藥。另外，抗體突變體可通過脈衝灌輸、特別是減少的抗體突變體劑量來適當地給予。較佳的，藥劑通過注射給予，更佳的是靜脈內或皮下注射給予，這部分取決於給藥是瞬時性還是慢性的。
為了預防或治療疾病，抗體或多肽的合適劑量取決於待治療疾病的類型、疾病的嚴重程度和病程、給予抗體突變體是出於預防目的還是治療目的、以往的治療、患者的臨床史以及對抗體突變體的反應、和主治醫師的判斷。抗人IgE抗體可以通過一次或連續治療適當地給予患者。
根據疾病的類型和嚴重程度，大約1微克/千克至150毫克/千克(例如0.1-20毫克/千克)抗體或多肽是給予患者的初始候選劑量，無論是通過一次或多次分開的給藥還是連續灌輸。根據上述因素，典型的每日劑量可能在大約1微克/千克至100毫克/千克或以上的範圍內。對於超過幾天或更長時間內的重複給藥，根據病徵，應維持治療直至疾病症狀受到所需的抑制。然而，可採用其它劑量方案。這種治療的進程很容易用常規技術和試驗來監測。一種典型的抗LFA-1或抗ICAM-1抗體的劑量方案公開在WO94/04188中。
抗體突變體組合物將以良好的醫學實踐相一致的方式配製、服藥或給藥。在本文上下文中考慮的因素包括待處理的特定的疾病、待處理的特定的哺乳動物、患者個體的臨床狀況、病因、輸遞試劑的部位、給藥方法、給藥方案以及醫生所知的其它因素。所給予抗體突變體的「治療有效量」將由這些考慮因素決定，並且是預防、改進或治療疾病或失調所需的最少量。抗體突變體不需要、但可任選地和目前使用的一種或多種試劑配製在一起，以預防或治療所討論的疾病。其它這些試劑的有效量取決於製劑中抗人IgE的量、疾病或治療的類型、以及上述的其它因素。這些試劑的用量和給藥途徑通常和上文所用的相同，或者約為上文所用劑量的1-99％。
G.產品在本發明另一個實例中，提供了一種含有用於治療上述疾病的物質的產品。產品包括一個容器和一個標籤。合適的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射管和試管。容器可用諸如玻璃或塑料之類的各種物質製成。容器中盛放了可有效治療病徵的組合物，還可以含有一個無菌入口(例如，容器可以是盛靜脈內注射用溶液的袋或有可用皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的活性劑是抗體突變體。容器上的或附帶的標籤標明該組合物可治療所選病徵。產品還可包含第二個容器，該容器含有藥學上可接受的緩衝液，如磷酸緩衝鹽溶液、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。它還可包括從商業和用戶立場上所需的其它物質，包括其它緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器和裝有使用說明書的包裝。
通過描述(而非限定)方式提供下列實施例。
實施例實施例1針對IgE的單克隆抗體的製備製備能阻斷IgE結合FcεRI的8種單克隆抗體(MAE10-MAE17)。用分離的抗IgE抗體(Genentech MAE1)作親和層析，從U266B1細胞(ATCC TIB 196)上清液製得針對IgE的單克隆抗體。對於MAE12，對5隻6周齡BALB/c雌性小鼠足墊用10微克純化的IgE(Ribi佐劑配製)免疫。在初次免疫後第一和第三周以相同方式進行注射。最後一次注射三天後，取出腹股溝和腿彎部淋巴結合併，使這些組織通過鋼網紗製得單細胞懸液。使細胞在含50％w/v聚乙二醇4000的高葡萄糖(DMEM)中和小鼠骨髓瘤P3X63-Ag8.653(ATCC CRL 1580)以4∶1的比例融合。對於MAE14、MAE15和MAE13以類似方式進行免疫，不同的是對於MAE13，每次注射用30微克IgE，測定IgE片段315-347(Kabat)作為融合前強化；對於MAE10和MAE11，以兩劑100微克皮下注射，最後一次用50微克強化，用脾細胞進行融合。
然後將融合細胞以2×105/孔的密度接種到96孔組織培養板中。24小時後加入HAT選擇性培養基(次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸苷，Sigma，#H0262)。在接種的1440個孔中，365個孔在HAT選擇後含有生長的細胞。
融合後15天，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測試上清中是否存在對人IgE特異的抗體。ELISA如下進行，所有培育在室溫下進行。用50mM pH9.6碳酸鈉緩衝液配製的1微克/毫升大鼠抗小鼠IgG(Boehringer Mannheim，#605-500)包被測試板(Nunc Immunoplate)2小時，然後用磷酸鹽緩衝液(PBS)含0.5％牛血清白蛋白封閉30分鐘，然後用含0.05％吐溫20的PBS(PBST)洗滌四次。加入測試的上清液，振搖培育2小時，然後用PBST洗滌四次。加入0.5微克/毫升人IgE(如上所述從U266細胞純化獲得)，振搖培育1小時，然後用PBST洗滌四次。加入稀釋度為1∶2500的辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗人IgE(Kirkegarrd Perry Labs，#14-10-04，0.5毫克/毫升)，培育1小時，然後用PBST洗滌四次。加入100微升/孔含10毫克鄰苯二胺二鹽酸鹽(Sigma，#P8287)和10微升30％過氧化氫(配製在25毫升pH5.0磷酸檸檬酸緩衝液中)，培育15分鐘，使板孔顯色。加入100微升/孔2.5M硫酸終止反應。用自動化ELISA平板讀數儀讀取490nm吸收值。對於MAE12，測試了365份上清液，其中100份對人IgE有特異性。在篩選其它抗體時，獲得了相似的IgE特異性頻率。本文描述的所有單克隆抗體均是IgG1同種型，除了MAE17(是IgG2b同種型)和MAE14(是IgG2a同種型)外。
在細胞為基礎的平板試驗中進一步測試各IgE特異性抗體，選出以抑制IgE結合FcεRI的方式結合IgE、且不能結合FCEH結合的IgE的抗體。下表1和2中列出了這些試驗的結果。
表1鼠抗HuIgE單克隆抗體性能的歸納
鼠抗HuIgE的歸納(續)<
>1.用於分析鼠抗人IgE單克隆抗體的FACS為基礎的試驗。結合CHO3D10(FcεRIα+)上的IgE的鼠抗人IgE單克隆的篩選a.使5×105細胞/每份樣品的CHO 3D10細胞(FcεRIα鏈穩定轉染子，Hakimi等人，J.Biol.Chem.2522079)與配製在100微升FACS緩衝液(0.1％BSA，10mM疊氮鈉，PBS配，pH7.4)中的10微克/毫升的U266 IgE標準品(批號13068-46)4℃培育30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌一次。使等份負載了IgE的細胞與50微克/毫升多克隆FITC偶聯的家兔抗人IgG(Accurate Chem.Co.AXL-475F，批號16)4℃培育30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌三次，測定IgE結合的量。
b.使載有IgE的細胞與鼠抗人IgE雜交瘤上清液(鼠IgG的濃度在1至20微克/毫升之間)4℃培育30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌一次。用10微克/毫升Genetech的單克隆抗人IgE(MaE1)作為結合的陽性對照。用10微克/毫升不識別IgE的Genetech的單克隆(MAD6P)作為陰性對照。
c.如下所述檢測單克隆抗體與CHO細胞上人IgE的結合使細胞和20微克/毫升偶聯FITC、親和純化的F(ab′)2山羊抗小鼠IgG(Organon Teknica，#10711-0081)4℃培育30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌三次。將細胞加入含2微克/毫升碘化丙錠(Sigma，#P4170)的400微升緩衝液中，對死亡細胞染色。
d.在Becton Dickinson FACSCAN流式細胞計上分析細胞。設定正向光散射器和90度側向散射門，分析細胞均質群。不分析排除碘化丙錠染色的死亡細胞。將不結合CHO 3D10細胞上IgE的雜交瘤上清液作為進一步篩選的候選物。
