用於產生報告分子的點擊化學的製作方法

2023-08-13 13:16:31 1

專利名稱：用於產生報告分子的點擊化學的製作方法
專利說明用於產生報告分子的點擊化學 本發明涉及產生適於檢測分析物，如核酸的報告分子。此外，本發明涉及檢測分析物的方法和區域。

背景技術：
在DNA合成領域中的劃時代突破，最重要的是聚合酶鏈式反應(PCR)和亞磷醯胺化學，已經導致天然DNA修飾的所有組成不斷增加。在PCR中，使用某些B族聚合酶可以摻入在嘧啶的5位或在7-脫氮雜嘌呤的7位上攜帶接頭的經修飾的核苷三磷酸[1]。這些結構單元向DNA中摻入的容易程度強烈依賴於側鏈的空間體積和分子結構。原則上，在PCR中所有天然的核鹼基都可以被經修飾的核鹼基替代[2]。如果使用亞磷醯胺化學，原則上任何分子結構都可以摻入DNA中。最大的限制是摻入DNA的經修飾的核鹼基對於亞磷醯胺DNA合成和所得DNA鏈的去保護條件必須是穩定的。
在我們的研究小組中已經開發了避免修飾的空間體積以及潛在化學不穩定性的問題的方法[3]。經修飾的核苷酸攜帶含有內部和末端炔的接頭。內部炔有助於通過PCR的摻入，因為與核鹼基很接近的空間體積被減少了。末端炔是點擊反應(click reaction)的反應性位點[4]，點擊反應是銅催化的疊氮化物和炔之間的Huisgen偶極環加成[5]。該反應可以方便地用於生物分子的合成後標記。從而疊氮化物可以在高產率反應中連接到DNA而不會遇到任何嚴重的副反應，因為天然的生物分子不攜帶任何疊氮化物或者末端炔。該方法也描述於PCT/EP2006/004017，將其內容引入本文作為參考。
根據以前描述的方法，僅僅一種類型的標記基團可以以位點選擇性方式導入。從而，本發明的目的是克服這種限制並允許用至少兩種不同的標記基團(例如，染料或其他功能分子)以連續的方式位點特異性標記報告分子，從而實現修飾中前所未有的通用性。
發明概述 本發明允許向報告分子中以連續方式位點特異性摻入兩種或多種不同的官能團。這可以通過在報告分子合成期間向其摻入至少兩種不同的手柄基團，其可以選擇性偶聯到包含不同官能團的反應配偶體。
從而，本發明的第一方面涉及產生包含至少兩種不同官能團的報告分子的方法，其中至少一個第一和至少一個第二手柄基團摻入到報告分子中，其中手柄基團選自炔基、經保護的炔基、疊氮基、醛基、經保護的醛基、肼基或者羥胺基，並且其中第一和第二手柄基團是不同的並且其中第一和第二手柄基團選擇性偶聯到包含第一和第二不同官能團的第一和第二反應配偶體。
本發明的另一方面涉及產生包含至少兩種不同官能團的報告分子的方法，其包括 (a)從多個結構單元合成報告分子，其中至少一個結構單元包含選自炔基、經保護的炔基、疊氮基、醛基、經保護的醛基、肼基或者羥胺基的第一手柄基團，其中至少一個結構單元包含選自炔基、經保護的炔基、疊氮基、醛基、經保護的醛基、肼基或者羥胺基的第二手柄基團，並且其中第一手柄基團不同於第二手柄基團； (b)在其中第一手柄基團是反應性並且第二手柄基團不是反應性的條件下將第一反應配偶體與第一手柄基團偶聯，其中第一反應配偶體包含第一官能團，並隨後 (c)將第二反應配偶體與第二手柄基團偶聯，其中第二反應配偶體包含第二官能團並且其中第一官能團不同於第二官能團。
本發明的另一方面涉及檢測樣品中的分析物的方法，其包括步驟 (a)提供樣品； (b)將樣品與報告分子接觸，該報告分子包含至少兩個不同的官能團，其中所述官能團通過包含1，2，3-三唑環的接頭基團結合至報告分子， (c)檢測報告分子與分析物的相互作用，其表明樣品中分析物的存在和/或量。
本發明的另一方面是報告分子，其包含至少兩種不同的官能團，其中所述官能團通過包含1，2，3-三唑環的接頭基團結合至報告分子。
本發明的另一方面是式(I)的化合物 C-S-N 其中C是經保護的炔基， S是間隔體或鍵，並且 N是核酸或核酸類似物結構單元，如核苷或核苷酸或非核苷化合物。
本發明的另一方面是式(II)的化合物 B-S-N3 其中B是生物素或生物素衍生物，如脫硫生物素或氨基生物素， S是間隔體或鍵，並且 N3是疊氮基。
本發明的另一方面是式(III)的化合物 Q-S-N 其中Q是淬滅基團， S是間隔體或鍵，並且 N是疊氮基。
此外，本發明涉及式(IV)的化合物 Z-S-N 其中Z是醛糖基，其中羥基用醯基和/或甲矽烷基保護，或者是經保護或未保護的1，2二醇基， S是間隔體或鍵，並且 N是核酸或核酸類似物結構單元，如核苷或核苷酸化合物。
此外，本發明涉及式(V)的化合物 D-S-N 其中D是紅外(IR)染料， S是間隔體或鍵，並且 N是疊氮基。
式(I)-(V)的化合物適於在用於檢測分析物，尤其如下文詳述的照相方法中用作試劑。
本發明允許有效產生包含兩種、三種或多種不同官能團的報告分子。這些報告分子允許高度靈敏地檢測生物樣品，如臨床樣品、環境樣品或農業樣品中的分析物，如核酸或核酸結合蛋白。優選的應用包括但不限於，檢測遺傳變異性，例如，單核苷酸多態性(SNP)、殺蟲劑或者藥物抗性、耐受性或者不耐性，基因分型，例如，檢測生物物種或者株系，檢測遺傳修飾的生物或者株系，或者檢測病原體或害蟲，和診斷疾病，例如，遺傳疾病、變應性疾病、自身免疫病或者感染性疾病。另一優選的應用是檢測樣品中的核酸用於商標保護，其中產品，如農產品、食品、或者有價值的商品和/或這些產品的包裝用產品特定信息編碼，例如，但不限於產地、生產日期、經銷商，等等，並且其中該信息用如上述的方法和試劑檢測。
優選實施方案詳述 本發明的第一方面涉及報告分子的生產。報告分子可以是任一類型的分子，其適於診斷應用並且其可以通過選擇性偶聯反應用至少兩個，例如，2、3、4或更多不同的官能團官能化。例如，報告分子可以是核酸分子、核酸類似物分子或者肽。優選地，從結構單元，例如，單體結構單元，如胺基酸、核苷酸或核苷酸類似物合成報告分子。合成可以涉及化學合成，例如，化學固相合成或者酶促合成，例如，通過引物延伸進行酶促核酸合成。優選地，報告分子包含至少4個、更優選至少6個，最優選至少10個結構單元。儘管可以使用具有幾百到多至數千個結構單元長度的報告分子，但是優選最多至300個結構單元。更優選地，長度為多至200，最優選多至100個結構單元。
官能團優選選自標記基團，如染料，尤其螢光染料、光敏基團、淬滅基團和附著基團。標記基團可以是直接標記基團，即產生可檢測信號的基團，或者間接標記基團，即通過不同的基團引起產生可檢測信號的基團。
