致病菌的檢測方法
2023-08-13 18:22:41
專利名稱：：致病菌的檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種病原微生物檢測方法，尤其是涉及一種雙砷染料-四半胱氨酸重組噬菌體對致病菌進行快速鑑別診斷的方法和應用。
背景技術：
：快速、靈敏、特異的致病菌檢測分析對食品安全、環境監測、疾病診斷治療和生物恐怖襲擊的防範等具有重要意義。傳統的病原微生物檢測方法需要對細菌進行分離、培養及一系列生化反應，操作複雜、檢測周期長，且無法適用於難以培養的病原菌，遠不會g滿足實際需求([l]Iqbal，S.S.，etal.，Areviewofmolecularrecognitiontechnologiesfordetectionofbiologicalthreatagents.BiosensBioelectron，2000.15(11-12):549-578;[2]Deisingh，A.K.andM.Thompson,StrategiesforthedetectionofEscherichiacoli0157:H7infoods.JApplMicrobiol,2004.96(3):419-429)。近年來，運用分子生物學及生物技術的最新研究成果，科研人員發展了一系列新的細菌快速檢測技術，如PCR相關技術、基因晶片技術、ELISAs技術、噬菌體鑑定技術、流式細胞檢測技術和生物傳感技術等等([3]Hahn，M.A.，J.S.Tabb，andT.D.Krauss，Detectionofsinglebacterialpathogenswithsemiconductorquantumdots.Anal.Chem.，2005.77(15):4861-4869;[4]Czechowska，K.，D.R.Johnson,andJ.R.vanderMeer，Useofflowcytometricmethodsforsingle—cellanalysisinenvironmentalmicrobiology.CurrOpinMicrobiol，2008.11(3):205-212;[5]Karo，0.，etal.，Bacteriadetectionbyflowcytometry.ClinChemLabMed，2008.46(7):947-953.)。其中，流式細胞術(flowcytometry,FCM)因其具有檢測速度快、精度高和多參數分析等特點，在細菌檢測和鑑定方面獨具優勢，已成為產品質量控制、細菌致病機理以及微生物群落結構研究的重要手段([4]Czechowska,K.，D.R.Johnson,andJ.R.vanderMeer，Useofflowcytometricmethodsforsingle—cellanalysisinenvironmentalmicrobiology.CurrOpinMicrobiol,2008.11(3):205-212)。例如，通過對細菌的核酸或蛋白進行螢光標記，FCM可以快速、準確地檢測樣本中的細菌總數、活菌數目和死菌數目。隨著技術的不斷改進，流式技術在細菌檢測方面的成功應用層出不窮，Hammes等([6]Hammes，F.，etal.，Flow-cytometrictotalbacterialcellcountsasadescriptivemicrobiologicalparameterfordrinkingwatertreatmentprocesses.WaterRes，2008.42(1-2):269-277)用FCM快速檢測飲用水中汙染的細菌數量，靈敏度比傳統的平板培養法高出兩個數量級；Burney等([7]Berney，M.，etal.，AssessmentandinterpretationofbacterialviabilitybyusingtheLIVE/DEADBacLightKitincombinationwithflowcytometry.ApplEnvironMicrobiol,2007.73(10):3283-3290)用FCM通過LIVE/DEAD螢光試劑盒鑑定了多種細菌的生理性能；流式細胞技術結合螢光原位雜交可以識別特定的核苷酸靶標，已被應用於基於16SrRNAs的細菌特異性識別及篩選表達特異mRNA的細菌([8]Jen，C.J.，etal.，Flow—FISHanalysisandisolationof3clostridialstrainsinananaerobicsemi_solidbio_hydrogenproducingsystembyhydrogenasegenetarget.ApplMicrobiolBiotechnol，2007.74(5):1126-1134;[9]Kalyuzhnaya，M.G.，etal.