用固定化的寡核苷酸純化三股螺旋體結構的製作方法
2023-09-09 23:48:50
專利名稱：用固定化的寡核苷酸純化三股螺旋體結構的製作方法
參照相關申請本申請要求2000年5月26日申請的美國申請第09/580 923號的優先權利益。後者是1997年6月9日申請的美國申請第08/860 038號的部分繼續申請，而美國申請08/860,038是1995年11月8號申請的PCTFR95/01468的美國國家階段申請，其內容作為根據並引為參考文獻。
背景技術：
這個發明涉及新的DNA純化方法。根據本發明的方法可以迅速純化藥用雙螺旋DNA。更具體地，根據本發明的方法包括DNA序列和寡核苷酸的特異性雜交。
基因和細胞治療目前正經歷著顯著的發展。但是，這些技術要求可能生產大量藥用純度的DNA。實際上，在這些新的療法裡，藥劑本身經常含有DNA，關鍵是能夠生產合適的量，分離和以適合人體治療使用的方式純化。
近年來，注射質粒DNA用於基因治療或疫苗接種已被大量的報告證明可行，這些報告證明DNA表達載體可以被多種細胞類型吸收，而且接著可以表達這些質粒編碼的基因(Ledley，1995 Hum.GeneTher.6，1129).
基因治療和疫苗接種應用中的目的基因可能包括，例如，腫瘤抑制基因， 自殺基因或者反義序列。它們也可編碼蛋白，比如，甲胎蛋白AFP(Morinaga，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，4604)，酶，激素，細胞因子，生長因子如FGF(Jounanneau等，1991，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，88，2893)或者VEGFB(Olofsson B等，1996，Proceedings 93，576)，凝血因子如B缺失因子VIII(Truett等，1985，DNA 4，333)，載脂蛋白，神經遞質，神經營養因子，天然或嵌合免疫球蛋白。也使用了報告基因，例如編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的lacZ。
使用質粒DNA作為人體基因傳送載體的主要挑戰是1)此藥品的製造和2)純度。最近發展了一些技術用於在大腸桿菌宿主中產生高拷貝數的質粒載體。目前使用的質粒要麼是ColE1衍生質粒，比如pBR322，pUC或者pBluescript(Lahijani等，1996，Hum.Gene.Ther.，7，1971)，或者pCOR質粒(Soubrier等，1999，Gene Therapy，6，1482)。
使用質粒DNA作為基因治療載體所產生的第二個考慮事項是質粒載體本身的純度。目前的純化方法，比如氯化銫梯度超離心或者層析，在去除宿主基因組DNA和RNA或蛋白質汙染時效率低下。特別是，化學結構和質粒DNA非常接近的宿主基因組DNA，使用常規層析極難去除。常規層析法製備的質粒中有典型濃度達0.5％到1％的宿主基因組DNA。因此，為了發展作為用於人類基因治療的安全載體的質粒DNA，需要純化技術可以降低宿主基因組DNA的含量到很低的水平，典型為0.1％，甚至0.01％或者更低。
本發明描述簡單而特別有效的DNA純化新方法。特別是，它使獲得高產量高純度成為可能。根據本發明的方法本質上是基於要純化的DNA中所插入的序列和由天然或修飾過的鹼基組成的寡核苷酸的特異性相互作用。
最近表明一些寡核苷酸能夠在DNA雙螺旋的大溝特異性地相互作用而局部形成三股螺旋，導致目的基因的轉錄被抑制(Helene et，Toulme，Biochim.Biophys.Acta 1049(1990)99)。這些寡核苷酸在寡嘌呤-寡嘧啶序列選擇性地識別DNA雙螺旋，也就是這樣的區域一條鏈是寡嘌呤序列，而互補鏈是寡嘧啶序列，從而在那裡形成局部三股螺旋。第三條鏈(寡核苷酸)的鹼基與Watson-Crick鹼基對的嘌呤形成氫鍵(Hoogsteen鍵或反Hoogsteen鍵)。
現有技術裡已經描述了這種相互作用在分離質粒中的用途。Ito等(PNAS 89(1992)495)描述了能夠識別質粒的特定序列從而與之形成三股螺旋的生物素化的寡核苷酸的用途。然後讓這樣形成的複合體與鏈親和素包被的磁珠接觸。生物素和鏈親和素之間的作用使得能夠通過磁分離磁珠然後洗脫而將質粒分離出來。然而，這個方法有一些缺點。尤其是，需要兩個連續的特異性相互作用，第一在寡核苷酸和質粒之間，而第二在生物素化的複合體和鏈親和素的珠子之間。並且，最後的溶液可能被生物素化的寡核苷酸所汙染，這樣就不能用於藥物組合物。
發明概述本發明描述了新的改進的利用這種相互作用的DNA純化方法。更具體的是，本發明的方法使用共價偶聯於支持物的寡核苷酸。這個方法極為快速，且導致特別高的產量和純度。而且，它能夠從複雜混合物中純化DNA，特別是當複雜混合物含有其他核酸，蛋白質，內毒素(如脂多糖)，核酸酶，等等。另外，支持物可以方便再生，且得到的DNA表現改進的藥用安全的性質。最後，與現有技術相比，這個方法只需一步。
因此，本發明的首要主題是用於純化雙鏈DNA的方法，根據這個方法，含有混有其它組分的上述DNA的溶液流經共價偶聯寡核苷酸的支持物，而這段寡核苷酸能夠和上述DNA中的特定序列雜交形成三股螺旋。這段特定序列可以是雙螺旋DNA中天然存在的序列，也可以是人工引入其中的合成序列。
本發明中使用的寡核苷酸是直接與雙鏈DNA雜交的寡核苷酸。這些寡核苷酸可以包括以下鹼基-胸腺嘧啶脫氧核苷(T)，能夠與雙鏈DNA的A.T對形成三體(Rajagopal等，Biochem 28(1989)7859)；-腺嘌呤(A)，能夠與雙鏈DNA的A.T對形成三體；-鳥嘌呤(G)，能夠與雙鏈DNA的C.G對形成三體；-質子化胞嘧啶(C+)，能夠與雙鏈DNA的G.C對形成三體(Rajagopal等)；-尿嘧啶(U)，能夠與A.T鹼基對或A.U鹼基對形成三體；優選地，使用的寡核苷酸含有富含胞嘧啶的單一嘧啶(homopyrimidine)序列，而DNA中的特定序列是單一嘌呤(homopurine)-單一嘧啶序列。胞嘧啶的存在使得可以具有在性pH值下胞嘧啶質子化時是穩定的，而在鹼性pH值下胞嘧啶中性時不穩定的三股螺旋。
為了允許通過雜交形成三股螺旋，寡核苷酸和DNA中的特定序列互補是很重要的。在這種關係中，為了得到最好的產率和最好的選擇性，在本發明的方法中使用完全互補的寡核苷酸和特定序列。具體的，這些可以是寡核苷酸聚(CTT)和特定序列聚(GAA)。作為一個例子，可能會提到這樣的寡核苷酸序列5』-GAGG C TT C TT C TT C TT C TT CTT C TT-3』(GAGG(CTT)7；SEQ ID NO1)，其中鹼基GAGG並不形成三股螺旋但使寡核苷酸可以從偶聯臂上分開；序列(CTT)7(SEQ ID NO26)也可能提到。這些寡核苷酸能夠跟含有互補單元(GAA)的特定序列形成三股螺旋。特別是，討論中的序列可以是含有7，14，17個GAA單元的區域，如實施例中所述。
另一段特別有用的序列是5』-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3』(SEQIDNo5)，這段序列與寡核苷酸5』-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3』(SEQ IDNo6)或者5』-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3』(SEQ ID NO7)形成三股螺旋.