2.外周血嗜鹼細胞釋放組胺。從正常獻血者獲得肝素化血液，1∶4稀釋在改進的Tyrodes緩衝液(25mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，MgCl2，0.3毫克/毫升HAS，pH7.35)中，然後和1nM人IgE(ND)4℃培育60分鐘。然後將細胞加入含有鼠單克隆抗IgE抗體(10毫克/毫升)或多克隆抗人抗血清(作為陽性對照)的Tyrodes緩衝液中，37℃培育30分鐘。沉澱細胞，使上清液中的組胺乙醯化，用RIA試劑盒(AMAC，Inc.Webrook，Main)測定組胺含量。測定受幾輪凍融的細胞的總組胺。
3.阻斷FITC偶聯的IgE與FcεRIα鏈的結合。研究抗體對IgE結合的效應，方法是在含0.1％BSA和10mM疊氮鈉的PBS(pH7.4)中預先37℃培育FITC標記的IgE和各種MaE抗體30分鐘，然後4℃培育混合物和5×1053D10細胞30分鐘。然後洗滌細胞三次，測定475納米下的平均通道螢光值。用不阻斷IgE結合FcεRIα鏈的鼠抗人IgE單抗(Mae1)作為對照。
4.分析鼠抗人IgE與膜IgE陽性B細胞U266的結合。
a.將U266B1細胞(膜IgE陽性)培養在添加了15％熱滅活胎牛血清(Hyclone，#A-1111-L)、青黴素、鏈黴素(100單位/毫升)和L-穀氨醯胺(2mM)的基礎培養基中。
b.將細胞(5×105/等份)培育在含10、5、1、0.5和0.1微克/毫升鼠抗人IgE單抗的100微升FACS緩衝液中，在96孔圓底微量滴定板中冰上培育30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌兩次。用Genentech的單克隆MAE1作為陽性對照。
c.將細胞培育在含50微克/毫升(1∶20原液)偶聯FITC的F(ab′)2親和純化的山羊抗小鼠IgE(Organon Teknika，#1711-0084)的100微升FACS緩衝液中，於冰上培育30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌三次。將細胞加入含有2微克/毫升碘化丙錠的400微升FACS緩衝液中，對死亡細胞染色。
5.對FcεRII(CD23)+B細胞IM9進行FACS為基礎的結合試驗。
a.將IM9人B細胞骨髓瘤(ATCC CCL 159 Ann.N.Y.Acad.Sci.190221-234(1972))維持在含有10％熱滅活胎牛血清、青黴素、鏈黴素(100單位/毫升)和L-穀氨醯胺(2mM)的GIF基礎培養基中。
b.將細胞(5×105等份)培育在含2微克/毫升U266IgE標準品的100微升FACS緩衝液中，在96孔微量滴定板中4℃培育30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌兩次。將細胞培育在單獨緩衝液或含有2微克/毫升人IgG1(Behring Diagnostics，目錄號400112，批號801024)的緩衝液中作為對照。
c.然後使細胞和0.1-10微克/毫升的鼠抗人IgE單克隆抗體於冰上培育30分鐘。用Genetech單克隆抗體MAE1作為陽性對照。
d.然後在含有50微克/毫升偶聯FITC的F(ab′)2山羊抗小鼠IgG(Organon Teknika，#1711-0084)的100微升FACS緩衝液中4℃培育細胞30分鐘，然後用FACS緩衝液洗滌三次。
e.然後將細胞加入含2微克/毫升碘化丙錠的400微升緩衝液中，對死亡細胞染色。
f.在Becton Dickenson FACSCAN流式細胞計上分析細胞。設定正向光散射器和90度側向散射器門，分析細胞均質群，分析排除被碘化丙錠染色的死亡細胞。相對於單用FITC家兔抗人IgE染色的細胞分析FITC陽性細胞(IgE結合)。
g.用10微克/毫升的Becton Dickinson鼠單抗Leu20(抗-CD23)4℃染色細胞等份30分鐘，然後洗滌兩次，作為測定各實驗中IM9細胞表面CD23水平的陽性對照。然後使細胞和50微克/毫升偶聯FITC的F(ab′)2親和純化的山羊抗鼠IgG一起培育。
6.抗體阻斷偶聯FITC的IgE與低親和力IgE受體的結合在FACSCAN流式細胞計上用流式細胞計數法分析40nM FITC標記的IgE與B淋巴母細胞IM-9上表達的低親和力IgE受體(CD23或FcεRI)的結合。研究抗體對FITCIgE結合的效應，方法是在含0.1％BSA和10mM疊氮鈉的PBS(pH7.4)中預先37℃培育FITC IgE和0.1-10微克/毫升鼠抗人抗體30分鐘，然後4℃培育混合物與5×105細胞30分鐘。然後洗滌細胞三次，測定475納米下的平均通道螢光值。
7.IgE體外試驗方法a.從正常獻血者分離外周血單核細胞。
b.用PBS充分洗滌細胞，儘可能多的除去血小板。
c.計數單核細胞，重懸於培養基中至1×106細胞/毫升。培養基是具有青黴素、鏈黴素、15％馬血清、IL-2(25U/毫升)和IL-4(20ng/毫升)的DMEM混合液。
d.在第0、5和8天加入適當濃度的抗體。
e.在24孔Falcon組織培養板中培育培養物14天。
f.在第14天，取出上清液，用IgE特異性ELISA方法測定IgE濃度。
8.用平衡結合(Scatchard)分析測定鼠單克隆抗體對人IgE的親和常數(kd)。
a.RIA緩衝液中的IgE(用氯胺T方法碘化ND和PS同種異型，用PD10sephadexG25柱(Pharmacia，#17-0851-01)與游離的125I Na分離)，緩衝液為PBS，0.5％牛血清白蛋白(Sigma，#A-7888)、0.05％吐溫20(Sigma，#P-1379)、0.01％硫柳汞(Sigma，#T-5125)，pH7.4。用50％三氯乙酸沉澱了大約78-95％的柱後計數，碘化IgE製備物的比活在1.6-13μCi/微克範圍內(假定計數效率為70％)。
b.將固定濃度的125I(約5×104cpm)加入不同濃度(1-200nM)的未標記的IgE中(在12×75毫米聚丙烯試管，RIA緩衝液最終體積為0.1毫升)。然後加入含鼠抗人IgE單抗(20mM最終濃度)的0.1毫升RIA緩衝液至最終試驗體積為0.2毫升。
c.25℃培育樣品16-18小時並持續攪拌。
d.如下分離結合的和游離的125I IgE加入偶聯於CNBr活化Sepharose4B(Pharmacia，#17-0430-01)和載體蛋白A sepharose(Repligen，#IPA300)珠上的親和純化的山羊抗小鼠IgG(Boehringer Mannheim，#605-208)的0.3毫升混合物(以RIA緩衝液配)，25℃培育1至2小時並持續攪拌。然後加入RIA緩衝液(1毫升)，400xg離心試管5分鐘。然後計數樣品以確定總計數。用巴斯德移液管小心吸出上清液，對樣品重新計數，計算出結合的和游離的計數對比。
e.用NIH的P.Munson編寫的配體程序為基礎的Fortran程序(scanplot)進行Scatchard分析。Scatplot採用質量作用方程式配合結合數作為用Rodbard型回歸分析總數的函數。
實施例2人源化Mae11的製備引言下列實施例描述人源化MaE11的各種製備，其中通過定點誘變修飾殘基，獲得12個抗IgE MaE11變體[F(ab)1-12]。用F(ab)12的殘基作為模板，產生rhuMaE25或E25(1992年8月4日提交的申請PCT/US92/06860中描述的一種高效抗IgE抗體)。
方法如圖1所示，從pUC119-為基礎的質粒pAK2(Carter等人(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894285)中含有人k亞型I輕鏈和人亞型III重鏈(VH-CH1)的含脫氧尿嘧啶模板，通過定點誘變(Kunken，T.A.(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488)修飾了鼠抗人IgE單抗MaE11，獲得變體F(ab)-1。F(ab)-2從F(ab)-1模板構建得到，而其它所有人源化F(ab)變體從F(ab)-2模板構建得到。將質粒轉化入大腸桿菌JM101中，用於製備雙鏈和單鏈DNA(Messing，J.(1979)，Recomb.DNA Tech.Bull.243；Ausuble等人，《現代分子生物學方法》，第1單元(1997))。用雙脫氧法對全部輕鏈和重鏈殘基測序。然後，將編碼輕鏈和重鏈的DNA亞克隆到大腸桿菌F(ab)表達載體pAK19(Carter等人，(1992)，Biotechnology 10163)中。此衍生物缺少形成F(ab′)2片段中重鏈間二硫鍵的鉸鏈半胱氨酸。與全長IgG抗體相反，F(ab)片段有助於分析較大量的變體，因為可採用大腸桿菌表達(而不是哺乳動物細胞)培養技術。這些單個變體在1993年3月4日公開的申請WO93/04173中有所描述。一旦確定了最佳變體，可將其隨後亞克隆到編碼全長人IgG1的質粒中(見下文)。
