用於乳腺癌的預後的方法和試劑盒的製作方法

2023-09-09 20:15:20 2

專利名稱：用於乳腺癌的預後的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於乳腺癌的預後的方法和試劑盒，包括其部分。具體地，本方法包括鑑定出指示乳腺癌患者的生存可能性和/或正接受乳腺癌治療的或已經治療的患者的疾病復發可能性和/或癌症的轉移特性的基因表達模式。
背景技術：
乳腺癌是英國、美國和丹麥最為常見的女性癌症。它也是工業化國家最常見的累及婦女的癌症類型。乳腺癌的發生率正在逐漸增加，在美國，它是第二常見的癌症死亡原因。事實上，在1997年，估計美國報導了181,000例新發病例，並且估計每年有40,000人死於乳腺癌。儘管全球已經進行了對抗這種病症的努力，但是乳腺癌的發病率只發生了很小的變化，雖然早期檢測和新的治療方法在過去的數十年裡已經少量地提高了生存率。
雖然絕大多數乳腺癌的腫瘤發生機制在很大程度上還很不清楚，但是多種因素能使得一些婦女容易發生乳腺癌。這些因素包括生育史、月經情況、腫瘤分級、ER狀態、腫瘤大小以及診斷和手術時的淋巴結受累。另外，用乳腺照相術或其他x線顯像方法可以不同程度地確定出預後。但是，乳腺照相術並非沒有危險，並且在檢查中所用射線的電離性質可能會誘髮乳腺腫瘤。另外，這些方法都是昂貴的，並且結果可被不同的技術人員不同地解讀。例如，一個研究顯示在一組被一組放射學家所解讀的乳腺照相中，約三分之一有著較大的臨床不一致。此外，許多婦女發現進行乳腺照相術是一種痛苦的經歷。
在臨床實踐中，疾病的預後是重要的，因為它決定了將會給予的治療。正確的預後可以使得腫瘤學家例如優先施用激素治療或化療，並且僅在最為侵襲性的癌症病例中才推薦手術治療。
但是，早期診斷已經成為乳腺癌的常見特點，因為越來越多的患者現在都呈現出非常早期的疾病。這使得評價癌癥結局的傳統方法變得更為困難，癌症類型和治療的時機都是患者應答好或壞的關鍵，這一點已經變得越來越明顯。例如，許多患者可能正接受不必要的治療，所述治療常常會引起毒性副作用，而其他患者可能採取保守的治療策略，事實上癌症比所預想的更為進展。因此，在早期作出正確的和準確的預後判斷是至關重要的。
至今還沒有鑑定出一組令人滿意的單獨基於臨床信息的預後預測物。因此，研究已經轉向於關注可以診斷癌症並預測癌症預後的分子標記(signature)。WO02/103320闡述了數千個遺傳標誌物，所述標誌物的表達與臨床預後有關，其可以被用於區分預後良好的和預後差的患者。確定表達的方法包括將取自患者的組織測試樣品的表達模式與取自預後良好的患者的組織樣品的表達模式進行比較，也與取自已知預後差的患者的樣品的表達模式進行比較，並確定出測試樣品的表達模式與哪個樣品的表達模式最為相符。
儘管該方法學比判斷預後的傳統臨床方法有所改進，但是它的確具有很多缺點。例如，分析數百個基因標誌物要花費相當多的時間，並且本身並不實際。此外，還不清楚表達一些好的預後標誌物和一些壞的預後標誌物的樣品是否會給出模稜兩可的預後。因此，由於方法學的複雜性，這種方法可能是不正確的，意思是患者將會被列入錯誤的預後組，因為他們表達一組中的基因多於另一組，或者這可能不能提供明確的答案。如上所述，早期的和正確的預後對於適當的和有效的治療是重要的。因此，很明顯需要更簡單的、更明確的分子標記。
我們因此開發出了用於確定給定乳腺癌的預後的方法，其相對容易進行，有效實施並能提供關於疾病的可能結局的正確指示。我們的方法使用小的但有高度代表性的標誌物樣本，因此能特別準確地確定出給定癌症的可能結局。此外，我們的方法可以分成三個組分第一個組分預測患有乳腺癌的個體的可能的生存率；第二個組分預測患有乳腺癌的個體的癌症的可能復發率；和第三個組分預測癌症的轉移特徵。對於本領域技術人員顯而易見的是，第二個組分因此提示了患有乳腺癌的患者的無發病生存可能性，以及第三個組分提示了疾病的侵襲性質。綜上所述，我們已經鑑定出了多個在確定給定乳腺癌的預後方面具有相關性的分子標記。每個分子標記包括多個遺傳標誌物，與具有中等預後(見下)的患者的組織相比較，所述遺傳標誌物的表達高或低是給定結局的指示。除此之外，我們已經分析了每個分子標記，以便鑑定出哪些遺傳標誌物是給定疾病的結局的最好的指示物，換句話說即對分子標記的預測能力貢獻最多的那些遺傳標誌物。該標誌物亞組被總稱為改進的(refined)分子標記。
例如，這裡提供了第一個分子標記，其包括兩組分子標誌物，所述標誌物的高表達與低生存率相關；第一組包括那些作為低生存率的統計學最為顯著的指示物的分子標誌物，在此它們全體被稱作第一個主要分子標記[組(A)]AMF、ATF4、Cyr61、ER、Matriptase2、MET、MLN64、MMP7、柄蛋白(Nectin)4、PAR1A、Psoriason、Pttg1、Rho-C、Scotin、SDF1、SEMP1、SPF45、SST1、ST15、TACC2、TBD10、TCF2、TEM6、TEM7R、ZO-3；和第二組包括前面的分子標誌物加上至少一種下面的分子標誌物，在此全體被稱作第一個次要分子標記[組(B)]Basigin、β-連環蛋白、BMP1、BMP10、Calpain large、CD44、CX43、細胞周期蛋白D2、EHMS、FAK、FAP、GIRK、HAVR1、Isotopo3、JAK1、LOX12、NET-2、PAR1A2、PTHrP、Rho-G、S100A4、SPARC、TCF3、VECAD、Vilip、Wave2。
在此提及上面的和下面的標誌物是引述已命名的蛋白，在www.NCBI.LM.NIH.gov資料庫可以獲得其全部身份，或者為本領域技術人員熟知。
