一種巨大芽孢桿菌及其產普魯蘭酶的方法與產品與流程

2023-09-11 14:27:25 2

本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種巨大芽孢桿菌p6。本發明還涉及該菌株產普魯蘭酶的方法及其產品。
背景技術：
：普魯蘭酶(pullulanase,ec3.2.1.41)是一種可以特異地水解普魯蘭多糖、澱粉及相關分支多糖中α-1,6糖苷鍵的澱粉脫支酶。由於它對α-1,6糖苷鍵的特異水解功能，普魯蘭酶被廣泛地應用於澱粉糖加工工業、醫藥領域、飼料、食品改性及釀酒等工業中。由於普魯蘭酶的重要應用價值，我國從上世紀70年代開始即開始其相關研究，近年來研究熱度更是逐步升高。目前，普魯蘭酶的研究和應用中存在以下問題：1.商品化的普魯蘭酶存在商業壟斷，我國的普魯蘭酶仍依賴進口，主要為丹麥novo公司的promozyme產品。2.雖然基因工程技術使得普魯蘭酶的異源表達研究取得了一些成績，但總體來說表達量較低、酶穩定性不好。3.通過原始產酶菌株發酵提取獲得普魯蘭酶，又存在生物安全性不理想、純化成本高、產品純度低等問題。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是針對目前現有技術的不足，提供一種新的能產細胞壁結合型普魯蘭酶的巨大芽孢桿菌p6(bacillusmegaterium)。本發明所要解決的另一個技術問題是提供了上述巨大芽孢桿菌p6(bacillusmegaterium)產普魯蘭酶的方法及酶產品。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明的特徵包括巨大芽孢桿菌p6(bacillusmegaterium)菌株本身(以下簡稱菌株p6)，以及利用該菌株產普魯蘭酶的方法，以及利用該菌株所產的普魯蘭酶產品。本發明所涉及的菌株是在中國江蘇省連雲港港口海泥中分離到的巨大芽孢桿菌p6(bacillusmegaterium)，該菌株已於2017年1月5日保藏於中國典型微生物保藏中心cctcc，保藏編號為cctccno：m2017009，保藏地址為：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心。以下對本發明進行詳細的闡述。一、本發明菌株p6的篩選方法1、本發明中涉及的培養基：牛肉膏蛋白腖培養基：牛肉膏0.3％，蛋白腖1％，nacl0.5％，蒸餾水配製，ph7。初篩培養基：普魯蘭糖0.3％，酵母粉0.5％，陳海水配製，自然ph。復篩培養基：普魯蘭糖0.3％，酵母粉0.5％，瓊脂2％，陳海水配製，自然ph。產酶培養基：普魯蘭糖1％，酵母粉1％，磷酸鹽緩衝液(ph7，0.1m)，或加瓊脂2％(固體平板)。2、菌株的篩選方法：取10g海泥加入到裝有90ml無菌水的三角瓶中，浸泡1h，振蕩30min，使樣品充分打散後，吸取1ml於100ml初篩培養基中，25℃、180r/min振蕩培養20h。取1ml培養液梯度稀釋，選擇合適的稀釋度塗布在復篩培養基上，25℃培養48h，待長出菌落後，將平皿倒置，向平皿蓋中倒入10ml無水乙醇，於4℃放置，每隔2h觀察一次，觀察菌落周圍是否出現透明圈，挑取有透明圈的單菌落，轉接到產酶培養基中，25℃、180r/min振蕩培養72h，8000r/min離心5min收集細胞，10倍體積無菌水吹吸、潤洗細胞，重複洗滌3遍，再次以8000r/min離心5min，取細胞測定酶活力大小。選出普魯蘭酶活性較高的菌株p6。二、本發明菌株p6的形態特徵和生理生化特徵1、形態特徵菌株p6為革蘭氏陽性杆狀細菌，有芽孢，不能運動。菌體大小約為1.2-1.6μm×2.0-4.0μm，杆狀，末端圓，兩個或多個呈鏈狀排列，參見圖1。芽孢大小為0.7-1.1μm×1.2-2.0μm，橢圓形，次端生，以產酶培養基進行搖瓶培養時，轉速180r/min，25℃培養30h產生10％芽孢，培養40h完全變成芽孢。