將表達質粒轉化入大腸桿菌MM294株(Meselon，M和R.Yuan(1968)，Nature2171110)中，使單菌落在5毫升2YT培養基-羧苄青黴素(100微克/毫升)中37℃生長5-8小時。然後將5毫升培養物加入到100毫升AP5培養基-羧苄青黴素(100微克/毫升)中，使其在500毫升搖瓶中37℃生長16小時。4000xg離心培養物，除去上清液。冷凍1小時後，將沉澱其重懸於5毫升冰冷的10mM Tris，1mM EDTA和50微升0.1M苄脒(Sigma，St.Louis)中，加入後者是為了抑制蛋白水解。在冰上輕微振搖1小時後，10000xg離心樣品15分鐘。將上清液加入蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱(0.5毫升床體積)中，然後用10毫升3M氯化鉀溶液/100毫升Tris(pH8.0)洗滌，再用2.5毫升100mM乙酸(pH2.8)洗脫到1M Tris(pH8.0)(0.5毫升)中。
然後用Centricon-30(Amicon)使F(ab)緩衝液交換成PBS，並濃縮至最終體積為0.5毫升。對每個F(ab)片段進行SDS-PAGE以確認純度。用0.1％ε280為1.0來測定F(ab)濃度。用純化的F(ab)-2的胺基酸分析得到的蛋白濃度以及該樣品的A280來確定消光係數。
用液相色譜/質譜法直接分析所選F(ab)片段，以確認其分子量。將樣品注射入壓縮的毛細管液相色譜系統(Henzel，W.J.等人(1990)，Anal.Biochem.187228)，用SciexAPI3質譜儀直接分析。將人生長激素較高的電荷狀態(m.w.22，256.2)(用和樣品所用相同的儀器參數獲得)來標定。
為了產生全長人IgG1版的人源化MaE11，將重鏈和輕鏈分開亞克隆到以前描述的pPK質粒(Gorman，C.M.等人，(1990)，DNA Protein Eng.Tech.23)中。用高效的方法(Graham等人，同上；Gorman，C.M.，Science 221551)，將合適的重鏈和輕鏈質粒(取決於所希望的序列變化)共轉染到腺病毒轉化的人胚腎細胞系(稱為293細胞，Graham，F.L.等人(1977)，J.Gen.Virol.3659)中。將培養基變成無血清並每天收穫培養基至第5天。用蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)從合併的上清液中純化抗體。通過G25凝膠過濾將洗脫抗體的緩衝液交換成PBS，用Centriprep-30或Centricon-100(Millipore)進行超濾濃縮，並4℃保藏。用總IgG結合ELISA測定抗體濃度。結果顯示在表4中。
可溶性受體試驗用0.05毫升含FcεRIα鏈IgG嵌合受體的包被緩衝液(50mM碳酸鹽、碳酸氫鹽，pH9.6)於4-8℃包被96孔試驗板(Nunc)12小時。吸出孔中液體，加入250微升封閉緩衝液(PBS，1％BSA，pH7.2)，4℃培育1小時。在分開的試驗板中，用試驗緩衝液(0.5％BSA和0.05％吐溫20，PBS，pH7.2)以1∶4的稀釋度將樣品和參照鼠MaE11從200微克/毫升滴定到0.001微克/毫升，加入相同體積的10ng/毫升生物素化IgE(O-Shannessy，D.J.等人(1984)，Immunol.let.8273)，然後25℃培育平板2-3小時。用PBS和0.05％吐溫20(Sigma)洗滌FcεRI包被的孔三次，從樣品孔中轉移50微升，25℃攪拌培育30分鐘。每孔加入50微升鏈黴親和素-HRP(500微克/毫升，Sigma)溶液(1∶5000稀釋在試驗緩衝液中)，然後攪動培育平板15分鐘，如前所述那樣洗滌。每孔加入50微升微孔過氧化物酶底物(Microwell Peroxidase Substrate)(Kirkgaard Perry Laboratories)，顯色30分鐘，加入等體積1N HCl終止反應，在450納米下測定吸收值。用Kaleidagraph數據分析應用軟體(Synergy Software)通過非線性四參數曲線匹配繪製抑制百分數對封閉抗體濃度，計算50％抑制時的濃度。結果顯示在表3中。
FACS為基礎的結合試驗用流式細胞計測定抗體抑制偶聯FITC(Goding，J.W.(1976)，J.Immunol.Methods13215)的IgE結合CHO 3D10細胞上表達的高親和力FcεRI受體α鏈(Hakimi，J.等人，(1990)，J.Biol.Chem.26522079)的能力。使FITC偶聯的IgE(40nM)在FACS緩衝液(PBS，0.1％BSA，和10mM疊氮鈉，pH7.4)中和抗體(0.3-1.0×10-6M)預先37℃培育30分鐘。然後4℃培育混合物和5×105CHO CD10細胞30分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞三次，在FACScan流式細胞計(Becton Dickinson)上475納米下測定平均通道螢光值。用不阻斷IgE結合FcεRIα鏈的鼠抗人IgE單抗作為陽性對照，不識別IgE的鼠單抗MOPC21(Cappel)作為陰性對照。結果顯示在圖3中。
抗體和載有IgE的FcεRI結合使抗體與CHO 3D10細胞上表達的FcεRIα亞基所結合的人IgE(10微克/毫升人IgE)4℃結合30分鐘。洗滌細胞三次，然後用不同濃度的鼠抗人IgE單抗MaE1或MaE11或人源化單抗變體12[F(ab)12]培育30分鐘。用MOPC21(鼠IgG1)作為鼠單抗對照，而用人源化4D5單抗(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894285(1992)，人IgG1)作為F(ab)12的對照。鼠單抗的結合用FITC偶聯的F(ab′)2山羊抗小鼠IgE(10微克/毫升)檢測。人源化單抗用FITC偶聯的F(ab′)2山羊抗人IgG(50微克/毫升)檢測，它已經IgE柱親和純化而最大程度地減少了與IgE的交叉反應性。圖4中描述了該結果。
鼠和人源化F(ab′)的計算機圖表模型用圖1的F(ab)VL和VH結構域序列構建鼠MaE11 VL-VH結構域的計算機圖表模型。隨後用該模型來確定那些構架殘基應被摻入人源化抗體導致產生F(ab)-2。還構建人源化變體的模型來驗證鼠構架殘基的正確選擇。如Carter等人(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA894285；Eigenbrot，C.等人(1993)，J.Mol.Biol.229969中描述的那樣構建模型。
結果人源化MaE11抗體的設計人源化抗體的此次研究採用人共有序列。這與採用接近感興趣鼠Ig的人序列的其它人源化技術相反。Shearman，C.W.等人(1991)，J.Immunol.1474366；Kettleborough，C.A.等人(1991)，Protein Eng.4773；Tempest，P.R.等人，(1991)，Biotechnology 9266；Co.M.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA882869；Routledge，E.G.(1991)，Eur.J.Immunol.212717。此人共有序列包括以人VH亞型III和VLk亞型I為基礎的構架(如Kabat等人(1991)，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Instituteof Health，Bethesda，MD中所述)。如Kabat(同上)所述的那樣，將6個CDR移植到人IgG 1構架上，產生F(ab)-1。所有的構架殘基保留為人的殘基。該變體最好描述成直率的「CDR交換」。F(ab)-1未顯示出對IgE結合受體有可檢測的抑制作用(表3)。這類「CDR交換」的變體不能結合其抗原在以前已有報導。(Carter等人，同上；Tempest等人，同上)。注意到表3中沒有描述F(ab)-1的確切序列，但是，該序列可通過用MaE11鼠Kabat CDR殘基替代對應人殘基(用括號表示)來推斷。圖1中的右側和左側括號表明了Kabat CDR，而Chothia CDR用下劃線表示。