在這個例子裡，寡核苷酸以反平行方向結合聚嘌呤鏈。這些三股螺旋只有在存在鎂離子(Mg2+)時才穩定(Vasquez等，Biochemistry，1995，34，7243-7251；Beal和Dervan，Science，1991，251，1360-1363).
正如以上所述，特定序列可以是雙鏈DNA中天然存在的序列，也可以是人工引入到雙螺旋DNA中的合成序列。尤其有利的是使用和雙鏈DNA中比如在質粒的複製起始點或在標記基因中天然存在的序列形成三股螺旋的寡核苷酸。因此，本申請人進行了質粒序列分析，且能夠表明這些DNA的一些區域，尤其在複製起始處，有單一嘌呤-單一嘧啶區域。能夠跟這些天然的單一嘌呤-單一嘧啶區域形成三股螺旋的寡核苷酸的合成可以有利地將本發明的方法應用於未經修改的質粒，尤其是pUC，pBR322，pSV之類的商品質粒。在雙螺旋DNA裡天然出現的單一嘌呤-單一嘧啶序列，可提到大腸桿菌質粒ColE1的複製起始處存在的序列，它包含以下序列的全部或者部分5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3』(SEQ ID NO2)。在此情況下，形成三股螺旋的寡核苷酸有以下序列5-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3』(SEQ IDNO3)，並且根據Beal和Dervan(J.Am.Chem.Soc.1992，114，4976-4982)與Jayasena和Johnston(Nucleic Acids.Res.1992，20，5279-5288)的敘述，它也可以跟雙螺旋的兩條鏈結合。可能也會提到pBR322質粒的β-內醯胺酶基因(Duval-Valentin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，504-508)中的序列5』-GAAAAAGGAAGAG-3』(SEQ ID NO4)。
在ColE1和pCOR的複製起始處已經鑑定了另兩個目的序列，它們可以跟特定寡核苷酸形成三體結構。ColE1的衍生質粒含有一段12鹼基的單一嘌呤序列(5』-AGAAAAAAAGGA-3』)(SEQ ID NO27)，這段序列位於與質粒複製有關的RNA-II轉錄的上遊(Lacatena等，1981，Nature，294，623)。這一序列與互補的12鹼基寡核苷酸5』-TCTTTTTTTCCT-3』(SEQ ID NO28)形成穩定的三體結構。pCOR骨架含有14個非重複的鹼基的單一嘌呤區域(5』-AAGAAAAAAAAGAA-3』)(SEQ ID NO29)，此區域位於pCOR複製子的γ複製起始點的富含A+T的部分(Levchenko等，1996，Nucleic Acids Res.，24，1936)。這一序列與互補的14鹼基寡核苷酸5』-T TCTTTTTTTTCTT-3』(SEQ ID NO30)形成穩定的三體結構。相應的寡核苷酸5』-TCTTTTTTTCCT-3』(SEQ ID，NO28)和5』-TTCTTTTTTTTCTT-3』(SEQ ID NO30)有效並特異的靶向它們各自位於ColE1 ori或者pCOR(oriγ)的複製起點中的互補序列。事實上，單個非規範的三聯體(T*GC或C*AT)就可能導致三體結構的完全去穩定。
尤其有利的是使用能夠與複製起始或標記基因中的序列形成三股螺旋的寡核苷酸，因為它使得用相同的寡核苷酸可能純化任何含有上述複製起始或標記基因的DNA。這樣就不必修飾質粒或者雙鏈DNA以向其中加入人工特異序列。
儘管優選完全互補的序列，但是可以理解，如果並不導致親和力的太大損失則可以容忍寡核苷酸和DNA中的序列之間的一些錯配。可提到大腸桿菌β-內醯胺酶基因中的序列5』-AAAAAAGGGAATAAGGG-3』(SEQ ID NO8)。在此例中，打斷聚嘌呤序列的胸腺嘧啶可以被第三條鏈的鳥嘌呤所識別，從而形成G*TA三聯體，如果兩翼是兩個T*AT三聯體時，它就是穩定的(Kiessling等，Biochemistry，1992，31，2829-2834)。
根據特定的實施方案，本發明中的寡核苷酸包含序列(CTT)n，序列(CT)n，或者序列(CTT)n，其中n表示1到15(包括1和15)的整數。特別有利的是使用(CT)n或者(CTT)n類型的序列。實際上，本申請人表明，純化產率受到寡核苷酸中C的含量的影響。具體，如實施例7中所示，當寡核苷酸含有較少的胞嘧啶時，純化產量增加。可以理解的是，本發明中的寡核苷酸同樣可以聯合(CTT)，(CT)或者(CTT)單元。
使用的寡核苷酸可以是天然的(由未修飾的天然鹼基組成)或者是化學修飾過的。具體地，寡核苷酸具有某些化學修飾可能是有利的，這使得它可以抵抗或抵禦核酸酶，或者提高對特定序列的親和力。
根據本發明，可以理解的是，寡核苷酸指的是任何相連的核苷酸連續體，它經歷過目的是使它更能抵抗核酸酶的骨架修飾。在可能的修飾裡，可能會提到可以和DNA形成三股螺旋的硫代磷酸寡核苷酸(Xodo等，Nucleic Acids Res.，1994，22，3322-3330)，以及有formacetal或膦酸甲酯(methylphosphonate)骨架的寡核苷酸(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.，1991，113，7767-7768)。也可能使用由核苷酸的α異頭物合成的寡核苷酸，它也可以跟DNA形成三股螺旋(Le Doan等，Nucleic Acids Res.，1987，15，7749-7760)。骨架的另一種修飾是氨基磷酸酯鍵。例如，可能提到Gryaznov和Chen描述的N3』-P5』核苷酸間的氨基磷酸酯鍵，那將得到跟DNA形成特別穩定三股螺旋的寡核苷酸(J.Am.Chem.Soc.，1994，116，3143-3144)。在其它的骨架修飾中，使用核糖核苷酸，2』-0-甲基核糖，磷酸二脂等等(Sun和Helene，Curr.Opinion Struct.Biol.，116，3143-3144)，也可被提到。最後，磷基礎的骨架在PNAs(肽核酸)中可能被聚醯胺骨架所替代，這樣也可以形成三股螺旋(Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；Kim等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，6477-6481)；或者如在DNGs(脫氧核糖核酸胍，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6097-6101)中被胍基礎的骨架所替代，或者被DNA的聚陽離子類似物所代替，這樣也可形成三股螺旋。