，Fluorescenceinsituhybridization_flowcytometry—cellsorting—basedmethodforseparationandenrichmentoftypeIandtypeIImethanotrophpopulations.ApplEnvironMicrobiol,2006.72(6):4293-4301)。致病菌的快速、靈敏檢測將為食品安全、環境監測、疾病的診斷與治療等提供重要科學依據。建立在抗體特異性識別基礎上的免疫分析方法是致病菌特異檢測的傳統方法，然而特異性的單克隆抗體不僅價格昂貴，重複性不高，而且難以獲取。自然界中存在著數量眾多、種類各異的噬菌體為致病菌的特異性檢測提供了一個天然的寶庫。噬菌體能在活的具有感受性的菌體內繁殖，並且每種細菌基本上都有特異的噬菌體。基於噬菌體的寄生專一性以及生長速度快等特點，近年來發展了一些噬菌體檢測特定致病菌的方法如噬菌斑法檢測結核分支桿菌技術([10]McNerney，R.，etal.，Developmentofabacteriophagephagereplicationassayfordiagnosisofpulmonarytuberculosis.JClinMicrobiol,2004.42(5):2115-2210);螢光標記噬菌體結合免疫磁性分離法檢測大腸桿菌0157:H7([ll]Goodridge，L.，J.Chen，andM.Griffiths,TheuseofafluorescentbacteriophageassayfordetectionofEscherichiacoli0157:H7ininoculatedgroundbeefandrawmilk.IntJFoodMicrobiol,1999.47Q-2):43-50;[12]Goodridge丄，J.Chen，andM.Griffiths，Developmentandcharacterizationofafluorescent—bacteriophageassayfordetectionofEscherichiacoli0157:H7.ApplEnvironMicrobiol,1999.65(4):1397-1404);基於噬菌體的電化學方法([13]Neufeld，T.，etal.，Combinedphagetypingandamperometricdetectionofreleasedenzymaticactivityforthespecificidentificationandqimntificationofbacteria.AnalChem，2003.75(3):580-585);螢光素酶報告的分枝桿菌噬菌體和李斯特噬菌體檢測法([14]Banaiee，N.，etal.，Luciferasereportermycobacteriophagesfordetection，identification,andantibioticsusceptibilitytestingofMycobacteriumtuberculosisinMexico.JClinMicrobiol,2001.39(11):3883-3888;[15]Loessner，M.J.，etal.，ConstructionofluciferasereporterbacteriophageA511::luxABforrapidandsensitivedetectionofviableListeriacells.ApplEnvironMicrobiol,1996.62(4):1133-1140);檢測由噬菌體介導的細菌裂解後釋放的酶(如腺苷酸激酶)([16]Blasco，R.，etal.，Specificassaysforbacteriausingphagemediatedreleaseofadenylatekinase.JApplMicrobiol,1998.84(4):661-666);利用噬菌體對沙門氏菌和大腸桿菌0157:H7等進行檢測，從標本收集到結果讀取僅需35h([17]Ulitzur，N.andS.Ulitzur，Newrapidandsimplemethodsfordetectionofbacteriaanddeterminationoftheirantibioticsusceptibilitybyusingphagemutants.ApplEnvironMicrobiol,2006.72(12):7455-7459)。0da等人將綠色螢光蛋白GFP嵌入對大腸桿菌0157:H7特異的噬菌體PP01的衣殼蛋白中進行表達，進而通過螢光顯微鏡可以快速敏感的檢測至U細菌([18]Kottegoda，S.，etal.，Biarsenical-tetracysteinemotifasafluorescenttagfordetectionincapillaryelectrophoresis.AnalChem，2008.80(14):5358-5366)。但是由於GFP體積較大(由238個胺基酸組成)，它在活體標記中可能會影響被標記的蛋白質或細胞的正常生理功能，而且它的中等光穩定性也限制了它在單分子研究中的應用。