在特別優選的實施方案中，標記基團是螢光染料，例如，藍色、紅色或者綠色螢光染料，如花青染料或者部花青染料。尤其優選IR染料。這些染料可以如實施例18中所述官能化為疊氮化物衍生物。
淬滅基團是能夠淬滅從螢光基團發出螢光的基團。淬滅基團可以選自已知的淬滅基團，例如，如參考文獻[12-16]中所述的分子信標(Molecular Beacon)報告分子中的淬滅基團。
附著基團是通過高親和力相互作用附著特定結合配偶體的基團。附著基團的特定實例是生物素和生物素衍生物，如脫硫生物素或氨基生物素，或者半抗原，例如，特別能夠與抗體相互作用的低分子量基團(例如，分子量≤2000)，如三硝基苯基或肽表位，如FLAG序列。
本發明包括不同官能團與報告分子的偶聯。不同的官能團優選包含至少一個標記基團。在特別優選的實施方案中，第一官能團是標記基團，第二官能團是淬滅基團或者附著基團。
當第一官能團是標記基團並且第二官能團是淬滅基團時，報告分子可以是分子信標(MB)。分子信標是單鏈雜交探針，例如，形成莖-環結構的核酸或核酸類似物探針。環可以含有與靶序列互補的探針序列，通過位於探針序列任一邊的互補的臂序列的退火形成莖。標記基團，例如，螢光團優選連接到臂的末端並且淬滅劑連接到另一臂。當分子信標在溶液中時游離的時候它們不發螢光。然而，當它們與含有靶序列的核酸鏈雜交時，它們經歷構象改變，其產生明亮的螢光。分子信標報告分子的長度優選為15-100並且更優選20-50個核苷酸或核苷酸類似物結構單元。
在另一實施方案中，第一和第二官能團是能夠進行螢光共振能量轉移(FRET)的標記基團。
本發明的方法涉及向報告分子摻入至少兩種不同類型的手柄基團，至少兩種不同類型的官能團可以偶聯到所述報告分子。根據本發明，手柄基團選自未保護或經保護的炔基、疊氮基、醛基、經保護的醛基、肼基或者羥胺基，並且其中第一和第二手柄基團是不同的。
在優選實施方案中，手柄基團選自炔基，其中第一手柄基團是未保護的炔基並且第二手柄基團可以是經保護的炔基或者其中第一手柄基團可以是第一經保護的炔基並且第二炔基可以是第二經保護的炔基，其中第一和第二保護基是不同的並且其中第一保護基可以從報告分子選擇性除去而不除去第二保護基。合適的保護基是例如如參考文獻[6]中所述的甲矽烷基，尤其是三(烷基/芳基)甲矽烷基，如三甲基甲矽烷基(TMS)、三乙基甲矽烷基(TES)、三異丙基甲矽烷基(TIPS)、三苯基甲矽烷基或叔丁基-二甲基甲矽烷基(TBDMS)。甲矽烷基保護基可以通過用酸和/或氟化物處理從炔基除去。小的甲矽烷基保護基如TMS是不穩定的並且可以在溫和條件下除去，而較大的甲矽烷基保護基如TBDMS或TIPS的去除需要更嚴格的條件。
本發明的方法包括第一反應配偶體與報告分子上的第一手柄基團的選擇性偶聯，該選擇性偶聯在第一手柄基團未保護並且從而能夠反應而第二手柄基團是不反應性的，例如，由於存在保護基的條件下進行。可以通過點擊反應使用疊氮基使炔基與反應配偶體偶聯，點擊反應即疊氮化物與炔基之間的(3+2)環加成，導致形成1，2，3-三唑環。點擊反應優選在銅離子存在下進行，例如，使用CuBr、三(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)和抗壞血酸鹽。
在另一優選實施方案中，手柄基團可以選自醛基，尤其選自含有不同類型保護基的經保護的醛基。醛基可以與肼(H2N-NH)基或羥胺基(NH2-O)反應得到腙(-C＝N-NH-)或肟(C＝N-O-)。通過用還原劑如NaBH4處理可以任選還原CN雙鍵。
優選的經保護醛基是乙縮醛或半縮醛基，其可以通過用酸，如有機或無機酸處理轉化為游離醛基。乙縮醛或半縮醛基的優選實例是用多元醇如丙二醇或乙二醇形成的乙縮醛基，或者糖或糖相關化合物如醛糖(如葡萄糖或半乳糖)中的半縮醛基。經保護的醛基的其他實例是亞氨基(例如，＝NH基)，其當用酸處理時產生醛基；硫縮醛或二硫縮醛基(例如，C(SR)2基團，其中R可以是烷基)，其當用汞鹽處理時得到醛基；肟基(例如，＝NOH基)，其當用酸處理時產生醛基；腙基(例如，＝N-NHR基，其中R可以是烷基)，其當用酸處理時產生醛基；和咪唑啉酮或咪唑烷基或苯並噻唑或二氫苯並噻唑基，其當例如用酸水解時產生醛。
特別優選的經保護的醛基是醛糖基，例如，環狀形式的丙糖、丁糖、戊糖或己糖，其中羥基被合適的保護基，尤其醯基或甲矽烷基保護。醯基保護基，例如，乙醯基、丁醯基、新戊醯基或其他脂肪族和/或芳香族羧酸保護基可以在鹼性條件下除去。通過用酸和/或氟化物處理可以除去甲矽烷基。在其他優選的實施方案中，經保護的醛基是經保護或不經保護的1，2二醇基，其可以與氧化劑如NaIO4反應產生游離醛基。
本發明也允許向報告分子中摻入兩個以上不同的手柄基團。在該情況中，第一手柄基團可以是未保護的基團炔基。第二手柄基團可以第一經保護的基團，例如，第一經保護的炔基，其可以在第一去保護條件下切除。第三手柄基團可以是第二經保護的基團，例如，第二經保護的炔基，其在導致第一經保護的基團去保護的第一去保護條件下是穩定的並且可以在與第一去保護條件不同的第二去保護條件下被切除。第一和第二去保護基團的特定實例是TMS和TIPS。TMS可以在溫和的酸性條件下，例如1％乙酸中被切除。TIPS在這些條件下是穩定的並且可以通過氟化物處理，例如用乙腈/DMF中的正叔丁基氟化銨(TBAF)處理而被切除。
報告分子的合成可以包括化學合成(例如，

圖17)或者酶促合成(例如，圖18)。優選地，合成是化學合成，例如，化學固相合成，其中通過在結合至固相時逐步裝配結構單元合成報告分子。第一反應配偶體和第二反應配偶體以及任選地其他反應配偶體的連續偶聯可以在化學合成方法期間在不同的步驟發生。例如，至少第一反應配偶體可以是偶聯的，同時報告分子結合至固相。在該情況下，可以發生第二反應配偶體和任選地其他反應配偶體的偶聯，同時報告分子也仍然結合至固相或者在報告分子從固相切割後發生所述偶聯。另一方面，在報告分子從固相切除後第一反應配偶體在溶液中偶聯也是可能的。在該情況下，其他反應配偶體的逐步去保護和偶聯也在溶液中發生。
本發明的另一方面涉及使用報告分子檢測樣品中分析物的方法，所述報告分子包含兩種不同的官能團，其中所述官能團通過包含1，2，3-三唑環的接頭基團結合至報告分子。這些接頭基團導致進行點擊反應，其涉及通過炔基和疊氮基之間的點擊反應將至少兩種不同的官能團偶聯到報告分子的主鏈。
