含有假異胞嘧啶核鹼基衍生物的3』修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應用的製作方法

2023-09-10 00:01:55

專利名稱：：含有假異胞嘧啶核鹼基衍生物的3』修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應用的製作方法含有假異胞嘧啶核鹼基衍生物的3'修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應用本發明涉及核酸擴增，例如應用於聚合酶鏈式反應(PCR)的化合物和方法。檢測是否存在靶核酸在各種領域中起著重要作用，包括醫學診斷、法醫學和遺傳分析。PCR是核酸擴增方法的例子之一，其提供的高度靈敏方法通過選擇性擴增耙核酸序列來檢測是否存在耙核酸。核酸擴增，例如PCR的重要問題是會產生非特異性擴增產物。會在PCR反應中造成問題的非特異性擴增過程的例子之一是"引物-二聚體"擴增。例如，當引物的3'末端區域與其自身或另一引物有一定程度互補時，會導致引物-二聚體擴增。這些引物能彼此雜交形成引物-二聚體。然後，引物-二聚體的擴增會產生引物-二聚體擴增子，進而用作進一步擴增的模板。這種過程的後果之一是消耗了引物，從而導致靈敏度降低或者甚至不能擴增所需的靶核酸。熟知在PCR反應期間加入過量的引物使得甚至3'末端區域的弱互補性亦會產生引物-二聚體擴增子，從而使該問題愈加複雜。因此，需要開發能抑制擴增反應，例如PCR中引物-二聚體形成的試劑和方法。本文出乎意料地發現在引物的3'末端區域摻入某些修飾的核鹼基(nudeobase)對擴增反應期間的引物-二聚體擴增子形成有有益影響。在一些實施方式中，本發明提供的多核苷酸在離該多核苷酸3'末端不超過4個核苷酸處含有至少一個嘧啶核鹼基，其中所述修飾的嘧啶核鹼基具有以下結構其中R選自-H、-F、-Cl、氰基、硝基、CrCV烷基、0<36取代的烷基、C3-C1芳基、C3-do取代的芳基、C3-C,o芳基醚、CVdo取代的芳基醚、-CF3、胺、取代的胺、CVC6環狀烷基、CVC6取代的環狀垸基、苯基、取代的苯基和雜芳基。在一些實施方式中，R可以是-H。在一些實施方式中，R可以是C,-C6垸基。在一些實施方式中，R可以是C,-C6取代的烷基。在一些實施方式中，R可以是C3-Cu)芳基。在一些實施方式中，R可以是CVC,o取代的芳基。在一些實施方式中，R可以是-CF3。在一些實施方式中，R可以是氨基。在一些實施方式中，R可以是取代的氨基。在一些實施方式中，R可以是C3-C6環狀垸基。在一些實施方式中，R可以是CVC6取代的環狀烷基。在一些實施方式中，R可以是苯基。在一些實施方式中，R可以是取代的苯基。在一些實施方式中，R可以是雜芳基。在一些實施方式中，R可以是氰基。在一些實施方式中，R可以是硝基。在一些實施方式中，所述至少一個修飾的嘧啶核鹼基離多核苷酸3'末端不超過3個核苷酸。在一些實施方式中，所述至少一個修飾的嘧啶核鹼基離多核苷酸3'末端不超過2個核苷酸。在一些實施方式中，所述至少一個修飾的嘧啶核鹼基是多核苷酸的3'末端核苷酸。在一些實施方式中，本發明多核苷酸可以是引物。在一些實施方式中，本發明多核苷酸在3'-末端可延長。在一些實施方式中，本發明多核苷酸可包含可檢測標記、猝滅劑或小溝結合劑中至少一個。在一些實施方式中，本發明多核苷酸可用作探針。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸的方法，包括將多核苷酸引物與變性DNA模板退火，從而使該多核苷酸引物與該變性DNA模板一條鏈上的互補多核苷酸序列退火以形成引物-模板複合物；和延伸該引物-模板複合物的引物部分以形成雙鏈擴增子，其中所述多核苷酸引物是本發明引物。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸方法，包括在延伸步驟後使雙鏈擴增子變性。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少1次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少10次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少20次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少30次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少40次。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸方法，其中所述延伸在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下發生從而形成DNA擴增子片段。在一些實施方式中，引物延伸方法包括檢測DNA擴增子片段。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸方法，包括i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物與變性DNA模板的第一和第二鏈退火，使得該第一多核苷酸引物與該變性DNA模板第一鏈的互補寡核苷酸序列退火，該第二多核苷酸引物與該變性DNA模板第二鏈的互補寡核苷酸序列退火，從而形成第一和第二引物-模板複合物，和ii)延伸該第一和第二引物-模板複合物中至少一個的引物部分以形成雙鏈DNA擴增子，其中該第一多核苷酸引物或該第二多核苷酸引物中至少一個可以是本發明多核苷酸。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸的方法，包括先形成包含第一多核苷酸引物、第二多核苷酸引物、DNA模板和其它引物延伸試劑的混合物，再進行退火步驟。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸的方法，包括在形成(混合物)步驟之後但在退火步驟之前使DNA模板變性，從而形成變性DNA模板和第二變性DNA模板的第一鏈。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸的方法，包括先進行延伸步驟，再使雙鏈DNA擴增子變性。在一些實施方式中，可任選重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟1-100次。可任選重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟l-50次。應該知道，本發明包括重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟1-100次之間所有可能的範圍。即，重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟可以重複1次，最多100次以及中間的任何次數。例如，1-10的範圍應理解為包括使用1-10之間所有整數，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO的所有可能範圍。在一些實施方式中，可任選重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟超過l次。在一些實施方式中，可任選重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟超過10次。在一些實施方式中，可任選重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟超過20次。在一些實施方式中，可任選重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟超過30次。在一些實施方式中，可任選重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟超過40次。在一些實施方式中，可任選重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟超過50次。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸的方法，包括先使多核苷酸探針與變性DNA模板的第一或第二鏈退火，從而使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第一鏈的互補多核苷酸序列退火和/或使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第二鏈的互補寡核苷酸序列退火，再進行延伸引物部分的步驟。在一些實施方式中，該多核苷酸探針包含至少一個可檢測標記。在一些實施方式中，該多核苷酸探針還包含猝滅劑、小溝結合劑中的至少一個或二者。在一些實施方式中，該多核苷酸探針可以是本發明多核苷酸。在一些實施方式中，本發明提供連接寡核苷酸的方法，包括i)形成包含與DNA模板退火的第一和第二多核苷酸鏈的複合物，從而使該第一多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第一互補多核苷酸序列退火和使該第二多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第二互補多核苷酸序列退火，其中該變性DNA模板鏈的第二互補多核苷酸序列位於該變性DNA模板鏈的第一互補多核苷酸序列的5'端，和ii)在該第一和第二多核苷酸鏈之間形成穩定的共價鍵，其中該第一多核苷酸鏈或第二多核苷酸鏈中至少一個是本發明多核苷酸。在一些實施方式中，本發明提供檢測靶多核苷酸序列的方法，包括(a)使靶多核苷酸鏈與第一探針對反應，所述第一探針對包含(i)含有與該靶鏈中第一靶區域互補的序列的第一多核苷酸探針和(ii)含有與該靶鏈中第二靶區域互補的序列的第二多核苷酸探針，其中該第二區域位於該第一區域的5'端並與該第一區域至少有一個核苷酸鹼基重疊，該反應在能使該第一和第二探針分別與該靶鏈中第一和第二區域雜交以形成第一雜交複合物的有效條件下進行，(b)切割該第一雜交複合物中的第二探針以形成含有該靶鏈、該第一探針和該第二探針的第一片段的第二雜交複合物，其中該第二探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第一探針的3'末端核苷酸，(c)連接該第一探針與該第二探針的雜交片段以形成與該靶鏈雜交的第一連接鏈，(d)使該第一連接鏈變性(脫離)該靶鏈，和(e)再進行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最後一輪中可任選省去步驟(d)，其中該第一探針、該第二探針中至少一個或二者是本發明多核苷酸。