在此所述的高或低表達是相對於相同標誌物在被認為具有中等預後的患者體內的表達水平，所述具有中等預後的患者即具有標準預後指數Nottingham預後指數(NPI)＝3.4-5.4的患者，其中NPI＝0.2×腫瘤大小+腫瘤級別+淋巴結情況，其中NPI(低)＜3.4，86％患者存活15年；NPI(中等)3.4-5.4，42％患者存活15年；NPI(高)＞5.4，13％患者存活5年。
這裡還提供了第二個分子標記，其包括兩組分子標誌物，所述分子標誌物的低表達與低生存率相關，第一組包括那些作為低生存率的統計學最為顯著的指示物的分子標誌物，在此它們全體被稱作第二個主要分子標記[組(C)]ARP2、Atf-3、HuR、MEN1、Paracellin、PTP-RK根蛋白(Radixin)、RH08/gdiG-Ratio；和第二組包括前面的分子標誌物加上至少一種下面的分子標誌物，在此全體被稱作第二個次要分子標記[組(D)]aMOT、Atf-1、Claudin-1、IL-22R、Rock 2 Veg1。
這裡還提供了第三個分子標記，其包括兩組分子標誌物，所述分子標誌物的高表達與低發生率的無癌生存相關，第一組包括那些作為低發生率的無癌生存的統計學最為顯著的指示物的分子標誌物，在此它們全體被稱作第三個主要分子標記[組(E)]AAMP、AMFR、Bmp8、BMP9、β-連環蛋白、CAR、Creb12、DRIM、EHMS、Endomuscin2、FAK、FAP、Isotopo1、Kiss1/ck19、Notch1、PAR1A、Par1A2、PLC-delta、Psoriasin、PTTG1、RhoC、Rock1、SDF1、SST1、ST15、TEM6、TEM7R；和第二組包括前面的分子標誌物加上至少一種下面的分子標誌物，在此全體被稱作第三個次要分子標記[組(F)]血管緊張素2R1、ATF4、Bmp10、CASM、組織蛋白酶(cathepsin)S、CX43、彈性蛋白酶PMN、GIRK、HAVR1、HIN、Isotopo3、Kiss1、LOX12、NOS3、PMSA、S100A4、SEMP1、TACC2、遍在蛋白、WISP2。
這裡還提供了第四個分子標記，其包括兩組分子標誌物，所述分子標誌物的低表達與低發生率的無癌生存相關，第一組包括那些作為低發生率的無癌生存的統計學最為顯著的指示物的分子標誌物，在此它們全體被稱作第四個主要分子標記[組(G)]Bmp3、IL22R、IL24、JAK1、PTP-RK、Rho8/GdiG、Snail、WASP；和第二組包括前面的分子標誌物加上至少一種下面的分子標誌物，在此全體被稱作第四個次要分子標記[組(H)]ATF3、Bmp4、BMPR1A、MEN1、Paracellin。
這裡還提供了第五個分子標記，其包括兩組分子標誌物，所述分子標誌物的高表達與轉移癌相關，第一組包括那些作為轉移癌的統計學最為顯著的指示物的分子標誌物，在此它們全體被稱作第五個主要分子標記[組(I)]BAF57、BNDF、CAR1、CASM、組織蛋白酶-L、Creb1/2、CXCR10、DRIM、HERG、IL-7R、IL-11、Kiss1、MKK1、PMN-彈性蛋白酶、PTTP1、SDF5、TACC2、遍在蛋白、VIPR1、VUDP；和第二組包括前面的分子標誌物加上至少一種下面的分子標誌物，在此全體被稱作第五個次要分子標記[組(J)]Angiomotin、BMP7、細胞周期蛋白D1、DNA連接酶-1、IGFBP7、LYVE1、NET2、RHO8、SRBC、Stath4、TGAse-3、粘著斑蛋白(Vinculin)、WAVE2。
最後，這裡還提供了第六個分子標記，其包括兩組分子標誌物，所述分子標誌物的低表達與轉移癌相關，第一組包括那些作為轉移癌的統計學最為顯著的指示物的分子標誌物，在此全體被稱作第六個主要分子標記[組(K)]Paracellin；和第二組包括前面的分子標誌物加上至少一種下面的分子標誌物，在此它們全體被稱作第六個次要分子標記[組(L)]ALCAM、Eplin、ERbeta、Glypic3、JAK1、MAGI-1、PEDF、PKC-eta、Stathlin、WWOX。
我們因此已經確定出了至少六個分子標記，包括12組分子標誌物(6組主要和6組次要標誌物)，其可以用於乳腺癌的預後。對這些標記的闡明包含了十多年的工作，期間我們已經系統地和仔細地檢查了數百個乳腺癌組織樣品以及成百上千多個遺傳分子標誌物。但是，在完成這個艱辛的工作後，我們驚訝地發現事實上對於提供給定乳腺癌組織樣品的正確預後，只需要檢查非常少的基因。甚至令人更驚訝的是，通過鑑定出對於我們的分子標記的預測結局貢獻最多的那些分子標誌物，我們能進一步地減少這個數目，例如對於與轉移癌相關的分子標記，只需要檢查20/21個基因。這意味著我們的方法學具有直接應用，在臨床上可以快速地和常規地實施。事實上，我們建議我們的方法學作為乳腺癌患者的標準治療方案的一部分，使得相關腫瘤學家在早期就能確定出特定疾病的結局，並能因此相應匹配治療。因此，例如對於具有提示低生存率或淋巴結轉移(即癌症可能播散)的標記的個體，可能要給予即刻的和攻擊形式的治療。同樣，當個體具有提示低無病生存率的標記，且因此更有可能出現疾病復發時，可能需要更頻繁的隨診和檢測。相反地，如果個體具有提示無轉移的標記，腫瘤學家可以給予侵入性和攻擊性較低的治療，據此使患者免於任何不必要的痛苦和不需要的副作用。我們的方法因此不僅能保證個體接受適應於他們的遺傳構成的治療，還能提高患者在治療期間的生活質量，通過保證只在必需的病例中給予攻擊性的治療。
因此，在本發明的一個方面，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查取自個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(A)中的分子標誌物的基因的表達水平；和(b)如果確定出這些標誌物的高水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有低的生存可能性。
