Dna擴增方法

2023-08-13 14:59:26

專利名稱：Dna擴增方法
技術領域：
本發明總體涉及擴增感興趣的核酸區域的方法，更特別地涉及用PCR方法擴增感興趣的核酸區域的方法，所述PCR方法設計為用於使從結合非感興趣的特異性區域的核酸 區域的引物的擴增子產生最小化。本發明方法基於下述的確定，即通過使正向引物或反向 引物的功能性低效，不相關核酸區域的擴增速率能相對於感興趣區域的擴增而言降低。提 供感興趣的核酸區域的選擇性擴增的手段可具有一系列應用，包括但非限於特徵在於特定 基因序列的疾病狀況的診斷和/或監測，感興趣基因區域的鑑定或分析，DNA斷裂點區域的 鑑別或鑑定，感興趣基因序列的分離，其中僅感興趣基因序列一個末端的核苷酸序列是已 知的。
背景技術：
說明書中的關於任何現有技術的參考文獻(或任何來源於此的信息)或任何已知 的內容都不應認為是認可或以任何形式提示現有出版物(或來源於此的信息)或已知內容 構成本發明涉及的領域的一般常識的一部分。本發明的作者引用的出版物書目細節以字母順序收集在說明書結尾。聚合酶鏈反應(PCR)是用於擴增DNA鏈的特定區域的技術。其可以是單個基因、 基因的僅僅一部分或非編碼序列。大多數PCR方法通常擴增達10千鹼基對(kb)的DNA 片段，但一些技術允許擴增達40kb的片段(Cheng etal.，1994，Proc Natl Acad Sci. 91 5695-5699)。目前常用的 PCR 需要幾種基礎成分(Sambrook and Russel，2001，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd Ed.)。這些成分是·含有待擴增的DNA片段的區域的DNA模板；·弓丨物，它們互補於在待擴增DNA區域的5'和3'末端的DNA區域；· DNA聚合酶(例如Taq聚合酶或另一種熱穩定DNA聚合酶，最佳溫度在大約 700C )，用於合成待擴增區域的DNA拷貝；及·脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，DNA聚合酶從它們構建新DNA。PCR在含有典型反應體積15-100 μ 1的小反應試管(0. 2-0. 5ml體積)中進行，這 些試管插入熱循環儀中。這個儀器加熱和冷卻其中的反應試管至每個反應步驟所需的精確 溫度。大多數熱循環儀包含加熱蓋以防止在反應試管帽內側的冷凝。或者可以將一層油置 於反應混合物上以防止蒸發。因此，PCR是一種允許指數擴增較長DNA分子內的DNA序列的方法。反應涉及一 些擴增循環，在每個循環中每個分子反應的模板是基因組DNA鏈或者在前一個循環中合成 的DNA鏈。每個PCR循環涉及下述步驟-加熱變性以分離雙鏈DNA分子的2條鏈-將上遊和下遊引物與它們的互補序列雜交-經DNA聚合酶延伸弓I物以產生模板序列的互補拷貝。
通常PCR試劑和條件被選擇以便變性、雜交及延伸以接近最大效率發生，結果希 望的序列的量在每個循環增加接近2倍。在PCR結束時發生實質擴增，例如30個循環的 PCR將產生原始模板的幾乎23°(1，000，000，000)倍的擴增。這個程度的擴增促進擴增產物 的檢測和分析。其它核酸擴增技術，如連接酶鏈反應(LCR)或基於核酸序列的反應(NASBA)，也用於擴增DNA中的希望的序列。反應策略與PCR不同但是它們也使用與靶序列的2個末端雜 交的引物，及同樣反應常規進行以保證每個步驟包括雜交均在或接近最大效率發生。儘管 接下來的討論基本上針對PCR，所述概念同樣適用於其它擴增技術。一些擴增循環後，PCR產物可以各種方式分析，最常用凝膠電泳分析。在其最簡單 形式中，這個分析方法是半定量的。產物的量不與輸入DNA的量緊密相關，由此使得這種類 型PCR是檢測具體DNA存在或不存在的定量工具。為了測量信使RNA(mRNA)，所述方法使用逆轉錄酶以先將mRNA轉化為互補 DNA(cDNA)，然後經PCR擴增及經瓊脂糖凝膠電泳分析。在許多情況中這個方法已用於測量 不同條件下具體mRNA水平。但是，這個方法因為額外的逆轉錄酶步驟實際上比DNA的PCR
定量性還差。為了提供定量能力，開發了實時PCR。這個程序遵循PCR的一般模式，但是擴增的 DNA在每個循環被定量。兩個常用定量方法是使用間插雙鏈DNA的螢光染料及修飾的DNA 寡核苷酸引物或探針，所述引物或探針的螢光在PCR步驟之一中變化。通常，實時聚合酶鏈 反應與逆轉錄酶聚合酶鏈反應組合以定量低豐度信使RNA (mRNA)，使得研究者可以在特定 時間或在特定細胞或組織類型中定量相對基因表達。(i)使用結合雙鏈DNA的染料的實時PCRDNA結合染料結合PCR反應中的所有雙鏈(ds)DNA，導致增加的染料螢光。PCR期 間DNA產物的增加因此導致螢光強度增加，其在每個循環中測量，由此允許定量DNA濃度。 與其它實時PCR方法類似，獲得值不具有與其相關的絕對單位(即mRNA拷貝/細胞)。因 此，測量的DNA/RNA樣品與標準稀釋液的比較僅給出樣品相對於標準的分數或比率，使得 僅允許在不同組織或實驗條件之間的相對比較。為保證定量精確性，通常需要將靶基因表 達針對穩定表達的基因標準化。這可以校正實驗樣品間RNA數量或質量中的可能差異。(ii)螢光報導序列方法已開發了一些使用螢光報導引物或探針的不同方法，它們趨於比使用DNA結合染 料更精確及可靠。它們使用一或多個DNA引物或探針以僅定量與引物或探針雜交的DNA。 使用報導探針顯著增加特異性及可允許甚至在一些非特異性DNA擴增的存在下的定量。使 用序列特異性引物或探針允許多重化(multiplexing)-通過使用具有不同顏色標記的特 異性序列或探針在相同反應中分析幾個不同擴增產物，條件是所有靶均以相似效率擴增。關於定量，在反應指數階段存在的DNA的相對濃度通過以對數規格用螢光對循環 數目繪圖而確定。高於背景的螢光增加或者低於背景的螢光降低的閾值(根據具體方法) 被確定。來自樣品的螢光超過閾值的循環被稱為循環閾值，Ct。由於指數階段每個循環DNA 數量加倍，可以計算DNA相對量，例如一個樣品Ct比另一個早3個循環具有23 = 8倍的更 多模板(假定每個循環的擴增DNA的量加倍)。DNA量然後通過比較結果和由已知量DNA的系列稀釋液(例如未稀釋的，1 4，1 16,1 64)產生的標準曲線而確定。但是，PRC的一個限制涉及這樣事實，引物在一些情況中可以結合DNA樣品的一個 以上區域，由此潛在導致產生與感興趣DNA序列不相關的擴增序列。結合多個區域可在一 些情況中發生，其包括但非限於1.引物的非特異性結合，由於，例如，引物非常短或者簡併或者設計有利於非特異 性結合或者受有利於非特異性結合的PCR條件影響。2.引物結合序列在基因組的許多區域天然存在。屬於家族如alu和line的序列 廣泛分布，雖然個體序列可略微變化，但是它們的同源性是使得結合一個家族成員的引物 很可能與許多其它成員結合。 3.引物結合序列已被導入基因組的許多區域。例如如果DNA由限制酶消化及共同 序列連接在消化位點，這可能發生。4.反應中存在多個引物。偶然地，一個引物可結合作為正向引物起作用，另一個可 結合作為反向引物起作用。這個現象發生概率隨著引物數增加而增加。