在5mm厚度的產酶培養基上的菌落特徵為：獨立單菌落的直徑為2mm-5mm，圓形、略微土黃色、表面粗糙、乾燥無光澤、中間略微隆起，參見圖2；當培養時間延長，隨著細胞逐漸破裂釋放芽孢時，菌落中心出現液化和光澤，逐漸向邊緣擴大，當細胞完全破裂釋放芽孢時，菌落表面完全溼潤光澤。2、生理生化特徵菌株p6的生理生化特徵參見表1(a-c)。菌株p6的精氨酸雙水解酶反應、甲基紅反應、賴氨酸脫羧酶反應、鳥氨酸脫羧酶反應、吲哚產生反應、h2s反應、硝酸鹽還原反應、脲酶、氧化酶反應為陰性，酪素水解反應、β–半乳糖苷酶反應、檸檬酸生長、明膠水解、澱粉水解、vp反應、接觸酶反應陽性，能夠利用l-丙氨酸、l-天冬氨酸、d-果糖-6-磷酸、l-組氨酸、葡糖醛醯胺、d-天冬氨酸、乙醯乙酸、l-蘋果酸、糊精、α-d-葡萄糖、奎寧酸、甲酸進行生長；該菌株對林可黴素、8％nacl、1％乳酸鈉、四唑紫、ph5.0化學因素不敏感，對二甲胺四環素、鹽酸胍、十四烷硫酸鈉、利福黴素sv、d-絲氨酸、溴酸鈉、醋竹桃黴素敏感。通過biolog微生物鑑定系統(geniiimicrostation)的生理生化反應結果，初步判定該菌株p6為巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)。表1(a).菌株p6的部分生理生化特徵實驗項目結果實驗項目結果細胞形態杆狀革蘭氏染色陽性形成芽孢+接觸酶+精氨酸雙水解酶-氧化酶-甲基紅反應-vp反應+賴氨酸脫羧酶-澱粉水解+酪素水解+明膠水解+β–半乳糖苷酶+脲酶-檸檬酸生長+硝酸鹽還原-鳥氨酸脫羧酶-h2s-吲哚產生-50℃生長+註：+：陽性；-：陰性。表1(b).菌株p6的生理生化特徵(biologgenⅲ(生長實驗))註：+：生長；-：不生長。表1(c).菌株p6的生理生化特徵(biologgenⅲ(化學敏感))註：+：不敏感；-：敏感3、菌株p6的分子生物學鑑定根據細菌16srdna序列和dna解旋酶b亞基基因(gyrb)序列的保守區設計兩對引物：16srdna序列的正向引物f1：5』-taatacatgcaagtcgagcgaactg-3』，反向引物r1：5』-accttaggcggctagctccttacgg-3』；gyrb序列的正向引物f2：5』-ggcggcggcggctataaagtatctgg-3』，反向引物r2：5』-tgtaagctcacgagcttttttagctg-3』。用takara試劑盒提取菌株p6的基因組dna，以其基因組dna為模板，進行兩種序列的pcr擴增反應，然後用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，對回收後純化的pcr產物進行測序，得菌株p6的16srdna序列(見seqidno：5)和gyrb基因序列(見seqidno：6)。其中，pcr條件為：25μl反應體系，94℃預變性5min；94℃，30s；55℃，45s；72℃，45s；一共35個循環，72℃終延伸7min。利用ncbi網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的系統進化分析軟體(blasttreeview)基於獲得的菌株p6的16srdna序列和gyrb基因序列對菌株p6進行種系關係分析，結果均提示菌株p6為巨大芽孢桿菌bacillusmegaterium。由上述biolog微生物鑑定系統的生理生化反應結果，以及《伯傑氏系統細菌學手冊》(第8版)，鑑定出菌株p6為巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)。三、本發明菌株p6的生長特性對本發明提供的菌株p6的生長特性進行了細緻的研究，了解不同條件下該菌的生長情況。1、種子液的製備：將巨大芽孢桿菌p6接種到牛肉膏蛋白腖培養基中，轉速180r/min，裝液量20％，25℃培養12h，得到種子液。2、溫度對菌株p6生長的影響：將種子液以1％接種量接種於牛肉膏蛋白腖培養基，轉速180r/min，裝液量20％，分別在不同溫度下培養，每隔一段時間測定細胞濃度，選擇在600nm波長下測定細胞懸液od值，該菌株生長溫度範圍為15～50℃，最適生長溫度為35℃，參見圖3。