在本發明的另一個優選的實施方式中，所述的方法學在其部分(a)中還包括確定編碼組(B)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否具有高表達水平；和/或確定編碼組(C)中的分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否表達不足(underexpressed)；和/或確定編碼組(D)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否表達不足；以及如果鑑定出上面的表達模式，則推斷所述個體具有低的生存可能性。
在本發明的進一步的方面，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(C)中的分子標誌物的基因的表達水平；和(b)如果確定出這些標誌物的低水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有低的生存可能性。
在本發明的另一個優選的實施方式中，所述方法學在其部分(a)中另外地或可選地包括確定編碼組(D)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否表達不足，如果它們是表達不足，則推斷個體具有低的生存可能性。
在本發明的這個方面的另一個優選的實施方式中，所述方法學在其部分(a)中還包括確定組(A)中的基因和/或組(B)中的至少一個基因的表達水平，以確定出這些基因是否是過量表達的，如果它們是過量表達的，則推斷個體具有低的生存可能性。
在本發明的進一步的方面中，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(E)中的分子標誌物的基因的表達水平；和(b)如果確定出這些標誌物的高水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有高的癌症復發可能性。
在此所述癌症復發包括指癌症的局部復發(在乳腺或在遠處部位)或者指轉移。
在本發明的另一個優選的實施方式中，所述的方法學在其部分(a)中還包括確定編碼組(F)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否具有高表達水平；和/或確定編碼組(G)中的分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否表達不足；和/或確定編碼組(H)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否表達不足；以及如果鑑定出上面的表達模式，則推斷所述個體具有高的癌症復發可能性。
在本發明的進一步的方面，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(G)中的分子標誌物的基因的表達水平；和(b)如果確定出這些標誌物的低水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有高的癌症復發可能性。
在本發明的另一個優選的實施方式中，所述方法學在其部分(a)中另外地或可選地包括確定編碼組(H)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否表達不足，如果它們是表達不足的，則推斷個體具有高的癌症復發可能性。
在本發明的這個方面的另一個優選的實施方式中，所述方法學在其部分(a)中還包括確定組(E)中的基因和/或組(F)中的至少一個基因的表達水平，以確定出這些基因是否是過量表達的，如果它們是過量表達的，則推斷個體具有高的癌症復發可能性。
在本發明的進一步的方面，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(I)中的分子標誌物的基因的表達水平；和(b)如果確定出這些標誌物的高水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有轉移形式的癌症。
在本發明的另一個優選的實施方式中，所述的方法學在其部分(a)中還包括確定編碼組(J)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否具有高表達水平；和/或確定編碼組(K)中的分子標誌物的基因的表達水平，以確定出該基因是否表達不足；和/或確定編碼組(L)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否表達不足；以及如果鑑定出上面的表達模式，則推斷所述個體具有轉移形式的癌症。
在本發明的進一步的方面，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼組(K)中的分子標誌物的基因的表達水平；和(b)如果確定出該標誌物的低水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有轉移形式的癌症。
在本發明的另一個優選的實施方式中，所述方法學在其部分(a)中另外地或可選地包括確定編碼組(L)中的至少一個分子標誌物的基因的表達水平，以確定出這些基因是否表達不足，如果它們是表達不足，則推斷個體具有轉移形式的癌症。
在本發明的這個方面的另一個優選的實施方式中，所述方法學在其部分(a)中還包括確定組(I)中的基因和/或組(J)中的至少一個基因的表達水平，以確定出這些基因是否是過量表達的，如果它們是過量表達的，則推斷個體具有轉移形式的癌症。