這些情況之一的結果是，一個引物可結合作為正向引物起作用，相同或另一個引 物結 合作為反向引物起作用。如果結合位點足夠近，可發生非特異性擴增。如果考慮到PCR 擴增十億倍以上的能力也增加擴增錯誤DNA序列的可能性超過十億倍，使這種可能性最小 化的重要性顯而易見。因此，有持續興趣和需要開發克服這個問題的手段。通常途徑是嵌套式PCR。在這 個方法中兩對PCR引物用於一個基因座。第一對擴增基因座如任何PCR實驗所見。第二對 引物(嵌套式引物)結合在第一個PCR產物內並產生比第一個短的第二個PCR產物。這個 策略後面的邏輯是如果不想要的基因座也被擴增，則其被第二對引物擴增第二次的概率非 常低。但是，嵌套式PCR僅在如下情況下有價值第一對引物內部的一些或全部DNA序列是 已知的從而一或多個提供額外特異性的內部引物可以被合成。在導致本發明的工作中，開發了另一個使不想要的擴增事件最小化的方法。特別 地，已經確定如果兩個PCR引物之一(例如引物2)被設計或使用從而其低效雜交及包含本 身導致第三個(標記)引物的結合位點的核酸標記，則發生擴增「瓶頸(bottleneck)。瓶 頸發生是因為希望產物的有效擴增僅在引物2雜交及延伸後開始，這個過程是低效的。在 後續循環中，從如此產生的模板開始的指數擴增是有效的，由引物1在一個方向的有效雜 交及延伸和標記引物在另一個方向的有效雜交及延伸介導。但是，對於從可以引物2作為 正向和反向引物的序列產生的不希望的擴增子，PCR期間的瓶頸更嚴重。對於這種序列，標 記引物的有效擴增僅在引物2的2個連續的低效雜交發生後發生，一個在正向，一個在反 向。因此，通過有意保證PCR中一個引物雜交被低效化，可以根據序列的擴增選擇正向和反 向引物，使得有利於由利用該引物從一個末端及利用有效雜交引物從另一個末端擴增的序 列的擴增。發明_既述在整個說明和權利要求中，除非上下文相反，則詞語「包含」應理解為包括所述整 數或步驟或者整數或步驟組但不排除任何其它整數或步驟或者整數或步驟組。如本文所用，術語「衍生自」應理解是指特定整數或整數組源自所述物種，但非必 須直接得自所述來源。另外，本文所用單數形式包括複數，除非上下文清楚表明不是這樣。
除非另外定義，本文所用所有技術和科學術語具有本領域技術人員通常理解的意義。本發明的一個方面提供了鑑別感興趣核酸區域的方法，所述方法包括(i)使核酸樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的核酸樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的核酸與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的核酸樣品。本發明另一方面提供了擴增感興趣DNA區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。在本發明另一個方面中，本發明提供了擴增感興趣的基因或基因片段的方法，所 述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣基因或基因片段的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣基因或基因片段的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。在另一個方面中，提供了擴增感興趣的染色體基因易位斷裂點區域的方法，所述 方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣的染色體基因易位斷裂點區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣的染色體基因易位斷裂點區域的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。在另一個方面中，提供了擴增感興趣的DNA區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣的區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣的區域的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連 接寡核苷酸標記，以及其中所述功能上低效的引物組是具有與非靶DNA區域混雜地 (promiscuously)雜交的潛力的引物組；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。在另一個方面中，提供了擴增感興趣的DNA區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物低效雜交並在它們的5』末端可操縱地連接寡核苷酸標 記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。本發明的另一個方面提供了擴增感興趣的DNA區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物低效雜交並在它們的5』末端可操縱地連接寡核苷酸標 記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iν)經PCR擴增步驟(i i i)的DNA樣品。本發明的另一個方面提供了擴增感興趣的DNA區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及
(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物低效雜交並且是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的部分或全部序列的引物接觸；(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品；及(ν)分離和/分析所述擴增的DNA。附圖簡述