為了幫助解釋和減少混淆，用正常字體書寫人殘基，而鼠殘基用斜體表示。在表示殘基替代時，第一個殘基是被取代的殘基，第二個殘基是插入的殘基，數字是天然序列的Kabat編號。
F(ab)-2變體根據的是分子模型。在該分子中，將幾個鼠構架殘基摻入人構架中。在F(ab)-2中，採用Kabat等人(同上，根據種間序列差異)提供的CDR定義(除CDR-H1和CDR-H2外)。
根據序列差異的CDR-H1定義(Kabat等人，同上)與根據抗原-抗體複合物的晶體學研究的定義(Chothia，C.等人(1989)，Nature 342877)有明顯不同(圖1)。因此，對CDR-H1重新定義以包括兩者，即人殘基26-35。
根據序列差異的CDR-H2定義(Kabat等人)所含有的殘基比根據抗體-抗原晶體結構的殘基(Chothia等人)多[見圖1Kabat CDR用括號表示，Chothia CDR用下劃線表示]。由於對抗體人殘基60-65沒有發現表明抗體-抗原接觸的晶體結構，因此修飾CDR-H2，使其包括兩種定義的混合，即包括人殘基50-58。結果，在F(ab)-2中，用較短版本的CDR-H2與F(ab)-1比較。
結果，產生人到鼠殘基變化最少的F(ab)-2，認為這些變化是維持結合所需的。產生其它10個變體，以便測試包埋殘基對CDR構型的影響，並評價有意義構架殘基的分子模型的預定效應，和檢查其它感興趣的殘基。
為了測試包埋殘基對CDR構型的影響，構建F(ab)-3和F(ab)-7，其中將鼠殘基變回人殘基。如表4(F(ab)-3和F(ab)-4)所示，VL4和VL33處側鏈對結合的影響最小，可能對人源化抗體中的CDR-L1的構型影響最小。
模型提示，構架殘基VH24可能影響CDR-L1構型，VH37能影響VL-VH界面。然而，在VH24[F(ab)-5]或VH37[F(ab)-7]處替代成人殘基顯示結合能力減少得最少。相反，用人Leu[F(ab)-6]代替構架位置VH78處的鼠Phe會引起結合明顯減少。該模型表明，該殘基影響CDR-H1和/或CDR-H2的構型。
F(ab)-9至F(ab)-12檢查了人殘基被鼠殘基取代的情況。所有這四種變體均顯示出結合比F(ab)-2有大幅提高(見表3、4和圖3)。在顯示出結合比F(ab)-2高5倍的F(ab)-9中，將CDR-H2中的兩個殘基(如Kabat等人，同上所定義的)變成鼠殘基AlaVH 60 Asn和Asp H61 Pro。Pro替代能改變CDR-H2構型和/或剛性，Asn H60預計包埋在VL-VH界面，可能與Asp VL1相互作用。
表現出結合比F(ab)-2大大提高的F(ab)-10是這樣一種變體，其中VL和VH結構域中的所有包埋殘基(定義成可及表面積低於游離胺基酸的5％的殘基)是鼠MaE11的殘基。實際上，F(ab)-10可被認為是鼠MaE11，其中只有VL和VH中外露的非CDR殘基被變成了人殘基。
為了確定F(ab)-10的結合性提高是由於一個或幾個殘基，產生變體F(ab)-11和F(ab)-12。用F(ab)-9(並非F(ab)-2)作為基本模板來製備這些變體，因為它表現出結合提高5倍。模型表明，VH63和VH67處的側鏈能影響CDR-H2的構型。如Kabat等人(同上)所確定的那樣(但並非如Chothia等人(同上)所確定的那樣)，認為VH63是CHR-H2的一部分。VH67是兩種定義中的一個構架殘基。在F(ab)-11中，VH63和VH67分別是鼠殘基Leu和Ile。在F(ab)-12中，只有VH67被變成鼠Ile。
在可溶性受體試驗(表4)和細胞為基礎的試驗(表4，圖3)中，F(ab)-11和F(ab)-12均表現出至少和F(ab)-10一樣佳、比F(ab)-9更佳的結合。這表明，F(ab)-10的結合提高並不是由於VH結構域內部重包裝入鼠殘基所致，而是僅僅受一個殘基(即VH67)的影響。
構建F(ab)-8，用鼠Gly取代人VL55殘基Glu，並在VL57處將Gly類似地替代成Glu。F(ab)-2採用人殘基，而F(ab)-8的這些位置替代為鼠殘基。從表3可迅速歸納出，這些殘基的替代對受體結合沒有影響。
表3人源化Mae11變體<
>
(a)鼠殘基用斜體字表示；殘基數根據Kabat等人的編號。
(b)三個可溶性受體試驗的平均值和標準偏差(c)F(ab)X/F(ab)-2比值大於16指，該變體即使在採用最高F(ab)濃度下也不表現出結合。
用經測定結合性最接近鼠MaE11的F(ab)變體，即F(ab)-2、F(ab)-9、F(ab)-10和F(ab)-12，來產生全長IgG1分子。這些分子相對於F(ab)-2或MaE11的結合與F(ab)片段表現的結合性相當。表4中報導了這些結果。
表4人源化MaE11 IgG1變體
MaE11與載有IgE的FcεRI的結合鼠MaE11阻止游離的IgE與肥大細胞上的FcεRI結合，但是不通過結合載有IgE的FcεRI觸發組胺釋放。如圖4所示，鼠MaE11和人源化變體12(IgG1-12)以及陰性同種型對照抗體MOPC21和陰性同種型對照人源化4D5(Carter等人，同上)不結合CHO 3D10細胞上載有IgE的FcεRI。相反，結合IgE但不阻止IgE結合FcεRI的鼠MaE1能結合載有IgE的FcεRI。與人IgG1對照(人源化4D5)不同的是，鼠IgG1同種型(用MOPC21表示)對這些細胞表現出約10％的非特異性本底結合。MaE11不產生高於MOP21對照的染色，人源化變體12不產生高於人源化4D5對照的染色(圖4)。
部分丙氨酸掃描IgE結合中重要的CDR殘基MaE11 CDR的序列表明帶電荷殘基佔優勢(圖1)。CDR-L1含有三個Asp殘基，而CDR-L3具有His，Glu和Asp。CDR-H3具有三個His殘基。鼠和人源化MaE11模型說明了所有這些帶電荷殘基在空間上毗鄰(未顯示)。相反，CDR-H2中單獨的Asp54在空間上與其它帶電荷殘基分開。用定點誘變(Kunkel，T.A.(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488)以丙氨酸代替這些帶電荷殘基的每一個，產生變體。在CDR-L1中，改變三個Asp殘基中的一個(Asp VL32b)變化就有效地廢除了IgE結合[F(ab)-16；表5]，而替代其它Asp殘基有最小的影響[F(ab)-14；F(ab)-15]。在CDR-L3中同時將Glu VL93和Asp VL94變為丙氨酸也減少了結合，但是沒有達到和VL32b處取代相同的程度。CDR-H3中的三個His各單獨替代成Ala導致結合稍有提高[F(ab)-21]，或結合減少三倍[F(ab)-20和F(ab)-21]。然而，同時改變三個His殘基消除了結合[F(ab)-19]。儘管不容易確定帶電荷殘基是否參與直接結合IgE或為其各自CDR提供了某種構型穩定性，但是變體F(ab)-13至F(ab)-22表明，CDR-L1和CDR-H3是IgE結合中重要的決定簇。
表5人源化Mae11 F(ab)CDR殘基變體
(a)鼠殘基用斜體字表示；殘基數根據Kabat等人的編號。
(b)三個可溶性受體試驗的平均值和標準偏差(c)F(ab)X/F(ab)-2比值大於16指，該變體即使在採用最高F(ab)濃度下也不表現出結合。
歸納和結論從MaE11產生功能性人源化鼠抗IgE抗體涉及將幾個鼠構架殘基替代入人構架殘基中。另外，帶電荷CDR的圖譜表明，這些殘基中有一些對於抗體-IgE相互作用很重要。