第三鏈的胸腺嘧啶也可能被5』-溴尿嘧啶所代替，後者提高了寡核苷酸跟DNA的親和力(Posic和Devan，J.Am.Chem.Soc.，1989，111，3059-3061)。第三條鏈還可能含有非天然鹼基，當中有將會提到的7-脫氮-2』-脫氧黃嘌呤核苷(Milligan等，Nucleic AcidsRes.，1993，21，327-333)，1-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑並[4，3-d]嘧啶-7-酮(Koh和Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1470-1478)，8-氧代腺嘌呤，2-氨基嘌呤，2』-0-甲基假異胞嘧啶，或本領域技術人員已知的其他任何修飾(綜述見Sun和Helene，Curr.Opinion Struct.Biol.，1993，3，345-356)。
另一類寡核苷酸的修飾目的更特別，是提高寡核苷酸和特定序列的相互作用或/和親和力。具體的，根據本發明的最有利的修飾包括甲基化寡核苷酸中的胞嘧啶(參看實施例5)，這樣甲基化的寡核苷酸表現了這樣值得注意的特性在接近中性的pH值(≥5)下跟特定序列形成穩定的三股螺旋。這樣就有可能在比現有技術的pH值高的情況下作用，也就是說，在導致質粒DNA降解的風險更低的PH值下。
本發明中的方法所使用的寡核苷酸的長度是至少3個鹼基，且優選5到30個。長度大於10的寡核苷酸用起來比較有利。長度由本領域技術人員根據每個單獨案例調整以適合相互作用需要的選擇性和穩定性。
根據本發明的寡核苷酸可以由任何已知技術合成。具體地，可以由核酸合成儀製備。顯然本領域技術人員已知的任何方法都是可以用的。
為了允許它共價偶聯於支持物，寡核苷酸通常都官能化。這樣，可以在5』或者3』位置用硫醇，胺或羧基末端基團來修飾它。具體地，另加的硫醇，胺或羧基基團使得寡核苷酸可以偶聯於帶有二硫化物，馬來醯亞胺，胺，羧基，酯，環氧化物，溴化氰或乙醛官能基的支持物。這些偶聯通過在寡核苷酸和支持物之間建立二硫鍵，硫醚，酯，醯胺或胺鍵而形成。也可以使用本領域技術人員所熟悉的任何其他方法，例如，雙功能偶聯劑。
而且，為了改善與偶聯的寡核苷酸的雜交，寡核苷酸含有「手臂」和「間隔區」鹼基序列是有利的。實際上，使用手臂可以在選定的與支持物的距離上結合寡核苷酸，使得跟DNA相互作用的條件得到改善。手臂最好是由線性碳鏈(它含有1到18個，優選6或者12個(CH2)基團)及允許結合於柱子的胺組成。手臂連接於寡核苷酸的磷酸酯，或者是含有不幹擾雜交的鹼基的間隔區的磷酸酯。這樣，間隔區可以含有嘌呤鹼基。一個例子是，間隔區可以含有GAGG序列。手臂最好是由含6或者12個碳原子的線性碳鏈構成。
為實施本發明，可以使用不同類的支持物。這些可以是官能化的層析支持物，散裝或者預裝於柱中，官能化的塑料表面或者官能化的膠乳珠，磁性的或者其它的。優選使用層析支持物。例如，可以使用的層析支持物是瓊脂糖，丙烯醯胺，葡聚糖以及它們的衍生物(如Sephadex，Sepharose，Superose等)，聚合物如聚(苯乙烯/二乙烯基苯)，或者接枝或非接枝二氧化矽(silica)。層析柱可以擴散或灌注模式操作。
為了獲得更好的純化產量，特別有利的是質粒上使用含有幾個跟寡核苷酸雜交的位置的序列。實際上，幾個雜交位置的存在促進了上述序列和寡核苷酸的相互作用，這導致純化產量的提高。這樣，對於含有(CCT)，(CT)或者(CTT)基元的n個重複的寡核苷酸，優選使用最少含n個互補基元，優選n+1個互補基元的DNA序列。含有n+1個互補基元的序列可以提供兩個跟寡核苷酸雜交的位置。有利的是，DNA序列含有多達11個雜交位置，也就是說，n+10個互補基元。
根據本發明的方法可以用於純化任何類型的雙鏈DNA。比如環狀DNA如質粒，通常帶有一或更多有治療意義的基因。這個質粒也可能帶有複製起點，標記基因或者類似的東西。本發明的方法可以直接用於細胞裂解液。在這個實施方案中，通過轉化然後培養細胞來擴增得到的質粒，可以在細胞裂解後直接純化。本發明的方法也可用于澄清的裂解液，亦即細胞裂解液中和，離心後得到的上清。顯然它也可應用於以已知方法預純化過的溶液。此方法也可從含有不同序列DNA的混合物中純化帶有重要序列的線性或環狀DNA。根據本發明的方法也可用於純化雙鏈DNA。
細胞裂解液可以是原核細胞或者是真核細胞的裂解液。
對於原核細胞，可提到細菌大腸桿菌，枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏菌或鏈黴菌屬作為實例。對於真核細胞，可提到動物細胞，酵母，真菌等等，尤其是克魯維氏酵母屬或糖酵母屬酵母或者COS，CHO，C127，NIH3T3等細胞。
本發明的方法特別有利，因為它能夠快速簡單地獲得高純度的質粒DNA。特別是，如實施例所示，此方法有效地將討論的質粒跟如染色體DNA片段，內毒素，蛋白質，核酸酶等汙染組分分離，更特別的是，本發明中的方法可以製備雙鏈DNA，尤其是質粒起源的，得到少於或等於0.5％的染色體DNA含量。更優選，獲得的DNA製備物的染色體DNA含量少於或等於0.2％。本發明因此描述含可藥用的質粒DNA的組合物，尤其用於基因或細胞治療。這樣，本發明的主題也是含有根據上述方法製備的線性或質粒起源的雙鏈DNA的藥用組合物。
本發明也涉及染色體DNA含量少於或等於0.5％的質粒DNA製備物，所述含量優選少於或等於0.2％，更優選少於或等於0.1％，且更優選少於或等於0.01％。正如以下示例，三體親和相互作用步驟與常規層析步驟的下遊純化過程相整合。此親和步驟極大提高了質粒製備物的純度，無論其起始純度如何。寡核苷酸(共價結合於層析支持物)與要純化的目標質粒之間三體結構的形成依賴於質粒上存在可以和寡核苷酸形成三體結構的序列。這個三體結構只有在酸性pH值下穩定，這時寡核苷酸的胞嘧啶是質子化的。然後，簡單的將pH值提高到中性就能將質粒DNA從柱上洗脫。
這些組合物包含的質粒DNA可以是「裸露的」，也可以是與如脂質體，微顆粒，陽離子脂，多聚物，重組病毒或蛋白質等轉運載體組合的。
在一個實施方案裡，根據本發明的方法可以用來從含有2或更多的不同類和序列的雙鏈DNA的混合物中純化出一種雙鏈DNA。這種方法可以直接用於細胞裂解液，其中通過細胞培養而擴增的雙鏈DNA可以在裂解培養的細胞之後被純化。本方法也可用于澄清的裂解液，亦即細胞裂解液中和，離心後得到的上清。這個方法也可應用於已經預純化的溶液。
更確切的，從含有第一和第二雙鏈DNA的溶液中純化第一雙鏈DNA的方法包含i)使溶液流經第一支持物，此支持物共價偶聯有能夠通過跟第二雙鏈DNA中的特定序列雜交從而與之形成三股螺旋的寡核苷酸，ii)回收流經第一支持物的溶液，它富集有未結合的第一雙鏈DNA，和iii)將回收的溶液流經第二支持物，此支持物共價偶聯有能夠通過跟上述第一雙鏈DNA中的特定序列雜交從而與之形成三股螺旋的寡核苷酸。接著是可選的淋洗步驟，然後可以從第二支持物上洗脫第一雙鏈DNA。使用這個雙純化方法，第一雙鏈DNA可以從第二支持物中回收而不含任何可檢測水平的第二雙鏈DNA。
在本發明特定的實施方案裡，第一雙鏈DNA分子是pCOR分子，它有特定序列5』-AAGAAAAAAAAGAA-3』(SEQ ID NO29)，並與含有序列5』-TTCTTTTTTTTCTT-3』(SEQ IN NO30)的寡核苷酸形成三股螺旋。第二雙鏈DNA分子是ColE1衍生質粒，含有特異序列5』-AGAAAAAAAGGA-3』(SEQ ID NO27)，並與含有序列5』-TCTTTTTTTCCT-3』(SEQ IN NO28)的寡核苷酸形成三股螺旋。相應的，通過使用根據本發明的雙純化方法，有利地從含有其它質粒比如ColE1衍生質粒的溶液中純化pCOR質粒。