另外，由於GFP是一個自發螢光蛋白，表達GFP的噬菌體不管對活菌，死菌還是不可培養菌均能識別而發光，從而無法區分細菌的生理狀態。2006年Edgar等人在《美國國家科學院院刊》上發表論文，他們利用活的細菌體內會產生biotin的特點，將噬菌體進行基因改造，使其表達與biotin相結合的肽段，再將親和素與量子點相連，利用生物素與親和素的結合使噬菌體標記上螢光，從而可以在螢光顯微鏡和流式細胞儀上快速檢測到被相應噬菌體侵染的細菌([19]Edgar，R.，etal.，High—sensitivitybacterialdetectio皿singbiotin-teggedphageandquantum—dotnanocomplexes.ProcNatlAcadSciUSA，2006.103(13):4841-4845)。然而這個方法，操作比較煩瑣，且用於檢測的噬菌體必須一直處於biotinfree狀態。雙砷染料是諾貝爾化學獎得主錢永健實驗室發展的一種很有前途的活細胞蛋白標記方法([20]Griffin，B.A.，S.R.Adams，andR.Y.Tsien，Specificcovalentlabelingofrecombinantproteinmoleculesinsidelivecells.Science,1998.281(5374):269-272)，該方法所用的螢光標記探針為一類能夠穿透細胞膜和含有雙砷基團的有機小分子(如FlAsH-EDT2)。雙砷螢光標記分子進入細胞後，與連在重組蛋白上的六肽標籤CCXXCC序列(簡稱TC，其中X是除了半胱氨酸以外的其他胺基酸)發生特異性作用，形成強螢光的共價結合的雙砷染料_四半胱氨酸體系(螢光強度約為FlAsH-EDT2的50000倍)。目前，已經開發出可產生藍色(ChoXAsH)、綠色(FlAsH)及紅色(ReAsH)螢光的雙砷染料。雙砷染料-四半胱氨酸體系具有背景噪音低、母體蛋白功能影響小、螢光團共價連接牢固等優點，並且整個體系可以通過電子顯微鏡監測。雙砷染料體系較之廣泛應用的螢光蛋白，最明顯的特點在於四半胱氨酸六肽標籤序列體積小，不會影響被標記蛋白質或細胞的正常生理功能，另外染料量子產率高、穩定性強、標記速度快並且能夠提供除了螢光之外的其它讀出方式，成為更理想的蛋白質螢光探針([21]K印pler，A.，etal.，Labelingoffusionproteinswithsyntheticfluorophoresinlivecells.ProcNatlAcadSciUSA，2004.101(27):9955—9959;[22]Miller，L.W.，etal.，Invivoproteinlabelingwithtrimethoprimconjugates:aflexiblechemicaltag.NatMethods,2005.2(4):255-257)
發明內容本發明的目的在於針對現有的細菌檢測操作較複雜、檢測周期較長和細菌特異性檢測中特異性單克隆抗體難以獲取、價格較昂貴等缺陷，提供一種致病菌的檢測方法，該檢測方法利用基因改造的噬菌體簡單、快速、靈敏、特異地鑑別致病菌。本發明所述雙砷染料_四半胱氨酸重組噬菌體是對噬菌體進行基因改造，在其外殼PIII蛋白上插入可以和新型雙砷染料特異結合的四半胱氨酸序列。改造後的噬菌體侵染特異的宿主菌並在其體內大量繁殖，其衣殼蛋白上所表達的四半胱氨酸與後續加入的跨膜雙砷染料結合，螢光大大增強，可以用流式細胞儀或螢光顯微鏡進行方便快速的檢測。本發明包括以下步驟1)設計併合成具有粘性末端的編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；2)將編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地連於噬菌體衣殼蛋白的表5達調控序列中，形成四半胱氨酸重組噬菌體；3)用步驟2)中的重組噬菌體侵染宿主細胞，並在其中繁殖，生成帶有表達四半胱氨酸重組噬菌體的重組細胞；4)在重組細胞中加入雙砷染料，經洗滌去除非特異性結合後，被重組噬菌體特異識別侵染的細菌，在激發光照射下可發出特異螢光，經流式細胞儀或螢光顯微鏡進行特異性檢測。在步驟1)中，所述四半胱氨酸多肽是指FLNCCPGCCMEP，所述編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列是指"TTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCT"。在步驟2)中，所述"可操作地連於"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，"可操作地連於"意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發明中所述噬菌體可選用本領域已知的各種噬菌體，如市售的噬菌體，包括T7，M13等。