在本發明的進一步的方面中，提供了所有上面提及的方法的任何選擇的組合。
在上述每個本發明方法中，該檢測理想地實施於人類乳腺癌組織，以及更優選地實施於人類女性乳腺癌組織。
在上述每個本發明方法中，理想地，對所檢查的組織樣品檢測RNA的存在，優選地是總RNA，以及仍更優選地是mRNA的量。對本領域技術人員顯而易見的是，用於檢測RNA含量的技術是公知的，並且實際上是臨床診斷領域中的技術人員常規地實行的。
在本發明的可選的實施方式中，方法包括檢測每種分子標誌物所編碼的蛋白，因此通常(但不排外)包括應用與相關蛋白結合併因此鑑定所述蛋白的試劑。常用的試劑是抗體，以及最理想地是單克隆抗體，所述單克隆抗體有利地已經被合適的標籤標記，據此可以確定出結合抗體的存在。用於鑑定蛋白的檢測技術對於本領域技術人員是熟知的，並且實際上為臨床診斷領域的人員每日使用。
另外，本發明的方法學可以包括在鑑定所選的標誌物之前擴增所選的標誌物，在這種情況中，通常用PCR反應實施擴增，其中使用對所述分子標誌物特異性的寡核苷酸探針，以便在確定其存在之前擴增所述分子標誌物，並考慮擴增程度而確定其量。
在實現本發明的其它優選的方法中，參照對照樣品確定出給定分子標誌物的表達水平，其中對照樣品是無癌症的乳腺組織樣品或者是來自具有在此所定義的中等預後的患者的乳腺組織樣品。更理想地是，該乳腺組織樣品取自未呈現該疾病的個體。可選地，對照是公認的每個相關基因在健康個體中的表達的標準物。
利用實時定量PCR可以測定出基因表達的水平，利用在Jiang等2003a或Parr和Jiang2004中所述的方法。
生存可能性表示患者將在未來的10年存活的可能性。復發可能性表示癌症將在10年內復發的可能性。轉移形式的癌症表示癌症將從起源的器官或組織播散到機體的另一個部分。
根據本發明的進一步的方面，提供了用於實施任何一種或多種上面所提及的方法的試劑盒，其中所述試劑盒包括(a)多個用於檢測至少一組在上面提及的方法中所述的分子標誌物的探針；和(b)任選地，與所述探針應用有關的試劑和說明書。
在本發明的另一個優選的方面，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的試劑盒，其包括(a)多個用於鑑定組(A)中的每個基因的至少一種轉錄物的探針；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
在本發明的進一步的實施方式中，所述試劑盒還包括(a)多個探針，其用於鑑定組(C)中的每個基因的至少一種轉錄物，和/或組(B)或(D)中的至少一個基因的至少一種轉錄物；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
在本發明的另一個優選的方面，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的試劑盒，其包括(a)多個用於鑑定組(E)中的每個基因的至少一種轉錄物的探針；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
在本發明的進一步的優選方面中，所述試劑盒還包括(a)多個探針，其用於鑑定組(G)中的每個基因的至少一種轉錄物，和/或組(F)或(H)中的至少一個基因的至少一種轉錄物；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
在本發明的另一個優選的方面，提供了用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的試劑盒，其包括(a)多個用於鑑定組(I)中的每個基因的至少一種轉錄物的探針；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
在本發明的另一個優選的方面，所述試劑盒還包括(a)多個探針，其用於鑑定組(K)中的每個基因的至少一種轉錄物，和/或組(J)或(L)中的至少一個基因的至少一種轉錄物；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
在本發明的進一步的方面，提供了包括上面提及的用於鑑定上面提及的分子標誌物組的探針組的任何選擇組合的試劑盒。
根據本發明的進一步的方面，提供了包括任何一個或多個上面提及的用於鑑定任何一個或多個上面提及的分子標誌物組的表達水平的探針組的微陣列。
在本發明的另一個方面，提供了用於確定患者的生存和/或乳腺癌復發的可能性和/或癌症的轉移性質的試劑盒，所述試劑盒包括(a)至少一個包括多個用於鑑定至少一組在上面方法中所述的分子標誌物的探針的微陣列；以及任選地(b)第二個包括多個用於鑑定在代表所述標誌物的正常表達水平的內標物中的相同組的分子標誌物的探針的微陣列。
本發明也提供了如上所述的微陣列或探針組。
參照表1-3和

圖1-4，現在將通過下面的實施例描述本發明，其中圖1顯示了表1中的所有標誌物的Kaplan-Meier生存曲線。
圖2顯示了表1中經*標示的標誌物的Kaplan-Meier生存曲線。
圖3顯示了表2中的所有標誌物的Kaplan-Meier生存曲線。
圖4顯示了表2中經*標示的標誌物的Kaplan-Meier生存曲線。
組織和細胞在手術後即刻收集乳腺腫瘤組織以及伴隨的正常組織，並冷凍備用。該試驗經過了當地倫理委員會的許可，試驗主要在1991到1994年間進行，有限的數目是在1995到1996年期間收集的。目前的分析是基於中位數10年的隨診(到2004年6月)。本研究採用了乳腺癌組織(n＝120)和正常背景組織(n＝32)。人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA MB 231、人成纖維細胞細胞系MRC-5購自歐洲動物細胞培養物保藏中心(ECACC，索爾茲伯裡，英國)。人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購自TCS Biologicals(牛津，英國)。在手術後不久或在隨診時獲得病理信息、手術期間或手術後的臨床信息以及患者的臨床結局。