變體F(ab)-1至F(ab)-12表明構架殘基可能對抗體功能有明顯影響，這與以前的研究(Carter等人，同上；Shearman，C.W.等人(1991)，J.Immunol.1474366；Kettleborough，C.A.等人(1991)，Protein Eng.4773；Tempest，P.R.(1991)，Biotechnology9266)一致。在考慮其中只有6個鼠CDR殘基被移植到人構架殘基上的直率CDR交換的F(ab)-1時，特別強調這一點。對此，可能的解釋包括CDR-H2。VH63和VH67位包埋的疏水性殘基能影響CDR-H2的構型。產生在VH63和H67位置含有四種組合的諸變體，即分別是鼠Leu和Ile[MaE11和F(ab)-11]，Val和Phe[F(ab)-2]、Leu和Phe[F(ab)-1]和Val和Ile[F(ab)-12]。從這四種變體的結合數據清楚地推斷表明，重要的殘基是VH67，它必須是鼠Ile，以便提供和鼠MaE11相當的親和力。在F(ab)-1中，該殘基是人Phe。
在保留成人殘基的F(ab)-1中的12個殘基[與F(ab)-2比較]中，將8個殘基分開變成其它變體中的鼠殘基。三個變化對結合沒有影響VL4[F(ab)-4]；VL55和VL57[F(ab)-8]。兩個殘基替代(VH60和VH61[F(ab)-9])提高了結合，而三個減少了結合VH24[F(ab)-5]；VH37[F(ab)-7]和VH78[F(ab)-6]。
用Padlan(Padlan，E.A.(1991)，Mol.Immunol.28489)提出的假設設計變體F(ab)-10，他提出鼠抗體免疫原性可通過只改變外露的構架殘基來降低。在該變體中，VL和VH結構域的疏水性內部，換句話說，變體是VL和VH中僅僅外露構架殘基被改變成人序列的鼠MaE11。儘管F(ab)-10表現出結合能力與鼠MaE11接近，但是單個胺基酸區域的變化(VH67從人變為鼠)使結合能力有同樣的提高[F(ab)-12，IgG1-12]。
表現出結合能力與鼠MaE11相當、且要求變化最少的人源化變體是F(ab)-12。該變體只有5個人構架殘基被小鼠殘基取代(VL4、VH24、VH37、VH67和VH78)。用分子模型測定這四個殘基。為了提高最初的變體F(ab)-2的結合能力，用分子模型將第5個殘基VH67以及CDR-H2殘基VH60和VH61包括在內。
實施例3組胺釋放試驗引言這是一個大鼠肥大細胞組胺試驗(RMCHA)，它根據抗體阻斷變應原致敏的RBL48細胞釋放組胺的能力來定量測定重組人源化單克隆抗IgE抗體的生物活性。另外，該測定在與人體內相似的生理條件下進行。RBL48細胞系從母代大鼠肥大細胞系RBL2H3衍生獲得，隨後轉染了高親和力人IgE受體(FcεRI)α亞基。Gilfillan A.M.等人，J.Immunol.149(7)2445-2451(1992)。
方法使RBL48細胞(Gilfillan等人，同上)在潤溼的5％CO2培養箱(Fischer，#610型)於T175組織培養瓶(Falcon#3028)內sIMDM(Iscove改進的Dulbecco培養基，其中添加了10％胎牛血清，2mM穀氨醯胺，和500微克/毫升活性遺傳黴素(Gibco，#860-1811))中37℃生長。收穫細胞，方法是使細胞和PBS/0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA的4毫升溶液37℃接觸2分鐘，然後離心(400xg，10分鐘)並重懸於新鮮sIMDM中。用血細胞計數器(Reichert-Jung)計數懸浮液中的細胞，調節細胞至0.4×106細胞/毫升。然後在96孔U型組織培養板(Linbro)60孔內以100微升/孔(40,000細胞/孔)的密度接種細胞，然後在溼潤的5％CO2培養箱中37℃培養24小時。在用200微升/孔sIMDM通過吸放洗滌一次後，使細胞和90微升/孔含豚草特異性IgE(RSIgE，10ng/ml，23.48ng/ml總IgE，1.43％豚草特異性人血漿，North American Biological，批號#42-365054)的試驗稀釋液(sIMDM，3U/ml肝素鈉)預先培育30分鐘。
在預培育期後，將10微升/孔的抗IgE抗體(稀釋在試驗稀釋液中，0.06-39.4微克/毫升)或試驗稀釋液(用於總組胺釋放、本底和豚草對照)加入細胞中，在5％CO2培養箱中37℃培育平板24小時。培育後，抽吸細胞，用200微升/孔的sIMDM洗滌3次。在洗滌後，用100微升/孔的(1)0.5％氚溶液(用於總組胺釋放)、(2)組胺釋放緩衝液(HRB、50％D2O，0.8％NaCl，1.3mM CaCl2，sIMDM，或(3)豚草抗原(NIH#A-601-903A-185，0.1微克/毫升，以HRB配)37℃培育細胞30分鐘，將其置於冰上終止反應。(100％D2O＝100％D2O，0.8％NaCl，1.3mM CaCl2)。
4℃、900xg(2460rpm)離心平板5分鐘，收穫上清液，1/80稀釋在PBS中(對於組胺釋放對照，1/1000稀釋在PBS中)，用組胺酶免疫試驗試劑盒(Immunotech#1153)測定組胺。將上清液(100微升/孔)轉移到含有醯化粉末(每一試劑盒)的醯化試管中並和50微升醯化緩衝液(每一試劑盒)室溫下反應30分鐘。然後將醯化的組胺(50微升/孔)轉移到偶聯平板(每一試劑盒)中，和200微升/孔組胺-乙醯膽鹼酯酶偶聯物(每一試劑盒)4℃培育18小時。
在該培育後，對孔作印跡，並用4X 300微升/孔洗滌緩衝液(Immunotech試劑盒，#1153)洗滌來除去不結合的偶聯物。加入顯色底物(乙醯基硫膽鹼、二硫硝基苯甲酸酯，200微升/孔，每一試劑盒)，於暗處室溫培育30分鐘。加入終止溶液(50微升/孔，每一試劑盒)終止反應，在SLT 340 ATTC平板讀數儀上測定405納米的吸收值和620納米的參比值。從組胺標準曲線(得自酶免疫試驗試劑盒，AMAC)看出，吸收強度和組胺濃度(用nM表示)呈反比。從組胺濃度數據計算總組胺釋放百分數，用100％總組胺釋放計算抑制百分數。結果顯示在圖5中。
歸納和結論抗IgE摩爾比對豚草誘導組胺釋放的抑制百分數的圖線表明，e26抗體的F(ab)形式所具有的豚草誘導組胺釋放性能優於e25抗體的F(ab)形式。E26以依賴於劑量的方法抑制豚草誘導的組胺釋放，半數最大抑制摩爾比為44∶1(抗IgE∶RSIgE)。相反，e25隻在非常高的摩爾比(在200∶1至1550∶1抗IgE∶RSIgE之間)抑制豚草誘導的組胺釋放。e25曲線的半數最大抑制摩爾比估計在400∶1至500∶1之間。因此，根據半數最大抑制摩爾比值數據(它是分子結合親和力的一個衡量標準)，e26分子與RSIgE的結合比e25分子好10倍。
實施例4噬菌體展示實施例引言該實施例描述了通過單價噬菌體展示產生特異性親和力改進的抗IgE抗體，以及選擇衍生自E25人源化抗IgE抗體的F(ab)片段(Presta等人，J.Immunol.1512623(1993))。
方法1.構建單價F(ab)-噬菌體文庫構建了幾個F(ab)文庫。用已知的技術(例如參見Bass等人，Proteins 8309(1990))，使含有VL替代D32E(以消除IsoAsp異構化)的e25變體與噬菌體M13g3p的C端結構域融合，作為起始載體。該質粒稱為p426，顯示於圖10中。首先，用「野生型」F(ab)-噬菌體p426作為模板來構建文庫特異性「終止」模板。通過導入終止密碼子(TAA或TGA)，使原來的分子滅活，從而減少構建文庫時誘變步驟(Lowman Wells，MethodsComp.Methods Enzymol.3205(1991))中的本底效應和模板特異性(雜交)偏性(bias)。用單鏈模板定向誘變和表10列出的寡核苷酸構建這些模板(Kunkel等人，Methods Enzymol.204125(1991))。
隨後，將這些終止模板用於第二輪誘變，採用表11列出的寡核苷酸來產生在每個指定CDR區域中的文庫。用NNS簡併密碼子在每個指定CDR區域內產生所有20種胺基酸。(核苷酸鹼基用單字母IUPAC名稱表示；N＝A、G、C或T；S＝G或C)。用32種不同的可能密碼子在每個隨機化位置用NNS簡併密碼子產生所有20種胺基酸。琥珀終止密碼子(TAG)在這裡採用的抑制系統(即，supE抑制株XL-1 Blue)中編碼Gln；Bullock等人，Biotechnique 5，376(1987)。存在於重鏈抗體結構域和噬菌體上g3p結構域之間的琥珀密碼子允許噬菌體展示的融合蛋白只表達在大腸桿菌琥珀抑制株中，而用相同構建物可在大腸桿菌非抑制株中能獲得可溶性F(ab)蛋白(Lowman等人，Biochemistry 3010832(1991)；Lowman和Wells，Methods Comp.Methods.Enzymol.3205(1991)；Hoogenboom等人，Nucl.Acids Res.194133(1991))。然而，本領域技術人員顯然還可採用用於其它大腸桿菌噬菌體表達系統的其它終止密碼子。