在生產本發明的四半胱氨酸重組噬菌體時，可以將編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地連於噬菌體衣殼蛋白的表達調控序列中，從而形成在衣殼蛋白上表達四半胱氨酸的重組噬菌體。在步驟3)中，所述宿主細胞為原核細胞，是步驟2)中所用噬菌體特異識別的待檢測細菌，可以為E.coliBLT5403;E.coliTG1;E.coli0157和salmonella等。重組噬菌體侵染宿主細胞時，應控制噬菌體和宿主細胞的比例小於1000:l，侵染繁殖時間可以為3090min。在步驟4)中，所述雙砷染料可以為FLAsH和ReAsH等螢光物質中的至少一種，其終濃度為110iiM，反應時間為3090min，反應溫度為室溫，所述洗滌可分別用BAL(3-羥基-l，2-丙二硫醇)和HBSS(Hank's平衡鹽溶液)洗至少1次；在經流式細胞儀或螢光顯微鏡進行特異性檢測前可加入HBSS重懸。本發明製備的雙砷染料-四半胱氨酸-重組噬菌體，可根據待檢測致病菌的種類，選擇特定的專一識別的噬菌體進行基因改造，在其衣殼蛋白上插入四半胱氨酸序列後，該重組噬菌體可以識別特定的致病菌，在其體內生長繁殖，並表達可被雙砷染料識別的四半胱氨酸序列。被重組噬菌體侵染的致病菌，經雙砷染料染色後，在合適的激發光照射下，該致病菌能夠發射螢光，並可以在流式細胞儀或螢光顯微鏡下明顯觀察和區分，從而實現對特定致病菌的快速鑑別。圖1為多價噬菌體侵染細菌用流式分析儀檢測的螢光信號圖。在圖1中，橫坐標為螢光強度(A.U)，縱坐標為側向散射強度(A.U)。圖2為圖1中陰性對照和實驗組的直方圖及螢光統計值。在圖2中，橫坐標為螢光強度(A.U)，縱坐標為統計數佔最大統計數比例；曲線a為M13侵染後的細菌，曲線b為M13-TC侵染後的細菌。圖3為單價噬菌體侵染細菌用流式分析儀檢測的螢光信號圖。在圖3中，橫坐標為螢光強度(A.U)，縱坐標為側向散射強度(A.U)。圖4為圖3中陰性對照和實驗組的直方圖及螢光統計值。在圖4中，橫坐標為螢光強度(A.U)，縱坐標為統計數佔最大統計數比例；曲線a為M13K07侵染後的細菌，曲線b為M13K07-TC侵染後的細菌。圖5為8種不同細菌用M13-TC侵染後的螢光信號值。在圖5中，橫坐標為菌種，給坐標為螢光強度(A.U);l為大腸桿菌E2738-空白對照，2為大腸杆圖E2738-陰性對照，3為大腸桿菌E2738,4為大腸桿菌K12，5為大腸桿菌BL21，6為遲鈍愛德華桿菌，7為溶壁微球菌，8為哈維氏弧菌，9為溶藻酸弧菌，10為副溶血弧菌。圖6為噬菌體侵染細菌的螢光顯微鏡圖陰性對照為用原噬菌體侵染的細菌經雙砷染料染色後的樣本；實驗組為用含有TC片段的重組噬菌體侵染的細菌經雙砷染料染色後的樣本。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001byColdSpringHarborLaboratoryPress)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1多價噬菌體M13KE-TC的製備四半胱氨酸TC片段的製備設計兩條帶有Acc65I，EagI粘性末端的TCDNA互補序列並於生工合成。'(記為SEQIDNO.1);'(記為SEQIDNO.2)。分別取PI，P2以終濃度10M混合於TaqBuffer中，於PCR儀進行退火反應，設置程序如下95。C，2min;連續降至25。C，約60min;4。C保存。對7222bp的多價噬菌體M13KEDNA進行Eag1、Acc65I雙酶切回收，雙酶切片段與退火的帶有EagI、Acc65I粘性末端的TCDNA片段連接後，轉染到大腸桿菌TG1感受態中，鋪板培養，隨機調取單噬菌斑，擴增，提取噬菌體ssDNA，寄往生工測序。陽性重組噬菌體測序結果如下所示，與理論M13KE-TCDNA序列完全匹配，其中s為理論序列的一部分，1為噬菌體ssDNA測序的一部分鹼基序列。s1s1s1NO.3)s1上列理論序列的一部分核酸序列；下列陽性重組噬菌體ssDNA測序的一部分。實施例2單價噬菌體M13K07-TC的製備1、重組噬菌粒pCANTAB5E-TC構建及鑑定設計兩條帶有NotI，SfiI粘性末端的TCDNA互補序列並於生工合成。P3:5—-CGGCCATTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCTGC-3—(記為SEQIDP4:5-GGCCGCAGGCTCCATGCAGCAGCCGGGACAACAGTTCAGGAATGGCCGGCT-3(記為SEQIDNO.4)。分別取P3，P4以終濃度10M混合於TaqBuffer中，於PCR儀進行退火反應，設置程序如下95。C，2min;連續降至25。C，約60min;4。C保存。對5.3kb的噬菌粒DNApCANTAB5E進行NotI，SfiI雙酶切，回收，雙酶切片段與退火的帶有NotI，SfiI粘性末端的TCDNA片段連接，構建重組噬菌粒，按常規方法進行克隆、測序，獲得SEQIDNO.3所示的序列。