在一些實施方式中，至少一個所述修飾的嘌呤核鹼基離該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端不超過2個核苷酸。在一些實施方式中，至少一個所述修飾的嘌呤核鹼基離該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端不超過1個核苷酸。在一些實施方式中，修飾的嘌呤核鹼基是該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端核苷酸。在一些實施方式中，該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者含有可檢測標記、猝滅劑或小溝結合劑中至少一種或它們的任何組合。在一些實施方式中，該第一區域與該第二區域有一個核苷酸鹼基重疊。在一些實施方式中，該第一探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第一探針的5'端以核苷酸5'羥基結尾。在一些實施方式中，該第二探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第二探針的5'端以核苷酸5，羥基結尾。在一些實施方式中，該第二探針的3'端以除核苷酸3'羥基以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第二探針的3'端以核苷酸3'磷酸基團結尾。在一些實施方式中，本發明提供檢測靶多核苷酸序列的方法，包括(a)使靶互補鏈與第二探針對反應，所述第二探針對包含(i)含有與該靶互補鏈中第一區域互補的序列的第三多核苷酸探針和(ii)含有與該靶互補鏈中第二區域互補的序列的第四多核苷酸探針，其中該第二區域位於該第一區域的5'端並與該第一區域至少有一個核苷酸鹼基重疊，該反應在能使該第三和第四探針分別與該靶互補鏈中第一和第二區域雜交以形成第三雜交複合物的有效條件下進行，(b)切割該第二雜交複合物中的第四探針以形成含有該靶互補鏈、該第三探針和該第四探針的第一片段的第四雜交複合物，其中該第四探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第三探針的3'末端核苷酸，(c)連接該第三探針與該第四探針的雜交片段以形成與該靶互補鏈雜交的第二連接鏈，(d)使該第二連接鏈變性(脫離)該靶互補鏈，和(e)再進行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最後一輪中可任選省去步驟(d)。在一些實施方式中，該第三探針或該第四探針中至少一個或二者是本發明多核苷酸。在一些實施方式中，至少一個所述修飾的嘌呤核鹼基離該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端不超過2個核苷酸。在一些實施方式中，至少一個所述修飾的嘌呤核鹼基離該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端不超過1個核苷酸。在一些實施方式中，所述修飾的嘌呤核鹼基是該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端核苷酸。在一些實施方式中，該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者可含有可檢測標記、猝滅劑或小溝結合劑中至少一種或它們的任何組合。在一些實施方式中，該第三探針的5'端任選以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第三探針的5'端任選以核苷酸5'羥基結尾。在一些實施方式中，該第四探針的5'端任選以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第四探針的5'端任選以核苷酸5，羥基結尾。在一些實施方式中，該第一、第二、第三和第四探針的5，端任選以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第四探針的3'端任選以除核苷酸3'羥基以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第四探針的3'端任選以核苷酸3'磷酸基團結尾。在一些實施方式中，這些探針中至少一個含有可檢測標記。在一些實施方式中，該標記可以是螢光標記。在一些實施方式中，該標記可以是放射性標記。在一些實施方式中，該標記可以是化學發光標記。在一些實施方式中，該標記可以是酶。在一些實施方式中，該第一探針和該第三探針中至少一個含有可檢測標記。在一些實施方式中，該第一探針和該第三探針各含有可檢測標記。在一些實施方式中，該第一探針和該第三探針上的可檢測標記相同。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針中至少一個含有可檢測標記。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針各含有可檢測標記。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針含有相同的可檢測標記。在一些實施方式中，所述切割產生了未與該第二雜交複合物相結合的該第二探針的第二片段，該方法還包括檢測該第二探針的所述第二片段。在一些實施方式中，所述切割產生了未與該第四雜交複合物相結合的該第四探針的第二片段，該方法還包括檢測該第四探針的所述第二片段。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針中至少一個同時含有(i)螢光染料和(ii)在螢光染料與螢光激發能量接觸時能猝滅螢光發射的猝滅劑染料，所述切割切開該第二探針和/或第四探針中螢光染料和猝滅劑染料之間的共價鍵，從而增強該螢光染料的可觀察螢光信號。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針各含有(i)螢光染料和(ii)猝滅劑染料。在一些實施方式中，本發明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括檢測兩種第二片段。在一些實施方式中，該第二片段含有基本上不與該靶鏈互補的一個或多個田比連核苷酸。在一些實施方式中，該一個或多個毗連核苷酸包含l-20個核苷酸。在一些實施方式中，本發明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括將該第二片段固定到固體支持物上。在一些實施方式中，本發明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括將對該第二片段進行電泳。在一些實施方式中，本發明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括通過質譜法檢測該第二片段。在一些實施方式中，本發明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括在最後一輪後檢測該第二片段。在一些實施方式中，本發明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括在多輪期間或之後檢測該第二片段。在一些實施方式中，本發明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括在所有輪次期間檢測該第二片段。在一些實施方式中，本發明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括在至少一輪後檢測該第一雜交複合物、第二雜交複合物或二者。在一些實施方式中，該方法還包括在至少一輪後檢測該第三雜交複合物、第四雜交複合物或二者。在一些實施方式中，該方法還包括在至少一輪後檢測該第一連接鏈、第二連接鏈或二者。在一些實施方式中，該檢測包括電泳分離步驟。在一些實施方式中，本發明提供分析片段的方法，包括i)使寡核苷酸引物與變性的DNA模板退火，從而使得該寡核苷酸引物同該變性DNA模板一條鏈的互補寡核苷酸序列退火以形成引物-模板複合物，ii)在有脫氧核糖核酸和不可延伸的核糖核酸存在下延伸該引物-模板複合物的引物部分以形成DNA擴增子片段，和iii)檢測DNA擴增子片段，其中所述寡核苷酸引物是本發明多核苷酸。以下方案i說明了含多個(x)核苷酸"N"的示範性多核苷酸，其定義了所需的核苷酸序列，其中下標l、2、3...x指核苷酸在引物中相當於3'端的位置，"…"表明N,和N7之間可能有一個或多個核苷酸。5'-Nx…N7關5N4N3N2N'-3'方案l因此，N,位於該示範性多核苷酸的3'末端，其可以稱為該示範性多核苷酸的3'末端核苷酸。類似地，N2位於第二核苷酸位，其可以稱為離3'末端1個核苷酸。類似地，N3位於第三核苷酸位，其可以稱為離3'末端2個核苷酸。類似地，N4位於第四核苷酸位，其可以稱為離3'末端3個核苷酸。據信，在引物中摻入本發明核鹼基導致的引物-二聚體形成減少作用會使得在N4位附近更接近3'-末端的任何位置不含本發明核苷酸的引物減少。本文所用的術語"寡核苷酸"、"多核苷酸"和"核酸"可互換使用來表示DNA、RNA或二者的單鏈或雙鏈多聚物，包括含有修飾的或非天然存在的核苷酸的多聚物。此外，術語"寡核苷酸"、"多核苷酸"和"核酸"表示含有骨架和多個核鹼基的任何其它類型多聚物，其能通過核鹼基特異性鹼基配對與互補的多核苷酸鏈形成雙螺旋，包括但不限於例如Nielsen等，Science254:1497-1500(1991)公開的肽核酸(PNA)、雙環DNA寡聚物(Bolli等，NucleicAcidsRes.24:4660-4667(1996))和相關的結構。