用電穿孔將隨機誘變反應產物轉化到大腸桿菌細胞(Stratagene，XL-1 blue中，使細胞和M13K07輔助噬菌體37℃生長過夜而擴增(Vierra和Messing，Methods Enzymol.153(1987))。
表10用於第一輪誘變的終止模板寡核苷酸
表11用於第二輪誘變的文庫特異的簡併寡核苷酸<
II.噬菌體結合選擇為了親和選擇噬菌體顆粒展示的F(ab)變體，用氯化鈉/聚乙二醇(NaCl/PEG)沉澱從大腸桿菌培養上清液製得噬菌體。將噬菌體懸浮於PBS緩衝液中，然後稀釋到含有0.05％吐溫TM-20，以及作為陰性對照的非展示噬菌體的馬血清(目錄號A-3311-D，Hyclone，Logan，UT)中。作為陽性對照，使「野生型」e426 F(ab)-噬菌體與非展示噬菌體混合併進行模擬選擇。
用50mM碳酸鈉緩衝液(pH9.6)配製的2微克/毫升IgE(人IgE；Genentech批號#9957-36)包被Maxisorp96孔板(Nunc)4℃過夜。然後除去IgE溶液，使平板和馬血清封閉溶液(沒有吐溫TM-20)一起室溫下培育2小時。
除去封閉溶液，將噬菌體溶液在平板上室溫培育1小時。然後，除去噬菌體溶液，用PBS/吐溫TM-20(0.05％)緩衝液洗滌平板10次。在孔中加滿PBS/吐溫，使其再培育10分鐘，然後再洗平板10次。
用20mM HCl洗脫保持結合平板的F(ab)噬菌體，用pH8的Tris-HCl中和，然後如上所述用輔助噬菌體增殖。連續洗脫等份噬菌體，和新鮮的XL-1 Blue細胞混合，接種到合適的抗生素平板上，計數展示F(ab)(抗羧苄青黴素；CFUa)或不展示F(ab)(氯黴素；CFUc)的洗脫噬菌體的CFU數(菌落形成單位數)。每一輪展示F(ab)相對不展示F(ab)噬菌體的富集數(Emut)計算成洗脫合併物的(CFUa/CFUc)除以起始合併物的(CFUa/CFUc)。野生型對照噬菌體的富集數(Ewt)以相同方式計算。
隨後如上所述進行親和選擇，只是在前10次洗滌後每一輪的培育時間增加。為了比較在增加嚴謹性的條件下每輪之間的噬菌體選擇效率，將每一輪的富集係數標準化成野生型對照的富集係數。圖6顯示了每一合併物的結合性富集與野生型的結合性富集之比(Emut/Ewt)。由於在平衡時高親和力變體結合IgE平板的組分應比低親和力變體多，因此親和力較高的變體應被更有效地回收，因此展示出更高的相對富集。實際上，VL1文庫顯示了逐次改進的相對富集，在5-6輪選擇後相對富集比野生型高大約10倍。通過這一衡量標準，VL1文庫顯示出其親和力相對於野生型的改進程度高於VH3文庫。兩組CDR文庫之間結果的不一致性可能反映出VL1為抗原結合提供了更多的能量。或者，e25的VH3 CDR可能已經比VL1 CDR更優化適合IgE結合，從而允許VL1通過側鏈替代在結合相互作用中提供更高的相對改進。
DNA測序表明，第一VL CDR1文庫的大多數F(ab)噬菌體變體(隨機化位置27、28、39和31)具有保守的野生型殘基D30，和優選突變的Y31G(表15，其中第3輪的克隆命名為212-3.x，從第6輪的克隆命名為212-6.x)。儘管在Q27和S28位觀察到各種替代，但是在6輪選擇後噬菌體合併物中主要是含有Q27K和S28P的一種克隆。該克隆還含有較佳的殘基D30和G31，這提示這種側鏈組合對於IgE結合可能是最優的。
在第2個VL CDR1文庫(隨機化位置30、31、32和34)中，大多數選擇子具有保守的野生型殘基D30和E32；在測序的克隆中只觀察到野生型D34。在該文庫，在Y31位發現了各種殘基類型。在兩個克隆213-6.7和213-6.8中發現了額外的一個亂真的突變G33S(表15)。
3輪選擇後VH CDR3文庫的克隆的序列分析表明，該文庫已經基本上集中成一個克隆，即214-3.1，它在101-103位具有野生型殘基，並有替代H105T和H107Y(表15)。
IV.所選F(ab)克隆的噬菌體ELISA試驗為了評價噬菌體結合選擇的結果，將噬菌體轉染入大腸桿菌XL-1 Blue細胞中，在液體培養中增殖或接種到含抗生素平板上。從這些平板隨機挑取克隆進行測序和用競爭性噬菌體-ELISA進行結合分析。(Cunningham等人，EMBO J.132508(1994)；Lowman，《分子生物學方法》第87卷第24章，Cabilly編著，Humana Press Inc.Totawa，NJ(1997))。
為了評價相對的IgE結合親和力，如上所述將噬菌體在包被IgE的平板上滴定，使展示F(ab)的濃度標準化。預先混合噬菌體和連續稀釋的IgE，然後加到包被IgE的平板上，室溫培育1小時。然後用PBS/吐溫洗滌平板10次，加入辣根過氧化物酶和山羊抗家兔的偶聯物混合的家兔抗噬菌體抗體溶液。室溫培育1小時後，用顯色底物鄰苯二胺(Sigma)使平板顯色。加入1/2體積的2.5M硫酸，終止反應，在分光光度平板讀數儀上測定490納米下的光密度。使4參數曲線與每一數據組匹配，測得每一變體的IC50(Lowman，《分子生物學方法》，同上)。根據其IC50與起始噬菌體e426的IC50的比值確定每一克隆噬菌體變體的相對結合親和力(表15-16)。
在一些情況下，全部測試給定輪選擇的噬菌體合併物，以估計對IgE的群體平均相對親和力[IC50(野生型)/IC50(突變型)]。例如，VL CDR1文庫殘基32、33、35和37表明在5輪選擇後親和力只比e426提高了3.6倍，即使該文庫的親代變體(e426)表現出親和力提高25倍。因此，不再繼續研究這些特定殘基的VL-CDR1文庫。另一方面，VH CDR2噬菌體合併物顯示出親和力比其親代e426噬菌體提高6.2倍。
還產生了CDR結構域VL CDR2殘基54-57以及VL CDR3殘基96-98、99和100的噬菌體文庫。然而，這些位置上的胺基酸替代不能產生超過e426的富集。針對VHCDR1殘基26-30產生的噬菌體文庫產生的富集也不超過e26，並且發現主要是汙染性e26噬菌體。這表明在最初文庫中沒有變體的親和力高於e26。
表15中報導了CDR結構域VL CDR1殘基27、28、30、31、32、34以及VH CDR1殘基101、102、103、105和107的噬菌體文庫，而表16中報導了VH CDR2。在表15和16中，對未表現出親和力顯著高於e26的克隆文庫不作繼續研究，也不測定結合性能提高係數。
表15IgE結合性能選擇(產生)的F(ab)-噬菌體克隆
表16VH CDR2噬菌體克隆<
注意估計群體平均相對噬菌體親和力比e426高6.2倍。
V.噬菌體篩選得到的組合突變蛋白質中不同位點處突變通常展示出對蛋白功能的加和效應(Wells，Biochemistry298509(1990))。因此，組合上述初始噬菌體文庫的幾個突變，以改進與IgE的結合。
為了減小提高抗IgE抗體免疫原性的可能性，需要使E-25的突變程度減小到最低程度。因此，只採用在獨立測定時展示出親和力提高程度最大的噬菌體變體的突變。另外，給定噬菌體克隆被觀察到的頻率可能與表達水平和/或蛋白水解穩定性有關(LowamanWells，1991，同上)。從VL1文庫選擇一個特定克隆212-6.7，重新命名為e26，因為它在噬菌體-ELISA試驗中表現出親和力比e426高25倍(表17)。
VH CDR2文庫也表現出親和力比e426有所改進，雖然測得的這一提高是對合併噬菌體測定而言為6.2倍。該合併噬菌體親和力表明合併物中的至少一些成員具有改進的結合親和力，而不必測定所有單個成員的親和力。用合併噬菌體還能鑑定在給定輪後親和力增強了多少，是否應繼續親和力選擇(即一旦合併物的親和力達到最大值，隨後輪選擇不可能提供額外的富集)。因此，合併物親和力數據是一種非常有用的篩選工具。
顯然，VH CDR2區域中的突變可以和VL CDR1中的那些突變加和起作用，因為在晶體結構和分子模型中，VH CDR2環遠離VL CDR1環。