組織處理將乳腺組織冰凍切片。切片被分成了下面的三個部分一個部分用於常規的組織學、一個部分用於免疫組織化學以及另一個部分用於製備RNA。
從細胞和組織中提取RNA以及cDNA合成組織的冰凍切片被切成5-10μm厚度，並留取用於免疫組織化學和常規組織學(Jiang等2003a)。在冰冷RNA提取溶液中，用手執式勻漿器將其他15到20個切片勻漿化。用UV分光光度計測定出RNA濃度。利用AbGeneTM提供的具有錨定寡dt引物的RT試劑盒以及利用1μg總RNA在96孔板中進行逆轉錄。用β-肌動蛋白引物驗證cDNA的質量。RNA提取試劑盒和RT試劑盒都來自AbGene Ltd，Surrey，England，UK。用Beacon Designer(California，USA)設計PCR引物，並經InvitrogenTMLtd(Paisley，Scotland，UK)合成所述引物。分子生物學級的瓊脂糖和DNA梯都來自Invitrogen。用於常規PCR和定量PCR的Mastermix來自AbGene。
遺傳標誌物的定量分析基於由先前報導的方法(Jiang等2003a和2003b)修改的AmplifuorTM技術(Nazarenko et al 1997)，用實時定量PCR從上面製備的cDNA確定出CCN家族成員的轉錄物水平。簡而言之，用BeaconDesigner軟體(第2版，美國加利福尼亞)設計出一對PCR引物。往其中一個引物(在我們實驗室常規向反義引物)中加入稱作Z序列的附加序列(5』actgaacctgaccgtaca』3)，Z序列與通用的Z探針(Nazarenko et at 1997)(Intergen Inc.，England，UK)互補。用於β-肌動蛋白的TaqmanTM檢測試劑盒購自Perkin-ElmerTM。
用下面的試劑進行反應Hot-start Q-master mix(Abgene)、10pmol特異性正向引物，1pmol具有Z序列的反向引物、10pmol FAM標記的探針(Intergen Inc.)、和來自約50ng RNA的cDNA(從RT反應中的起始RNA計算得到)。用裝配有能實時檢測96個反應的光學單元的IcyclerIQTM(Bio-RadTM)進行反應，利用下面的條件94℃12分鐘；50個循環的94℃15秒、55℃40秒以及72℃20分鐘(Jiangetal 2003b，2003c，Parr和Jiang 2004)。從與樣品同時擴增的內標物(Jiang et al 2003a)生成轉錄物的水平。在此用兩種方式顯示了結果基於相同量的RNA的轉錄物水平，或者作為靶/CK19比值。
適宜情況下對分子的免疫組織化學染色用恆冷切片機將乳腺腫瘤和背景組織的冷凍切片切成6μm厚(Jiang et al 2003c)。將切片放置於super frost plus顯微鏡載玻片上，風乾，然後將其在50％丙酮和50％甲醇的混合物中進行固定。然後將切片放置於「Optimax」洗滌緩衝液中5到10分鐘，以便進行再水合。將切片在0.6％BSA封閉溶液中溫育20分鐘，並用第一抗體探測。在充分洗滌之後，將切片在生物素化的第二抗體(Multilink豬抗-山羊/小鼠/兔免疫球蛋白，Dako Inc.)中溫育30分鐘。在洗滌之後，將Avidin Biotin Complex(Vector Laboratories)施用於切片，然後充分洗滌。然後往切片中加入二氨基聯苯胺色原(Vector Labs)，將其在暗處溫育5分鐘。然後在用二甲苯清洗和放上蓋玻片之前，將切片在Gill蘇木精中復染並在漸增等級的甲醇中脫水。利用我們先前所述的Optimas6.0軟體(Davies et al 2000，King et al 2004)定量相應蛋白的胞質染色，並在此用相對染色強度表示。
統計學分析用Mann-Whitney U檢驗和Kruskal-Wallis檢驗進行統計學分析。用Kaplan-Meier生存曲線和單變量分析(SPSS11)進行生存分析。
結果篩選的分子針對於包括10年隨診情況的完整臨床信息，我們已經定量了453個分子。在分析了生存率和疾病復發發生率之後，我們已經開發出了三個標記生存的分子標記和發病預測的分子標記以及轉移的分子標記。
生存的分子標記如表1所示，發現51個分子與低生存率有著正相關，而14個分子與低生存率負相關。圖1顯示，預測92.2％的具有在此被稱為「好標記」(即沒有高表達表1左側欄中的分子以及沒有低表達表1右側欄中的分子)的個體可生存長達148.9個月，而預測僅8.3％的具有在此被稱作「壞標記」(即高表達表1左側欄中的分子以及低表達表1右側欄中的分子)的個體可生存長達40個月。該結果是統計學顯著的，p值＜0.00001。
利用Kaplan-Meier生存曲線和單變量分析，我們通過鑑定出那些對統計學準確性貢獻最多的分子(在表1中用*表示)改進了分子標記。我們已經發現了33個主要分子標誌物造成了大多數的統計學顯著性，其中25個與低生存率有著正相關，以及其中8個與低生存率有著負相關。圖2顯示了用第一個主要和第二個主要分子標記預測的生存曲線，預測93.2％的具有好標記的個體可生存長達149.69個月，預測僅14.4％的具有壞標記的個體可生存長達52.3個月(p＜0.000001)。