在一些實施方式中，本發明多核苷酸可包含天然存在的糖或糖苷部分，例如卩-D-呋喃核糖的骨架。此外，在一些實施方式中，本發明修飾的核苷酸可包含含有一個或多個"糖類似物"的骨架。本文所用的術語"糖類似物"指糖核糖的類似物。示範性核糖糖類似物包括但不限於具有5個以上或以下環原子的取代或未取代的呋喃糖，例如赤癬糖和己糖和取代或未取代的3-6碳無環糖。典型的取代的呋喃糖和無環糖是其中一個或多個碳原子被一個或多個相同或不同的-R、-OR、-NRR或滷素基團取代的那些糖，其中各R獨立為-H、(Q-C6)烷基或(C3-d4)芳基。具有5個環原子的未取代和取代的呋喃糖的例子包括但不限於2'-脫氧核糖、2'-(d-C6)-烷基核糖、2'-(C,-C6)-垸氧基核糖、2'-(Cs-CM)-芳氧基核糖、2'，3'-二脫氧核糖、2',3'-二脫氧核糖、2'-脫氧-3'-滷代核糖、2'-脫氧-3'-氟代核糖、2'-脫氧-3'-氯代核糖、2'-脫氧-3'-氨基核糖、2'-脫氧-3'-(C,-C6)-烷基核糖、2'-脫氧-3'-(C,-C6)-烷氧基核糖、2'-脫氧-3'-(C5-C,4)-芳氧基核糖、3'-(C廣C6)-烷基核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-(C,-C6)-垸基核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-(CVC6)-垸氧基核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-(CVd4)-芳氧基核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-滷代核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-氨基核糖-5'-三磷酸、2'，3'-二脫氧核糖-5'-三磷酸或2'，3'-二脫氫核糖-5'-三磷酸。其它糖類似物包括但不限於例如"鎖核酸"(LNA)，即在C-4'和C-2'位氧原子之間含有如亞甲基橋的那些糖，例如納入本文作為參考的Wengel等，WO99/14226和WengeU，Ace.Chem.Res.，32:301-310(1998)所述的在一些實施方式中，本發明多核苷酸包括其中的磷酸骨架含有一個或多個"磷酸類似物"的那些多核苷酸。術語"磷酸類似物"指其中磷原子處於+5氧化狀態並且一個或多個氧原子被非氧部分取代的磷酸類似物。示範性類似物包括但不限於硫代磷酸根(phosphorothioate)、二硫代磷酸根(phosphorodkhioate)、硒代磷酸根(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸根(phosphorodiselenoate)、硫代苯胺膦酸根(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸根(phosphoranilidate)、亞磷醯胺、硼磷酸根(boronophosphates)和相關的抗衡離子，包括但不限於H+、NH4+、Na+、Mg++，如果存在這些抗衡離子的話。含磷酸類似物的本發明多核苷酸可包含，例如硫代磷酸鍵、甲基膦酸鍵和/亞磷醯胺(參見Chen等，NuclAcidsRes.，23:2662-2668(1995))。多核苷酸鍵(polynucleotidelinkage)的組合也屬於本發明範圍。在一些實施方式中，本文所述多核苷酸可摻入PNA和DNA/PNA嵌合體中。包括肽核酸(PNA，也稱為聚醯胺核酸)，參見，例如Nielsen等，Science254:1497-1500(199)。PNA含有通過聚醯胺骨架而不是DNA和RNA特徵性的糖-磷酸骨架相連的雜環核鹼基單元。PNA能與互補DNA和RNA靶序列雜交。PNA寡聚物的合成與用於合成PNA寡聚物的反應性單體描述於，例如美國專利號5,539,082;5,714,331;5,773,571;5,736,336禾Q5,766,855。PNA和DNA/PNA嵌合體合成的其它方法以及PNA合成的單體已描述於，例如Uhlmann等，Angew.Chem.Int,Ed.37:2796-2823(1998)。在一些實施方式中，本發明多核苷酸的大小可以自是長度為少數核苷酸單體(例如5-80個)到數百或數千個核苷酸單體。例如，本發明多核苷酸可含有5-50個核苷酸、5-30個核苷酸或5-20個核苷酸。在一些實施方式中，當本發明多核苷酸含有，例如5-30個核苷酸時，這種範圍包括5-30之間所有可能的整數範圍，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個核苷酸。除非另有指明，當用一串字母，例如"ATGCCTG"表示多核苷酸時，應該知道這些核苷酸自左向右是5'到3'順序，並且"A"表示脫氧腺苷、"C"表示脫氧胞苷、"G"表示脫氧鳥苷和"T"表示胸苷。此外，當用包含"X"的一串字母表示本發明多核苷酸時，應該知道"X"表示不同的核苷酸單體，其中"X"是除"A"、"C"、"G"或"T"以外的核苷酸單體。在一些實施方式中，本發明多核苷酸可用作擴增反應的引物。本文所用的"引物"指本文所定義的多核苷酸，可通過加入一個或多個核苷酸單體或與連接探針相連延伸其3'末端。在一些實施方式中，本發明多核苷酸可包含各自獨立含有修飾的核鹼基的一個或多個核苷酸。本文所用的術語"修飾的核鹼基"包括可通過加入和/或刪除一個或多個功能基團、在雜環結構中有差異(即，用碳取代雜原子，或反之)和/或與一個或多個取代基相連而不同於天然存在鹼基(例如，A、G、C、T和U)的核鹼基。在一些實施方式中，本發明所用修飾的核鹼基包含具有以下結構的修飾嘧啶核鹼基formulaseeoriginaldocumentpage19其中R選自-H、-F、-Cl、C,-C6烷基、C,-C6取代的垸基、CVdo芳基、C3-C10取代的芳基、C3-do芳基醚、C3-do取代的芳基醚、-CF3、-NR,R,、C3-Q環狀烷基、CVC6取代的環狀垸基、苯基、取代的苯基和雜芳基，其中R,選自-H、-F、-Cl、C,-C6垸基、C,-C6取代的垸基、C3-Qo芳基、C3-do取代的芳基。本文所用的"烷基"指從母體焼烴、烯烴或炔烴的一個碳原子上除去一個氫原子而衍生的取代或未取代、支鏈、直鏈或環狀單價烴基團。典型的烷基包括但不限於甲基(甲烷基(methanyl));乙基，例如乙烷基(ethanyl)、乙烯基、乙炔基；丙基，例如丙烷-l-基、丙垸-2-基(異丙基)、環丙垸-l-基、丙-l-烯-l-基、丙隱1-烯-2-基、丙-2-烯-l-基、環丙-l-烯-l-基、環丙-2-烯-l-基、丙-l-炔-l-基、丙-2-炔-l-基等；丁基，例如丁垸-l-基、丁烷-2-基(仲丁基)、2-甲基-丙烷-l-基(異丁基)、2-甲基-丙垸-2-基(叔丁基)、環丁烷-l-基、丁-l-烯-l-基、丁-l-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁_2-烯-1-基、丁隱2-烯-2-基、丁-l,3-二烯-l-基、丁-l,3-二烯-2-基、環丁-l-烯-l-基、環丁-l-烯-3-基、環丁-l，3-二烯-l-基、丁-l陽炔-l-基、丁-l-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；等等。本文所用的"芳基"指從芳族環系統的一個碳原子上除去一個氫原子而衍生的單價芳族烴基團。典型的芳基包括但不限於衍生自以下的基團醋蒽烯、苊、苯並熒蒽(acephenanthrylene)、蒽、奠、苯、窟、暈苯、熒蒽、芴、並六苯、己芬、環已烯(hexalene)、不對稱引達省(as-indaeene)、對稱引達省(s-indacene)、茚滿、茚、萘、並八苯(octacene)、辛芬(octaphene)、氯甲橋萘(octalene)、卵苯、戊-2,4-二烯、並五苯、並環戊二烯(pentalene)、戊芬、茈、非那烯(phenalene)、菲、茜、七曜烯(pleiadene)、芘、皮蒽、玉紅省、苯並菲、三萘(trinaphthalene)等。在一些實施方式中，芳基是(CVC2)芳基或(C5-Ch))芳基。其它芳基是苯基(C6芳基)和萘基(Qo芳基)。本文在"取代的垸基"、"取代的芳基醚"、"取代的芳基"、"取代的胺基"、"取代的環狀烷基"或"取代的苯基"中所用的"取代的"表示烷基、芳基、胺、環狀垸基或苯基部分被一個或多個非氫取代基取代。這種取代基包括但不限於:-F、-Cl、-Br、-CF3、胺基、-OH、-CC13、-CN、國CHO、-C02R、-S03R、-P03RR、-C(0)NRR和-N02，其中R可以是-H、C廣CV烷基或CrC1芳基中任一個。本文所用的"雜芳基"表示具有選自N、O或S的至少一個雜原子的任何芳環系統。雜芳基部分的實例包括但不限於呋喃、噻吩、吡啶、吡咯、吡嗪、喹啉和哌嗪(piperizine)。在一些實施方式中，本發明所用修飾的核鹼基包括但不限於假異胞嘧啶(pseudoisocytisine)Pankiewicz，K,等，JOrg.Chem.，v.47，458-8(1982)和Chu，C.K.等，J.HetChem.，v.14，1119-21(1977)公開了其2'-脫氧衍生物。本領域已知本發明所用具有各種R取代基的修飾核鹼基的其它實例和製備方法，包括但不限於Ashki認i，R.等，WO01019801Al;Hlavka，J.等，美國專利號4,577,018;Hlavka，J.等，J.Het.Chem.，22(5)，1317-22(1985);Skulnick，H.等，J.Med.Chem.，28(12)，1864-9(1985);Lazarus,R.等，Biochemistry,20(24)，6834-41(1981);Hunter,J.等，DE2522090;Wierenga，W.等，J.Med.Chem.，23(3)，237-9(1980)及它們引用的參考文獻所述的。本發明所用核鹼基和核苷/核苷酸的其它例子及製備方法可見本領域已知的各種資料庫，包括Scifinder⑧Scholar、ChemicalAbstracts⑧等。應該知道，本領域技術人員通過本領域熟知的化學合成方法聯用或不用本文和以上參考文獻的指導不難獲得本發明所用的其它核苷和核苷酸。本發明寡核苷酸包括天然存在的鹼基、修飾的鹼基和鹼基類似物的所有互變異構體形式。