圖1是示意圖，描述了用於擴增感興趣序列的在2個(非必需連續)PCR循環中的 2個事件，其必須在有效擴增發生之前發生。第一個是當低效引物2雜交並延伸形成反義鏈 時，第二個是當有效引物1與所得反義鏈雜交並延伸形成含有標記引物的結合序列的有義 鏈時。然後在後續循環中發生由引物1和標記引物引發的有效擴增。圖2是瓶頸PCR期間的陰性選擇的示意圖。在經典PCR中在上遊和下遊引物位點 均具有有效雜交及延伸。在瓶頸PCR中由於在一個或兩個引物結合位點的低效雜交而具有 瓶頸。這導致與僅在一個末端具有瓶頸的靶相比在每個末端均有瓶頸的靶的陰性選擇。圖3是使用瓶頸PCR富集BCR-ABL斷裂點序列的實驗設計示意圖。第二、第三和 第四輪PCR是瓶頸PCR，因為雜交-標記下遊引物以低濃度存在，導致低效雜交和延伸。在 第一輪中還有一些偶然瓶頸效應，是由於每個下遊ABL引物的低濃度所致。在典型實驗中， 前3輪各涉及20個PCR循環，最終第四輪涉及20-35個循環。圖4是用瓶頸PCR富集希望產物的實驗設計示意圖。初始PCR涉及正向基因特異性引物(Fl)及一個簡併(通用)反向引物(如果進行基因步移)或者反向引物集合(如 果進行跨易位斷裂點的擴增)。初始PCR可以通過使反向引物低效而設計為瓶頸PCR，並且 當使用反向引物集合時，實際上由於每個反向引物的低濃度而作為瓶頸PCR進行。第二和 第三輪PCR是確定的瓶頸PCR。它們涉及相同或嵌套式正向引物和低濃度雜交-標記反向 引物，其導致這個引物的低效雜交及延伸。在典型實驗中，前2或3輪各涉及20個PCR循 環，最終一輪涉及20-35個循環。圖5是經針對非特異性產物選擇而富集特異性產物的示意圖。特異性產物是 BCR-ABL易位序列，非特異性產物是無名基因組序列，一或多個ABL引物雜交在所述基因組 序列每個末端導致擴增。來自具有BCR-ABL易位的患者的DNA在第1輪中用上遊BCR引物 和282個下遊標記ABL引物擴增。然後進行3輪連續瓶頸PCR，每輪使用上遊BCR引物和下 遊連接雜交標記廠標記i+1引物及標記i+1引物。每一輪擴增用BCR-ABL易位的序列特異性 引物及非特異性產物的標記引物量化。如2個產物的Ct值所示，非特異性產物在第一輪中 佔據主導但是其相對量隨著每一輪下降，從而特異性產物在第3和第4輪中佔據主導。在 第2輪和第1輪之間及在第3輪和第2輪之間觀察到的富集程度提示標記_標記引物以大 約最大效率起作用。圖6是促進易位斷裂點區域分離的瓶頸PCR的選擇作用的圖像。泳道2、5和17 顯示用來自慢性髓樣白血病的3名患者的DNA的擴增結果，泳道N顯示用來自正常對照的 DNA的結果，泳道MQ顯示來自水對照的結果。在PCR擴增的第一個循環中，所有樣品均用1個針對BCR的上遊引物和282個針對ABL基因的引物擴增。對於一個系列的擴增，第一輪 持續45個循環(第1輪)，而對於其它系列擴增PCR在20個循環後終止，使用1/100等份 進行進一步3輪瓶頸PCR(第4個循環)。第1輪結果顯示異質產物的寬的成片條帶，其由 於ABL引物在兩個末端引發而擴增。第4輪產物不複雜得多並且可見同質條帶。在所有樣 品中均可見一個非特異性條帶，在患者2和5中可見由於BCR-ABL易位的擴增導致的條帶 (箭頭)。
圖7是瓶頸PCR的選擇作用的另一個圖像。泳道6、16和23顯示用來自慢性髓樣 白血病的3名患者的DNA的擴增結果，泳道N顯示用來自正常對照的DNA的結果，泳道MQ 顯示來自水對照的結果。在第一輪PCR擴增中，所有樣品均用1個針對BCR的上遊引物和 282個針對ABL基因的引物擴增；在第二輪中，所有樣品均用1個針對BCR的嵌套式上遊引 物和282個針對ABL基因的嵌套式引物擴增。當不進行瓶頸PCR時，第二輪持續45個循環， 而當其進行時，第二輪PCR在20個循環後終止，使用1/100等份進行進一步2輪瓶頸PCR。 這導致3名患者中BCR-ABL序列的優先擴增(箭頭表示)。圖8是示意圖，描述了在經典PCR或其中一個引物或兩個引物低效的單輪瓶頸PCR 中產生的擴增的模型。所述模型用Excel表格產生。在所示實施例中，對於每個PCR的起 始靶是一個DNA雙螺旋，包含有義鏈和反義鏈，每個循環期間雜交及延伸的概率對於有效 引物是1，對於低效引物是0.001。指數擴增佔主導之前的瓶頸是明顯的。在任何給定數目 PCR循環後，用一個有效和一個低效引物擴增的靶與用兩個低效引物擴增的靶相比增加大 約1000倍。圖9顯示用瓶頸PCR從急性早幼粒細胞白血病患者分離PML-RAR α易位斷裂點的 實驗的圖像。a)患者DNA用多個RAR α引物和一個PML引物擴增，然後進行2輪瓶頸PCR。 該圖顯示在2%瓊脂糖凝膠上電泳的擴增的DNA。P是患者DNA，N是正常DNA，W是水對照。 DNA梯顯示從上至下700bp-100bp的條帶。患者條帶可在大約500bp見到。b)為證實斷裂 點已被分離，用斷裂點序列設計跨越斷裂點的RARa弓丨物和PML引物，用這些引物擴增患者 DNA 一輪。該圖顯示在2%瓊脂糖凝膠上電泳的擴增的DNA。P是患者DNA，N是正常DNA，W 是水對照。DNA梯顯示從上至下700bp-100bp的條帶。證實的患者條帶可在大約150bp見 至IJ。c)從圖的a部分的凝膠上顯示的擴增條帶獲得的序列層析圖。顯示了 PML和RARa之 間的斷裂點。圖10示出用於基因步移的瓶頸PCR的應用，其使用「通用」簡併引物，沿Myocillin 基因使用4個不同簡併引物(泳道1-4)，其除了在它們的第5個最3』鹼基是A、G、C或T之 外是相同的。第一輪是初始PCR，第二和第三輪是瓶頸PCR。隨著系列瓶頸PCR複雜度的降 低是明顯的。4個擴增的每一個中的主要條帶的測序顯示預期的Myocillin基因序列。泳 道M是DNA梯，產物從700-100bp，間隔IOObp，W是無DNA的水對照。圖11是經瓶頸PCR針對非特異性擴增產物的進行性選擇的示意圖。實驗研究了 沿APC基因的步移。初始PCR用20個循環，使用一個基因特異性和一個簡併引物，隨後3 輪瓶頸PCR，各20個循環。擴增產物每5個循環取樣，在「read-out」 PCR中測定特異性和 非特異性產物。降低的Ct表示增加產物。特異性產物在1個瓶頸PCR後開始佔據主導。圖12示出來自3輪基因步移實驗的APC基因序列的圖像。使用APC基因特異性 引物和簡併反向引物的初始PCR後接2輪瓶頸PCR，擴增產物不經電泳而直接測序。示出使用不同測序引物的正向的3個APC序列。用於獲得A的測序引物與第三輪PCR中使用的引 物相同。用於獲得B和C的測序引物分別是來自最5』引物的732和1302bp。可讀序列的 總長度是大約1. 5kb。發明詳述本發明部分基於如下確定，即衍生自引物與非感興趣區域的DNA區域的結合的不 想要的擴增子產生的機率可以通過標記在非感興趣位點可能產生引物雜交及延伸的引物 及使其功能上低效而最小化。本發明方法因此提供了擴增感興趣核酸區域的簡單有效手 段。因此，本發明的一個方面提供了擴增感興趣核酸區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸
(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iν)擴增步驟(iii)的DNA樣品。核酸「感興趣區域」應被理解是指任何要被擴增的DNA或RNA區域。這可以是基 因或基因部分。為此，「基因」應理解是指編碼蛋白質產物的DNA分子，可以是全長蛋白質 或蛋白質片段。對於染色體DNA，基因包括內含子和外顯子區域。但是，當感興趣DNA是 cDNA時，例如如果感興趣DNA是載體DNA或者逆轉錄的mRNA可能發生，可能不存在內含子 區域。然而這種DNA可包括5』或3』未翻譯區。因此，本文「基因」是理解是包含任何形式 的DNA，其編碼蛋白質或蛋白質片段，包括例如基因組DNA和cDNA。感興趣的核酸區域也可 以是基因組DNA的非編碼部分，未知其與任何特異基因相關(如通常命名的「無用，，DNA區 域)。其可以是由重組產生的基因組DNA的任何區域，在基因組DNA兩個區域之間或者基因 組DNA —個區域與外來DNA如病毒或導入的序列之間。其可以是部分或全合成的或重組產 生的核酸分子的區域。感興趣的核酸序列也可以是先前已用任何核酸擴增方法包括PCR擴 增的DNA區域(即其已通過擴增方法產生)。「核酸」區域可以是DNA或RNA或其衍生物或類似物。當感興趣區域是編碼蛋白質 分子的DNA序列時，其可以是基因組DNA、從mRNA轉錄物產生的cDNA或通過核酸擴增產生 的DNA的形式。但是當本發明DNA不編碼蛋白質時，基因組DNA或者合成或重組產生的DNA 可以是分析的目標。本領域技術人員理解，合成和重組產生的DNA也可以編碼蛋白質的全 部或部分。但是，如果本發明方法涉及檢測RNA區域，應理解首先需要逆轉錄RNA為DNA， 如使用RT-PCR。本發明RNA可以是任何形式的RNA，如mRNA、一級RNA轉錄物、核糖體RNA、 轉移RNA、微小RNA等。優選地，所述感興趣核酸區域是感興趣的DNA區域。為此，所述DNA 包括通過從RNA逆轉錄產生的DNA，其最終是分析的目標，以及通過核酸擴增方法如PCR產 生的DNA。本發明因此更優選地提供擴增感興趣DNA區域的方法，所述方法包括
⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。「DNA」應理解是指脫氧核糖核酸或其衍生物或類似物。應理解其包含所有形式的 DNA，包括cDNA和基因組DNA。本發明的核酸分子可以是任何來源，包括天然發生的(如衍 生自生物學樣品)、重組產生的或合成產生的。「衍生物」應理解是包括來自天然、合成或重組來源的所述DNA的片段、同系物或直 向同源物。「功能衍生物」應理解是顯示DNA的任何一或多種功能活性的衍生物。所述DNA 序列的衍生物包括具有與其它蛋白質或非蛋白質分子融合的DNA分子的特定區域的片段。 本文所述「類似物」包括但非限於對核苷酸或核酸分子的修飾如對其化學組成或整體構象 的修飾。這包括例如摻入新的或修飾的嘌呤或嘧啶鹼基或者修飾核苷酸或核酸分子與其它 核苷酸或核酸分子的相互作用的方式，如在骨架形成水平或互補鹼基對雜交。核苷酸或核 酸分子的生物素化或其它形式的標記是本文限定的「功能衍生物」的一個例子。優選地，所述DNA是基因或基因片段，染色體基因易位斷裂點或由先前核酸擴增 產生的DNA。根據這個方面，本發明提供了擴增感興趣基因或基因片段的方法，所述方法包 括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣的基因或基因片段的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣的基因或基因片段的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。在另一方面，提供了擴增感興趣的染色體基因易位斷裂點區域的方法，所述方法 包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣的染色體基因易位斷裂點區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣的染色體基因易位斷裂點區域的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物是功 能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；
(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。在另一個方面中，提供了擴增由先前的核酸擴增產生的DNA的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣的染色體基因易位斷裂點區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣的染色體基因易位斷裂點區域的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。優選地，所述先前的核酸擴增是PCR。在經典PCR中，引物及反應條件被設計為正向和反向引物的引物雜交及延伸以最 大效率或接近最大效率發生從而擴增子數目每輪大約倍增，產生有效指數擴增。然而本發 明方法基於使用正向和反向引物組，其中一組引物已在其中它們不有效雜交及延伸的條件 下被設計或者另外使用。因此，儘管優選引物組正常擴增，低效組不會這樣。結果，當感興 趣序列被擴增時，擴增子鏈的數目顯著低於經典PCR中發生的那些。有效擴增僅在擴增子 已被產生時開始，其在一個末端摻入低效引物的標記區域(這些擴增子的產生示於圖1，標 記的功能在以下更詳細討論)。在這一點，針對標記區域的引物實現正常擴增速率。「瓶頸 (bottleneck) 」因此在從低效引物組產生轉錄物時有效產生。更嚴重瓶頸通常當被低效化的引物是簡併的並廣泛雜交或者針對常見重複序列 如alu序列時產生。如果引物結合位點緊密並列(apposed)時及如果低效引物可以作為正 向引物和反向引物，則可產生不想要的產物的擴增。但是，由於兩個引物是低效的，擴增最 初極度低效及存在嚴重瓶頸。這種情況示於圖2。有效擴增僅在一端包含低效引物的標記 區域及另一端包含其互補序列的擴增子鏈已產生時開始。但是在給定數目循環後，這種擴 增子的數目大大低於如上所述在感興趣序列擴增期間產生的數目。擴增反應結束時不想要 產物的量相應降低。已正確雜交感興趣序列的低效引物的雜交及延伸後，在隨後循環中有效引物與先 前合成的擴增子的雜交及延伸，產生標記引物可以有效雜交及延伸的模板。由於這種分子 與其互補序列一起提供上遊和下遊結合位點，各針對有效引物(標記引物及有效組的一個 成員)，從這種模板的後續擴增循環是有效的及指數型的。結果是在最初延遲或「瓶頸」後， 擴增的整體速率在後面的循環中加速，從而產生每個循環幾乎加倍的擴增子數。但是，淨結 果是針對不希望擴增子的擴增與感興趣序列的擴增子相比有陰性選擇，這是由於對於前者 每個末端均有瓶頸，而對於後者僅在一個末端有瓶頸。因此，如果考慮起始靶序列的相同數目以及與經典PCR產生的擴增相比，本發明方法的應用使得產生感興趣序列的擴增子數目增加較低，產生不想要的序列的擴增子數目 增加甚至更低，如圖8所示。儘管想要的和不想要的產物的擴增均發生，但是相對於不想要 的序列，存在感興趣序列的相對富集。絕對擴增與富集之間存在逆相關，因為降低低效引物 組的效率以較少擴增的代價產生增加的富集。本領域技術人員應意識到所述方法的第一和第二階段不需要以物理上分離的反 應進行，可以簡便地在同一反應容器中進行；第一階段以循環1開始並進行，而第二階段以 循環3開始並繼續進行。關於決定是正向引物組或是反向引物組被低效化可以隨情況變化。但是通常，人 們尋求使這樣的引物組的雜交及延伸低效，即顯示與非感興趣靶的序列以最大概率結合的 引物組。關於本文提供的舉例，富集BCR-ABL斷裂點的實驗設計基於使ABL引物組而非BCR 引物組低效。在另一個實施例中，如果感興趣DNA區域的引物靶序列僅在該DNA區域的一側 是已知的，可以使用通用或簡併引物以從另一側起始引物延伸和擴增。但是，由於這種引物 定義是混雜結合樣品DNA，通過使這個引物組低效，可以實現感興趣DNA區域與無關序列相 比增強的擴增。