用於表徵透明顆粒的光學方法

2023-07-10 14:44:16

專利名稱：用於表徵透明顆粒的光學方法
技術領域：
本發明涉及一種用於表徵顆粒的光學方法。
背景技術：
在一些技術領域，計算透明介質中小的透明顆粒是熟知的問題。這可以是在材料科學中計算分散相顆粒的數量，在生物培養中計算細胞數量，在化學或聚合物合成中計算乳膠中微膠粒的數量……。解決這個問題的第一個嘗試是使用標準的透明網格(標線)，然後手動計算顯微照片中各個由網格所限定的每個正方形中顆粒的數量。這種手動計數方法存在一些缺陷。首先，它非常耗時，它在數量很少時具有較差的統計有效性，並且通常具有有限的可靠性。因此，圖像分析有時用於使這種計數自動化。在這些方法中，顯微照片通常通過標準程序轉換，如利用閾值、分割、膨脹和腐蝕變換、邊緣檢測……。然後這些利用或多或少複雜的算法計算單獨的顆粒。這種自動化方法通常存在一些缺陷。例如，如果獲得的照片對比度有限，或者在顆粒重疊的情況下，該算法可能無法精確的將不同的顆粒分離，並且計數僅具有較差的可靠性。其它已知的用於計算在液體中流動的顆粒的方法是基於陰影或者光漫射效應。這些方法廣泛用於，例如製藥領域中，也存在一些缺陷。首先，其通常不可能區分氣泡和固體顆粒。這在評估包含大量幹擾測量的溶解CO2的生理緩衝溶液的潔淨度時特別關鍵。在這種測量中，根本不能從結果中得到任何關於顆粒性質的信息。發明目的本發明旨在提供一種不 存在現有技術缺點的表徵和/或計算透明介質中球形透明顆粒的方法。根據以下描述，本發明的優點將是顯而易見的。

發明內容
本發明涉及一種用於表徵顯示為焦點區(焦點)的透明物體至少一種性質的方法，所述物體在透明介質中，所述方法包括以下步驟:-通過定向光源照射包含待表徵物體的樣品，從而在所述透明物體的焦點區誘導光強度峰。測定光強度峰的至少一個特性，由所述光強度峰的至少一個特性測定所述物體的至少一種性質。對於顯示為焦點區(焦點)的透明物體，在本文中其意指當被定向光源照射時，能夠在所述焦點區集中光的物體，該集中的光形成光強度峰。在本發明中，所述光強度峰直接由物體和獨立於成像裝置的定向光源之間的相互作用誘導(即，光峰即使沒有被觀測到也存在)。根據特別優選的實施方式，本發明的方法包括以下特徵中的一個或者至少兩個的適當組合:
該方法進一步包括以下步驟:記錄被照射樣本的全息再現像(holographic representation)；由所述全息再現像重建由所述樣本誘導的光場強度的三維再現像；掃描該光場強度的三維再現像用來測定給出高於預定閾值的強度的光峰面積，所述光峰的每一個相應於一個顆粒；-至少一種物體特性包括所述物體的數量，光強度峰的決定的特性(其包括峰的數
量);-這些 物體選自由以下各項組成的組:乳液、固體珠、活細胞、死細胞以及它們的混合物中的氣泡、液泡；-這些物體選自由活細胞、死細胞和它們的混合物組成的組；-所述至少一種峰特徵包括至少一種選自由以下各項組成的組中的特徵:光峰和相應物體之間的距離，光峰面積和光峰強度；-該峰特徵用於將所述物體分為物體的至少兩個亞組；-物體的一個亞組相應於活細胞，物體的第二個亞組相應於死細胞；-在連續全息再現像中動態實施表徵方法；-透明介質是運送物體的流動液體；-全息再現像通過全息顯微鏡獲得；-顯微鏡根據差分模式操作；-顯微鏡在暗場模式下操作；-光源是部分相干的；-顯微鏡是離軸操作的。本發明的另外一個方面涉及實施本發明方法或本發明優選實施方式的電腦程式。


圖1示意性示出了本發明的基本原理。圖2示意性示出了使用根據本發明的方法的接觸角的測量。圖3示意性示出了用於產生實施例的數據的數字全息顯微鏡。圖4a示出了活細胞「在焦點上」的強度圖。圖4b示出了圖4a的透明細胞的焦點區，這些透明細胞集中照射光線形成光強度峰。圖5示出了在誘導細胞死亡的熱處理前後，細胞培養物的峰數作為峰尺寸(面積)的函數的直方圖。附圖標號:1:透明介質2、3:球形透明物體4:樣品容器的透明壁5、6:集中照射光線(7)形成光強度峰的透明物體(2、3)的焦點區7:照射光線
8:流動透明介質的方向