檢測可以是定性檢測，例如，測定待分析的樣品中分析物，例如特定核酸序列的存在或不存在。然而，本發明也允許定量檢測分析物，例如，待分析的樣品中的核酸序列。定性和/或定量檢測可以包括根據本領域已知的方法測定標記基團。
待檢測的分析物優選選自核酸和結合核苷、核苷酸或核酸的分子，例如，結合核苷、核苷酸或核酸的蛋白質。更優選地，分析物是核酸，例如，可以根據已知的技術，尤其根據雜交技術檢測的任一類型的核酸。例如，核酸分析物可以選自DNA，例如，雙鏈或單鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交體。核酸分析物的具體實例是基因組DNA、mRNA或從其衍生的產物，例如，cDNA。此外，核酸分析物可以是DNA片段，其通過連接酶從許多、例如兩個子片段連接得到。
可以根據適於檢測樣品中分析物，尤其核酸分析物的任何已知的測試形式進行本發明的方法。例如，該方法可以涉及檢測固定在固體表面，如膜，例如，在Southern或Northern印跡、晶片、陣列或者如小珠的顆粒上的分析物。此外，可以在凝膠中，例如在電泳分離凝膠中的樣品中後，例如在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中進行檢測。該方法可以涉及檢測單一分析物或者平行地檢測多種分析物，例如，以晶片或微陣列形式進行檢測。
在優選實施方案中，檢測涉及在懷疑含有分析物的樣品和報告分子的存在下，照射光敏介質，所述報告分子包含光敏劑標記基團，例如，螢光基團，其能夠實現能量向光敏介質的轉移，其中在該介質中可以形成標記物基團。優選地，使用報告分子，其中不存在分析物時，光敏基團被淬滅。存在分析物時，光敏基團的淬滅被減小或消除。
由於高度靈敏性，本發明的方法適於不用擴增而直接檢測分析物。根據本發明，甚至在不擴增的情況下測定微量的分析物，例如核酸，例如，0.1ng或更低，優選0.01ng或更低，更優選1pg或更低，甚至更優選0.1pg或更低，甚至更優選0.01pg或更低，最優選0.001pg或更低。通過向報告分子摻入多個標記基團可以得到特別高的靈敏度。例如，通過組合Southern印跡和本發明方法可以進行生物樣品中分析物，如基因的檢測。然而，應該注意到，本發明的方法也允許與擴增步驟組合檢測核酸，擴增步驟可以根據已知的方案如PCR或其修飾方案，如不對稱PCR、實時PCR、逆轉錄PCR等等或者其他擴增方案如LCR進行。
在本發明的優選實施方案中，進行分析物的序列特異性檢測，其中例如，具有特定序列的核酸與樣品中的其他核酸序列區分或者能夠結合特定核酸序列的多肽與樣品中的其他多肽區分。此類序列特異性檢測優選包括序列特異性雜交反應，通過該反應，待檢測的核酸序列與攜帶標記物基團或標記物前體基團的化合物結合。然而，應該注意到，本發明也允許序列非特異性檢測核酸，例如，檢測樣品中存在的任何核酸。
手柄基團連接到適於合成報告分子的結構單元。優選地，手柄基團連接到，核鹼基可以選自天然的和非天然的嘌呤和嘧啶鹼基。優選地，核鹼基選自胞苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、7-脫氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、次黃苷和黃嘌呤。手柄基團優選連接到嘧啶核鹼基的5或6位，優選5位，或者連接到嘌呤核鹼基的7或8位，優選7位，尤其如果希望酶促摻入到核酸的情況下。
備選地，手柄基團也連接到核苷酸結構單元的磷酸或糖基。
此外，本發明也允許攜帶手柄基團的非核苷結構單元摻入到報告分子。優選具有通式(V)的非核苷結構單元
其中 A是經保護或未保護的炔基， S1和S2在每種情況下獨立地為非核苷基團，例如，間隔體或鍵，並且例如S1是如下定義的間隔體並且S2是共價鍵， P是磷酸或磷酸類似物基團，例如，亞磷醯胺基團， R是用於核酸合成的偶聯基團，例如，二甲氧基三苯甲基(DMT)基團。
手柄基團可以共價連接到結構單元，例如通過直接的鍵或者間隔體，例如具有多至20個原子的鏈長的間隔體連接到結構單元。間隔體可以是柔性間隔體，例如，基於亞烷基的間隔體，任選含有雜原子，如O、S和/或N或者至少部分剛性間隔體，例如，包含至少一個剛性基團的間隔體，其選自烯基、炔基、環狀基團，尤其芳族或雜芳族基團，並且環脂肪族基團和其組合。如果結構單元化合物包含炔或疊氮化物，那麼優選通過直接的鍵、柔性間隔體或部分剛性間隔體進行官能團的附著，其中柔性間隔體可以例如具有多至6個原子、更尤其多至4個原子的鏈長，並且其中部分剛性間隔體優選具有多至20個原子，例如，多至10個原子的鏈長並且包含如上文定義的至少一個剛性基團，尤其是炔基，和至少一個柔性基團，例如，亞烷基。如果另一方面，手柄基團是醛基或經保護的醛基或醛基前體基團，那麼通過如上文定義的部分剛性間隔體或者具有2到10個原子鏈長的至少部分剛性間隔體連接是優選的。含有剛性基團的間隔體，例如部分剛性間隔體的結構是優選的，使得剛性基團直接連接到核鹼基。
根據本發明的術語「核苷酸」特別涉及核糖核苷酸、2』-脫氧核糖核苷酸或2』，3』-二脫氧核糖核苷酸。核苷酸類似物可以選自糖或骨架修飾的核苷酸，尤其可以是酶促摻入核酸的核苷酸類似物。在優選的糖修飾的核苷酸中，核糖糖的2』-OH或H基被選自OR、R、滷素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團取代，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基並且滷素是F、Cl、Br或I。核糖自身可以被其他碳環或雜環5或6元基團如環戊烷或環己烷基團取代。在優選的骨架修飾的核苷酸中，磷酸(三)酯基團可以被修飾基團，例如，被硫代磷酸基團或者H-膦酸基團取代。進一步優選的核苷酸類似物包括用於合成核酸類似物如嗎啉代核酸、肽核酸或鎖核酸(locked nucleic acid)的結構單元。
官能化的核酸可以是寡核苷酸，例如，具有多至30個核苷酸(或核苷酸類似物)結構單元長度的核酸，或者具有或大於30個核苷酸(或核苷酸類似物)結構單元長度的多核苷酸。優選地，核酸和核酸類似物能夠特異結合分析物，例如能夠在測定條件下與核酸分析物雜交。最小長度優選為12並且更優選為14個核苷酸(或核苷酸類似物)結構單元。