無發病預測的分子標記如表2所示，發現48個分子與發病發生(復發和轉移)有著正相關，而13個分子與發病發生負相關。圖3顯示，預測94.5％的具有「好標記」(即沒有高表達表2左側欄中的分子以及沒有低表達表2右側欄中的分子)的個體無疾病復發(即無病生存)可長達150.4個月，而預測僅有34.5％的具有「壞標記」(即高表達表2左側欄中的分子以及低表達表2右側欄中的分子)的個體能無病生存僅長達72.4個月(p值＜0.00001)。
與上面的生存標記一樣，我們也改進了該標記，並發現了36個主要分子標誌物(在表2中用*表示)造成了大多數的統計學顯著性，其中28個與復發有著正相關，以及其中8個與復發具有負相關。圖4顯示了用第三個主要和第四個主要分子標記預測的生存曲線，預測91.7％的具有好標記的個體可無疾病復髮長達148.4個月，預測僅有5.88％的具有壞標記的個體可無任何疾病復發生存長達44.2個月(p＜0.000001)。
淋巴結轉移的分子標記如表3所示，發現37個分子與淋巴結轉移具有正相關，以及10個分子與淋巴結轉移負相關。這37個分子的組合已經顯示91％的具有壞標記(即高表達表3左側欄中的分子以及低表達表3右側蘭中的分子)的腫瘤發生淋巴結轉移。此外，88.9％的具有好標記(即沒有高表達表3左側欄中的分子以及沒有低表達表3右側欄中的分子)的腫瘤沒有淋巴結轉移(p＝0.00024)。
如上所述，我們通過精選組合已經改良了該標記，並發現了21個主要基因的組合也能很好地預測，其中20個基因與淋巴結轉移有著正相關，1個基因與淋巴結轉移有著負相關(在表3中用*表示)。89.1％具有壞標記的腫瘤有著淋巴結轉移，86.8％有著好標記的腫瘤沒有淋巴結轉移(p＝0.0000205)。
參考文獻Davies et al 2000Davies G，Jiang WG，Mason MD.Cell-celladhesion and signalling intermediates inhuman prostate cancer.Journal of Urology，2000，163，985-992Jiang et al 2003aJiang WG，Watkins G，Lane J，Douglas-Jones A，Cunnick GH，Mokbel M，Mansel RE.Prognosticvalue of Rho family and and rho-GDIs in breast cancer.ClinicalCancer Research，2003，9(17)，6432-6440Jiang et al 2003bJiang WG，Douglas-Jones A，and ManselRE.Level of expression of PPAR-gamma and its co-activator(PPAR-GCA)in human breast cancer.International Journal ofCancer，2003，106，752-757Jiang et al 2003cJiang WG，Grimshaw D，Lane J，Martin TA，Parr C，Davies G，Laterra J，and Mansel RE.Retroviralhammerhead transgenes to cMET and HGF/SF inhibited growth ofbreast tumour，induced by fibroblasts.Clinical Cancer Research，2003，9，4274-4281King et al 2004King JAC，Ofori-Acquah AF，Stevens T，Al-Mehdi AB，Fodstad O，Jiang WG.Prognostic value of ALCAM inhuman breast cancer.Breast Cancer Research，2004，R478-487Nazarenko et al 1997Nazarenko IA，Bha tnagar SK，HohmanRJ.A closed tube format for amplification and detection of DNAbased on energy trans fer.Nucleic Acids Res 1997；252516-21Parr和Jiang 2004Parr C and Jiang WG.The Notch receptors，Notch-1 and Notch-2，in human breast cancers.InternationalJournal of Molecular Medicine，2004 Nov；14(5)779-786表1.總生存的分子標記


表2.人乳腺癌中的無發病生存的分子標記原始試劑盒，基因＝61改良試劑盒，基因＝36


表3.預測淋巴結轉移的分子標記

權利要求
1.一種用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定編碼以下分子標誌物的基因的表達水平AMF、ATF4、Cyr61、ER、Matriptase2、MET、MLN64、MMP7、柄蛋白4、PAR1A、Psoriason、Pttg1、Rho-C、Scotin、SDF1、SEMP1、SPF45、SST1、ST15、TACC2、TBD10、TCF2、TEM6、TEM7R、ZO-3；和(b)如果確定出這些標誌物的高水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有低的生存可能性。