S2S2S2S2S2上列理論序列的一部分核酸序列；下列陽性重組噬菌粒ssDNA測序的一部分。82、單價噬菌體M13K07-TC的獲取對以上重組噬菌粒pCANTAB5E-TC通過輔助噬菌體M13K07的補救，便得到了含有一個TC肽段的單價噬菌體M13K07-TC，具體步驟如下(1)取100L過夜培養含有重組噬菌粒pCANTAB5E-TC的大腸桿菌TG1菌液接種到10mL2xYT-AG(100g/mLAmp，2%Glucose)中，37°C，150rpm，培養1.5h;(2)加入1.2xl010pfu輔助噬菌體M13麗，37°C，250rpm，培養lh;(3)10000rpm室溫離心10min，去上清；(4)將細胞沉澱重新接種到10mL2xYT-AK(100mg/LAmp，25mg/LKanamycin)中，37。C，250rpm培養8h;(5)10000rpm室溫離心2min，保留上清液；(6)用PEG8000/NaCI，冰浴沉降30-60min，4°C，10000rpm離心20min，去上清，用2xYT重新溶解沉澱，fC保存，便得到單價噬菌體M13K07-TC。實施例3四半胱氨酸重組噬菌體對特異致病菌的侵染及雙砷染料染色挑取待檢菌E.coliTGl單菌落於2mL2XYT，37°C，250rpm過夜培養，取過夜培養的E.coliTGl菌液IOOL加入到10mL2XYT-G，37°C，250rpm搖至OD=0.6，各取2mL相應菌液於培養管中，分別加入重組噬菌體及原噬菌體，37t:，250rpm，侵染lh。各取侵染液80uL，用100LHBSS洗兩次，最後加入HBSS，加入終濃度5yM的雙砷染料FlAsH-EDT2，孵育30min，離心棄上清，加入洗滌劑BAL，孵育15min，離心棄上清，重複洗滌一次，加入HBSS80uL重懸。這樣用原噬菌體侵染的細菌樣本為陰性對照組；用重組噬菌體侵染的細菌樣本為實驗組。實施例4含雙砷染料-四半胱氨酸重組噬菌體的致病菌的快速檢測1、傳統流式細胞儀檢測取實施例3中HBSS重懸液300L於傳統流式細胞儀進行檢測，實驗條件如下488nm激發電壓400V;SSC:300V;FSC:300V;檢測個數10000。1)對於多價噬菌體，結果如圖1和2所示，圖1為多價噬菌體侵染細菌用流式分析儀檢測的螢光信號圖。在圖1中，圖A為陰性對照(用原噬菌體侵染的細菌經雙砷染料染色後的樣本，即雙砷標記M13侵染後的細菌)的散點圖；圖B為實驗組(用含有TC片段的重組噬菌體侵染的細菌經雙砷染料染色後的樣本，即雙砷標記M13-TC侵染後的細菌)的散點圖。圖2為圖1中陰性對照和實驗組的直方圖。在圖2中，曲線a為M13KE侵染的細菌，曲線b為M13KE-TC侵染的細菌。陰性對照和實驗組的螢光統計值如表l所示。實驗組的螢光峰明顯比陰性組向右偏移，即信號可以與背景相分離。表面該體系可適用於傳統的流式細胞儀的對致病菌的快速檢測。表1tableseeoriginaldocumentpage92)對於單價噬菌體結果如圖3和4所示，圖3為單價噬菌體侵染細菌用流式分析儀檢測的螢光信號圖。在圖3中，圖A為陰性對照(用原噬菌體侵染的細菌經雙砷染料染色後的樣本，即雙砷標記M13K07侵染後的細菌)的散點圖；圖B為實驗組(用含有TC片段的重組噬菌體侵染的細菌經雙砷染料染色後的樣本，即雙砷標記M13K07-TC侵染後的細菌)的散點圖。圖4為圖3中陰性對照和實驗組的直方圖。在圖4中，曲線a為M13K07侵染的細菌，曲線b為M13K07-TC侵染的細菌。陰性對照和實驗組的螢光統計值如表2所示。實驗組的螢光峰明顯比陰性組向右偏移，即信號可以與背景相分離。表面該體系可適用於傳統的流式細胞儀的對致病菌的快速檢測。表2tableseeoriginaldocumentpage102、螢光顯微鏡檢測取實施例3中HBSS重懸液20L於螢光顯微鏡下觀察，分別在明場和藍光激發下觀察，結果如圖6所示，在藍色雷射照射下，實驗組可以觀察到帶有螢光的細菌而陰性組無法看到，表明該體系可適用於螢光顯微鏡下對致病菌的快速檢測。實施例5雙砷染料_四半胱氨酸重組噬菌體對致病菌檢測的特異性考察分別取8種不同種類細菌E.coli2378;E.coliK12;E.coliBL21;Edwardiellatarda;M.Lysodeikticus;VibrioharveryiVibrioalginolyticus;Vibrioparahemolyticus(其中僅E.coli2378為重組噬菌體的宿主菌)單菌落於2mL2XYT，37°C，250rpm過夜培養，取過夜培養的各菌液IOOL加入到10mL2XYT-G，37°C，250rpm搖至0D=0.6，各取2mL相應菌液於培養管中，分別加入重組噬菌體及原噬菌體，37t:，250rpm，侵染lh。