通過用於化學合成的標準技術和/或通過酶促摻入可以向核酸中摻入結合至核酸或核酸類似物結構單元的手柄基團。例如，在標準合成方案中使用經修飾的核苷亞磷醯胺作為結構單元，通過標準亞磷醯胺化學可以進行化學合成。用於化學合成的其他類型的優選結構單元包括H-膦酸或磷酸三酯修飾的核苷。
另一方面，通過酶促方法可以向核酸中摻入經修飾的核苷酸。令人驚奇地，發現手柄修飾的核苷三磷酸被核酸合成酶接受為酶底物，所述酶為諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶或端粒酶。例如，發現經修飾的核苷三磷酸被常用於引物延伸和擴增方案的DNA聚合酶接受，所述DNA聚合酶為諸如熱穩定的DNA聚合酶，如Taq聚合酶、Vent聚合酶、Pfx聚合酶、Pwo聚合酶或Therminator聚合酶。酶接受經修飾的三磷酸酯而不喪失保真性並且允許基於模板摻入核酸，如DNA和RNA。
本發明的方法提供了分析物檢測的多種實施方案。例如，可以提供酶促摻入核酸分子中的經修飾的核酸結構單元，例如，核苷酸或核苷酸類似物，以及合適的酶。在本發明中，可以使用多種不同類型的官能化核苷酸。
通過任何已知的核酸檢測方案，例如，涉及使用固相支持體的方案進行本發明的檢測方法。例如，可以提供固相支持體，例如，晶片或陣列或如小珠的顆粒物質，能夠與待檢測的分析物雜交的捕獲探針與所述固相支持體結合。可以如下檢測固相結合的核酸分析物使用官能化的雜交探針，其作為捕獲探針與核酸分析物在不同序列部分中雜交，並隨後例如用金屬化試劑檢測結合的雜交探針。該方法尤其適於農業和臨床領域中的診斷應用，例如用於檢測來自植物，例如，遺傳經修飾的植物的DNA和/或mRNA，來自病原體或植物害蟲等的DNA，或者用於商標保護。
在特定實施方案中，檢測可以涉及將分析物與包含光敏基團的報告分子的聯合產物與光敏介質接觸，例如，通過點樣、移液等等轉移樣品或樣品等分試樣，其中聯合產物可以存在於光敏介質上。照射時，實現能量從光敏基團向光敏介質的轉移，使得在光敏基團存在下而不是缺失時，在光敏介質中形成標記物基團如金屬，如銀核。如果必要，標記物基團可以根據照相技術進行顯影步驟，例如，化學或光化學顯影步驟。光敏介質可以是能夠形成標記物基團，如金屬核的任何固相支持體或任何受支持的材料。
優選地，光敏介質是光敏感介質，如光敏紙或者支持材料上的光敏乳劑或凝膠劑。更優選地，光敏介質是照相介質，如曬像紙。在例如照射光的波長和/或強度的條件下進行照射，在所述條件下在光敏基團存在下發生選擇性標記物基團形成。優選地，取決於介質的靈敏性，用紅外線和/或用長波可見光進行照射。對於可見光，照射波長可以為例如500nm或更高，520nm或更高，540nm或更高，560nm或更高，580nm或更高，或對於紅外線，照射波長可以為700nm到10μm。
本發明的方法包括檢測標記基團。標記基團可以優選選自形成金屬沉積物的基團(例如，醛官能化基團)，螢光或形成螢光的基團，或者氧化還原活性基團。
金屬沉積物的形成需要用金屬化試劑處理醛基，所述金屬化試劑為例如包含選自Ag、Au、Bi、Cu、Pd或Pt的金屬原子和/或離子的試劑，所述金屬原子和/或離子可以例如通過還原選擇性沉積在醛基周圍。優選地，金屬化試劑包含Ag+鹽，如Ag-銨絡合物，即Tollens試劑。金屬化試劑的進一步優選的實例是Cu(NO3)/I2、鉑三聯吡啶絡合物，如[Pt(三聯吡啶)Cl]Cl、Pd(OAc)2或KAuCl4。
可以根據已知的方法進行標記物基團的檢測。例如，通過光學方法和/或電學方法可以定性和/或定量測定金屬沉積物。在優選實施方案中，通過測量電學參數，例如，電導率來測定固相表面上的金屬沉積物。通過已知的螢光測量方法，例如，通過合適的光源如雷射激發並檢測發生的螢光來定性和/或定量測定螢光標記物基團。
在另一實施方案中，本發明包括檢測在光敏基團存在下在光敏介質中位點特異性形成的標記物基團。光敏基團優選選自螢光或發光基團。光敏介質包含這樣的基團，其當在光敏基團存在下照射時形成可檢測的標記物基團，如金屬核，所述標記物基團可以根據標準照相技術，如通過化學或光化學顯影技術進行顯影。
此外，本發明涉及核酸或核酸類似物結構單元與經保護的炔基任選通過如式(I)所示的分子連接的綴合物。優選地，間隔體具有3-10個原子的鏈長。此外，優選間隔體包含內部剛性基團，例如，炔基。經保護的炔基優選為如上述的甲矽烷基保護的炔基。
此外，本發明涉及生物素或生物素衍生物如脫硫生物素或氨基生物素與疊氮基任選通過如式(II)所示的間隔體連接的綴合物。間隔體優選具有1-10個原子的鏈長。
此外，本發明涉及淬滅劑基團與核酸或核酸類似物結構單元任選通過如式(III)所示間隔體連接的綴合物。間隔體優選具有3-10個原子的鏈長並且可以包含內部剛性基團，如炔基。
此外，本發明涉及經保護的醛糖基或者經保護的或未保護的1，2二醇基與核酸或核酸類似物結構單元任選通過如式(IV)所示間隔體連接的綴合物，所述醛糖基中醛糖的羥基優選用醯基和/或甲矽烷基保護。醯基或甲矽烷基保護基優選如上述。
間隔體優選具有3-10個原子的鏈長並且優選包含剛性基團，例如，炔基。
本發明還涉及式(I)、式(II)、式(III)以及式(IV)的化合物。這些化合物尤其可用於標記核酸，尤其是DNA或RNA。使用這些化合物，一個、優選至少兩個官能團與分子的連接是可能的。化合物尤其可用於DNA純化，例如，使用生物素標記，用於DNA-微陣列，用於DNA-晶片，用於實時PCR以及用於RNAi實驗和用於定位細胞中的DNA。
通過下面的實施例和附圖進一步描述本發明。
附圖簡述 圖1用於DNA的合成後標記的經修飾的脫氧核糖核苷酸。
圖2通過點擊化學的DNA官能化。
圖3通過順序點擊反應的DNA官能化。
圖4合成炔官能化的2』-脫氧尿苷三磷酸和亞磷醯胺。
圖5合成炔官能化的2』-脫氧胞苷三磷酸和兩種亞磷醯胺。
圖6合成炔官能化的2』-脫氧鳥苷三磷酸。
圖7PAGE凝膠電泳(Vent exo-，0.5mM Mg2+，50mM TMAC)。泳道1100bp DNA序列梯，泳道2天然的289bp片段，泳道3與2相同，所有胸苷都是經修飾的，泳道4所有胸苷和胞苷都是經修飾的。
圖8對DNA的點擊反應。
圖9反應順序，產生共價連接到兩個不同分子(R1-R2)的寡核苷酸。
圖10糖修飾的核苷酸結構單元。