具體實施例方式本發明涉及一種利用許多透明物體在被光照射時共有的光學特徵的分析方法。該共有特徵為許多透明物體充當透鏡，使光集中在所述物體之後的實焦點區(5)或在所述物體之前的虛區(6)。這樣的焦點區可以由例如具有不同於周圍介質的折射率的球形或橢圓形透明顆粒(2-3 )形式的物體誘導。這樣的顆粒可以是例如分散在水溶液中的油滴，液體、活細胞或者死細胞中的氣泡(3 )，氣流中的液滴……。對於透明，在本文中意指介質保持足夠的光定向性以觀測聚焦峰。這樣的透明度例如可以通過霧度測量(ASTM D1003)來表徵。由高霧度引起的問題是光背景增加，並且增加了區分背景和峰的難度。為了觀測光聚焦強度峰，優選顆粒表現大出於入射光波長的尺寸，更優選大於光波長三倍。在可見光的情況下，優選顆粒具有大於I μ m的尺寸。誘導焦點區的透 明顆粒不限於自由流動的球形顆粒，而是還可以包括在平面上捕獲的顆粒，如玻璃等接觸的液滴或氣泡。存在這樣的聚焦點/區的結果是這些顆粒中的每一個在被照射時將會產生光強度峰，通過掃描三維光強度分布可以容易地探測到該光強度峰。有利的是，本發明的方法首先通過記錄包含待分析顆粒的照射樣品的數字全息再現像實施。然後優選地，在重建的由照射樣品誘導的光場的3D再現像上實施掃描和分析。即使可以通過本發明的方法表徵單一顆粒，但是該方法自動化的可能性使得其對大組的顆粒特別適合。待表徵的顆粒可以同時存在於再現像的範圍內或者可以存在於時間序列內。優選地，數字全息再現像通過數字全息顯微鏡記錄(DHM)。所述DHM可以有利地是在EP1399730中描述的類型，其通過引用合併於此。作為優選的替代，DHM可以是差分全息顯微鏡，如在EP1631788中所描述的，其通過引用合併於此。有利的是，如在W0/2010/037861中所描述的DHM以暗場模式操作的。這樣的暗場模式的優點是通過減少平均光背景使得容易檢測光峰。如國際專利申請號PCT/EP2010/64843中所描述的，使用離軸DHM具有的優點是快速記錄動態事件(dynamical event),如流體中流動顆粒。優選地，通過檢測3D全息像的容積內高於預定閾值的光強度來測定光峰強度。這種聚焦點測定的第一應用是一種用於計算流動介質中球形顆粒的方法。在這種方法中，光峰強度的數量相當於樣品中球形顆粒的數量。這種計數方法的優點是聚光區比顆粒尺寸小得多，使得即使在顆粒的密度較高的情況下，也可以容易地分辨並很好地區分光峰。相比於2D再現像中重疊顆粒的計算方法，這是關鍵的優點。計算顆粒僅使用峰的檢測，但是其它的光峰特徵，如形狀、強度和位置也可以有利地利用。此類信息是相當於每個顆粒的透鏡的特徵。那些透鏡特徵本身是通過這些顆粒的幾何形狀和折射率而測定的。
例如，在液體中的氣泡將充當凹透鏡，在氣泡前方產生焦點，這與將充當會聚透鏡的高折射率的顆粒相反，其在該顆粒後方產生焦點。因此，在優選的方法中，這些顆粒是根據相應光峰區的相對位置而分類的。該分類使得容易區分不同種類的顆粒，如氣泡和高折射率顆粒。對於高或低的折射率，在本文中意指分別高於或低於顆粒周圍介質折射率的折射率。作為通過顆粒光學性質而區分的顆粒的另外實例，出乎意料地顯示出，本發明的方法能夠基於與細胞相應的光峰特徵來區分流體介質中流動的死細胞和活細胞。在下文中示出的實驗性實施例中，如在圖5中示出的，峰的尺寸用作區分標準(即，其中光強度高於閥值的體積或面積)。也發現可以使用其他標準，如絕對峰強度(即，峰內最大強度或光強度的積分)。由於該方法可以容易地自動化並以連續的時間序列自動實施，因此本發明的方法可以有利地用於研究單個細胞的位移。作為本發明進一步的動力學應用，可以利用一些峰特徵對噴霧乾燥過程進行研究。在這類研究中，噴霧顆粒通過上述方法計數，可以精確地測定他們在流體中的單獨移動，同時可以通過分析重構顆粒(「在焦點上」圖像)來測定作為時間函數的顆粒尺寸，並且該溶液濃度可以由顆粒折射率計算，由顆粒形狀和位於焦點區的光強度峰之間的相互關係測定。這種方法帶來的一個優點將是例如測定過飽和現象和相應的成核和生長過程的能力。測定透明物體焦點的另一個有利應用是準確測定透明平面上液滴的幾何參數。然後可以將那些幾何參數用於例如準確計算接觸角。更一般地，以下參數可以 是感興趣的:峰數量、峰形狀和尺寸、峰強度(積分值和/或最大值)、與相應顆粒的相對位置。那些峰參數可以有利地與相應顆粒的形狀和位置相關。與源於顆粒的相應螢光數據的相關性也可以有利地用於表徵顆粒。這種螢光相關性可以使用在文獻US2004/156098中描述的方法，其通過引用合併於此。由那些參數，以下特徵可以有利地推論:活細胞的活力、溶液濃度、細胞類型、顆粒運動等等。實施例使用本發明的方法表徵細胞培養物。如圖3所示的顯微鏡用於記錄數字全息圖。全息圖採樣速率是2.5Hz，並且在一個序列中拍攝200張全息圖。如圖1所示，樣品架4是流動室，其中流體樣品處於流體8中，並且顆粒是動態觀測的。圖4a示出所獲得的全息記錄之一的重建圖。圖4b示出聚焦峰的相應投影。在圖4b中可以看到，當考慮用光峰代替相應細胞再現像(細胞圖像，cell representation)時，即使接觸細胞也很好地分辨。注意到為了簡化圖像，在二維上示出這些峰。在真實圖像中，也可以在深度上分辨它們。通過給出的方法測定的細胞的數量是三百七十二萬細胞/ml。作為對比，在burker計數細胞中手動計數為三百七i^一萬細胞/ml。即使在非常高的細胞濃度的情況下，也保持良好的一致性。在最後一種情況下，常用的自動計數方法給出了不精確的結果。在進一步的實驗中，本發明的方法首先用於計算在培養物種的細胞數。在第二步中，培養介質在42.5°C下經受3小時熱處理。已知這種處理可以降低細胞的活力。然後在熱處理前後測定觀測到的光峰尺寸的分布。該結果如圖5所示。如在該圖中可以看到的，峰尺寸 的分布與細胞活力有很大的相關性。