3、ph對菌株p6生長的影響：在牛肉膏蛋白腖培養基中加入終濃度為0.1m的磷酸鹽緩衝液，使培養基的ph分別為3.5～11.0之間，將種子液以1％接種量接種於不同ph的培養基，在25℃培養24h，測定細胞濃度，生長ph範圍為4～10，最適生長ph為6，參見圖4。4、nacl對菌株p6生長的影響：配製不同nacl濃度的牛肉膏蛋白腖培養基，使其濃度為0％～12％，在25℃培養24h，測定細胞濃度，能進行生長的nacl濃度為0％～8％，最適生長的nacl濃度為0％，參見圖5。四、菌株p6產普魯蘭酶的方法1、搖瓶培養：將巨大芽孢桿菌p6接種到牛肉膏蛋白腖培養基中，裝液量15～40％，搖床轉速160～200r/min，25℃培養10～20h，得種子液，將種子液以1％的接種比例接種到產酶培養基中，裝液量15～40％，搖床轉速160～200r/min，25℃培養48h～96h，得發酵液；2、粗酶液製備：取上述發酵液在12000r/min條件下離心15min得到沉澱，沉澱通過超聲波細胞破碎儀進行細胞破碎，超聲溫度0℃，超聲功率250～300w，超聲處理5～10min，取上清即為粗酶液。3、粗酶液的分離純化：(1)取粗酶液置於磁力攪拌器上冰浴攪拌，向粗酶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨的飽和度達到60％～80％，攪拌40min後，冰浴靜置1～1.5h，離心處理，收集沉澱，用濃度為0.2m、ph值為7磷酸鹽緩衝液溶解沉澱，0℃下透析過夜，再用聚乙二醇20000在4℃進行濃縮，得初步純化的濃縮酶液；(2)將上述濃縮酶液上葡聚糖凝膠層析柱，以濃度為0.2m、ph值為7磷酸鹽緩衝液為洗脫液洗脫，收集洗脫液並檢測其活性，即得進一步純化的普魯蘭酶酶液。進一步優選地，所述的葡聚糖凝膠層析柱的填料為sephadexg100，葡聚糖凝膠層析柱的徑高比為1:60，洗脫的流速為0.5ml/min。其中，在粗酶液分離純化的步驟(1)中，對硫酸銨鹽析法純化蛋白的條件進行了篩選：在0℃下向粗酶液中加入硫酸銨，分別至飽和度0～20％、20％～40％、40％～60％、60％～80％、80％～100％，攪拌40min後靜置1～1.5h，12000r/min離心25min，分別收集沉澱，每個硫酸銨梯度的沉澱用0.2m、ph7的磷酸緩衝液溶解，溶解後在冰浴下用1000倍體積純水透析脫鹽過夜，得脫鹽酶溶液，對不同的硫酸銨飽和度下得到的脫鹽的酶溶液進行普魯蘭酶活性測定。結果顯示，在60％-80％飽和度下的鹽析沉澱物中具有最高酶活，因此，將硫酸銨的飽和度選為60％-80％。本發明所述的磷酸鹽緩衝液為磷酸鉀緩衝液、磷酸鈉緩衝液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液。五、普魯蘭酶的性質1、反應溫度對酶活性的影響將反應體系置於不同溫度下與底物發生反應，測定酶活力，結果見圖6，酶的最適作用溫度為45℃，30℃和65℃均有20％的酶活力，在35℃～50℃溫度範圍時有70％以上的催化活力。2、酶的熱穩定性取適量粗酶液分別在不同溫度(30℃、40℃、45℃、50℃和65℃)下保溫50h，每隔3h取出一組樣品，迅速置於4℃冰箱內，待保溫結束後統一在標準條件下測定殘餘酶活，以未進行溫度處理的酶液的酶活設為100％，結果見圖7，菌株p6產的普魯蘭酶的在中溫時熱穩定性較好，在45℃下保溫5h後酶活仍能保持70％以上，但在65℃下保溫1h後酶活即為0％。3、反應ph對酶活性的影響用不同ph的緩衝液配製1％的普魯蘭糖溶液，加入酶液後，反應體系為：25μl粗酶液，75μl緩衝液，在45℃下進行酶活力測定，不同ph值的緩衝液為：20mm檸檬酸鈉緩衝液(ph3.0到6.0)；20mm磷酸鹽緩衝液(ph6.0到8.0)；50mmtris-鹽酸緩衝液(ph8.0～8.5)；50mm甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液(ph9.0到10.0)。結果見圖8，ph6.5該酶的活性最高，在ph5～7.5之間有70％酶活力。