圖11合成環狀二醇官能化的尿苷三磷酸和亞磷醯胺。
圖12醛的NaIO4-去保護。
圖13炔修飾的胸苷和胞苷結構單元。
圖14疊氮化物結構單元。苄基疊氮35、香豆素疊氮36、生物素疊氮37、蒽醌疊氮38、半乳糖疊氮39、dabcyl疊氮40、芘疊氮41、螢光素疊氮42、TAMRA疊氮43、Cy3疊氮44。
圖15用dabcyl疊氮40和香豆素疊氮36修飾的寡核苷酸ODN-3的初步HPLC跡線(260nm)(表2，條目10)和MALDI譜(插圖)。
圖16非核苷DNA修飾劑13和14。
圖17固相合成後通過順序點擊反應進行核酸官能化的圖示。
圖18PCR後通過順序點擊反應進行核酸官能化的圖示。
實施例 1.合成經修飾的核苷酸結構單元 可以以短而有效的反應順序實現合成如圖1中所示的作為三磷酸和作為亞磷醯胺的核苷酸結構單元1-5。根據標準方案可以在標準固相化學中使用這些亞磷醯胺進行DNA合成，只是對於經修飾的結構單元偶聯時間延長。通過PCR摻入三磷酸在實施例6中描述。這些結構單元可以用於通過如圖2所示的點擊化學官能化報告分子，尤其DNA分子。如圖3所示，可以通過順序點擊反應摻入不同的官能團。
2.合成攜帶炔手柄基團的2』-脫氧尿苷衍生物 炔官能化的2』-脫氧尿苷衍生物的合成在圖4中圖示。它用可商購的5-2』-脫氧碘代尿苷6開始。通過標準的保護-Sonogashira-去保護順序，使用1-三甲基甲矽烷基-1，7-辛二烯在Sonogashira交叉偶聯中導入容易官能化的接頭，可以得到游離的、官能化的核苷8。使用標準方法可以得到亞磷醯胺9。通過Yoshikawa的磷酸化方法可以製備三磷酸10[7]。
3.合成攜帶炔或甲矽烷基保護的炔手柄基團的2』-脫氧胞苷衍生物 通過對未保護的和可商購的5-碘代-2』-脫氧胞苷進行Sonogashira交叉偶聯可以製備容易官能化的、游離的核苷12。用銨處理可以除去TMS基團。以逐步方式製備N4-苯甲醯基保護的亞磷醯胺13。通過兩步LudwigEckstein方法[8]製備三磷酸14。在Sonogashira交叉偶聯後，通過簡單地省略TMS去保護步驟得到帶有TMS保護的炔的亞磷醯胺16。反應方案在圖5中顯示。通過類似方法，可以得到攜帶TIPS保護的炔基的亞磷醯胺。
4.合成攜帶炔手柄基團的2』-脫氧鳥苷衍生物 17的合成按照Froehler等人的合成方法[9]。Sonogashira交叉偶聯、總體去保護和Yoshikawa方法的磷酸化[7]的標準反應順序得到三磷酸18。反應方案在圖6中顯示。
5.合成攜帶炔手柄基團的2』-脫氧腺苷衍生物 經修飾的2』-脫氧腺苷衍生物4的合成與脫氧鳥苷衍生物的合成非常類似。它非常類似於Froehler等人的工作[9]。類似於鳥苷合成，成功地進行了Sonogashira交叉偶聯。最後的步驟類似於對衍生物18所述的。
6.通過PCR摻入核苷三磷酸 通過引物延伸進行結構單元1和2向289mer DNA鏈的同時摻入。對於2的三磷酸實現了最佳的摻入效率。使用的聚合酶是來自B族的Vent exo-和Pwo。在高密度修飾的情況下，添加劑(DMSO、甲醯胺、TMAC、甜菜鹼)的加入變得必須。通過PAGE凝膠電泳可以顯示不同水平的炔修飾。圖7中的泳道2-4顯示了炔向DNA中增加摻入的效果。所觀察到的偏移是由於DNA鏈的分子量的提高。
7.合成後官能化 如引言中概述的，合成後標記策略的主要優點是可能向DNA中引入不穩定的或反應性的部分。待附著到DNA的分子僅僅必須攜帶疊氮化物以便用於點擊反應中。該方法是高度模塊化的並且因此可以被改變而不需要精心合成。
點擊反應已經成功地用於在高密度水平官能化DNA。接頭具有足夠柔性以允許甚至通過點擊反應摻入六個連續的修飾，如在一行中帶有六個炔修飾的鹼基的短寡核苷酸修飾中所示。反應在水和氧的存在下進行並且不需要任何複雜的設備。Cu(I)是活性催化物並且可以通過配體穩定化。反應方案在圖8中顯示。
8.逐步官能化的策略 8.1一般考慮 使用上述方法可以製備用於合成後修飾的含有兩個接頭的DNA。通過PCR製備的DNA不連接到樹脂並且在核鹼基上不含有任何保護基並且可以以如圖9中所示的直接方式官能化。
未保護的炔可以用R1-N3進行點擊反應。TMS保護的炔在測試反應中顯示出對標準點擊反應條件的足夠穩定性。TMS-炔基可以用TBAF去保護，從而釋放游離炔。另一疊氮化物R2-N3然後可以在第二點擊反應中連接到DNA。
通過固相亞磷醯胺化學製備的DNA附著到樹脂並且在核鹼基上攜帶鹼基不穩定的保護基。使用H2O/MeOH中的氨可以將TMS-炔基去保護。然而，15中甲矽烷基的製備使用的去保護(圖5)需要2-4天才完成。該顯著的穩定性可以用於從樹脂選擇性切除DNA和/或去保護核鹼基而不用去保護大量的經修飾的炔，例如，TMS-炔。原則上，有三種方法可以處理該問題，其將在下文中提出。
8.2特定方案 例如，使用Expedite DNA合成儀(Applied Biosystems)或在Amersham Biosciences的

Oligopilot上，通過DMT-和β-(氰乙基)亞磷醯胺方法在CPG支持體(500

)上製備寡核苷酸(ODN)。為偶聯經修飾的鹼基，使用雙偶聯方案(每個10當量)並且將偶聯時間延長到10分鐘。作為活化劑，苯甲基硫代四唑(BTT)得到最佳的偶聯產率。自動化合成後，通過在25℃下浸入濃氨水/乙醇溶液(3∶1)中24小時從固相支持體切除ODN。在SpeedVac中除去氨水，並通過RP-HPLC純化粗ODN。UV/Vis光譜和MALDI-TOF質譜法用於表徵ODN。
9.樹脂上的點擊化學 9.1一般考慮 可以在樹脂上進行點擊化學[10]。在第一官能團R1附著到DNA時，使用氨可以在延長的時間內一步實現TMS-基團(核鹼基保護基)的總體去保護和樹脂的切除。此時，通過標準點擊反應可以引入第二官能團R2。在該方法中，R1必須是鹼基穩定的分子。
9.2特定方案 例如，DNA合成後在高真空下乾燥CPG樹脂上的約0.02μmol的DNA並將其與20μL苄基疊氮35一起置於1.5mL瓶中。在單獨的瓶中，將40μL CuBr溶液(DMSO/t BuOH 3∶1中10mM)，10μL抗壞血酸鈉(水中100mM)和80μL配體溶液(DMSO/tBuOH 3∶1中10mM)進行渦旋並加入到DNA中。將反應瓶輕輕旋轉過夜，離心並且小心取出並丟棄溶液。通過加入溶劑(2×DMSO，2×H2O，2×乙醇)、渦旋、離心並丟棄該溶液反覆洗滌樹脂。隨後如上述將DNA去保護。