因此，具有DNA、PNA或DNA/PNA的正常鹼基、修飾的嘧啶核鹼基、通用鹼基、糖修飾或骨架修飾的組合的多核苷酸屬於本發明範圍。在一些實施方式中，可將本發明多核苷酸與至少一種可檢測標記、無螢光猝滅劑和/或至少一種穩定部分偶聯。在一些實施方式中，與至少一種可檢測標記、無螢光猝滅劑和/或至少一種穩定部分偶聯的本發明多核苷酸可用作擴增反應的探針或引物。術語"可檢測標記"指當與本發明多核苷酸相連時可採用已知的檢測方法檢測這種多核苷酸的任何部分。示範性可檢測標記包括但不限於能用合適的檢測器直接檢測標記化合物的螢光團、生色團、放射性同位素、自旋標記、酶標記或化學發光標記，或者結合對，例如配體，如能以高親和力特異性結合可檢測抗配體(如標記的抗體或親和素)的抗原或生物素。在一些實施方式中，標記可以是螢光標記，例如螢光素或羅丹明染料或螢光染料對，如FRET染料。在一些實施方式中，本發明多核苷酸可包含一個或多個"無螢光猝滅劑"部分。本文所用的"無螢光猝滅劑"包括但不限於例如特定的偶氮染料(如DABCYL或DABSYL染料和它們的結構類似物)，三芳基甲烷染料，如孔雀綠或酚紅，4',5'-二醚取代的螢光素(美國專利號4,318,846)，不對稱花青染料猝滅劑(參見，Lee等，美國專利號6,080,868和Lee等，美國專利號6,348,596)，或在一個或多個氨基氮原子之處被芳族或雜芳族環系統取代的3-和/或6-氨基咕噸的無螢光衍生物(Haugland等，美國專利號6,399,392)。本文所用的"無螢光"表明對於本文的任何方法，所述試驗溶液中猝滅部分在發射-、皿的螢光效率小於或等於5%發射。在一些實施方式中，在發射-^，的螢光效率小於或等於1%發射。在本發明的一些實施方式中.，共價連接的猝滅部分在發射-、皿顯示量子產率低於約0.1%發射。在一些實施方式中，在發射-^^低於約0.01%發射。在一些實施方式中，可將本發明多核苷酸與至少一個"穩定部分"偶聯。本文所用的術語"穩定部分"所指的部分包括但不限於小溝結合劑(MGB)部分。參考文獻描述了各種合適的小溝結合劑。參見，例如Kutyavin等，美國專利號5,801,155;Wemmer,D.E.禾卩DervanP.B.，CurrentOpinoninStructuralBiology,7:355-361(1997);Walker,W.L.，K叩ka,J.L.和Goodsell,D.S.，Biopolymers,44:323-334(1997);Zimmer，C和Wahnert,U.，Prog.Biophys.Molec.Bio.，47:31-112(1986)和Reddy，B.S.P.，Dondhi,S.M.和Lown，J,W.，Pharmacol.Therap.，84:1-111(1999)。將MGB(以及報導基團，如上述螢光團和猝滅劑)通過接頭與多核苷酸相連的合適方法見，例如美國專利號5,512,677;5,419,966;5,696,251;5,585,481;5,942,610和5，736,626。小溝結合劑包括，例如3-氨甲醯基-l,2-二氫-(3-H7)-吡咯[3,2-e]吲哚-7-羧酸酯的三聚物(CDPl3)和N-甲基吡咯-4-羧-2-醯胺的五聚物(MPC5)。其它MGB部分見美國專利號5,801,155。在某些實施方式中，可將MGB與增強水溶性的基團相連(例如，糖或胺基酸)。本發明多核苷酸可用於，例如多核苷酸鏈延伸或連接反應的引物和/或探針。本文所用的"鏈延伸反應"指其中至少一種本發明多核苷酸(例如，作為引物或連接探針)可與至少一條DNA模板鏈退火的引物延伸反應。在多核苷酸鏈延伸反應中，退火步驟後可將引物延伸至少一個核苷酸從而形成擴增子或延伸產物。或者，在多核苷酸鏈延伸反應中，退火步驟後可將引物與第二連接探針相連從而形成連接產物。本發明包括所有可能的鏈延伸反應，包括但不限於聚合酶鏈式反應(PCR)、嵌套式PCR(nestedPCR)、異步PCR(asynchronousPCR)、實日寸PCR、TaqMan試驗、DNA測序、循環DNA測序(cycledDNAs叫uencing)、寡核苷酸連接試驗(OLA)和片段分析，這些反應描述於，例如ThePCRTechnique:DNASequencingII(《PCR技術DNA測序II》)，EatonPublishingCo.(1997);GenomeAnalysis,ALaboratoryManualVolumeI:AnalyzingDNA(《基因組分析實驗室手冊》，第1巻DNA分析)，Birren，B.，Green，E.，Klapholz，S.，Myers,R.M.和Roskams，J.編，冷泉港實驗室出版社(1997);Innis，M.等，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandA卯lications(《PCR方案:方法與應用指南》)，AcademicPress(1989);Chen,C.等，美國專利申請公布號2003/0207266Al;Erlich等，美國專利號5,314,809;美國專利號6，221，606和Bi，W.等，美國專利號6,511,810。本發明寡核苷酸可各自合適地作為引物或探針用於以上任何引物延伸反應。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸方法，包括將多核苷酸引物與變性DNA模板退火，從而使該多核苷酸與該變性DNA模板一條鏈上的互補多核苷酸序列退火以形成引物-模板複合物；和延伸該引物-模板複合物的引物部分以形成雙鏈擴增子，其中所述多核苷酸引物是本發明引物。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸方法，包括在延伸步驟後使雙鏈擴增子變性。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少1次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少10次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少20次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少30次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少40次。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸方法，包括i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物與變性DNA模板的第一和第二鏈退火，使得該第一多核苷酸引物與該變性DNA模板第一鏈的互補寡核苷酸序列退火，該第二多核苷酸引物與該變性DNA模板第二鏈的互補寡核苷酸序列退火，從而形成第一和第二引物-模板複合物，和ii)延伸該第一和第二引物-模板複合物中至少一個的引物部分以形成雙鏈DNA擴增子，其中該第一多核苷酸引物或該第二多核苷酸引物中至少一個可以是本發明多核苷酸。在一些實施方式中，該方法可以包括先形成含第一多核苷酸引物、第二多核苷酸引物、DNA模板和其它引物延伸試劑(包括，例如緩衝液和聚合酶)的混合物，再進行退火步驟。在一些實施方式中，本發明所用聚合酶可包括至少一種熱穩定聚合酶，包括但不限於ra《、屍/w、Vent、DeepVent、/Vo、UITma和Tth聚合酶及它們的酶活性突變體和變體。可商品化購得熟知的這種聚合酶。聚合酶的其它描述見全球資訊網URL:the-scientist.library.upenn.edu/yrl998/jan/profilel_980105.html。在一些實施方式中，該方法在形成(混合物)步驟之後但在退火步驟之前使DNA模板變性，從而形成變性DNA模板和第二變性DNA模板的第一鏈。在一些實施方式中，先進行延伸步驟，再使雙鏈DNA擴增子變性。在一些實施方式中，可重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟1-100次。在一些實施方式中，可重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟10-100次。在一些實施方式中，可重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟20-100次。在一些實施方式中，可重複雙鏈DNA擴增子的退火、延伸和變性步驟30-100次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少l次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少10次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少20次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少30次。在一些實施方式中，可重複退火、延伸和變性步驟至少40次。在一些實施方式中，本發明提供引物延伸的方法，包括先使多核苷酸探針與變性DNA模板的第一或第二鏈退火，從而使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第一鏈的互補多核苷酸序列退火和/或使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第二鏈的互補寡核苷酸序列退火，再進行延伸引物部分的步驟。在一些實施方式中，該多核苷酸探針包含至少一個可檢測標記。在一些實施方式中，該多核苷酸探針還包含猝滅劑、小溝結合劑中的至少一個或二者。在一些實施方式中，該多核苷酸探針可以是本發明多核苷酸。在一些實施方式中，本發明提供"片段分析"或"遺傳學分析"的方法，其中可通過模板指導的酶促合成使用標記的引物或核苷酸產生標記的多核苷酸片段；可通過尺寸依賴性分離方法，例如電泳或層析分離這些片段；和在分離後檢測(例如通過雷射誘導的螢光)分離的片段。在一些實施方式中，同時分離多類多核苷酸，通過光譜學可分辨的標記區分不同類別。在一些實施方式中，本發明提供分析片段的方法，其中可根據末端核苷酸鑑定和確定片段類別，從而能在四種可能的末端鹼基與一組光譜學可分辨染料的諸成員之間建立聯繫。