在另一個實施例中，當被擴增的DNA樣品已通過先前的核酸擴增產生時，關 於確定是正向引物組或是反向引物組被低效化，如果在初始擴增中的正向引物是混雜的， 人們可能尋求使正向引物的雜交及延伸低效，或者，相反，如果在初始擴增中的反向引物是 混雜的，則使反向引物的雜交及延伸低效。 優選地，被低效化的引物組是能與非靶DNA區域混雜雜交的組。根據這個方面，提供了擴增感興趣DNA區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物；其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記，以及其中所述功能上低效的引物組是能與非靶DNA區域混雜地雜交的引物組；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。「引物」或「寡核苷酸引物」應理解是指包含核苷酸序列的任何分子或其功能衍生 物或類似物，其功能包括與感興趣的核酸分子的一個區域雜交(感興趣的DNA可互換地指 「靶DNA」)。應理解引物可包含非核酸成分。例如，引物還可包含非核酸標記如螢光或酶標 記或者一些其它非核酸成分，其促進該分子用作探針或者其另外促進其檢測或固定化。引 物還可包含額外的核酸成分，如寡核苷酸標記，其在後文詳細描述。在另一個實施例中，弓丨 物可以是蛋白質核酸，其包含顯示核酸側鏈的肽骨架。優選地，所述寡核苷酸引物是DNA引 物。「正向引物」應理解是指通過雜交靶DNA的反義鏈而擴增感興趣DNA樣品中的靶 DNA的引物。「反向引物」應理解是指通過雜交靶DNA的有義鏈而擴增感興趣DNA樣品中的靶 DNA的引物。
適用於本發明的引物的設計和合成是本領域技術人員熟知的。在一個實施方案 中，本發明引物是4-60個核苷酸長，在另一個實施方案中是10-50個核苷酸長，在另一個實 施方案中是15-45個核苷酸長，在另一個實施方案中是20-40個核苷酸長，在另一個實施方 案中是25-35個核苷酸長。在另一個實施方案中，引物是大約26、27、28、29、30、31、32、33 或34個核苷酸長。關於用於本發明方法中的引物的數目，這可以由本領域技術人員確定。如果感興 趣序列的 兩個末端的序列是已知的，則可能僅需要1個正向和1個反向引物，但是如果這個 信息是未知的，則可以採用多個正向和/或反向引物或者一或多個簡併引物。對於可在相 互作用基因的大區域內的未知點發生的易位斷裂點的分離，可使用多個引物以嘗試保證至 少1個正向和1個反向引物緊密跨越斷裂點，從而會發生有效PCR。對於慢性髓樣白血病 (CML)，例如，幾乎所有BCR易位均涉及兩個區域中的一個，每個長度大約3kb。在這種情況 中，可以使用12個外(outer)正向引物。但是ABL基因更大，易位中通常涉及的區域長度 大約140kb，可以使用高達282個或更多個外反向引物。在一個特定實施方案中，組合使用 6個正向引物和24個反向引物，在另一個實施方案中組合1個正向引物和282個反向引物。 在另一個組合中，有6個正向引物和270-310個反向引物。在另一個組合中，有1-20個正 向引物和250-350個反向引物。選擇使用的引物數目取決於感興趣的靶區域及因此可隨著 靶變化。本領域技術人員理解，對於經典PCR，每個PCR反應中的大的引物數目增加非特異 性擴增反應的概率。但是本發明方法使得可以使用大量引物，這是由於通過使一個引物組 功能低效而使非特異性擴增反應最小化。還應理解在單個正向或反向引物集合中存在2個或多個不同引物，可以使該集合 中的所有引物均低效，或者可以使這些引物中僅一個選定亞組低效，其據信對於產生不相 關擴增子是問題最大的。「功能上低效」是指本發明引物已被修飾和/或用在某種環境條件下，使得其雜交 及延伸比引物設計未被修飾或該引物未被用在所述環境條件下就從該引物產生擴增子的 數目和/或速率方面而言更為低效。使引物功能上低效的方法是本領域技術人員熟知的並 且包括但非限於(i)降低所用引物濃度；(ii)降低引物雜交時間；(iii)增加雜交反應發生所需的溫度；(iv)修飾引物長度；(ν)改變引物解鏈溫度；(vi)在雜交/引物延伸階段中引入離液劑；(vii)將引物競爭性抑制劑如其互補序列導入反應中；(viii)將核苷酸錯配導入引物序列；(ix)使用引物類似物，其在雜交中與氫鍵合有效性較差(hydrogen-bondless effectively)。應理解除了潛在修飾引物本身之外，還可以(或者另外)選擇修飾反應條件以實 現相同結果。為此，應理解也可以設計一種系統，其使用兩或多種上述方法以實現一個引 物的功能低效而不類似使另一個引物功能低效。當選擇改變反應條件而非引物本身時，這更可能成為問題。例如，如果選擇增加反應溫度以降低效率，這會影響兩個引物組(即正向引物和反向引物)的功能性。因此，為最小化所需的溫度增加，可以組合使用這個方法及使 用長度已增加的引物以最大化一個引物而非另一引物的低效。在另一個實施例中，可以選 擇不改變反應條件，而是可以降低使用的引物的濃度。在另一個實施例中，可以降低引物長 度或者降低其濃度組合降低雜交時間。設計及改變這些因素以實現功能低效是本領域技術 人員熟知的，因為它們是在設計PCR反應中本領域常規考慮和詳細描述的問題(Sambrook J.andRussell D. 「 Molecular cloning :a laboratory manual" 3rd edition published byCold Spring Harbor，2001)，儘管通常是降低正向和反向引物的功能低效的可能性，與 有意誘導這個狀態相反。不過，設計有效PCR反應需要考慮的與設計使部分反應功能低效 需要考慮的相同。因此，問題僅僅是這些考慮如何應用。為此，應理解使引物功能低效不只 包括修飾引物本身的設計，而且或者任選包含修飾引物起作用所需的反應條件。優選地，功能低效是雜交低效，其通過修飾引物長度、序列、退火溫度、起始濃度或 雜交時間之一或多種而實現。根據這個方面，提供了擴增感興趣的DNA區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。優選地，所述功能低效引物組是在未被功能低效化時能混雜雜交非靶DNA區域的 引物組。在另一個優選的實施方案中，所述感興趣的DNA區域是基因或基因片段或者染色 體基因易位斷裂點。如前所述，本發明方法目的在於富集感興趣序列及使正向或反向引物組低效。結 果，感興趣序列的擴增是低效的，但是對通過作為正向和反向引物的低效引物組的一或多 個成員擴增的其它不想要的序列而言更低效。這種情況在圖2示出，導致針對這種不想要 的序列的陰性選擇及感興趣序列的富集。但是，還希望的是返回有效擴增水平以促進感興 趣擴增子的拷貝數增加。這方便地通過向功能上低效的引物中摻入標記而實現，所述標記 可以本身起作用產生引物雜交靶位點。通過這種方法有效地使得可以實現與功能上低效引 物相同方向的有效擴增。使得在後面循環中由標記引物有效引發的這種模板的產生導致進一步富集，事件 順序如圖1所示。引物2包含寡核苷酸標記，其與模板鏈雜交，所述模板鏈是原始基因組鏈或在前 一個PCR循環中產生的擴增子鏈。