10.第一點擊反應前的總體DNA去保護 在第一點擊反應前(氨，12h)可以對DNA核鹼基去保護並從樹脂切除所述鏈。TMS-炔對去保護條件的穩定性應該足夠高以使其多數保持完整形式。必須進行HPLC純化以除去含有去保護的TMS-炔位點的DNA。從這點向前，可以使用圖9概述的合成。
11.從樹脂單獨切除 11.1一般考慮 從樹脂切除DNA後，也可以不去除保護基而在溶液中進行點擊化學反應。
DNA與樹脂的連接在鹼性條件下的穩定性低於核鹼基保護基的穩定性。從而，可以通過用氨處理30分鐘從樹脂切除DNA。該處理後，將核鹼基部分去保護，TMS-炔基應該保持幾乎定量。必須將該複雜混合物進行點擊反應，引入R1。此時，可以在長時間內用氨處理DNA，導致核鹼基和TMS-炔的總體去保護。該步驟釋放第二點擊位點，其可以與R2-N3反應。
11.2具體方案 將DNA(0.38μM，200μL)和疊氮化物(10mM，114μL)置於1.5mL瓶中。在第二個瓶中，對17μL CuBr溶液(DMSO/t BuOH 3∶1中100mM)和34μL配體溶液(DMSO/tBuOH 3∶1中100mM)進行渦旋並加入DNA中。將該溶液在25℃搖動4h並在SpeedVac中蒸發至接近乾燥。加入乙酸鈉溶液(0.3M，100μL)並將懸浮液靜置1h，偶爾渦旋。加入1mL乙醇，將瓶子渦旋並置於冰箱(-20℃)中過夜。離心(13000rpm 15分鐘)後，從DNA沉澱小心地去除上清液。加入70％乙醇(-20℃)，渦旋小瓶，離心並除去上清液。重複該洗滌步驟兩次。最後一次洗滌步驟後，將沉澱物風乾並優選用水或緩衝液吸收。
11.3TIPS-炔基的去保護 將凍幹的DNA溶於無水乙腈(400μL)和無水DMF(100μL)中。加入兩滴TBAF(THF中1.0M)並將溶液在45℃搖動2h。用MeOTMS(10μL)淬滅過量的氟離子。如果將對DNA鏈進行額外的點擊反應，那麼應該如下將有機溶劑交換成水在SpeedVac中蒸發反應液至接近乾燥，加入水(1mL)，冷凍溶液，凍幹，並用適量水吸收。
12.糖修飾的結構單元的合成 已經成功地將三磷酸22-26摻入DNA中。也已經合成了23的對應的亞磷醯胺並將其摻入DNA中。化合物26中的乙醯基保護的糖引起在聚丙烯醯胺凝膠中經修飾的DNA的有效染色，因為保護基在Tollens處理條件下被切除。丙酮化合物保護的糖24和25需要在酸性條件下去保護。初步實驗表明乙縮醛保護基的切割是可行的，不引起DNA的脫嘌呤作用。
在下文中，詳細給出了環狀二醇修飾的核苷酸的示例性合成。
用環狀二醇修飾的尿苷三磷酸31的合成用已知的化合物27開始[11]。關鍵步驟是吡咯啉雙鍵的Sharpless鄰位二羥基化。根據已知的方法，從中間體30可以合成亞磷醯胺32。
13.通過PCR摻入核苷三磷酸 通過PCR可以向DNA中摻入所有五種給出的核苷酸。核苷酸26甚至摻入到2000bp鏈中。迄今用核苷酸26得到的結果開啟了任何目的基因的有效銀染的方法。原則上，應該可能合成用末端二醇修飾的胞苷從而實現DNA中每個鹼基對的醛官能化。
通過酶促合成(例如PCR)摻入三磷酸並且三元點擊反應在圖18中示例。使用的優選的聚合酶是來自B族的Vent exo-和Pwo。在高密度修飾的情況下，添加劑(DMSO、甲醯胺、TMAC和/或甜菜鹼)的加入是優選的。通過PAGE凝膠電泳可以顯示不同水平的炔修飾。
14.合成後官能化 如具有二醇修飾的尿嘧啶的DNA鏈的化學修飾所示，可以在溫和條件下用NaIO4處理所得鏈，得到二醇部分的溫和切割，而無任何可觀察到的副反應。通過MALDI，以及通過用二硝基苯肼的清潔偶聯反應(clean coupling reaction)，可以表徵帶有醛的鏈。已經進行了長的二醇修飾的DNA鏈的切割，並且消化研究已經表明切割與短寡核苷酸中一樣有效地進行。在帶有醛的DNA與含有肼的染料的偶聯中已經得到了初步結果，證明了高碘酸切割的有效性。
對於含糖DNA鏈的情況，消化實驗也表明向DNA的有效摻入。對於乙醯基保護的糖已經顯示了有效銀染。
也提出了新的二醇修飾的核苷酸以及新的糖修飾的核苷酸向DNA的直接摻入。這些三磷酸向DNA的直接摻入及其後接著進行溫和的合成後去保護極大地簡化了我們的研究組中開發的銀染方法。與「點擊-點擊」化學組合，通過高碘酸鹽切割對我們的經修飾的DNA的選擇性醛修飾可以用於開發新的三元標記策略。
15.生物素疊氮的合成 活性酯與1-氨基-3-疊氮基丙烷反應形成生物素疊氮。

16.用點擊化學進行單、雙和三DNA修飾 16.1導入兩種不同的標記 16.1.1樹脂上的雙點擊反應 第一種方法涉及為第一點擊反應引入一個自由炔和用弱酸在樹脂上去保護後為第二點擊方法引入第二個TMS保護的炔。為了測試樹脂上點擊反應的可行性，我們製備了含有一個自由炔的測試鏈33並直接在樹脂上進行點擊反應，接著DNA去保護。官能化DNA鏈與相同系列的未處理的DNA鏈的HPLC跡線(trace)的比較顯示了幾乎定量轉化，表明點擊反應在用於DNA合成的可控孔度玻璃支持體上高效率地進行(數據未顯示)。
為了引入兩種標記，我們使用標準亞磷醯胺化學向寡核苷酸如ODN-1或ODN-2(表1)中摻入了胸苷和胞苷結構單元33和34a。兩種亞磷醯胺的偶聯產率是優秀的。在固相支持體上完全裝配寡核苷酸後，乾燥樹脂並通過用CuBr、TBTA配體、抗壞血酸鈉和苄基疊氮35的溶液搖動樹脂進行第二點擊反應。用1％乙酸洗滌並衝洗樹脂以切割第二個炔上的TMS保護基。最後，使用dabcyl疊氮40與第一點擊反應類似地再次進行第二點擊反應。最後從樹脂切除DNA並通過將樹脂暴露於氨(H2O/EtOH 3∶1)除去所有保護基。發現所得的原始-MALDI譜與預期的雙修飾寡核苷酸完全一致(表2，條目1)，表明可以在固相支持體上直接向DNA中引入穩定的標記。
16.1.2樹脂上的單點擊反應和組合切割/去保護 在一些情況下，優選在溶液中進行第二點擊反應。用溶於水/乙醇的濃NH3處理單修飾的ODN-2(表1)從樹脂切除了DNA。在這些條件下，也除去了鹼基保護基和保護醛的TMS基團。所得的粗DNA帶有一個clicked-on修飾和一個自由炔，將該DNA在溶液(CuBr，TBTA配體，疊氮化物)中進行第二點擊反應，以優良的產率和純度得到雙修飾的DNA(表2，條目2)。