使用可商品化購得的分光光度計通過檢測發射和吸收帶寬不難從本領域已知的螢光染料裝配這些染料組。在一些實施方式中，通過DNA測序的鏈終止方法，即二脫氧DNA測序或桑格型測序檢測片段類別。桑格型測序包括利用要測定序列的單鏈或雙鏈DNA模板通過DNA聚合酶在體外合成DNA鏈。在按照寡核苷酸引物與模板退火之處確定的位點開始合成。通過摻入不支持DNA繼續延伸的核苷酸來終止合成反應。示範性鏈終止核苷酸類似物包括缺乏3'-5'DNA鏈延伸所需的3'-OH的2'，3'-二脫氧核苷5'-三磷酸(ddNTP)。當使用適當比例的dNTP(2'-脫氧核苷5'-三磷酸)禾卩4種ddNTP之一時，鏈群體的一部分中酶催化聚合將在慘入ddNTP的各位點終止。如果各反應使用標記的引物或標記的ddNTP，高解析度電泳分離後可通過螢光檢測序列信息。在鏈終止方法中，可將本發明染料與測序引物或二脫氧核苷酸相連。在該方法中，可將螢光染料分子與以下位置的互補官能團相連例如引物5'末端，如Fung等，美國專利號4,757,141所述；引物的核鹼基上；或二脫氧核苷酸的核鹼基上，如通過納入本文作為參考的Hobbs等，歐洲專利申請號87305844.0和Hobbs等，JOrg.Chem.，54:3420(1989)所述的炔基氨基連接基團。在一些實施方式中，優選通過電泳方法分離標記的多核苷酸，所述電泳方法公開於，例如Ricl(wood禾口Hames編，GelElectrophoresisofNucleicAcids:APracticalApproach(《核酸凝膠電泳實用方法》)，IRLPressLimited,倫敦，1981;Osterman，MethodsofProteinandNucleicAcidResearch(蛋白質與核酸研究方法)，第1巻，Springer-Verlag，伯林，1984;或美國專利5,374,527;5,624,800和/或5,552,028。在一些實施方式中，電泳基質的類型可以是濃度(重量體積比)在約2-20重量百分比之間的交聯或未交聯聚丙烯醯胺。在一些實施方式中，聚丙烯醯胺濃度在約4-8百分比之間。在一些實施方式，例如DNA測序中，電泳基質可包含變性劑，例如脲、甲醯胺等。構建這種基質的詳細方法見，例如Maniatis等，"FractionationofLowMolecularWeightDNAandRNAinPolyacrylamideGelsContaining98%Fo醒mideor7MUrea"(用含98%甲醯胺或7M脲的聚丙烯醯胺凝膠分級低分子量DNA和RNA)，刊於MethodsinEnzymology,65:299-305(1980);Maniatis等，"ChainLengthDeterminationofSmallDouble-andSingle-StrandedDNAMoleculesbyPolyacrylamideGelElectrophoresis"(通過聚丙烯醯胺凝膠電泳測定雙鏈和單鏈小DNA分子的鏈長)，Biochemistry,14:3787-3794(1975);Maniatis等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆實驗室手冊》)，冷泉港實驗室，紐約，第179-185頁，(1982);和ABIPRISM377DNASequencerUser'sMa薩l(DNA測序儀用戶手冊)，Rev.A，1995年1月，第2章(AppliedBiosystems，FosterCity,加利福尼亞州)。應該知道，最佳電泳條件，例如具體分離採用的多聚物濃度、pH、溫度和變性劑濃度取決於許多因素，包括待分離核酸的大小範圍、它們的鹼基組成、它們是單鏈還是雙鏈、電泳所探尋信息的類別性質。電泳分離後，可釆用，例如檢測標記多核苷酸的染料發射的螢光來檢測標記的多核苷酸。為進行這種檢測，可採用標準方法，例如高強度汞蒸氣燈、雷射等照射標記的多核苷酸。在一些實施方式中，照射方式是照射束的波長大於約600nm的雷射。在一些實施方式中，用He-Ne氣體雷射或固態二級管雷射產生的雷射照射染料-多核苷酸。照射後，可利用光敏檢測器，例如光電倍增管、電荷耦合器件檢測標記多核苷酸的螢光強度。示範性電泳檢測系統描述於，例如美國專利號5,543,026;5,274,240;4,879,012;5,091,652和4,811,218。在一些實施方式中，本發明提供分析片段的方法，包括使多核苷酸引物與變性的DNA模板退火，從而使得該多核苷酸引物同該變性DNA模板一條鏈的互補多核苷酸序列退火以形成引物-模板複合物，在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下延伸該引物-模板複合物的引物部分以形成DNA擴增子片段，和檢測該DNA擴增子片段。在一些實施方式中，該多核苷酸引物可以是本發明寡核苷酸。本發明片段分析方法的氣體實施方式可見，例如納入本文作為參考的美國專利號6,221,606。本文所用的"連接反應"指其中等位基因特異性連接探針與至少一條DNA模板鏈退火，從而形成探針-模板複合物的反應。退火步驟後，通過連接試劑在探針和第二寡核苷酸片段之間形成共價鍵從而產生連接產物。本發明連接試劑可包含任何數量的酶或化學(即，非酶的)試劑。例如，連接酶是在合適條件下能在毗鄰多核苷酸的3'-OH和5'-磷酸之間形成磷酸二酯鍵的一種酶連接試劑。溫度敏感的連接酶包括但不限於噬菌體T4連接酶、噬菌體T7連接酶和大腸桿菌連接酶。熱穩定的連接酶包括但不限於r^連接酶、T7/z連接酶和屍/"連接酶。可從嗜熱或嗜高溫生物，包括但不限於原核生物、真核生物或古生物獲得熱穩定的連接酶。本發明方法也可用一些RNA連接酶。化學連接試劑包括但不限於活化、縮合和還原劑，例如碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、N-氰基咪唑、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外光。自連接，即在沒有連接試劑存在下的自發連接也屬於本發明範圍。化學連接方法的詳述方案和合適反應基團的描述可見Xu等，NucleicAcidRes.，27:875-81(1999);Gryaznov和Letsinger，NucleicAcidRes.21:1403-08(1993);Gryaznov等，NucleicAcidRes.22:2366-69(1994);Kanaya禾口Yanagawa，Biochemistry25:7423-30(1986);Luebke禾口Dervan，NucleicAcidsRes.20:3005-09(1992);Sievers禾卩vonKiedrowski，Nature369:221-24(1994);Liu和Taylor,NucleicAcidsRes.26:3300-04(1999);Wang禾口Kool，NucleicAcidsRes.22:2326-33(1994);Purmal等，NucleicAcidsRes.20:3713-19(1992);Ashley和Kushlan，Biochemistry30:2927-33(1991);Chu和Orgel，NucleicAcidsRes.16:3671-91(1988);Sokolova等，FEBSLetters232:153-55(1988);Naylor和Gilham，Biochemistry5:2722-28(1966);美國專利號5,476,930;和Royer,EP324616Bl)等。在一些實施方式中，連接試劑是"活化"或還原劑。應該知道如果使用化學連接，第一探針的3'端和第二探針的5'端應包含有助於連接的合適反應基團。在一些實施方式中，本發明提供連接寡核苷酸的方法，包括i)形成包含與DNA模板退火的第一和第二多核苷酸鏈的複合物，從而使該第一多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第一互補多核苷酸序列退火和使該第二多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第二互補多核苷酸序列退火，其中該變性DNA模板鏈的第二互補多核苷酸序列位於該變性DNA模板鏈的第一互補多核苷酸序列的5'端，和ii)在該第一和第二多核苷酸鏈之間形成穩定的共價鍵，其中該第一多核苷酸鏈或第二多核苷酸鏈中至少一個是本發明多核苷酸。在一些實施方式中，本發明提供連接寡核苷酸的方法，包括第一寡核苷酸與變性DNA模板的一條鏈退火，使得該第一寡核苷酸與該變性DNA模板鏈的互補寡核苷酸序列退火，從而形成第一寡核苷酸-模板複合物；第二寡核苷酸與該第一寡核苷酸-模板複合物中與該第二寡核苷酸互補的寡核苷酸序列退火，從而形成第二寡核苷酸-模板複合物，其中該第二寡核苷酸與該第一寡核苷酸-模板複合物退火使得該第一寡核苷酸的3'末端和該第二寡核苷酸的5'末端與變性DNA模板的毗鄰核苷酸相連；和在該第一寡核苷酸的3'末端和該第二寡核苷酸的5'末端之間形成穩定的共價鍵。在一些實施方式中，該第一寡核苷酸或該第二寡核苷酸中至少一個可以是本發明寡核苷酸。在一些實施方式中，本發明提供檢測靶多核苷酸序列的方法，包括(a)使靶多核苷酸鏈和靶互補鏈與第一探針對和第二探針對反應，所述第一探針對包含(i)含有與該靶鏈中第一耙區域互補的序列的第一多核苷酸探針和(ii)含有與該耙鏈中第二靶區域互補的序列的第二多核苷酸探針，其中該第二區域位於該第一區域的5'端並與該第一區域至少有一個核苷酸鹼基重疊，所述第二探針對包含(i)含有與該靶互補鏈中第一區域互補的序列的第三多核苷酸探針和(ii)含有與該靶互補鏈中第二靶區域互補的序列的第四多核苷酸探針，其中該第二區域位於該第一區域的5'端並與該第一區域至少有一個核苷酸鹼基重疊，該反應在能使該第一和第二探針分別與該靶鏈中第一和第二區域雜交以形成第一雜交複合物，以及該第三和第四探針分別與該靶互補鏈中第一和第二區域雜交以形成第二雜交複合物的有效條件下進行；(b)切割該第一雜交複合物中的第二探針，以及該第二雜交複合物中的第四探針以形成(i)含有該靶鏈、該第一探針和該第二探針的第一片段的第三雜交複合物，其中該第二探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第一探針的3'末端核苷酸，和(ii)含有該靶互補鏈、該第三探針和該第四探針的第一片段的第四雜交複合物，其中該第四探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第三探針的3'末端核苷酸；(c)連接該第一探針與該第二探針的雜交片段以形成與該靶鏈雜交的第一連接鏈，連接該第三探針與該第四探針的雜交片段以形成與該靶互補鏈雜交的第二連接鏈；(d)使該第一連接鏈變性(脫離)該靶鏈，使該第二連接鏈變性(脫離)該靶互補鏈；和(e)再進行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最後一輪中可任選省去步驟(d)。