這個引物低效雜交但是其在這第一個循環中確實產生一 些互補鏈。在第二個擴增循環中，引物1與引物2產生的擴增子鏈雜交並且延伸，產生包含標記引物的結合位點的鏈，其能夠被標記引物在後續循環中有效擴增。附圖示出這樣的情 況，其中引物1是有效引物，其選擇相應於感興趣的DNA區域的擴增子並且有效產生含有標 記引物的結合位點的擴增子鏈。對於特徵在於由低效引物組的一或多個成員正向和反向引 發的情況，如通用序列如Alu或者能被簡併或通用引物擴增的序列的擴增，及擴增是不希 望的，相應於圖1中的引物1的引物是低效的並且其在第二個循環中的延伸產生更少的含 有標記引物的結合位點的鏈。因此，有效發生了進一步的針對這種不希望模板的產生的陰 性選擇及有利於感興趣序列的模板鏈的陽性選擇，其在一個末端包含引物1，及在另一個末 端包含標記的結合位點。為了保證這些寡核苷酸標記不幹擾引物延伸，引物在它們的5'末端與寡核苷酸 標記連接。「寡核苷酸標記」因此應理解是指通常少於50個核苷酸的核苷酸序列，其連接在 本發明功能上低效引物的5'末端。在一個實施方案中，標記長度是25-30個鹼基。應理解 與關於正向和反向引物提供的定義一致，本文描述的寡核苷酸標記也可包含非核酸成分如 分離或顯現標記，例如生物素、酶標記、螢光標記等。這使得通過非分子學方法快速簡單分 離或顯現標記的弓I物或擴增子。寡核苷酸標記與引物「可操縱地連接」應被理解是指那些區域的連接是使得標記 引物的如前所述的功能目的可以實現。關於這些區域連接所用手段及進一步地本發明寡核 苷酸引物結合其靶DNA區域所用的手段，它們相應於各種類型的相互作用。為此，「相互作 用」應理解是指任何形式的相互作用如互補核苷酸鹼基對之間的雜交或者其它一些形式的 相互作用如在引物分子的任何核酸或非核酸部分或 標記分子與任何其它核酸或非核酸分 子如靶分子、顯現手段、分離手段等之間形成鍵。這種類型相互作用可通過形成鍵例如但非 限於共價鍵、氫鍵、範德華力或任何其它相互作用機制而發生。優選地，相互作用發生在引 物和靶DNA區域之間時，所述相互作用是互補核苷酸鹼基對之間的雜交。為了促進這個相 互作用，優選地，靶DNA被部分或全部單鏈化，時間和條件是足以使得與引物發生雜交。應理解本發明的寡核苷酸引物和標記不應限於本文舉例的特定結構(線性、單鏈 分子)，而是可以延伸為實現本文描述的功能目的的任何合適結構構型。例如，可希望所有 或部分寡核苷酸是雙鏈的，包含環區域(如髮夾彎曲)或採取開環構象形式，即核苷酸引物 形狀基本上是環狀但其末端區域不連接。促進核酸引物與靶DNA的相互作用可以通過任何合適方法進行。這些方法是本領 域技術人員熟知的。為此，應理解針對標記的引物可以在任何合適時間點摻入反應試管中。 例如，其可以在最初擴增循環開始之前摻入，即與正向和反向引物組一起，或者其可以隨後 摻入到最初2個擴增循環中。在每種情況中，標記區引物僅在摻入標記區的擴增子產生後 有功能，如前所述。實現引物指導的擴增的方法也是本領域技術人員熟知的。在優選的方法中，所述 擴增是聚合酶鏈反應，NASBA或者鏈置換擴增。最優選地，所述擴增是聚合酶鏈反應。使用來自前一個擴增的產物作為後一個反應的模板進行連續核酸擴增的方法，也 是本領域技術人員熟知的。在另一個優選的方法中，例如產生圖3-12所示結果的方法，可 以進行瓶頸擴增以產生感興趣DNA序列的選擇性擴增，所述DNA序列已通過之前的瓶頸PCR 或之前的非選擇性PCR產生。本領域技術人員理解可以進行連續瓶頸PCR。因此提供了擴增感興趣的DNA區域的方法，所述方法包括
⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品。優選地，所述感興趣的DNA區域已通過先前核酸擴增產生。在另一個優選實施方案中，所述感興趣的DNA區域是基因或基因片段或者染色體 基因易位斷裂點如BCR-ABL斷裂點。關於實現本發明方法，應理解步驟⑴和(iii)的引物可以在前2個擴增循環之 前同時加入反應溶液中，或者步驟(iii)的引物可以在第一個和第二個擴增循環後導入。 這取決於本領域技術人員如何進行PCR反應。例如，為便於使用，經常希望能夠在一個試管 中進行全部反應。然而，可以使用實現本發明步驟的任何其它方法。「樣品」應理解是指生物學或非生物學樣品。非生物學樣品的例子包括例如合成產 生的核酸群體的核酸產物。「生物學樣品」應理解是指衍生自動物、植物或微生物(包括微 生物培養物)的生物學材料的任何樣品，如但非限於細胞材料、血液、粘液、糞便、尿液、組 織活檢樣本，導入動物體內隨後取出的液體(例如在肺灌洗後從肺中抽出的鹽溶液或者從 灌腸中取出的溶液)，植物材料或者植物繁殖材料如種子或者花或者微生物集落。根據本發 明方法測試的生物學材料可以直接測試或者可能在測試前需要一些形式的處理。例如，活 檢樣品在測試前可能需要勻漿或者可能需要切片以用於原位測試。另外，當生物學樣品不 是液體形式時，(如果這種形式是測試所需的)，可能需要添加試劑如緩衝劑以移動樣品。如果靶DNA存在於生物學樣品中，則生物學樣品可以直接測試或者存在於生物學 樣品中的全部或一些核酸材料可在測試前被分離。在測試前預處理靶核酸分子是在本發明 範圍內，例如失活活病毒或者在凝膠上電泳。還應理解生物學樣品可以是新鮮採集的或者 其可以在測試前被儲存(例如通過冷凍)或者在測試前另外處理(如通過培養)。使樣品「接觸」引物應理解為促進引物與樣品的混合從而可以發生相互作用(例 如雜交)。實現這個目的的手段是本領域技術人員熟知的。選擇何種樣品最適合根據本文方法測試取決於情況的性質，如被監測狀況的性 質。例如，在一個優選的實施方案中，瘤形成狀況是分析主題。如果瘤形成狀況是白血病，則 血樣、淋巴液樣品或骨髓吸出物會提供合適的測試樣品。當瘤形成狀況是淋巴瘤時，淋巴結 活檢或血樣或骨髓樣品可能提供用於測試的合適組織來源。還需要考慮是否在監測瘤形成 細胞的原始來源或者是否監測轉移的存在或其它形式的從原始點的瘤形成的擴散。為此， 可能希望採集和測試來自一個哺乳動物的一些不同樣品。對於任何給定檢測情形選擇合適 樣品是本領域技術人員的技能。術語「哺乳動物」當用於本文時包括人類、靈長類、家畜動物(例如馬、牛、羊、豬、 驢)、實驗室試驗動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、陪伴動物(例如狗、貓)和捕獲野生動物(例如袋鼠、鹿、狐狸)。優選地，哺乳動物是人類或實驗室試驗動物。更優選哺乳動物是 人類。如前所述，本發明方法優選地作為連續擴增循環系列進行。為此，在步驟(ii)需 要最少2個擴增循環以實現擴增子產生，所述擴增子適合用於利用低效引物的寡核苷酸標 記的引物和保留效率的原始引物進行的擴增。但是，應理解本發明方法可以設計為在實現 與寡核苷酸標記的引物接觸之前進行3或更多個擴增循環。或者，如果本發明方法的所有 試劑在開始前均導入反應試管，則在步驟(iv)的基於標記的擴增變得有效之前可不發生 兩個以上擴增循環。還應理解，甚至在同一 PCR之內，每個擴增循環可產生新的擴增子，其 然後適於後續的基於標記的擴增。