16.1.3溶液中的雙點擊反應 用帶有兩個炔的結構單元33和34b容易得到用兩種鹼基和親核試劑敏感性分子修飾的寡核苷酸。使用標準固相亞磷醯胺化學方法將它們都摻入ODN-3(表1)中。脫保護並從樹脂切除寡核苷酸後，進行第一點擊反應(使用上述溶液條件)，產生單修飾的寡核苷酸，具有平均＞90％的高產率。在第二步中，我們用溶於乙腈/DMF(4∶1 v/v)中的TBAF溶液切割TIPS保護基，對帶有一個標記的DNA鏈不引起任何損害。溶液中的第二點擊反應在三步驟方法中以通常60-90％到優良產率產生雙修飾的寡核苷酸。
為了研究雙點擊修飾的寬應用性，我們用整個系列的不同標記進行雙點擊，並且發現了對DNA的優良化學方法產率(表2，條目3-15)。值得一提的是各點擊反應和去保護步驟如此乾淨使得在每個反應步驟後簡單的乙醇沉澱就足夠純化。圖15顯示了典型的原始HPLC層析圖和ODN-3的雙修飾後得到的MALDI分析(插圖)。對於非常靈敏的應用，推薦一次最終的HPLC純化。在罕見情況下，如對於Cy3疊氮44，我們發現接頭在很小程度上被切割。
16.2引入三種不同的標記 使用點擊反應及其後通過乙醇沉澱，也可能用三種不同的標記修飾寡核苷酸。為此，我們向寡核苷酸如ODN-4中引入了三種結構單元33、34a和34b(表1)。直接在樹脂上進行第一點擊反應。隨後在TMS基團的相伴切割下從支持體切除單修飾的寡核苷酸並通過HPLC純化。在溶液中以高產率進行第二點擊反應。乙醇沉澱雙修飾的寡核苷酸，用TBAF切割TIPS基團並隨後在溶液中進行第三點擊反應提供了所希望的三重修飾的寡核苷酸，在最終的乙醇沉澱後產率為約50％(表2，條目16和17)。
16.3在非核苷酸結構單元上引入手柄基團 儘管非常希望在一些鹼基(這裡為dC和dT)上直接標記寡核苷酸，但是經常需要在核鹼基外，例如在磷酸或糖上引入標記。為了允許容易引入標記，我們製備了帶有炔的非核苷DNA修飾劑37和38(圖16)。在DNA中使用這些結構單元的點擊反應一樣有效。
16.4結論 總之，我們報導了DNA的高效的、模塊化的和穩健的多官能化方案。該方法的效率是基於三個特徵1.在DNA去保護中的氨處理期間定量去除了TMS保護的炔。2.在該氨處理期間定量保留了TIPS保護的炔。3.可以有效而溫和地實現TIPS保護的炔的切除。帶有經保護的炔的三磷酸的合成允許我們以逐步的方式標記PCR片段。該方法極大地擴寬了我們對於分子生物學診斷和納米技術應用所需的操作DNA的能力。此外，多個經修飾的DNA鏈的文庫的組合合成得到新的適體。
表1.用於該研究中的ODN[a]
[a]X＝基於1的DNA核苷酸，Y＝基於34a的DNA核苷酸，Z＝基於34b的DNA核苷酸。
表2.ODN 1-4的合成後標記
[a]最後一次點擊反應後通過260nm處初步HPLC的積分確定，[b]從樹脂切割後無HPLC純化。因此，產率包括來自DNA合成的雜質，[c]樹脂上點擊後HPLC純化。*在樹脂上進行的點擊反應。
17.用於DNA(和RNA)中三元點擊反應的結構單元 核糖核苷酸的合成遵循脫氧核糖系列的相同方法。所有炔可以作為自由炔、作為TMS保護的炔或者作為TIPS保護的炔產生。這得到了12種脫氧核糖核苷酸-亞磷醯胺和12中脫氧核糖核苷酸-三磷酸(每種核鹼基3種不同的炔)和其他24種核糖核苷酸系列。此外，也可以得到6種末端炔亞磷醯胺。

方案1用於DNA的合成後標記的經修飾的脫氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)和末端炔。
核苷酸結構單元作為三磷酸和作為亞磷醯胺的合成可以在短的和有效的反應順序中實現。在下面報告這些合成的一些實例。
帶有末端炔的尿苷衍生物的合成
方案2合成炔官能化的尿苷三磷酸和亞磷醯胺 炔官能化的尿苷衍生物的合成用可商購的5-碘代尿苷7開始。通過標準的保護-Sonogashira-去保護順序，使用1-三甲基甲矽烷基-1，7-辛二炔在Sonogashira交叉偶聯中導入容易官能化的接頭可以得到官能化的核苷9。使用標準方法可以得到亞磷醯胺10。通過Yoshikawa的磷酸化方法可以製備三磷酸11。
合成帶有末端炔和甲矽烷基保護的炔的胞苷衍生物
方案3合成炔官能化的胞苷三磷酸和兩種亞磷醯胺 通過對未保護的和可商購的5-碘代胞苷進行Sonogashira交叉偶聯可以製備容易官能化的游離的核苷13。通過用氨處理可以除去TMS基團。以逐步的方式製備N4-苯甲醯基保護的亞磷醯胺14。通過兩步Ludwig-Eckstein方法製備三磷酸15。在Sonogashira1交叉偶聯後通過簡單地省略TMS去保護步驟得到帶有TMS保護的炔的亞磷醯胺17。
合成帶有末端炔的鳥苷和腺苷衍生物
方案4合成炔官能化的鳥苷和腺苷三磷酸 18的合成按照Froehler等人的合成方法。Sonogashira交叉偶聯、總體去保護和Yoshikawa方法的磷酸化的標準反應順序產生了三磷酸19。經修飾的腺苷衍生物4的合成與鳥苷衍生物的合成非常類似並且仍然在發展中。其非常類似於Froehler等人的工作。已經類似於鳥苷合成成功地進行了Sonogashira交叉偶聯。最終的步驟類似於為鳥苷衍生物19所述的。
在標準固相化學中使用這些經修飾的亞磷醯胺的DNA(或RNA)合成是直接的，只是對於經修飾的結構單元延長了偶聯時間。
使用三種不同的炔以便實現三元點擊反應一種游離的炔，一種TMS保護的炔和一種TIPS保護的炔。第一點擊反應仍然在樹脂存在下進行(用於自動化合成的固相支持體)。從樹脂的標準DNA(或RNA)切除後(其也除去了TMS基團)，使用標準點擊方案實現了第二點擊反應。對TIPS基團的最後的TBAF(四丁基氟化銨)去保護後，進行第三次點擊反應(方案4)。
18.作為疊氮化物修飾商業IR-染料的實例 IR-染料可以容易地轉化為它們的疊氮化物衍生物。下面的方案顯示了來自許多其他可能的合成中的兩種不同的合成路徑。
在第一次情況下，接頭通過Sonogashira偶聯附著到該染料。
下面的甲磺酸化和疊氮化產生了可用於DNA中的點擊反應的疊氮化物。

在第二次合成中，直接在染料核心上產生疊氮化物(方案2)。

IR染料疊氮化物可以用於DNA照相中作為被設計和開發用於通過紅外線感光的相紙的光敏劑。此類紙可以在正常光條件下處理，消除了對暗室的限制。