在一些實施方式中，該第一區域與該第二區域有一個核苷酸鹼基重疊。在一些實施方式中，該第一和第三探針的5'端可以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第一和第三探針的5'端以核苷酸5'羥基結尾。在一些實施方式中，該第二和第四探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第二和第四探針的5'端以核苷酸5'羥基結尾。在一些實施方式中，該第一、第二、第三和第四探針的5'端各自獨立以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第二和第四探針的3，端各自獨立以除核苷酸3'羥基以外的基團結尾。在一些實施方式中，該第二和第四探針的3'端各自獨立以核苷酸3，磷酸基團結尾。在一些實施方式中，這些探針中至少一個含有可檢測標記。在一些實施方式中，該標記可以是螢光標記。在一些實施方式中，該標記可以是放射性標記。在一些實施方式中，該標記可以是化學發光標記。在一些實施方式中，該標記可以是酶。在一些實施方式中，該第一探針和該第三探針中至少一個含有可檢測標記。在一些實施方式中，該第一探針和該第三探針各含有可檢測標記。在一些實施方式中，該第一探針和該第三探針上的可檢測標記可以相同。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針中至少一個含有可檢測標記。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針各含有可檢測標記。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針可含有相同的可檢測標記。在一些實施方式中，切割步驟產生了未與該第三雜交複合物結合的該第二探針的第二片段，該方法還包括檢測所述第二片段。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針中至少一個同時含有(i)螢光染料和(ii)在螢光染料與螢光激發能量接觸時能猝滅螢光發射的猝滅劑染料，所述切割切開該第二探針和/或第四探針中螢光染料和猝滅劑染料之間的共價鍵，從而增強該螢光染料的可觀察螢光信號。在一些實施方式中，該第二探針和該第四探針各含有(i)螢光染料和(ii)猝滅劑染料。在一些實施方式中，切割步驟產生了未與該第四雜交複合物相連的該第四探針的第二片段，該方法還包括檢測兩種第二片段。在一些實施方式中，該第二片段含有基本上不與該靶鏈互補的一個或多個毗連核苷酸。在一些實施方式中，一個或多個毗連核苷酸包含l-20個核苷酸。在一些實施方式中，該方法還包括將該第二片段固定在固體支持物上。在一些實施方式中，該方法還包括對該第二片段進行電泳。在一些實施方式中，該方法還包括通過質譜法檢測該第二片段。在一些實施方式中，該方法還包括在最後一輪後檢測該第二片段。在一些實施方式中，該方法還包括在多輪期間或之後檢測該第二片段。在一些實施方式中，該方法還包括在所有輪次期間檢測該第二片段。在一些實施方式中，該方法還包括在至少一輪後檢測該第一雜交複合物、第二雜交複合物或二者。在一些實施方式中，該方法還包括在至少一輪後檢測該第三雜交複合物、第四雜交複合物或二者。在一些實施方式中，該方法還包括在至少一輪後檢測該第--連接鏈、第二連接鏈或二者。在一些實施方式中，該檢測包括電泳分離步驟。用於檢測靶多核苷酸的連接方法的其它實施方式可見全文納入本文作為參考的Bi，W.等，美國專利號6,511,810。實施例材料與方法除非另有表述，所有合成反應均在氬氣氣氛中在烘箱或火焰乾燥的玻璃器皿中進行。在氬氣氣氛中用氫化鈣(CaH2)蒸餾二氯甲垸(CH2Cl2)。除非另有表述，所有其它溶劑從分配器接收使用。用購自Sigma-Aldrich(密爾沃基，威斯康星州)的1mm矽膠板進行薄層層析(TLC)，用紫外光(Spectroline;ENF-240C型)或用KMn04或磷鉬酸染色觀察。用購自Sigma-Aldrich(密爾沃基，威斯康星州)的平均粒徑為40pm的矽膠進行快速柱層析。未衍生的CPG支持物購自AppliedBiosystemsInc(P/N360139,FosterCity，加利福尼亞州)。除非另有表述，所有其它試劑購自Sigma-Aldrich。除非另有表述，用ABI394DNA合成儀按照標準方法進行0.2pmol規模的自動DNA合成。用Agilent1100HPLC系統通過反相HPLC純化寡核苷酸。用Mariner質譜儀(AppliedBiosystems,FosterCity)記錄ESI-TOF質譜。用AgilentCE系統通過毛細管電泳(CE)檢測合成寡核苷酸的純度。合成2'-脫氧-假異胞苷CPG:按照方案1合成2'-脫氧-假異胞苷(2'-Deoxy-pseudoisocvtidine)CPG。如Mayer,A.，Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids，第22巻，1919-25(2003)所述合成N-苯甲醯基保護的2'-脫氧-假異胞苷(1)。方案14'-(3-羧基丙醯基)-5'-二甲氧基三苯甲基-2'-脫氧-假異胞苷(2):向攪拌的30mg1的0.7mL012(:12溶液中加入8.5mg琥珀酸酐，2.9mgDMAP和14pL三乙胺(Et3N)。攪拌12小時後，用7mLCH2C12稀釋混合物，用5%檸檬酸水溶液(1X7mL)和飽和的氯化鈉，NaCl(1X7mL)洗滌。用Na2S04乾燥有機層，蒸發，採用矽膠層析純化殘留物得到18mg4'-(3-羧基丙醯基)-5'-二甲氧基三苯甲基-2'-脫氧-假異胞苷。2'-脫氧-假異胞苷CPG(3):向上文獲得的17mg5-三氟甲基-4'-(3-羧基丙醯基)-5'-二甲氧基三苯甲基-2'-脫氧尿苷的0,6mL二甲基甲醯胺(DMF)溶液中加入8.3mg2-(lH-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鏡六氟磷酸鹽(HBTU)、5.7pL二異丙基乙胺(DIPEA)和594mgCPG(37|iM/g)。混合物振蕩2小時，然後用DMF(4X20mL)和THF(2X20mL)洗滌。高度真空下乾燥5-三氟甲基-2'-脫氧尿苷CPG產物4小時。2'-脫氧-假異胞苷的3'-末端核苷酸如上所述，用ABI394DNA合成儀按照標準方法進行0.2pmol規模的自動DNA合成。用Agilent1100HPLC系統通過反相HPLC純化寡核苷酸。結果合成了表1所示多核苷酸。正向引物ATIRFcC和反向引物ATIRRcC血管緊張素II1型受體基因(ATIR，100bp)。正向引物LIGFcC和反向引物LIGRcC擴增部分人DNA連接酶I基因(LIG，250bp)。正向引物D10SFcC和反向以引物D10SRcC擴增部分人染色體10克隆RP11-143D9(D10S，102bp)。表ltableseeoriginaldocumentpage31每15反應(體系)用5000拷貝的gDNA進行所有gDNA擴增。擴增反應條件使用未修飾和/或修飾的引物在含以下試劑的15反應(體系)中進行擴增-10mMTris-HCl緩衝液，pH8.3-50mMKCl，3mMMgCl2，0.01。/。v/v明膠-0,2mMdATP，0.2mMdCTP，0.2mMdGTP禾P0.4mMdUTP-0.025單位/pLAmpliTaqGoldDNA聚合酶(AppliedBiosystems，P/NN808-0107)-200nM各種正向和反向引物-無模板對照(NTC)實驗用水或15ng基因組DNA(AppliedBiosystems，P/N403062)。如SYBRGreenPCRMasterMixandRT陽PCR:Protocol(SYBR⑧綠色PCR主混合物和RT-PCR:方案)(AppliedBiosystems,2002)所述，通過SYBRGreenassay(SYBI^綠色試驗)使用ABIPRISM7900HT序列檢測系統(AppliedBiosystems;FosterCity，加利福尼亞州)實時監測所有PCR反應的進展。擴增反應分析如下所示通過凝膠電泳分析所有擴增產物。用5^L無核酸酶的水稀釋PCR反應混合物(15nL)。將該溶液連同25bpDNA梯加載入4。/。瓊脂糖凝膠孔中(Invitrogen，P/NG5018-04)。在12VDC，880mA進行電泳30分鐘。採用紫外照射觀察溴化乙錠染色的dsDNA條帶，採用裝配了柯達數位相機的AlphaDigDoc1000軟體(AlphaI腸tech;SanLeandro，加利福尼亞州)定量測定。熱循環採用以下熱循環參數進行擴增溫度循環。表2tableseeoriginaldocumentpage32對於各引物對，使用未修飾和3'-修飾的引物進行含有對應於引物對的gDNA的擴增反應。此外，使用未修飾和3'-修飾引物進行不含任何模板的擴增反應作為無模板對照(NTC)反應。如上所述進行凝膠電泳分析。依據所用的引物組，凝膠電泳顯示含未修飾引物的NTC擴增中在約40-50bp處有顯著量的非特異性擴增產物，表明有引物-二聚體擴增子形成。另一方面，在使用3'-修飾引物的NTC擴增的凝膠電泳圖像中觀察到引物-二聚體擴增子形成顯著減少。使用未修飾引物的gDNA模板擴增反應的凝膠電泳明確顯示了對應於所需模板擴增子的條帶，也顯示了對應於有引物-二聚體擴增子形成的條帶。使用未修飾引物的ATIR模板擴增明確顯示在約100bp處有對應於所需模板擴增子的條帶，也顯示在約50bp處有對應於有引物-二聚體擴增子形成的條帶。在另一方面，使用3'-修飾引物的ATIR模板擴增明確顯示在約100bp處有對應於所需模板擴增子的條帶，但未顯示形成了可鑑定的引物-二聚體擴增子。實時RCR監測顯示使用未修飾和3'修飾引物的ATIRgDNA擴增效率非常相似。