2.權利要求1的方法，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標誌物的基因的表達水平Basigin、β-連環蛋白、BMP1、BMP10、Calpain large、CD44、CX43、細胞周期蛋白D2、EHMS、FAK、FAP、GIRK、HAVR1、Isotopo3、JAK1、LOX12、NET-2，PAR1A2、PTHrP、Rho-G、S100A4、SPARC、TCF3、VECAD、Vilip、Wave2。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中部分(a)還包括確定編碼以下分子標誌物的基因的表達水平ARP2、Atf-3、HuR、MEN1、Paracellin、PTP-RK根蛋白和RHO8/gdiG-Ratio；和(b)如果確定出這些標誌物的低水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有低的生存可能性。
4. 權利要求3的方法，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標誌物的基因的表達水平aMOT、Atf-1、Claudin-1、IL22R、Rock2、Veg1。
5.一種用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼以下分子標誌物的基因的表達水平AAMP、AMFR、Bmp8、BMP9、β-連環蛋白、CAR、Creb12、DRIM、EHMS、Endomuscin2、FAK、FAP、Isotopo1、Kiss1/ck19、Notch1、PAR1A、Par1A2、PLC-delta、Psoriasin、PTTG1、RhoC、Rock1、SDF1、SST1、ST15、TEM6、TEM7R；和(b)如果確定出這些標誌物的高水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有高的癌症復發可能性。
6.權利要求5的方法，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標誌物的基因的表達水平血管緊張素2R1、ATF4、Bmp10、CASM、組織蛋白酶S、CX43、彈性蛋白酶PMN、GIRK、HAVR1、HIN、Isotopo3、Kiss1、LOX12、NOS3、PMSA、S100A4、SEMP1、TACC2、遍在蛋白、WISP2。
7.權利要求5或權利要求6的方法，其中部分(a)還包括確定編碼以下分子標誌物的基因的表達水平Bmp3、IL22R、IL24、JAK1、PTP-RK、Rho8/GdiG、Snail、WASP；和(b)如果確定出這些標誌物的低水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有高的癌症復發可能性。
8.權利要求7的方法，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標誌物的基因的表達水平ATF3、Bmp4、BMPR1A、MEN1、Paracellin。
9.一種用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的方法，所述方法包括(a)檢查個體的乳腺癌組織樣品，以確定出編碼以下分子標誌物的基因的表達水平BAF57、BNDF、CAR1、CASM、組織蛋白酶-L、Creb1/2、CXCR10、DRIM、HERG、IL7R、IL-11、Kiss1、MKK1、PMN-彈性蛋白酶、PTTP1、SDF5、TACC2、遍在蛋白、VIPR1、VUDP；和(b)如果確定出這些標誌物的高水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有轉移形式的癌症。
10.權利要求9的方法，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標誌物的基因的表達水平Angiomotin、BMP7、細胞周期蛋白D1、DNA連接酶-1、IGFBP7、LYVE1、NET2、RHO8、SRBC、Stath4、TGAse-3、粘著斑蛋白、WAVE2。
11.權利要求9或權利要求10的方法，其中部分(a)還包括確定編碼分子標誌物Paracellin的基因的表達水平；和(b)如果確定出該標誌物的低水平表達；(c)推斷從中取得組織樣品的個體具有轉移形式的癌症。
12.權利要求11的方法，其中部分(a)還包括確定編碼至少一種以下分子標誌物的基因的表達水平ALCAM、Eplin、ERbeta、Glypic3、JAK1、MAGI-1、PEDF、PKC-eta、Stathlin、WWOX。
13.任一先前權利要求的方法，其中癌症組織取自於人。
14.任一先前權利要求的方法，其中癌症組織取自雌性。
15.任一先前權利要求的方法，其中通過檢測RNA或mRNA的存在確定表達水平。
16.權利要求1到15中任一項的方法，其中通過檢測分子標誌物編碼的蛋白確定表達水平。
17.權利要求16的方法，其中方法包括使用與相關蛋白結合併由此鑑定所述相關蛋白的試劑。
18.權利要求17的方法，其中試劑是抗體。
19.權利要求1到14中任一項的方法，其中在實施部分(a)之前，擴增所選的標誌物。
20.權利要求19的方法，其中用PCR擴增標誌物。
21.任一先前權利要求的方法，其中參照對照樣品確定給定分子標誌物的表達水平，其中對照樣品是以下任何一種無癌症的乳腺組織樣品、取自未呈現癌症的個體的乳腺組織樣品、或公認的每種相關分子標誌物在健康個體中的表達的標準物。
22.一種用於實施權利要求1到21中任一項的方法的試劑盒，其中所述試劑盒包括(a)多種用於檢測至少一組在權利要求1到21的方法中所說明的分子標誌物的探針；和(b)任選地，關於使用所述探針的試劑和說明書。