各取侵染液80uL，用100LHBSS洗兩次，最後加入HBSS，加入終濃度5yM的雙砷染料FlAsH-EDT2，孵育30min，離心棄上清，加入洗滌劑BAL，孵育15min，離心棄上清，重複洗滌一次，加入HBSS80uL重懸。另外加入用原噬菌體侵染的細菌樣本為陰性對照組；用重組噬菌體侵染，不加入雙砷染料但經歷同樣洗滌過程的細菌作為空白對照組。將以上樣本用流式分析儀進行分析，取每一組的螢光值進行比較，陰性對照和實驗組的直方圖及螢光統計值如圖5所示；宿主菌E.coli2378的信號明顯高於其他任何其他細菌，因此雙砷染料_四半胱氨酸重組噬菌體對致病菌檢測具有很強的特異性。10權利要求致病菌的檢測方法，其特徵在於包括以下步驟1)設計併合成具有粘性末端的編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；2)將編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地連於噬菌體衣殼蛋白的表達調控序列中，形成四半胱氨酸重組噬菌體；3)用步驟2)中的重組噬菌體侵染宿主細胞，並在其中繁殖，生成帶有表達四半胱氨酸重組噬菌體的重組細胞；4)在重組細胞中加入雙砷染料，經洗滌去除非特異性結合後，被重組噬菌體特異識別侵染的細菌，在激發光照射下可發出特異螢光，經流式細胞儀或螢光顯微鏡進行特異性檢測。2.如權利要求l所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於在步驟l)中，所述四半胱氨酸多肽是指FLNCCPGCCMEP。3.如權利要求l所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於在步驟l)中，所述編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列是指"TTCCTGAACTGTTGTCCCGGCTGCTGCATGGAGCCT"。4.如權利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於在步驟2)中，所述可操作地連於，是指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性；如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。5.如權利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於在步驟2)中，所述可操作地連於，意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。6.如權利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於在步驟3)中，所述宿主細胞為原核細胞，是步驟2)中所用噬菌體特異識別的待檢測細菌。7.如權利要求6所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於所述待檢測細菌為E.coliBLT5403;E.coliTGI;E.coli0157或salmonella。8.如權利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於在步驟3)中，重組噬菌體侵染宿主細胞時，控制噬菌體和宿主細胞的比例小於1000:l，侵染繁殖時間為3090min。9.如權利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於在步驟4)中，所述雙砷染料為FLAsH和ReAsH螢光物質中的至少一種，其終濃度為110iiM，反應時間為3090min，反應溫度為室溫。10.如權利要求1所述的致病菌的檢測方法，其特徵在於在步驟4)中，所述洗滌分別用BAL(3-羥基-1，2-丙二硫醇)和HBSS(Hank's平衡鹽溶液)洗至少1次；在經流式細胞儀或螢光顯微鏡進行特異性檢測前加入HBSS重懸。全文摘要致病菌的檢測方法，涉及一種病原微生物檢測方法。提供一種致病菌的檢測方法，該檢測方法利用基因改造的噬菌體簡單、快速、靈敏、特異地鑑別致病菌。設計併合成具有粘性末端的編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列；將編碼具有四半胱氨酸多肽的核苷酸序列可操作地連於噬菌體衣殼蛋白的表達調控序列中，形成四半胱氨酸重組噬菌體；用重組噬菌體侵染宿主細胞，並在其中繁殖，生成帶有表達四半胱氨酸重組噬菌體的重組細胞；在重組細胞中加入雙砷染料，經洗滌去除非特異性結合後，被重組噬菌體特異識別侵染的細菌，在激發光照射下可發出特異螢光，經流式細胞儀或螢光顯微鏡進行特異性檢測。文檔編號C12Q1/04GK101768625SQ20101011595公開日2010年7月7日申請日期2010年2月23日優先權日2010年2月23日發明者吳麗娜,潘建波,顏曉梅,黃婷婷申請人:廈門大學