將通過下面的實施例更加詳細的描述本申請，這些實施例用於說明而非限制發明詳述克隆和分子生物學的一般方法傳統的分子生物學方法，比如限制性內切酶消化，凝膠電泳，轉化大腸桿菌，核酸沉澱等等，文獻中已有敘述(Maniatis等，T.，E.F.Fritsch，和J.Sambrook，1989.Molecular Cloningalaboratory mannual，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，紐約；Ausubel F.M，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.Seidman和K.Struhl.1987.Current protocols in molecularbiology 1987-1988.John Willey and Sons，紐約)。用末端終止法根據已發表的流程(Ausubel等，1987)確定核酸序列。
限制性內切酶由New England Biolabs，Beverly，MA(biolabs)提供。
為了進行連接，在含50mM Tris-HCl pH7.4，10mM MgCl2，10mM DTT，2mM ATP的緩衝液中，有噬菌體T4 DNA連接酶(Biolabs)存在時孵育DNA片段。
寡核苷酸的合成使用Biosearch自動DNA合成儀，根據生產商的建議，採用亞磷醯胺化學，其中由氰乙基在β位保護亞磷醯胺(Sinha，N.D.，J.Biernat，J.McManus和H.Koster，1984.Polymersupport oligonucleotide synthesis，XVIII；Use of β-cyanoethyl-N，N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite ofdeoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifyingdeprotection and isolation of the final product.Nucl.AcidsRes.，12，4539-4557Giles，J.W.1985.Advances in automated DNAsynthesis.Am.Biotechnol.，Nov./Dec)。
連接好的DNA或用於測試轉化效率的DNA轉化下面的感受態細胞株大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)[F/endA1，hsdR17，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，Δ(lacZYA-arqF)U169，deoR，80dlac(lacZΔM15)](用於任何ColE1質粒)，或者大腸桿菌XAC-pir(用於任何pCOR衍生質粒)。
根據Klein等1980的方法小量製備質粒DNA.
大腸桿菌的生長使用LB培養基(Maniatis，等，1982)。細菌在37℃下培養。細菌塗布於補充有合適抗生素的LB培養基的平板。
實施例11.1柱子製備設備柱子使用1ml經NHS(N-羥基琥珀醯亞胺，Pharmacia)活化的HiTrap柱，與蠕動泵(流速小於1ml/mim)相連。使用的特異性寡核苷酸5』末端有NH2基團，其序列如下5』-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3』(SEQID NO1)此實施例中的緩衝液是偶聯緩衝液0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3.
緩衝液A0.5M 乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.3.
緩衝液B0.1M 醋酸，0.5M NaCl，pH4.方法6毫升1mM HCl洗柱，用偶聯緩衝液稀釋後的寡核苷酸(1ml中含50nmol)上柱，室溫下放置30分鐘。然後用6ml緩衝液A和緩衝液B連續洗柱3次。這樣寡核苷酸就通過CONH鍵與柱子共價結合。柱子存於4℃在PBS，0.1％NaN3中，可以最少使用4次。1.2質粒構建合成下面兩段寡核苷酸。寡核苷酸48175』-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3』(SEQ ID NO9)寡核苷酸48185』-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3』(SEQ ID NO10)這些寡核苷酸，當被雜交並克隆於一個質粒時，如前所述，將單一嘌呤-單一嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO33)導入相應的質粒。
將這兩個雜交的寡核苷酸的對應序列克隆到質粒pBKS+的多克隆位點(Stratagene Cloning System，La Jolla，CA)，此質粒帶有氨苄青黴素抗性基因。最後，這些寡核苷酸通過以下方式雜交1μg兩種寡核苷酸共同置於40ml含50mM Tis-HCl pH7.4，10mM MgCl2的終緩衝液中。混合物加熱到95℃，然後置於室溫讓溫度逐漸下降。200ng經BamHI和EcoRI消化的pBKS+質粒(Stratagene Cloning System，LaJolla，CA)與10ng雜交後的寡核苷酸混合物在終體積30μl中連接。連接之後，部分用於轉化DH5α。轉化混合物塗平板於有氨苄青黴素(50mg/l)和X-gal(20mg/l)的L培養基。重組克隆在此培養基上應該表現沒有藍色，相反，原質粒(pBKS+)允許大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的ω片段的α-互補。從6個克隆中小量製備質粒DNA，它們都表現出位於pBKS+的BamHI和EcoRI之間的PstI位點的消失，以及含多克隆位點的448bpPvuII條帶分子量增加。選出一個克隆並將相應質粒命名為pXL2563。使用質粒pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla(A)的引物-20(5』-TGACCGGCAGCAAAATG-3』(SEQ ID NO11))(VieraJ.和J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived systemfor insertion mutagenesis and sequencing with syntheticuniversal primers.Gene，19，259-268)測序鑑定克隆的序列。根據供應商的推薦，使用Wizard Megaprep試劑盒(Promega Corp.Madison，WI)純化pXL2563質粒。然後此質粒DNA製備物用於下述例子。