然而，由於這些突變的一些組合可能不相容，我們測試了四個不同的組合突變體e26與克隆235-5.1、235-5.2、235-5.3和235-5.4中發現的突變組合(表17)。這些構建物用e26 F(ab)噬菌體作為模板，用編碼VH2突變的誘變性寡核苷酸通過Kunkel誘變(Kunkel等人，Methods Enzymol.204125(1991))來製得。
用噬菌體ELISA試驗(Lowman，《分子生物學方法》第87卷，Cabilly編輯，HumanaPress Inc.，Totawa，NJ(1997))比較e26中VL CDR1突變和克隆235-5.1、235-5.2、235-5.3和235-5.4中VH CDR2突變的組合形成的最終變體。還製得可溶性F(ab)蛋白，在生物素-IgE平板試驗中比較，報導在下表17和圖7中。
表17
VI.生物素平板試驗(FcERI-IgG嵌合體競爭試驗)引言本實施例的目的是為了比較在抗IgE F(ab)和生物素-IgE同時加入包被IgE受體嵌合體的平板中時，不同的抗IgE F(ab)是如何與固定化高親和力IgE受體IgG嵌合體，競爭結合溶液相內生物素化的人IgE。隨著抗IgE F(ab)濃度的增加，能結合平板上受體的生物素IgE的量減少，產生低的光密度值(經分光光度計測得)。
通過加入等份100微升的1微克/毫升原液(以50nm碳酸鈉緩衝液(pH9.6)配)，用100微克/孔的FcεRI-IgG(Haak-Frendsho等人，J.Immunol.151，352(1993)(Genentech，批號#2148-74(6.4毫克/毫升))4℃包被Nuc maxisorp平板(目錄號F96)12至24小時。用ELISA洗滌緩衝液(0.05％聚山梨醇酯20(Sigma)，以PBS配製，pH7.4)洗滌平板3次，通過和200微升ELISA試驗緩衝液(Tris緩衝鹽溶液，pH4.45，含0.5％RIA級牛血清白蛋白，Sigma；0.05％聚山梨醇酯20和4mM EDTA)一起培育60分鐘進行封閉。用洗滌緩衝液洗3次後，將100微升連續2倍稀釋的試驗緩衝液中初始濃度為200nM的抗IgE F(ab)加入ELISA平板中一式三份。用Titertek多通道移液管進行稀釋。將試驗緩衝液(100微升，0.5毫克/毫升原液1/500稀釋)配的生物素化IgE加入所有孔內，在微軌道搖動器(Bellco)上25℃培育混合物60分鐘。從U266B1骨髓瘤(ATCC TIB196)培養上清液中親和純化出IgE，用生物胞素醯肼生物素化(O′Shannessy等人，Immunol Lett.8273(1984)；Pierce Chemical)。用洗滌緩衝液洗滌樣品5次，結合的IgE用1∶3000的100微升過氧化物酶偶聯的鏈黴親和素(Zymed)檢測90分鐘。然後用洗滌緩衝液再洗6次，加入100微升底物溶液(400微克/毫升鄰苯二胺二鹽酸鹽和4mM H2O2，以PBS配製)，培育6分鐘。然後用4.5M硫酸(100微升)終止反應，在Uvmax微量板讀數儀(Molecular Devices)上讀取490納米吸收值。圖8中繪出了e25、e26和e27 F(ab)抗體片段不同F(ab)濃度水平的吸收值。
結論圖8中曲線表明，E26和E27對高親和力受體的親和力高於E25，E27顯示出最高的親和力。
VII.可溶性F(ab)蛋白的BIAcore試驗從用BIAcoreTM-2000表面等離子體共振系統(BIAcore，Inc.)測得的締合和解離速率常數計算出幾種F(ab)片段的受體結合親和力(Lofas Johnson，J.Chem.Soc.Commun.21，1526-1528(1990))。根據生產商(BIAcore)說明書，用N-乙基N′-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化生物傳感器晶片來共價連接IgE。將IgE稀釋到10nM乙酸鈉緩衝液(pH4.5)中，再將其進一步稀釋成大約30微克/毫升，然後注射在晶片上，獲得800-12400固定化物質響應單位(RU)的信號，由於RU中的信號與固定化物質的質量成比例，這表示基質上的固定化IgE密度範圍約為0.4-6.5皮摩爾/平方釐米。最後，注射1M乙醇胺作為封閉劑。用4.5MMgCl2再生。
為了動力學測定，在25℃以20微升/毫升的流速將1.5倍連續稀釋的F(ab)抗體片段(以PBS/吐溫緩衝液配製(0.05％吐溫-20，磷酸鹽緩衝液配製))注射到IgE晶片上[圖9]。
將解離數據與單點(one-site)模型匹配，以獲得koff±s.d.(測定值的標準偏差)。計算每一締合曲線的擬一級速率常數(ks)，繪成蛋白濃度函數以獲得kon±s.e.(匹配值的標準誤差)。從SPR測定值計算Fab∶IgE結合的平衡解離常數Kd(koff/kon)。在不存在實驗人為現象(如解離的F(ab)重新結合)時，觀察到的離去速度不依賴於F(ab)濃度。同樣，由於平衡解離常數Kd與koff成反比，假定所有變體的締合速率(kon)是恆定的，則可以估計親和力提高倍數。表18中顯示了離去速率以及計算出的解離半衰期。
表18解離動力學
WIII.F(ab)表達和純化在大腸桿菌菌株34B8中表達抗IgE F(ab)E-25(Presta等人，J.Immunol.1512623-2632(1993))和衍生自p426的噬菌粒中的變體(圖10)。37℃培育含50微克/毫升羧苄青黴素的2YT培養基中的牙籤培養物(10毫升)8小時，然後轉移到1升含50微克/毫升羧苄青黴素的修飾的AP-5中，37℃培育24小時。4℃、7000rpm離心500毫升瓶中培養物15分鐘。-20℃冷凍沉澱至少3小時。將每500毫升沉澱懸浮於12.5毫升冰冷的25％蔗糖(用4℃、含1mM苄脒的50mM Tris pH8.0配製)中。4℃攪拌3小時，使懸浮液溶解。4℃、18000rpm離心懸浮液15分鐘，用蛋白G(Pharmacia)親和層析純化上清液中表達的F(ab)。用10mM Tris(pH6.7)和1mM EDTA(pH8.0)的溶液洗柱，用2.5倍柱體積的100mM乙酸(pH3.0)洗脫F(ab)，立即用0.5體積的1M TrispH8.0返回中性pH。用centricon 30 microcentrator(Amicon)濃縮洗脫液並用PBS交換緩衝液。用分光光度計(Beckman DU64)測定280nM下吸收值，以確定蛋白濃度，在5％β-巰基乙醇的還原條件下用4-20％SDS PAGE凝膠(Novex)評價樣品純度。
IX.結果和結論噬菌體-ELISA競爭性實驗的結果表明，儘管e26 F(ab)-噬菌體的親和力比e426提高約9倍，但是組合變體e695、e696和e697比e426-噬菌體提高20-40倍。噬菌體衍生的突變的疊加組合能產生具有類似改進的親和力的抗體變體。
當在生物素-IgE平板試驗中測試F(ab)可溶性蛋白時，e26 F(ab)和e27 F(ab)在抑制IgE結合FcεRI-IgG方面分別比e25提高大約10倍和30倍。BIAcore分析的離去速率測定支持了這些相對親和力。特別是，e26和e27顯示出離去速率比e25低7.7倍和22倍。更長的半衰期意味著，IgE被「佔據」或不能更長時間地結合高親和力受體，因此導致抗IgE治療劑的效能提高。
因此，平衡和動力學結合數據均支持了這樣一個結論，即e26和e27 F(ab)與IgE的結合分別比e25牢固大約10倍和30倍。含有相應F(ab)突變的全長抗體(IgG)預計將展示出和e25 IgG相似的相對親和力。序列表(1)一般信息(i)申請人Genentech，Inc.(ii)發明名稱改進的抗IgE抗體以及改進多肽的方法(iii)序列數目26(iv)通信地址(A)地址Genentech，Inc.
(B)街道1 DNA Way(C)城市South San Francisco(D)州California(E)國家USA(F)ZIP94080(v)計算機可讀形式(A)記錄介質類型3.5英寸，1.44Mb軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體WinPatin(Genentech)(vi)本申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Svoboda，Craig G.