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權利要求
1.產生包含至少兩種不同官能團的報告分子的方法，其中至少一個第一和至少一個第二手柄基團摻入到報告分子中，其中手柄基團選自炔基、經保護的炔基、疊氮基、醛基、經保護的醛基、肼基或者羥胺基，並且其中第一和第二手柄基團是不同的並且其中第一和第二手柄基團選擇性偶聯到包含不同的第一和第二官能團的第一和第二反應配偶體。
2.產生包含至少兩種不同官能團的報告分子的方法，其包括
(a)從多個結構單元合成報告分子，其中至少一個結構單元包含選自炔基、經保護的炔基、疊氮基、醛基、經保護的醛基、肼基或者羥胺基的第一手柄基團，其中至少一個結構單元包含選自炔基、經保護的炔基、疊氮基、醛基、經保護的醛基、肼基或者羥胺基的第二手柄基團，並且其中第一手柄基團不同於第二手柄基團；
(b)在其中第一手柄基團是反應性並且第二手柄基團不是反應性的條件下將第一種反應配偶體與第一手柄基團偶聯，其中第一反應配偶體包含第一官能團，並隨後
(c)將第二反應配偶體與第二手柄基團偶聯，其中第二反應配偶體包含第二官能團並且其中第一官能團不同於第二官能團。
3.權利要求1或2的方法，其中所述報告分子選自肽、核酸和核酸類似物。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述報告分子包含多至2000，優選4-200，更優選10-100個結構單元。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述官能團選自標記基團，如染料、淬滅基團和附著基團，如生物素、生物素衍生物和半抗原。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中第一和第二官能團是標記基團和淬滅基團或者其中第一和第二官能團是標記基團和附著基團。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中手柄基團選自炔基和經保護的炔基。
8.權利要求7的方法，其中包含疊氮基的反應配偶體通過點擊反應偶聯到炔基。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中第一和第二手柄基團是炔基和經保護的炔基或者其中第一和第二手柄基團是第一經保護的炔基和第二經保護的炔基。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中在第一手柄基團為未保護並且第二手柄基團為經保護的條件下，第一種反應配偶體偶聯到第一手柄基團。
11.權利要求1-10任一項的方法，其中至少三種手柄基團摻入到報告分子中。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中第一手柄基團是炔基並且第二和第三手柄基團是攜帶不同保護基的經保護的炔基。
13.權利要求1-12任一項的方法，其中報告分子的合成是化學合成，優選化學固相合成，其中在結合固相的情況下通過結構單元的逐步裝配合成報告分子。
14.權利要求13的方法，其中至少第一反應配偶體是偶聯的而報告分子結合至固相。
15.權利要求13的方法，其中在報告分子從固相切除後，第一反應配偶體被偶聯。
16.權利要求1-12任一項的方法，其中合成是報告分子合成，其中報告分子從核苷三磷酸結構單元合成。
17.檢測樣品中分析物的方法，其包括步驟
(a)提供樣品；
(b)將樣品與報告分子接觸，該報告分子包含至少兩種不同的官能團，其中所述官能團通過包含1，2，3-三唑環的接頭基團結合至報告分子，
(c)檢測報告分子與分析物的相互作用，其表明樣品中分析物的存在和/或量。
18.權利要求17的方法，其中分析物是核酸或者核酸切割或結合蛋白。
19.權利要求17或18任一項的方法，其中報告分子與分析物的相互作用是結合，優選雜交。
20.權利要求12-19任一項的方法，其中報告分子是核酸或核酸類似物，優選分子信標。
21.報告分子，其包含至少兩種不同的官能團，其中所述官能團通過包含1，2，3-三唑環的接頭基團結合至該報告分子。
22.權利要求21的報告分子，其是核酸或核酸類似物，優選分子信標。
23.式(I)的化合物
C-S-N
其中C是經保護的炔基，
S是間隔體或鍵，並且
N是核酸或核酸類似物結構單元，如核苷或核苷酸或非核苷化合物。
24.式(V)的非核苷化合物
其中
A是經保護或未保護的炔基，
S1和S2在每種情況下獨立地為非核苷基團，例如，間隔體或鍵，
P是磷酸或磷酸類似物基團，並且
R是用於核酸合成的偶聯基團。
25.權利要求24的化合物，其中S1是間隔體並且S2是共價鍵。
26.權利要求23-25任一項的化合物，其中間隔體具有3到10個原子的鏈長。
27.權利要求23-26任一項的化合物，其中間隔體包含炔基。
28.權利要求23-27任一項的化合物，其中經保護的炔基是甲矽烷基保護的炔基。
29.權利要求28的化合物，其中甲矽烷基是三(烷基/芳基)甲矽烷基，如三甲基甲矽烷基、三乙基甲矽烷基、三異丙基甲矽烷基、三苯基甲矽烷基或叔丁基-二甲基甲矽烷基或環狀橋接的甲矽烷基。
30.式(II)的化合物
B-S-N3
其中B是生物素或生物素衍生物，如脫硫生物素或氨基生物素，
S是間隔體或鍵，並且
N3是疊氮基。
31.式(III)的化合物
Q-S-N3
其中Q是淬滅基團，
S是間隔體或鍵，並且
N3是疊氮基。
32.式(IV)的化合物
Z-S-N
其中Z是醛糖基，其中羥基用醯基和/或甲矽烷基保護，或者經保護或未保護的1，2二醇基，
S是間隔體或鍵，並且
N是核酸或核酸類似物結構單元，如核苷或核苷酸化合物。
33.權利要求32的化合物，其中醯基選自乙醯基、丁醯基或新戊醯基。
34.式(V)的化合物
D-S-N
其中D是紅外(IR)染料，
S是間隔體或鍵，並且
N是疊氮基。
全文摘要
本發明涉及產生適於分析物如核酸的檢測的報告分子的方法。此外，本發明涉及檢測分析物的方法和區域。
文檔編號C07B61/00GK101605743SQ200780040593
公開日2009年12月16日 申請日期2007年10月31日 優先權日2006年10月31日
發明者T·卡萊爾, A·斯科沃格勒 申請人:貝瑟克裡科有限公司