儘管本發明方法已設計為使得擴增輪次可以直接在前一輪擴增的擴增產物上連 續進行，這不應被理解為限制是否任何額外步驟被本領域技術人員摻入，如富集/選擇步 驟。例如，在第一輪擴增後可以尋求選擇或富集希望的擴增子及之後僅在該材料上進行第 二輪擴增。可以用於選擇或富集的方法包括(i)基於與引物連接的獨特標記的選擇步驟。例如，引物之一的生物素化提供了鑑 別和分離通過正向或反向引物延伸產生的擴增子的手段。匯集(flooding)具有生物素化 引物的擴增產物，所述引物可以作為探針以鑑別感興趣的擴增子，生物素化可以提供分離 那些擴增子的基礎。通過保證本發明引物組的每一個均包含獨特標記，可以以顯著特定性 選擇出僅感興趣的特定擴增子。具體地，本領域技術人員會尋求排除由正向引物擴增但沒 有隨後被反向引物擴增的擴增子。(ii)在凝膠上對產物電泳並僅切離很可能相關的一定條帶或區域，隨後將它們進 一步擴增。當在第二個擴增循環後凝膠上存在條帶時，如果測序有困難，可以嘗試通過將該 產物切離凝膠並用單獨的引物和/或較小的引物集合進行一系列PCR反應而進行清理。儘管本發明方法可以被改變以包括任何這種額外步驟，但是本發明方法的一個獨 特優勢是其被設計用於使不相關擴增子產生最小化，由此使實施富集或選擇步驟的需要最 小化。然而，根據特定情況，摻入這種步驟可能是有用的。在另一個實施例中，希望改變本發明方法以各種方式組合適應本發明方法的一或 多個擴增和一或多個其它擴增步驟，以增加特異性及促進希望產物的分離。圖6和11示 出實驗結果，其中1個標準PCR後接3輪瓶頸PCR。圖7示出實驗結果，其中2輪標準PCR 後接瓶頸PCR的2個循環。圖9、10和12示出實驗結果，其中1個標準PCR後接2輪瓶頸 PCR。還可以交替步驟及瓶頸PCR的循環。因此，可以通過任何合適手段優化感興趣序列的 擴增，如增加方法第二階段的PCR循環數或者進行後續PCR或其它形式擴增。所述方法也 可以重複應用以提供感興趣序列的進一步富集和擴增至希望程度。顯示經重複使用所述方 法得到的感興趣序列的進行性富集的例子見圖5和11 ；用數據進行的計算提示用於這些實 驗的第2和3輪的低效引物的效率大約是最大值的1%。這些不同實驗設計是本領域技術 人員理解的。提供擴增感興趣合適區域的有效手段可具有一系列應用，包括但非限於特徵在於 特定基因序列的疾病狀況的診斷和/或監測，感興趣基因區域的鑑定或分析，DNA斷裂點區 域的鑑別或鑑定，以及感興趣基因序列的分離，其中僅在感興趣基因序列一個末端的核苷 酸序列是已知的或者可以推導的。
本發明另一個方面涉及擴增感興趣的DNA區域的方法，所述方法包括⑴使DNA樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核 苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的DNA樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的DNA與針對互補於步驟⑴的寡核苷酸標記的序列的 部分或全部序列的引物接觸；(iv)擴增步驟(iii)的DNA樣品；及(v)分離和/或分析所述擴增的DNA。本發明進一步通過下述非限制性實施例描述。實施例1用瓶頸PCR進行BCR-ABL DNA斷裂點擴增用BCR和ABL特異性引物在4輪PCR篩選中擴增BCR-ABL DNA斷裂點。設計了 6 個BCR特異性引物及282個ABL特異性引物分別跨越BCR(3. 2kb)和ABL(140kb)DNA的主 要斷裂點區域。第一輪PCR擴增在25iU中進行，所述25 yl含有50ng單一 BCR特異性引物， lOOng所有282個ABL特異性引物(每個引物350pg)，50ng Tag A，50ng基因組DNA，50mM KCl,2mM Tris HC1 (pH8. 4)，1U Platinum Taq DNA 聚合酶(Invitrogen)，5mM MgCl2 和 300 u M每種dUTP、dATP、dGTP和dTTP。擴增條件是95°C 4分鐘；然後6個循環的97 °C 1 分鐘、65°C 1分鐘，每2個循環溫度降低1°C、72V 1分鐘；然後是4個循環的96°C 30秒、 62°C 1分鐘，前2個循環後溫度降低1°C、72°C 1分鐘；然後10個循環的94°C 30秒、61°C 1 分鐘、72°C 1分鐘。ABL特異性引物在引物5'末端具有標記區域(Tag A)，其不與ABL DNA互補。在 第一輪PCR中，附著於ABL特異性引物的標記序列摻入擴增子中，使得DNA進一步在後續輪 的PCR中擴增，使用BCR引物與TagA弓丨物而非ABL特異性反向引物。每輪PCR使用不同的 標記序列。第二、第三和第四輪PCR擴增25iU中進行，其含有前一輪PCR反應混合物的稀釋 液(稀釋倍數為100)，50ng單一 BCR特異性嵌套式引物，500pg嵌合Tag引物(在第二、第 三和第四輪中分別為Tag A/I，I/l，l/2)，50ng單一Tag引物(第二、第三和第四輪中分別為 Tag 1,1,2) ,50mM KCl,2mMTris HC1 (pH8. 4)，1U Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)， 5mM MgCl2和300 u M每種dUTP、dATP、dGTP和dTTP。擴增條件是95°C 4分鐘；然後20個 循環的94°C 30秒，65°C 1分鐘，72°C 1分鐘。實施例2用瓶頸PCR進行PML-RAR a DNA斷裂點擴增用瓶頸PCR從急性早幼粒細胞白血病患者分離PML-RARa易位斷裂點。患者DNA 用多個RARa引物和單個PML引物擴增，然後進行2輪瓶頸PCR。擴增的DNA在2%瓊脂糖 凝膠上電泳(圖9a)。為證實已分離斷裂點，用斷裂點序列設計跨越斷裂點的RARa和PML引物，用這些引物擴增患者DNA—輪(圖9b)。還確定了圖9a凝膠上所示的擴增條帶的序 列(圖9c)。實施例3用簡併引物及瓶頸PCR的基因步移用50ng基因特異性正向引物、50ng各種簡併反向引物之一和50ng反向標記引物 進行沿3個基因APC、BRCA1和myocillin的基因步移。簡併反向引物在3'末端具有4_6 個隨機正常殘基，隨後3-6個簡併殘基，隨後12-18、通常18個正常殘基的隨機標記序列。 最常用簡併引物在3'末端具有5個固定鹼基，隨後是5個簡併鹼基，隨後18個鹼基的標 記序列(5' TGCTAGGATCCAAGGNNNNNATTCG3『 (SEQ ID N 0:1))。反向標記引物具有與簡併 反向引物上的標記相同的序列。5個PCR循環(在35°C退火5分鐘)，隨後15個循環(在 55°C退火3分鐘)。PCR 在 25ii 1 體積中進行，具有 50ng 總 DNA，5mM MgCl2，0. ImMdUTP，0. 2mM dTTP 和 0. 3mM 每種 dCTP、dATP 和 dGTP,和 1 單位 PlatinumTaq 聚合酶(Invitrogen)。引物來自 Sigma-Aldrich (St. Louis，M0，USA)或者 Invitrogen (Carlsbad，CA，USA)。