23.一種用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的試劑盒，其包括(a)多種用於鑑定下面標誌物組中的每個基因的至少一種轉錄物的探針AMF、ATF4、Cyr61、ER、Matriptase2、MET、MLN64、MMP7、柄蛋白4、PAR1A、Psoriason、Pttg1、Rho-C、Scotin、SDF1、SEMP1、SPF45、SST1、ST15、TACC2、TBD10、TCF2、TEM6、TEM7R、ZO-3；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
24.權利要求23的試劑盒，其中所述試劑盒還包括(a)多種探針，其能鑑定以下標誌物組中的至少一個基因的至少一種轉錄物Basigin、β-連環蛋白、BMP1、BMP10、Calpainlarge、CD44、CX43、細胞周期蛋白D2、EHMS、FAK、FAP、GIRK、HAVR1、Isotopo3、JAK1、LOX12、NET-2、PAR1A2、PTHrP、Rho-G、S100A4、SPARC、TCF3、VECAD、Vilip、Wave2；和/或下面標誌物組中的每個基因的至少一種轉錄物ARP2、Atf-3、HuR、MEN1、Paracellin、PTP-RK根蛋白和RHO8/gdiG-Ratio；和/或下面標誌物組中至少一個的至少一種轉錄物aMOT、Atf-1、Claudin-1、IL22R、Rock2；和(b)任選地，確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
25.一種用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的試劑盒，其包括(a)多種用於鑑定下面標誌物組中的每個基因的至少一種轉錄物的探針AMFR、AAMP、β-連環蛋白、Bmp8、BMP9、CAR、Creb12、DRIM、EHMS、Endomuscin2、FAK、FAP、Isotopo1、Kiss1/ck19、Notch1、PAR1A、Par1A2、PLC-delta、Psoriasin、PTTG1、RhoC、Rock1、SDF1、ST15、SST1、TEM6、TEM7R；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
26.權利要求25的試劑盒，其中試劑盒還包括(a)多種探針，其用於鑑定以下標誌物組中的至少一個基因的至少一種轉錄物血管緊張素2R1、ATF4、Bmp10、CASM、組織蛋白酶S、CX43、彈性蛋白酶PMN、GIRK、HAVR1、HIN、Isotopo3、Kiss1、LOX12、NOS3、PMSA、S100A4、SEMP1、TACC2、遍在蛋白、WISP2；和/或下面標誌物組中的每個基因的至少一種轉錄物Bmp3、IL22R、IL24、JAK1、PTP-RK、Rho8/GdiG、Snail、WASP；和/或下面標誌物組中至少一個的至少一種轉錄物ATF3、Bmp4、BMPR1A、MEN1、Paracellin；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
27.一種用於確定哺乳動物乳腺癌的預後的試劑盒，其包括(a)多種用於鑑定以下標誌物組中的每個基因的至少一種轉錄物的探針BAF57、BNDF、CAR1、CASM、組織蛋白酶-L、Creb1/2、CXCR10、DRIM、HERG、IL7R、IL-11、Kiss1、MKK1、PMN-彈性蛋白酶、PTTP1、SDF5、TACC2、VIPR1、VUDP、遍在蛋白；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
28.權利要求27的試劑盒，其中所述試劑盒還包括(a)多種探針，其用於鑑定以下標誌物組中的至少一個基因的至少一種轉錄物Angiomotin、BMP7、細胞周期蛋白D1、DNA連接酶-1、IGFBP7、LYVE1、NET2、RHO8、SRBC、Stath4、TGASe-3、粘著斑蛋白、WAVE2；和/或以下標誌物組Paracellin；和/或下面標誌物組中至少一個的至少一種轉錄物ALCAM、Eplin、ERbeta、Glypic3、JAK1、MAGI-1、PEDF、PKC-eta、Stathlin、WWOX；和(b)任選地，確定或顯示如何確定每個所述基因的表達水平的試劑和說明書。
29.微陣列，包括至少一組用於鑑定構成在權利要求22到28中所述的分子標記的分子標誌物組的探針。
30.一種用於確定患者的生存和/或乳腺癌復發可能性和/或癌症的轉移性質的試劑盒，所述試劑盒包括(a)至少一種包括至少一組用於鑑定構成權利要求1到21中所述的分子標記的分子標誌物組的探針的微陣列；和任選地(b)包括多種用於鑑定在代表所述標誌物在無癌症個體或具有中等預後的患者體內的表達水平的內標物中的相同組分子標誌物的探針的第二微陣列。
31.權利要求30的微陣列。
32.權利要求22到28的一組探針。
33.在此充分描述的方法、試劑盒或其部分。
全文摘要
本發明涉及用於乳腺癌的預後的方法和試劑盒，包括其部分。具體地，方法包括鑑定出指示乳腺癌患者的生存可能性、和/或正接受乳腺癌治療的或已經被治療的患者的疾病復發可能性、以及患者具有轉移形式的癌症的可能性的基因表達模式、或分子標記。已經鑑定出了6個分子標記，包括12群/組分子標誌物，其在確定給定乳腺癌的預後方面具有關聯性。每個分子標記都包括多個遺傳標誌物，其相對於正常組織的高或低水平的表達是給定結局例如生存或復發的指示。
文檔編號C12Q1/68GK101014720SQ200580030372
公開日2007年8月8日 申請日期2005年7月27日 優先權日2004年8月10日
發明者姜文國 申請人:加的夫大學學院諮詢有限公司