1.3質粒純化儀器如1.1中所述，從還含有pBKS+質粒的溶液中，在偶聯寡核苷酸的HiTrap柱子上純化pXL2563質粒(1.2中所述)。這步純化中使用的緩衝液是緩衝液F2M Nacl，0.2M醋酸鹽，pH4.5至5。
緩衝液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA。方法用6毫升緩衝液F洗柱，並將質粒(400μl緩衝液F中含20μgpXL2563和20μg pBKS+)上柱，室溫下放置2小時。用10ml緩衝液F淋洗，然後用緩衝液E洗脫。在1％的瓊脂糖凝膠上電泳並用溴化乙錠染色來檢測質粒。溶液中質粒含量比例通過測量其對大腸桿菌的轉化活性來估計。
結果從含有30％的pXL2563和70％的pBKS+的混合物開始，從柱子出口回收了含100％的pXL2563，由260nm與280nm的OD值比估計的純度，從1.9上升至2.5，這表明此方法已去除了蛋白汙染。
緩衝液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
用6毫升1mM緩衝液F洗柱，稀釋於400μl緩衝液F中的100ug的pXL2563質粒上柱，室溫下放置2小時。柱子用10ml緩衝液F淋洗，然後用緩衝液E洗脫。通過測定260nm處的光密度來定量質粒。
在此實施例中，結合用的緩衝液裡NaCl的摩爾濃度從0到2M(緩衝液F)變化。當NaCl的摩爾濃度下降時，純化產率下降。結合緩衝液的pH值可以從4.5到5變化，在4.5時純化產率較好。也可以用鹼性pH下的其它洗脫緩衝液這樣用含50mM硼酸鹽，pH9，0.5mM EDTA的緩衝液洗脫.2.2如例1中所敘述，將寡核苷酸(5』-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3』(SEQ ID NO1))偶聯於柱上。根據供應商的推薦，使用Wizard Megaprep試劑盒(PromegaCorp.Madison，WI)純化pXL2563質粒。本實施例使用的緩衝液是緩衝液F0.1M NaCl，0.2M醋酸，pH5。
緩衝液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
6毫升1mM緩衝液F洗柱，且將稀釋於400μl緩衝液F中的100μg pXL2563質粒上柱，室溫下放置1小時。柱子用10ml緩衝液F淋洗，然後用緩衝液E洗脫。測量流經寡核苷酸柱之前和之後質粒樣品中的大腸桿菌基因組或染色體DNA的含量。基因組DNA用PCR的方法定量，使用大腸桿菌galK基因中的引物。根據如下方法Debouck等對這些引物作過描述(Nucleic Acids Res.1985，13，1841-1853)5』-CCG AAT TCTGGG GAC CAA AGC AGT TTC-3』(SEQ ID NO24)和5』-CCA AGC TTC ACTGTT CAC GAC GGG TGT-3』(SEQ ID NO25).
反應介質包括，在25μlPCR緩衝液(Promega France，Charbonnieres)中1.5mM MgCl2；0.2mM dXTP(Pharmacia，Orsay)；0.5μM引物；20U/ml Taq酶(Promega)。反應按以下順序進行-95℃ 5分鐘-95℃ 10秒60℃ 30秒78℃ 1分鐘 30循環-78℃ 10分鐘擴增的長度為124鹼基對的DNA片段通過在有SybrGreenI(Molecular Probes，Eugene，USA)的3％的瓊脂糖上電泳而分離，然後以大腸桿菌菌株B的超純基因組DNA系列(Sigma，ref D4889)對比而定量。
上柱的樣品中有1％的染色體DNA，從寡核苷酸柱上純化後的樣品含0.2％的染色體DNA。
實施例3.清裂解液的實驗本實驗描述了從細菌培養物的清裂解液中純化質粒DNA，規模是所謂的「小量製備」離心含有pXL2563質粒的過夜培養的1.5ml DH5α菌株，重懸沉澱於100μl的50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8，10mMEDTA中。然後加上200μl的0.2M NaOH，1％SDS，顛倒管子以混合，接著加150μl的3M乙酸鉀，pH5，再顛倒管子以混合。離心之後，回收上清，上樣於實施例1所述的寡核苷酸柱。結合，淋洗，洗脫與實施例1所述一樣。從1.5ml培養物裡可以大約回收1μg質粒。得到並通過瓊脂糖電泳和溴乙錠染色分析的質粒的形式是單一條帶的超螺旋環狀DNA。在此方法純化的質粒中沒有發現高分子量DNA(染色體的)或RNA的痕跡。260nm與280nm的光密度比大於2。
實施例44.1本實施例敘述的質粒DNA純化實驗，進行的條件跟實施例3一樣，但起點是20ml含有pXL2563質粒的過夜培養的DH5α菌株。細菌沉澱重懸於1.5ml的50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8，10mM EDTA.裂解用2ml的0.2M NaOH，1％SDS，而中和用1.5ml的3M乙酸鉀，pH5。然後用3ml的2-異丙醇沉澱DNA，沉澱用0.5ml的0.2M乙酸鉀，pH5，0.1M NaCl懸浮，並上樣於例1所述得到的寡核苷酸柱。結合，淋洗，及洗脫與例1所述一樣，只是淋洗緩衝液中NaCl的摩爾濃度為0.1M.大約得到16μg的質粒DNA。得到並通過瓊脂糖電泳和溴乙錠染色分析的質粒的形式是單一條帶的超螺旋環狀DNA。在此方法純化的質粒中沒有發現高分子量DNA(染色體的)或RNA的痕跡。用限制性酶消化質粒得到單一條帶，位於預期的3kb的分子量處。樣品中的蛋白質濃度從澄清裂解液中的125μg/ml下降到純化後質粒中的少於1μg/ml(Micro-BCAassay，Pierce)。由LAL方法(Biosepra)估側的內毒素濃度，與起始清裂解液相比，純化後質粒中少了至少10倍。
4.2使用的質粒含有含巨細胞病毒啟動子，編碼螢光素酶的基因，以及來自質粒pXL2563的單一嘌呤-單一嘧啶序列(GAA)17(SEQ IDNO33)的盒。含有此質粒的DH1菌株(Maniatis等，1989)在7L的發酵罐中培養，從200g細菌中製備清裂解液細菌沉澱重懸於2L的50mMglucose，25mMTris，pH6.8，10mM EDTA，然後加2L的0.2M NaOH，1％SDS。用加1L的3M乙酸鉀中和裂解液。滲濾之後，根據實施例1.1所述，4ml這樣的裂解液上樣於5ml偶聯以下寡核苷酸序列的HiTrap-NHS柱5』-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3』(SEQ ID NO1)。淋洗和洗脫也如實施例1所述進行。回收大約400微克質粒。按照實施例2.2中的技術測出的樣品中基因組DNA的含量是0.1％。
實施例5使用修飾過的寡核苷酸本實施例描述了使用有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸。使用的寡核苷酸的序列如下5』-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT-3』(SEQ IDNO12).