PCR 循環條件典 型涉及在94°C變性30秒，如上所述退火，及在72°C延伸90秒。進行1-3輪的瓶頸PCR，通常來自上述最初一輪的擴增材料的1/100稀釋液在第一 個瓶頸PCR中擴增，來自前一輪的擴增材料的1/1000稀釋液用於每一後續輪次。每輪PCR 進行20個循環，但進行電泳時(在這種情況中其進行至完成)，進行30-40個循環。每個 PCR含有50ng嵌套式正向引物，0. 5ng雜合反向引物和50ng標記反向引物。雜合反向引物 由具有與前一輪PCR的標記引物相同的序列的3'末端及具有新標記序列的5'末端組成。 標記反向弓丨物具有與新標記序列相同的序列。PCR產物經凝膠電泳檢查，分離分開的條帶並通常用正向引物和用於最後擴增的 標記引物測序。在一些涉及基因步移的實驗中，測序完整擴增產物，而無論是否一個或多個 分開的條帶被顯現。在一個涉及基因步移的實驗中，測序反應用最初測序引物的732bp和 1302bp下遊的引物進行。實施例4圖13提供了適合用於本發明方法中的引物和標記序列的例子。本領域技術人員理解本文所述本發明適合進行不同於特別描述的變異和修飾。應 理解本發明包括所有這種變異和修飾。本發明還包括說明書中指出的所有步驟、特徵、組合 物和化合物，其逐個或集合的形式，及任何兩個或多個所述步驟或特徵的任何及全部組合。參考文獻Cheng et al. ,1994, Effective amplification of long targets from cloned inserts and humangenomic DNA. Proc Natl Acad Sci.91 :5695_5699Sambrook and Russel,2001, Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd Ed. ColdSpring Harbor, N. ff. :Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8 :In vitroAmplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction.Nailis H, Coeny e T, Van Ni euwerburgh F, Deforce D, Nelis HJ(2006). "Development andevaluation of different normalization strategies for gene expression studies in Candidaalbicans biofilms by real-time PCR". BMC MolBiol. 7 25 Nolan T, Hands RE, Bustin SA(2006). "Quantification of mRNA using real-time RT-PCR". Nat.Protoc. 1 :1559—158權利要求
擴增感興趣核酸區域的方法，所述方法包括(i)使核酸樣品接觸(a)針對所述感興趣區域的一或多個正向引物；及(b)針對所述感興趣區域的一或多個反向引物其中組(a)或組(b)引物是功能上低效的並在它們的5』末端可操縱地連接寡核苷酸標記；(ii)通過至少兩個擴增循環擴增步驟(i)的核酸樣品；(iii)將步驟(ii)的擴增的核酸與針對互補於步驟(i)的寡核苷酸標記的序列的部分或全部序列的引物接觸；及(iv)擴增步驟(iii)的核酸樣品。
2.權利要求1的方法，其中所述核酸是DNA。
3.權利要求1或2的方法，其中步驟(iv)的所述擴增的核酸被分離和/或分析。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述感興趣的核酸區域是已通過擴增方法產生的 DNA分子的區域。
5.權利要求4的方法，其中所述擴增方法是PCR。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中步驟(ii)和(iv)的擴增方法是PCR、NASBA或鏈置換擴增。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中所述引物是4-60個核苷酸長，10-50個核苷酸長， 15-45個核苷酸長，20-40個核苷酸長或25-35寡核苷酸長。
8.權利要求7的方法，其中所述引物是26、27、28、29、30、31、32、33或34個核苷酸長。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中所述引物通過如下方法被賦予功能上低效(i)降低所用引物濃度；(ii)降低引物雜交時間；(iii)增加雜交反應發生所需的溫度；(iv)修飾引物長度； (ν)改變引物解鏈溫度；(Vi)在雜交/引物延伸階段中引入離液劑；(Vii)將引物競爭性抑制劑如其互補序列導入反應中；(Viii)將核苷酸錯配導入引物序列；(ix)使用引物類似物，其在雜交中與氫鍵合有效性較差(hydrogen-bondless effectively)0
10.權利要求1-9任一項的方法，其中被低效化的引物組是能與非靶DNA區域混雜雜交 的引物組。
11.權利要求10的方法，其中所述引物是簡併引物。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中所述感興趣的區域是基因組DNA的區域、基因、 基因部分、DNA重組產物或染色體基因易位斷裂點。
13.權利要求12的方法，其中所述染色體基因易位斷裂點是BCR-ABL。
14.權利要求12的方法，其中所述染色體基因易位斷裂點是PML-RARα。
15.權利要求13的方法，其中使用1-20個針對BCR的正向引物和250-350個針對ABL的反向引物。
16.權利要求15的方法，其中使用12個針對BCR的正向引物和282個針對ABL的反向 引物。
17.權利要求15的方法，其中使用6個針對BCR的正向引物和24個針對ABL的反向引 物。
18.權利要求15的方法，其中使用1個針對BCR的正向引物和282個針對ABL的反向 引物。
19.權利要求15的方法，其中使用6個針對BCR的正向引物和270-310個針對ABL的 反向引物。
全文摘要
本發明總體涉及擴增感興趣的核酸區域的方法，更特別地涉及用PCR方法擴增感興趣的核酸區域的方法，所述PCR方法設計為用於使從結合非感興趣的特異性區域的核酸區域的引物的擴增子產生最小化。本發明方法基於下述的確定，即通過使正向引物或反向引物的功能性低效，不相關核酸區域的擴增速率能相對於感興趣區域的擴增而言降低。提供感興趣的核酸區域的選擇性擴增的手段可具有一系列應用，包括但非限於特徵在於特定基因序列的疾病狀況的診斷和/或監測，感興趣基因區域的鑑定或分析，DNA斷裂點區域的鑑別或鑑定，感興趣基因序列的分離，其中僅感興趣基因序列一個末端的核苷酸序列是已知的。
文檔編號C12Q1/68GK101849022SQ200880112859
公開日2010年9月29日 申請日期2008年10月2日 優先權日2007年10月22日
發明者A·A·莫利 申請人:莫諾匡特私人有限公司