權利要求
1.用於表徵在透明介質(I)中透明物體(2、3)的方法，所述透明物體(2、3)顯示為光學焦點區(5、6)，所述方法包括以下步驟 -通過定向光源(7)照射包含待表徵的所述物體(2、3)的樣品，從而在所述透明物體的所述焦點區誘導光強度峰(5、6)； -測定誘導的所述光強度峰(5、6)的至少一個特徵； 由所述光強度峰(5、6)的所述至少一個特徵測定所述物體(2、3)的至少一種性質。
2.根據權利要求I所述的方法，進一步包括以下步驟 -記錄被照射的所述樣品的全息再現像； -由所述全息再現像重建由所述樣品誘導的所述光場強度的三維再現像； -掃描所述光場強度的所述三維再現像，用來測定顯示為高於預定閥值的強度的光強度峰(5、6)，所述光強度峰(5、6)的每一個相應於一個物體(2、3)。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述全息再現像通過全息顯微鏡獲得。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述顯微鏡根據差分模式操作。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其中，所述顯微鏡在暗場模式下操作。
6.根據權利要求3至5中任一項所述的方法，其中，所述光源是部分相干的。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述顯微鏡是離軸操作的。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述至少一種顆粒特徵包括所述物體的數量。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述物體選自由以下各項組成的組中乳液、固體珠、活細胞、死細胞，以及它們的混合物中的氣泡、液泡。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述物體選自由活細胞、死細胞以及它們的混合物組成的組。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，測定至少一個峰特徵，所述峰特徵選自由以下各項組成的組中所述光強度峰和相應的所述物體之間的距離、所述光強度峰的面積、以及所述光強度峰的強度。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述峰特徵用於將所述物體分為物體的至少兩個亞組。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，物體的一個亞組相應於活細胞，物體的第二個亞組相應於死細胞。
14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，在連續全息再現像中動態實施所述表徵方法。
15.一種記錄在計算機可讀介質上的電腦程式，用於由包含所述物體的透明樣品的數字全息再現像來計算顯示為光學聚光區的透明物體，所述電腦程式在安裝到計算機上時測定在所述全息再現像中光強度峰的所述數量。
全文摘要
本發明涉及一種用於表徵透明介質(1)中透明物體(2、3)的方法，所述透明物體(2、3)顯示為光學焦點區(5、6)，所述方法包括以下步驟通過定向光源(7)照射包含待表徵物體(2、3)的樣品，從而在所述透明物體的焦點區誘導光強度峰(5、6)；測定由所述待表徵物體誘導的光強度峰(5、6)的至少一個特徵，由所述光強度峰(5、6)測定所述物體的至少一種性質。
文檔編號G03H1/00GK103238120SQ201180054629
公開日2013年8月7日 申請日期2011年11月9日 優先權日2010年11月12日
發明者弗蘭克·杜波依斯, 凱薩琳·尤拉索夫斯基 申請人:布魯塞爾大學