(B)登記號39,044(C)參考/案卷號P1123PCT(ix)通訊信息(A)電話650/225-1489(B)電傳650/952-9881(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度6127鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(xi)序列描述SEQ ID NO1GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC 50TCATTGCTGA GTTGTTATTT AAGCTTGCCC AAAAAGAAGA AGAGTCGAAT 100GAACTGTGTG CGCAGGTAGA AGCTTTGGAG ATTATCGTCA CTGCAATGCT 150TCGCAATATG GCGCAAAATG ACCAACAGCG GTTGATTGAT CAGGTAGAGG 200GGGCGCTGTA CGAGGTAAAG CCCGATGCCA GCATTCCTGA CGACGATACG 250GAGCTGCTGC GCGATTACGT AAAGAAGTTA TTGAAGCATC CTCGTCAGTA 300AAAAGTTAAT CTTTTCAACA GCTGTCATAA AGTTGTCACG GCCGAGACTT 350ATAGTCGCTT TGTTTTTATT TTTTAATGTA TTTGTAACTA GAATTCGAGC 400TCGGTACCCG GGGATCCTCT CGAGGTTGAG GTGATTTTAT GAAAAAGAAT 450ATCGCATTTC TTCTTGCATC TATGTTCGTT TTTTCTATTG CTACAAACGC 500GTACGCTGAT ATCCAGCTGA CCCAGTCCCC GAGCTCCCTG TCCGCCTCTG 550TGGGCGATAG GGTCACCATC ACCTGCCGTG CCAGTCAGAG CGTCGATTAC 600GAAGGTGATA GCTACCTGAA CTGGTATCAA CAGAAACCAG GAAAAGCTCC 650GAAACTACTG ATTTACGCGG CCTCGTACCT GGAGTCTGGA GTCCCTTCTC 700GCTTCTCTGG ATCCGGTTCT GGGACGGATT 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Ser Arg Glu350 355 360Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly365 370 375Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln380 385 390Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp395 400 405Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg410 415 420Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala425 430 435Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly440 445 450Lys451(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度218胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO19Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp20 25 30Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser50 55 60Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr80 85 90Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly95 100 105Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe110 115 120Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser125 130 135Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val140 145 150Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu155 160 165Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser170 175 180Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val185 190 195Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr200 205 210Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys215 218(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度229胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO20Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr50 55 60Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser65 70 75Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His95 100 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser110 115 120Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser125 130 135Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val140 145 150Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly155 160 165Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser170 175 180Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser185 190 195Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro200 205 210Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp215 220 225Lys Thr His Thr229(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵
(A)長度229胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO21Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr50 55 60Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser65 70 75Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His95 100 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser110 115 120Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser125 130 135Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val140 145 150Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly155 160 165Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser170 175 180Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser185 190 195Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro200 205 210Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp215 220 225Lys Thr His Thr
229(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特徵(A)長度248胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO22Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr50 55 60Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser65 70 75Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His95 100 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser110 115 120Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly125 130 135Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser140 145 150Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val155 160 165Asp Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro170 175 180Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu185 190 195Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp200 205 210Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr215 220 225Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln230 235 240Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg245 248(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特徵(A)長度248胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO23Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr50 55 60Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser65 70 75Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His95 100 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser110 115 120Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly125 130 135Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser140 145 150Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val155 160 165Asp Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro170 175 180Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu185 190 195Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp200 205 210Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr215 220 225Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln230 235 240Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg245 248(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特徵(A)長度218胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO24Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Pro Val Asp20 25 30Gly Glu Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly35 40 45Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser50 55 60Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr80 85 90Tyr Cys Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly95 100 105Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe110 115 120Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
125 130 135Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val140 145 150Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu155 160 165Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser170 175 180Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val185 190 195Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr200 205 210Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys215 218(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特徵(A)長度233胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO25Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr50 55 60Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser65 70 75Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His95 100 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser110 115 120Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser125 130 135Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val140 145 150Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly155 160 165Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser170 175 180Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser185 190 195Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro200 205 210Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp215 220 225Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys230 233(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特徵(A)長度233胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO26Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr20 25 30Ser Gly Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly35 40 45Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Lys Tyr Ser Gly Glu Thr Lys Tyr50 55 60Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser65 70 75Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His95 100 105Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser110 115 120Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser125 130 135Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val140 145 150Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly155 160 165Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser170 175 180Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser185 190 195Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro200 205 210Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp215 220 225Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys230 23權利要求
1.一種調節多肽對靶分子親和力的方法，該方法包括a)鑑定傾向於異構化的天冬氨醯基殘基；和b)用替換殘基替代，並篩選所得突變體對靶分子的親和力。
2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟b)用噬菌體展示來使親和力成熟。
3.根據權利要求2所述的方法，其中多肽是抗體。
4.根據權利要求3所述的方法，其中抗體是抗IgE抗體，靶分子是IgE。
5.根據權利要求4所述的方法，其中抗體是圖12所示＂E25＂的序列[SEQ ID NO13-14]。
6.根據權利要求5所述的方法，其中替代的殘基是輕鏈可變區CDR1殘基Asp32Glu，Gln27Lys和Ser28Pro。
7.根據權利要求6所述的方法，其中額外的替代殘基是重鏈可變區CDR2殘基Thr53Lys，Asp55Ser，Ser57Glu和Asn59Lys。
8.一種抗體分子，它包含選自F(ab)片段[SEQ ID NO19-20]、sFv片段[SEQ IDNO22]或F(ab′)2[SEQ ID NO24-25]的e26序列。
9.一種抗體分子，它具有與圖12的＂e26＂序列[SEQ ID NO15-16]基本上相同的序列。
10.一種抗體分子，它包含選自F(ab)片段[SEQ ID NO19和21]、sFv片段[SEQID NO23]或F(ab′)2[SEQ ID NO24和26]的e27序列。
11.一種抗體分子，它具有與圖12的＂e27＂序列[SEQ ID NO17-18]基本上相同的序列。
12.一種改進的抗體或其功能性片段，它因採用權利要求1所述的方法而具有改進的抑制豚草誘導組胺釋放的性能。
13.一種改進的抗體或其功能性片段，它因採用權利要求2所述的方法而具有改進的抑制豚草誘導組胺釋放的性能。
14.一種核酸分子，它具有編碼選自F(ab)、sFv和F(ab′)2的e26抗體片段的序列。
15.一種核酸分子，它具有與編碼e26的序列基本上相同的序列。
16.一種核酸分子，它具有編碼選自F(ab)、sFv和F(ab′)2的e27抗體片段的序列。
17.一種核酸分子，它具有與編碼e27的序列基本上相同的序列。
18.一種核酸分子，它編碼的抗體因採用權利要求1所述的方法而具有改進的抑制豚草誘導組胺釋放的性能。
19.一種核酸分子，它編碼的抗體因採用權利要求2所述的方法而具有改進的抑制豚草誘導組胺釋放的性能。
20.一種組合物，它包含藥學上可接受的賦形劑與e26抗體分子的混合物，該抗體分子具有選自F(ab)[SEQ ID NO19-20]；sFv[SEQ ID NO22]和F(ab′)2[SEQ IDNO24-25]的序列。
21.一種組合物，它包含藥學上可接受的賦形劑和抗體的混合物，該抗體具有的序列與圖12的＂e26＂[SEQ ID NO15-16]基本上相似。
22.一種組合物，它包含藥學上可接受的賦形劑和e27抗體分子的混合物，該抗體分子具有選自F(ab)[SEQ ID NO19和20]、sFv[SEQ ID NO23]和F(ab′)2[SEQ IDNO24和26]的序列。
23.一種組合物，它包含藥學上可接受的賦形劑和抗體分子的混合物，該抗體分子具有的序列與圖12的＂e27＂[SEQ ID NO17-18]基本上相似。
24.一種減少或防止哺乳動物體內IgE介導產生組胺的方法，該方法包括給予治療有效量的e26抗體，該抗體具有選自F(ab)[SEQ ID NO1 9-20]、sFv[SEQ ID NO22]和F(ab′)2[SEQ ID NO24-25]的序列。
25.一種減少或防止哺乳動物體內IgE介導產生組胺的方法，該方法包括給予治療有效量的抗體，該抗體具有的序列與圖12的＂e26＂[SEQ ID NO15-16]基本上相似。
26.一種減少或防止哺乳動物體內IgE介導產生組胺的方法，該方法包括給予治療有效量的e27抗體，該抗體具有選自SEQ ID NO15-16的序列。
27.一種減少或防止哺乳動物體內IgE介導產生組胺的方法，該方法包括給予治療有效量的抗體，該抗體具有的序列與圖12的＂e27＂[SEQ ID NO17-18]基本上相似。
28.一種治療IgE介導疾病的方法，該方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的選自F(ab)[SEQ ID NO19-20]、sFv[SEQ ID NO22]和F(ab′)2[SEQ ID NO24-25]的e26抗體序列片段。
29.一種治療IgE介導疾病的方法，該方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的抗體，該抗體具有的序列與圖12的＂e26＂[SEQ ID NO15-16]基本上相似。
30.一種治療IgE介導疾病的方法，該方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的e27抗體分子，該抗體分子具有選自SEQ ID NO15-16的序列片段。
31.一種治療IgE介導疾病的方法，該方法包括給予需要治療的哺乳動物治療有效量的抗體分子，該抗體分子具有的序列與圖12的＂e27＂[SEQ ID NO17-18]基本上相似。
全文摘要
本發明涉及一種通過多步組合來調節多肽對靶分子親和力的方法,該方法包括下列步驟:(1)鑑定傾向於異構化的天冬氨醯基殘基;(2)以替換殘基替代和篩選所得突變體對靶分子的親和力。在一個較佳的實例中,替代殘基的方法是用噬菌體展示的親和力成熟法(AMPD)。在另一個較佳的實例中,多肽是抗體,靶分子是抗原。在另一個較佳的實例中,抗體是抗IgE,靶分子是IgE。在另一個實例中,本發明涉及具有對IgE親和力有所改進的抗IgE抗體。
文檔編號A61K38/00GK1268176SQ98808431
公開日2000年9月27日 申請日期1998年6月30日 優先權日1997年7月2日
發明者H·B·洛曼, L·G·普雷斯塔, P·M·雅迪厄, J·洛 申請人:基因技術股份有限公司