在另一方面，雖然使用未修飾引物的NTC擴增的Ct值約為30，但使用2'-脫氧-假異胞苷修飾引物的NTC擴增直到第37輪(擴增)後也未得到可檢測的信號。使用未修飾引物的LIG模板擴增明確顯示在約250bp處有對應於所需模板擴增子的條帶，也顯示在約50bp處有對應於引物-二聚體擴增子形成的微弱條帶。在另一方面，使用3'-修飾引物的LIG模板擴增明確顯示在約250bp處有對應於所需模板擴增子的條帶，但未顯示形成了可鑑定的引物-二聚體擴增子。實時PCR監測顯示使用未修飾和3'修飾引物的LIGgDNA擴增效率相似，Ct值分別為26和33。在另一方面，雖然使用未修飾引物的NTC擴增的Ct值約為36，但使用2'-脫氧-假異胞苷修飾引物的NTC擴增顯示通過50輪擴增未形成可檢測的擴增子。使用未修飾引物的D10S模板擴增明確顯示在約100bp處有對應於所需模板擴增子的條帶，也顯示在約50bp處有對應於引物-二聚體擴增子形成的微弱條帶。在另一方面，使用3'-修飾引物的D10S模板擴增明確顯示在約100bp處有對應於所需模板擴增子的條帶，但未觀察到形成了引物-二聚體擴增子。實時PCR監測顯示使用未修飾和3，修飾引物的D10SgDNA擴增效率非常相似，Ct值分別為23和26。在另一方面，雖然使用未修飾引物的NTC擴增的Ct值約為29，但使用2'-脫氧-假異胞苷修飾引物的NTC擴增顯示直到第40輪(擴增)後也未得到可檢測的信號。權利要求1.一種在離其3』末端不超過4個核鹼基處含有至少一個修飾的嘧啶核鹼基的多核苷酸，其中所述修飾的嘧啶核鹼基具有以下結構其中R選自-H、-F、-Cl、氰基、硝基、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基、C3-C10芳基醚、C3-C10取代的芳基醚、-CF3、-NR1R1、C3-C6環狀烷基、C3-C6取代的環狀烷基、苯基、取代的苯基和C5-C10雜芳基，其中R1選自-H、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基。2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，R是-H。3.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，R是C1-C6烷基.4.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，R是C1-C6取代的烷基。5.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，R是C3-C10芳基。6.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，R是C3-C10取代的芳基。7.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，R是-CF3。8,如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，R是氨基。9.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於，R是取代的氨基。10.如權利要求1所述的多核苷酸，其特徵在於R是C3-C6環狀垸基。11.如權利要求1所述的多核苷酸其特徵在於，R是C3-C6取代的環狀烷基。12.如權利要求l所述的多核苷酸其特徵在於R是苯基。13.如權利要求1所述的多核苷酸其特徵在於，R是取代的苯基。14.如權利要求1所述的多核苷酸其特徵在於，R是雜芳基。15.如權利要求1-14中任一項所述的多核苷酸，其特徵在於，在離所述多核苷酸的3'末端不超過3個核苷酸處含有至少一個修飾的嘧啶核鹼基。16.如權利要求1-14中任一項所述的多核苷酸，其特徵在於，在離所述多核苷酸的3'末端不超過2個核苷酸處含有至少一個修飾的嘧啶核鹼基。17.如權利要求1-14中任一項所述的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸的3'末端核苷酸是至少一個修飾的核苷酸。18.如權利要求1-17中任一項所述的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸是引物。19.如權利要求1-17中任一項所述的多核苷酸，其特徵在於，所述多核苷酸在3'末端是可延伸的。20.如權利要求1-17中任一項所述的多核苷酸，其特徵在於，含有可檢測標記、猝滅劑、小溝結合劑中至少一種或它們的任何組分。21.如權利要求20所述的多核苷酸，其特徵在於，該寡核苷酸是在其3'末端不可延伸的探針。22.-—種延伸引物的方法i)將多核苷酸引物與變性DNA模板退火，從而使該多核苷酸引物與該變性DNA模板一條鏈上的互補多核苷酸序列退火以形成引物-模板複合物；和ii)延伸該引物-模板複合物的引物部分以形成雙鏈擴增子，其中所述多核苷酸引物是如權利要求1-20中任一項所述的多核苷酸。23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，包括在延伸步驟後使該雙鏈擴增子變性。24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和變性步驟至少一次。25.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和變性步驟至少十次。26.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和變性步驟至少二十次。27.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和變性步驟至少三十次。28.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和變性步驟至少四十次。29.如權利要求22-28中任一項所述的方法，其特徵在於，在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下進行延伸，從而形成DNA擴增子片段。30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，檢測該DNA擴增子片段。31.—種延伸引物的方法，包括i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物與變性DNA模板的第一鏈和第二鏈退火，使得該第一多核苷酸引物與該變性DNA模板第一鏈的互補寡核苷酸序列退火，該第二多核苷酸引物與該變性DNA模板第二鏈的互補寡核苷酸序列退火，從而形成第一和第二引物-模板複合物，和ii)延伸該第一和第二引物-模板複合物中至少一個的引物部分以形成雙鏈DNA擴增子，其中該第一多核苷酸引物或該第二多核苷酸引物中至少一個是如權利要求1-20中任一項所述的多核苷酸。32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，包括在形成步驟後但在退火步驟前使該DNA模板變性以形成變性DNA模板和第二變性DNA模板的第一鏈。33.如權利要求31-32中任一項所述的方法，其特徵在於，包括在延伸步驟後使該雙鏈DNA擴增子變性。34.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和該雙鏈DNA擴增子的變性步驟至少一次。35.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和該雙鏈DNA擴增子的變性步驟至少十次。36.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和該雙鏈DNA擴增子的變性步驟至少二十次。'37.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，重複退火、延伸和該雙鏈DNA擴增子的變性步驟至少三十次。38.如權利要求31-37中任一項所述的方法，包括先使多核苷酸探針與變性DNA模板的第一鏈或第二鏈退火，從而使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第一鏈的互補多核苷酸序列退火或使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第二鏈的互補寡核苷酸序列退火，再進行延伸引物部分的步驟。39.如權利要求38所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸探針包含至少一個可檢測標記。40.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸探針還包含猝滅劑、小溝結合劑的至少一種或二者。41.如權利要求38-40中任一項所述的方法，其特徵在於，所述多核苷酸探針是如權利要求21所述的多核苷酸。42.如權利要求38-41中任一項所述的方法，其特徵在於，在離所述探針的3'末端不超過2個核苷酸處含有至少一個所述修飾的嘌呤核鹼基。43.如權利要求38-41中任一項所述的方法，其特徵在於，至少一個所述修飾的嘌呤核鹼基離所述探針的3'末端不超過1個核苷酸。44.如權利要求38-41中任一項所述的方法，其特徵在於，所述修飾的嘌呤核鹼基是所述探針的3'末端核苷酸。45.—種連接寡核苷酸的方法，包括i)形成包含與DNA模板退火的第一和第二多核苷酸鏈的複合物，從而使該第--多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第一互補多核苷酸序列退火和使該第二多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第二互補多核苷酸序列退火，其中該變性DNA模板鏈的第二互補多核苷酸序列位於該變性DNA模板鏈的第一互補多核苷酸序列的5'端，禾口ii)在該第一和第二多核苷酸鏈之間形成穩定的共價鍵，其中該第一多核苷酸鏈或第二多核苷酸鏈中至少一個是如權利要求1-20中任一項所述的多核苷酸。46.