此寡核苷酸在5』端有NH2基團。MeC代表5-甲基胞嘧啶。在實施例1的條件下，使用pH5的結合緩衝液(這樣降低質粒降解的風險)，該寡核苷酸使pXL2563質粒被純化。
實施例6在以上的實施例裡，使用的寡核苷酸在5』端由胺基修飾，後者通過含6個碳原子的手臂NH2-(CH2)6結合磷酸。在此實施例中，氨基通過含12碳原子的手臂NH2-(CH2)12與5』端的磷酸結合。寡核苷酸偶聯和過柱按照實施例2所述進行，使用緩衝液F2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。此寡核苷酸使得可以得到較好的純化產率達到53％，而使用含6個碳原子的寡核苷酸，在相同的條件下產率是約45％。
實施例7按照實施例1.2中敘述的克隆策略，構建了另外兩個帶有單一嘌呤-單一嘧啶序列的質粒含有序列(GGA)16(SEQ ID NO34)的質粒pXL2725和含有序列(GA)25(SEQ ID NO35)的質粒pXL2726。
實施例7.1質粒構建質粒pXL2725和質粒pXL2726跟質粒pXL2563類似，按照實施例1.2所敘述的克隆策略構建，使用了以下寡核苷酸對59865』GATCC(GA)25GGG-3』(SEQIDNO13)59875』-AATTCCC(TC)25G-3』(SEQIDNO14)59815』-GATCC(GGA)17GG-3』(SEQIDNO15)59825』-AATT(CCT)17CCG-3』(SEQIDNO16)使用寡核苷酸對5986和5987構建質粒pXL2726，方法是將寡核苷酸克隆至pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla CA)的BamHI和EcoRI位點之間，使用寡核苷酸對5981和5982構建質粒pXL2725。使用構建質粒pXL2563相同的實驗條件，只是寡核苷酸對改變。相似地，克隆的序列通過質粒測序來鑑定。可以看出質粒pXL2725有跟預期序列相關的修飾不是GGA重複17次，而是GGAGA(GGA)15(SEQ ID NO17).
實施例7.2製備柱子和純化根據實施例1.1中敘述的技術，與這些單一嘌呤序列形成三股螺旋的寡核苷酸偶聯於HiTrap柱。純化質粒pXL2725使用的寡核苷酸的序列是5』-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3』(SEQ ID NO18)，而純化質粒pXL2726使用的寡核苷酸的序列是5』-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3』(SEQ ID NO19).
根據實施例2中的技術，這樣得到的兩柱可以純化相應的質粒，使用以下的緩衝液
緩衝液F2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。
緩衝液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
純化質粒pXL2725和質粒pXL2726的產率分別是23％和31％。
實施例8此例說明了質粒中特定序列的長度對純化產率的影響。
實施例8.1質粒構建本實驗中使用的用於表明本發明組合物活性的報告基因是編碼螢光素酶的基因(Luc).
質粒pXL2621有含661鹼基對的巨細胞病毒(CMV)啟動子的盒，該盒通過用限制性酶MluI和HindIII酶切從pcDNA3(InvitrogenCorp.，San Diego，CA)中取出，然後克隆至載體pGL basic Vector的編碼螢光素酶的基因的上遊的Ml1uI和HindIII位點。此質粒的構建使用標準的分子生物學技術。
質粒pXL2727-1和質粒pXL2727-2按照以下方法構建2微克質粒pXL2721質粒用BamHI線性化；然後在65℃中處理10分鐘失活酶；同時按照質粒pXL2563構建的方法雜交寡核苷酸6006和6008。
60065』-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3』(SEQIDNO20)60085』-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3』(SEQIDNO21)雜交混合物克隆至質粒pXL2621的BamHI末端，然後，在轉化DH5α後，使用PstI酶限制分析鑑定重組克隆，因為寡核苷酸引入PstI位點。挑選2個克隆，使用引物(6282，5』-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3』(SEQ ID NO22)))作為測序反應引物(Viera J.和J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived system for insertionmutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.Gene，19，259-268)測序克隆片段的核苷酸序列。
第一克隆(pXL2727-1)含有GAA重複10次的序列，第二克隆(pXL2727-2)含有序列5』-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3』(SEQ IDNO23).
實施例8.2製備柱子和純化使用的柱子如實施例1中所敘述，並與寡核苷酸5』-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3』(SEQ ID NO1)偶聯。
質粒pXL2727-1有序列GAA的14次重複。上述寡核苷酸，只含有相應雜交序列CTT的7次重複，因此可以和該質粒在8個不同位置上雜交。相反，質粒pXL2727-2，有和結合於柱上的寡核苷酸相同長度的雜交序列(GAA)7(SEQID NO36)。這樣的寡核苷酸只能在一個位置上跟pXL2727-2雜交。
實驗與實施例2中的敘述一樣，使用以下緩衝液緩衝液F2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。
緩衝液E1M Tris-HCl，pH9，0.5mMEDTA.