—種檢測耙多核苷酸序列的方法，包括(a)使靶多核苷酸鏈與第一探針對反應，所述第一探針對包含(i)含有與該耙鏈中第一靶區域互補的序列的第一多核苷酸探針和(ii)含有與該靶鏈中第二耙區域互補的序列的第二多核苷酸探針，其中該第二區域位於該第一區域的5'端並與該第一區域至少有一個核苷酸鹼基重疊，該反應在能使該第一和第二探針分別與該靶鏈中第一和第二區域雜交以形成第一雜交複合物的有效條件下進行，(b)切割該第一雜交複合物中的第二探針以形成含有該靶鏈、該第一探針和該第二探針的第一片段的第二雜交複合物，其中該第二探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第一探針的3'末端核苷酸，(c)連接該第一探針與該第二探針的雜交片段以形成與該靶鏈雜交的第一連接鏈，(d)使該第一連接鏈變性脫離該靶鏈，和(e)再進行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最後一輪中可任選省去步驟(d),其中該第一探針、該第二探針中至少一個或二者是如權利要求1-20中任一項所述的多核苷酸。47.如權利要求46所述的方法，其特徵在於，所述第一區域與所述第二區域有一個核苷酸鹼基重疊。48.如權利要求46-47中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第一探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。49.如權利要求46-47中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第一探針的5'端以核苷酸5'羥基結尾。50.如權利要求46-49中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第二探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。51.如權利要求46-49中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第二探針的5'端以核苷酸5'羥基結尾。52.如權利要求46-51中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第二探針的3'端以除核苷酸3'羥基以外的基團結尾。53.如權利要求46-51中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第二探針的所述3'端以核苷酸3'磷酸基團結尾。54.如權利要求46-53所述的方法，包括(a)使靶互補鏈與第二探針對反應，所述第二探針對包含(i)含有與該耙互補鏈中第一區域互補的序列的第三多核苷酸探針和(ii)含有與該靶互補鏈中第二區域互補的序列的第四多核苷酸探針，其中該第二區域位於該第一區域的5'端並與該第一區域至少有一個核苷酸鹼基重疊，該反應在能使該第三和第四探針分別與該靶互補鏈中第一和第二區域雜交以形成第三雜交複合物的有效條件下進行，(b)切割該第二雜交複合物中的第四探針以形成含有該靶互補鏈、該第三探針和該第四探針的第一片段的第四雜交複合物，其中該第四探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第三探針的3，末端核苷酸，(c)連接該第三探針與該第四探針的雜交片段以形成與該靶互補鏈雜交的第二連接鏈，(d)使該第二連接鏈變性脫離該靶互補鏈，和(e)再進行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最後一輪中可任選省去步驟(d)。55.如權利要求54所述的方法，其特徵在於，所述第三探針與所述第四探針中至少一個或二者是如權利要求1-20中任一項所述的多核苷酸。56.如權利要求54-55中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第三探針的5，端以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。57.如權利要求54-55中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第三探針的5'端以核苷酸5'羥基結尾。58.如權利要求54-55中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第四探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團以外的基團結尾。59.如權利要求54-55中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第四探針的5'端以核苷酸5'羥基結尾。60.如權利要求46-59中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第一、第二、第三和第四探針的5'端任選以除核苷酸5，磷酸基團以外的基團結尾。61.如權利要求54-58中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第四探針的3'端以除核苷酸3'羥基以外的基團結尾。62.如權利要求54-58中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第四探針的所述3'端以核苷酸3'磷酸基團結尾。63.如權利要求46-62中任一項所述的方法，其特徵在於，至少一個所述探針含有可檢測標記。64.如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述標記是螢光標記。65，如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述標記是放射性標記。66.如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述標記是化學發光標記。67.如權利要求63所述的方法，其特徵在於，所述標記是酶。68.如權利要求54-63中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第一探針和第三探針中至少一個含有可檢測標記。69.如權利要求54-63中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第一探針和第三探針各含有可檢測標記。70.如權利要求69所述的方法，其特徵在於，所述第一探針和第三探針上的可檢測標記相同。71.如權利要求54-63中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第二探針和第四探針中至少一個含有可檢測標記。72.如權利要求54-63中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第二探針和第四探針各含有可檢測標記。73.如權利要求72所述的方法，其特徵在於，所述第二探針和第四探針含有相同的可檢測標記。74.如權利要求54-73中任一項所述的方法，其特徵在於，所述切割產生了未與所述第二雜交複合物相連的所述第二探針的第二片段，所述方法還包括檢測所述第二探針的所述第二片段。75.如權利要求54-73中任一項所述的方法，其特徵在於，所述切割產生了未與所述第四雜交複合物相連的所述第四探針的第二片段，所述方法還包括檢測所述第四探針的所述第二片段。76.如權利要求74-75中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第二探針和所述第四探針中至少一個同時含有(i)螢光染料和(ii)在螢光染料與螢光激發能量接觸時能猝滅螢光發射的猝滅劑染料，所述切割切開該第二探針和/或第四探針中螢光染料和猝滅劑染料之間的共價鍵，從而增強該螢光染料的可觀察螢光信號。77.如權利要求76所述的方法，其特徵在於，所述第二探針和所述第四探針各含有(i)螢光染料和(ii)猝滅劑染料。78.如權利要求74-75中任一項所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括檢測兩種所述第二片段。79.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，所述第二片段含有基本上不與該耙鏈互補的一個或多個毗連核苷酸。80.如權利要求79所述的方法，其特徵在於，所述一個或多個毗連核苷酸包含l-20個核苷酸。81.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，還包括將所述第二片段固定到固體支持物上。82.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，還包括將對所述第二片段進行電泳。83.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，還包括通過質譜法檢測所述第二片段。84.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，還包括在最後一輪後檢測所述第二片段。85.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，還包括在多輪期間或之後檢測所述第二片段。86.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，還包括在所有輪次期間檢測所述第二片段。87.如權利要求74所述的方法，其特徵在於，還包括在至少一輪後檢測所述第一雜交複合物、第二雜交複合物或二者。88.如權利要求1和15-21中任一項所述的多核苷酸，其特徵在於，R是氰基。89.如權利要求1和15-21中任一項所述的多核苷酸，其特徵在於，R是硝基。90.如權利要求22-87中任一項所述的方法，其特徵在於，R是氰基。91.如權利要求22-87中任一項所述的方法，其特徵在於，R是硝基。全文摘要文中披露了在其3』末端區域含有某些修飾核鹼基的引物及其各種用法，所述引物能減少擴增反應期間形成的引物-二聚體。文檔編號C12Q1/68GK101171343SQ200580049701公開日2008年4月30日申請日期2005年4月14日優先權日2005年4月14日發明者K·B·穆拉,馬兆春申請人:阿普裡拉股份有限公司