質粒pXL2727-1的純化產率是29％，而pXL2727-2是19％。
實施例8.3體外轉染哺乳動物細胞使用的細胞是NIH 3T3細胞，實驗前在24孔培養板上按照50000細胞/孔接種。質粒用150mM NaCl稀釋，並與脂轉染物RPR115335混合。使用的脂轉染物正電荷與DNA負電荷的比等於6。混勻混合物，室溫下放置10分鐘，用不含胎牛血清的培養基稀釋，然後加入到細胞中，比例是每個培養孔1μgDNA。37℃下2小時後，加入體積比為10％的胎牛血清，然後細胞在5％CO2下37℃培養48小時。細胞用PBS洗滌2次，根據所述方法(Promega試劑盒，Promega Corp.Madi son，WI)在LumatLB9501發光計上(EG and G Berthold，Evry)測量螢光素酶活性。按照實施例8.2純化的質粒pXL2727-1給出的轉染效率是使用WizardMegaprep試劑盒(Promega Corp.Madison，WI)純化的那些質粒的2倍。
實施例9純化pCOR衍生質粒下面的例子論證使用三股螺旋親和層析純化pCOR衍生質粒。表明此技術去除核酸汙染(尤其是宿主基因組DNA和RNA)的水平是常規層析方法所達不到的。
使用Sephacryl S-1000 SF(Amersham-Pharmacia Biotech)作為層析基質合成三體親和凝膠。首先使用溶於0.2M醋酸鈉(pH4.7)的m-高碘酸鈉(3mM，室溫，1小時)活化Sephacryl S-1000。然後按照前述偶聯蛋白質的方法(Hornsey等，J.Immunol.Methods，1986，93，83-88)，通過在抗壞血酸存在(5mM)時的還原性氨基化，將寡核苷酸通過其5』-NH2末端部分偶聯到已活化的基質的醛基上。這些實驗中的單一嘧啶寡核苷酸(來自Eurogentec，HPLC純)有這樣的序列跟出現於pCOR質粒(Soubrier等，Gene Therapy，1999，6，1482-1488)的複製起點(oriγ)的短的14鹼基單一嘌呤序列(5』-AAGAAAAAAAAGAA-3』)(SEQ IDNO29)互補。如上所討論，單一嘧啶寡核苷酸的序列是5』-TTCTTTTTTTTCT-3』(SEQ ID NO30)。
層析了以下質粒pXL3296(無轉基因的pCOR，2.0kbp)，pXL3179(pCOR-FGF，2.4kbp)，pXL3579(pCOR-VEGFB，2.5kbp)，pXL3678(pCOR-AFP，3.7kbp)，pXL3227(pCOR-lacZ，5.4kbp)和pXL3397(pCOR-Bdeleted FVIII，6.6kbp)。所有的質粒從實施例4中所述得到的清裂解液中經過二步陽離子交換層析而純化。也研究了pBKS+(pBluescript II KS+來自Stratagene)質粒，它是一種ColE1衍生質粒，用氯化銫超離心純化。所有使用的質粒都是在其超螺旋(＞95％)的拓撲狀態。
在每個質粒DNA純化實驗中，溶於6毫升的2M NaCl，0.2M乙酸鉀(pH5.0)中的300μg質粒DNA以30cm/h的流速上樣於含有上面所提寡核苷酸5』-TTCTTTTTTTTCTT-3』(SEQ ID NO30)的親和柱。用5倍體積的相同緩衝液淋洗之後，用1M Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH9.0洗脫結合的質粒，並用UV(260nm)和Millipore Gen-Pak柱(Marquet等，BioPharm，1995，8，26-37)離子交換層析定量。收集的部分中質粒回收是207μg pXL3296；196μg pXL3179；192μg pXL3579；139μgpXL3678；97μg pXL3227和79μg pXL3397。
用此柱層析pBKS時，檢測不到質粒結合(＜3μg)。這表明寡核苷酸5』-TTCTTTTTTTCTT-3』(SEQ ID NO30)與pCOR(oriγ)中出現的互補的14鹼基序列5』-AAGAAAAAAAAGAA-3』(SEQ ID NO29)形成穩定的三體結構，但與pBKS中出現的很相關的序列5』-AGAAAAAAAGGA-3』(SEQ ID NO27)卻不然。這表明引入單一非規範的三聯體(此例中是T*GC)導致三體結構的完全去穩定。
作為對照，當用在非常相近的條件但是沒有寡核苷酸的空的柱子上層析pXL3179時，沒有觀察到質粒結合(＜1μg)。
在此報告的條件下操作這個親和層析柱，對於製備pXL3296，宿主基因組DNA的汙染水平從2.6％降低到0.07％。與此類似，對於製備pXL3179，當樣品用相同的親和柱層析時，宿主基因組DNA的汙染水平從0.5％降低到0.008％。而且，當用此親和純化柱製備pXL3179時，RNA的汙染水平從43％大大減少到0.2％。
除此之外，當親和柱上寡核苷酸5』-TTCTTTTTTTTCTT-3』(SEQ IDNO30)被寡核苷酸5』-TTTTTTTTCTT-3』(SEQ ID NO31)替換時，質粒pXL3579的回收率小於8％。儘管SEQ ID NO31中的寡核苷酸與pXL3579中的VEGFB的部分序列互補(即相對於ATG的核苷酸379到389)，沒有明顯的三體親和出現。這表明此親和純化需要非隨機的單一嘌呤-單一嘧啶DNA序列。實施例10純化ColE1衍生質粒下面的例子論證了使用三股螺旋親和層析純化ColE1衍生質粒。表明此技術去除核酸汙染(尤其是宿主基因組DNA和RNA)的水平是常規層析方法所達不到的。
三體親和凝膠的合成是偶聯具有序列5』-TCTTTTTTTCTT-3』(SEQID NO28)的寡核苷酸到高碘酸鹽氧化的Sephacryl S-1000 SF上，如質粒pXL3296(無轉基因的pCOR)和質粒pBKS，ColE1衍生質粒，在實施例9所述的條件下，在1ml的含寡核苷酸5』-T CTTTTTTTCCT-3』(SEQ ID NO28)的柱上層析。收集部分中質粒回收是pBKS 175μg和小於1ug的pXL3296。這表明寡核苷酸5』-TCTTTTTTTCCT-3』(SEQ IDNO28)與pBKS中出現的互補的12鹼基序列(5』-AGAAAAAAAGGA-3』)(SEQ ID NO27)形成穩定的三體結構，但與pCOR中出現的很相關的12鹼基序列(5』-AGAAAAAAAAGA-3』(SEQ ID NO32)則不形成。這表明引入單一非規範的三聯體(此例中是C*AT)導致三體結構的完全去穩定。
實施例11雙純化方法下面的實施例闡述，用三股螺旋親和層析，從含另一種超螺旋雙鏈分子如pBSK的混合物中，純化超螺旋雙鏈DNA分子，如pXL3296。兩個超螺旋雙鏈DNA雙鏈分子可以有相似的大小，但是每個DNA分子含有能與不同的目的序列形成三股螺旋的獨特序列。正如以上所討論，pXL3296之類的分子含有序列5』-AAGAAAAAAAAGAA-3』(SEQ ID NO29)，但是不含序列5』-AGAAAAAAAGGA-3』(SEQ ID NO27)。相反的，pBSK之類的分子含有SEQ ID NO27，但是不含SEQ ID NO29。
在第一步裡，含pXL3296和pBKS的混合物上樣於有寡核苷酸5』-TCTTTTTTTCCTT-3』(SEQ ID NO28)的第一親和柱，如實施例10中所述柱子。含有未結合的DNA分子的溶液流經第一柱。在第二步裡，第一步中未結合的DNA分子上樣於有寡核苷酸5』-TTCTTTTTTTTCTT-3』(SEQID NO30)的第二親和柱，如實施例9中所敘述柱子。然後淋洗此柱並洗脫下結合的分子，如實施例9中所敘述。只有pXL3296分子從第二柱中洗脫。在第二柱的洗脫液中(即，從柱上洗脫的溶液)沒有檢測到pBKS分子。
序列表110AVENTIS PHARMA S.A.
CROUZET，JoelSCHERMAN，DanielWILS，PierreCAMERON，BeatriceBLANCHE，Francis120用固定化的寡核苷酸純化三股螺旋體結構1303804.1381304140
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15009/580，9231512000-05-2616036170PatentIn Ver.2.1210121125212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4001gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25210221119212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4002cttcccgaag ggagaaagg 19210321119212DNA
213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4003gaagggcttc cctctttcc 19210421113212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4004gaaaaaggaa gag13210521119212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4005aagggaggga ggagaggaa 19210621119212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4006aaggagagga gggagggaa 19210721119212DNA
213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4007ttggtgtggt gggtgggtt 19210821117212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4008aaaaaaggga ataaggg17210921158212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸4009gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg 582101021158212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40010aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg 552101121117212DNA
213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40011tgaccggcag caaaatg172101221125212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸220
223序列中所有的胞嘧啶都是甲基化的40012gaggcttctt cttcttcctc ttctt 252101321158212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40013gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg 582101421158212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40014aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg 58
2101521158212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40015gatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg 582101621158212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40016aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg 582101721150212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40017ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga502101821125212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40018aatgcctcct cctcctcctc ctcct 25
2101921126212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40019agtgctctct ctctctctct ctctct 262102021166212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40020gatctgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaactgc 60agatct662102121166212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40021gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 60tcttca662102221121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40022
acagtcataa gtgcggcgac g 212102321139212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40023gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa392102421127212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40024ccgaattctg gggaccaaag cagtttc 272102521127212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40025ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt 272102621121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40026
cttcttcttc ttcttcttct t 212102721112212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40027agaaaaaaag ga 122102821112212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40028tctttttttc ct 122102921114212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40029aagaaaaaaa agaa 142103021114212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40030
ttcttttttt tctt 142103121111212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40031ttttttttcc t 112103221112212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40032agaaaaaaaa ga 122103321151212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40033gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a 512103421148212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40034
ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga 482103521150212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40035gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga502103621121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述合成的寡核苷酸40036gaagaagaag aagaagaaga a 2權利要求
1.從含混有其它組分的雙鏈DNA的溶液中純化雙鏈DNA的方法，包括使溶液流經含有共價偶聯的寡核苷酸的支持物，該寡核苷酸能通過與雙鏈DNA中特定的序列雜交而與雙鏈DNA形成三股螺旋，其中共價偶聯的寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO28)或TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO30)。
2.從含混有其它組分的雙鏈DNA的溶液中純化雙鏈DNA的方法，包括使溶液流經含有共價偶聯的寡核苷酸的支持物，該寡核苷酸能通過與雙鏈DNA中特定的序列雜交而與雙鏈DNA形成三股螺旋，其中雙鏈DNA中特定的序列含有序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO27)或AAGAAAAAAAAGAA(SEQ ID NO29)。
3.從含有第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA的溶液中純化第一雙鏈DNA的方法，包括(i)使溶液流經第一支持物，此支持物含有共價偶聯的寡核苷酸，它能通過與上述的第二雙鏈DNA中的特定序列雜交而與之形成三股螺旋，(ii)回收流經第一支持物的溶液，(iii)使回收的溶液流經第二支持物，此支持物含有共價偶聯的寡核苷酸，它能通過與上述的第一雙鏈DNA中的特定序列雜交而與之形成三股螺旋，其中上述第一雙鏈DNA中的特定序列包含序列AAGAAAAAAAAGAA(SEQ IDNO29)，而上述第二雙鏈DNA中的特定序列包含序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO27)。
4.從含有第一雙鏈DNA和第二雙鏈DNA的溶液中純化第一雙鏈DNA的方法，包括(i)使溶液流經第一支持物，此支持物含有共價偶聯的寡核苷酸，它能通過與上述的第二雙鏈DNA中的特定序列雜交而與之形成三股螺旋，(ii)回收流經第一支持物的溶液，(iii)使回收的溶液流經第二支持物，此支持物含有共價偶聯的寡核苷酸，它能通過與上述的第一雙鏈DNA中的特定序列雜交而與之形成三股螺旋，其中能與上述第一雙鏈DNA形成三股螺旋的寡核苷酸包含序列TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO30)，而能與上述第二雙鏈DNA形成三股螺旋的寡核苷酸包含序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO28)。
5.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中溶液是細胞裂解液。
6.根據權利要求5的方法，其中細胞裂解液是澄清的裂解液。
7.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中雙鏈DNA是預先純化的。
8.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中特定序列是人工引入雙鏈DNA的。
9.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中特定序列天然存在於雙鏈DNA中。
10.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中寡核苷酸通過二硫鍵，硫醚鍵，酯鍵，醯胺鍵或胺鍵偶聯於支持物。
11.根據權利要求10的方法，其中寡核苷酸通過含碳鏈(CH2)n的手臂結合到柱上，其中n是1到18的整數，包括1和18，並且其中手臂通過磷酸酯連接到寡核苷酸，而通過醯胺鍵連接到柱上。
12.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中寡核苷酸至少有一個化學修飾，使得它能夠抵抗或抵禦核酸酶，或者增加它對特定序列的親和力。
13.根據權利要求12的方法，其中寡核苷酸至少有一個胞嘧啶被甲基化。
14.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中雙鏈DNA是環狀DNA。
15.根據權利要求14的方法，其中環狀DNA是質粒。
16.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中雙鏈DNA中存在的特定序列含有幾個和寡核苷酸雜交的位點。
17.根據權利要求1，2，3或4的方法，其中支持物是官能化的層析支持物，官能化的塑料表面或官能化的膠乳珠。
18.根據權利要求17的方法，其中支持物是官能化的層析支持物。
19.根據權利要求18的方法，其中純化的雙鏈DNA裡的染色體DNA含量少於或等於0.5％。
20.根據權利要求19的方法，其中純化的雙鏈DNA裡的染色體DNA含量少於或等於0.01％。
21.從含混有其它組分的雙鏈RNA的溶液中純化雙鏈RNA的方法，包括將溶液流經含有共價偶聯的寡核苷酸的支持物，該寡核苷酸能通過與雙鏈RNA中的特定序列雜交而與雙鏈RNA形成三股螺旋，其中寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO28)或TTCTTTTTTTTCTT(SEQ IDNO30)。
22.根據權利要求1或3的方法，其中共價偶聯的寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO28)。
23.根據權利要求1或3的方法，其中共價偶聯的寡核苷酸含有序列TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO30)。
24.根據權利要求2或4的方法，其中雙鏈DNA中存在的特定序列含有序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO27)。
25.根據權利要求2或4的方法，其中雙鏈DNA中存在的特定序列含有序列AAGAAAAAAAAGAA(SEQ ID NO29)。
全文摘要
本發明公開了純化雙鏈DNA的方法，通過此方法，含有混合其它組分的上述DNA的溶液流經其上共價偶聯了寡核苷酸的支持物，此寡核苷酸能夠與上述DNA中的特異序列雜交形成三股螺旋。
文檔編號C12N15/09GK1446258SQ01810168
公開日2003年10月1日 申請日期2001年5月25日 優先權日2000年5月26日
發明者J·克羅賽特, D·施爾曼, P·維爾斯, F·布蘭徹, B·喀莫隆 申請人:甘瑟爾股份有限公司