4、酶的ph穩定性將25μl酶液與75μl不同ph的緩衝液混合，在45℃水浴鍋中保溫12h，每隔2h取一次樣，迅速置於4℃冰箱內，待保溫結束後統一在標準條件下測定殘餘酶活，以未進行溫度處理的酶液的酶活設為100％。結果見圖9，結果表明在45℃保溫下5h後，普魯蘭酶在ph6.0～7.5範圍內穩定，殘餘酶活力保持在50％以上，在ph3.0和ph8.5沒有酶活性，在ph4和ph8保持20％以上殘餘酶活力。5、酶的活性測定酶活單位定義為：45℃條件下，每分鐘催化普魯蘭糖產生1μm還原糖所需的粗酶蛋白含量(μg)為一個單位。普魯蘭酶酶活測定方法：將25μl酶液加入到75μl含有1％的普魯蘭糖的磷酸緩衝液(0.02m，ph6.5)中，45℃水浴中反應15min，以麥芽糖製作標準曲線，根據標準曲線用dns法測定反應液中還原糖含量，然後根據酶活單位定義計算酶活力。普魯蘭酶在澱粉糖加工工業、醫藥領域、飼料、食品改性及釀酒等工業中具有廣泛的應用。在澱粉製糖工業中，普魯蘭酶和α-澱粉酶、β-澱粉酶等協同作用可以用來提高澱粉得糖率，生產高葡萄糖漿和超高麥芽糖漿。高麥芽糖漿代替酸水解澱粉糖漿製造硬糖，不僅口味柔和，甜度適中，產品透明度高，不易著色，可延長保藏期，而且具有更好的熱穩定性可塑性。在醫藥領域，用超高麥芽糖漿可進一步製備純麥芽糖，由於其不引起血糖濃度升高，具有在靜脈注射中代替葡萄糖的優勢。另外，普魯蘭酶可以用於緩慢消化澱粉的製備。緩慢消化澱粉有助於維持血糖的穩態，在治療和預防糖尿病和心腦血管疾病方面具有一定的保健作用。在飼料和養殖業中，在飼料中添加普魯蘭酶能有效促進動物對飼料中營養物質的消化吸收，減少浪費，縮短生長周期，提高飼料利用率，提高動物的抗病能力，減少疾病發生，節約糧食，提高經濟效益，以及提高雞的產蛋效率和奶牛的產奶率等。與現有技術相比，本發明提供的菌株p6能以普魯蘭糖為唯一碳源生長，能夠產生細胞壁結合型普魯蘭酶，通過收集細胞，並以細胞直接作為粗酶製劑製備普魯蘭酶，簡化了傳統的以細胞分泌方法製備普魯蘭酶的提取步驟，降低了生產成本，促進了普魯蘭酶生產的工業化。附圖說明圖1為菌株p6細胞形態(×1000)圖；圖2為菌株p6單菌落形態圖；圖3為不同溫度對菌株p6生長的影響圖；圖4為不同ph對菌株p6生長的影響圖；圖5為不同nacl濃度對菌株p6生長的影響圖；圖6為不同反應溫度對酶活性的影響圖；圖7為不同溫度對酶熱穩定性的影響圖；圖8為不同反應ph對酶活性的影響圖；圖9為不同ph對酶ph穩定性的影響圖。本發明所涉及的菌株p6是在中國江蘇省連雲港港口海泥中分離到的巨大芽孢桿菌p6(bacillusmegateriump6)，該菌株已於2017年1月5日保藏於中國典型微生物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2017009，保藏地址為：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，電話：027-68752319。具體實施方式以下通過實例進一步說明本發明，以使本領域技術人員更好地理解本發明，而不構成對本發明權利的限制。實施實例1，一種巨大芽孢桿菌p6(bacillusmegateriump6)cctccno：m2017009。該菌株具有以下特徵：菌株為革蘭氏陽性杆狀細菌、有芽孢、不能運動，菌體大小約為1.2-1.6μm×2.0-4.0μm，杆狀，末端圓，兩個或多個呈鏈狀排列；芽孢大小為0.7-1.1μm×1.2-2.0μm，橢圓形，次端生；以產酶培養基進行搖瓶培養時，轉速180r/min，25℃培養30h產生10％芽孢，40h完全變成芽孢；該菌株在5mm厚度的產酶培養基上的菌落特徵為：菌落直徑為2mm-5mm，圓形、略微土黃色、表面粗糙、乾燥無光澤、中間隆起，隨著培養時間延長，當細胞逐漸破裂釋放芽孢時，菌落中心出現液化和光澤，逐漸向邊緣擴大，當細胞完全破裂釋放芽孢時，菌落表面完全溼潤光澤；該菌株的精氨酸雙水解酶反應、甲基紅反應、賴氨酸脫羧酶反應、鳥氨酸脫羧酶反應、吲哚產生反應、h2s反應、硝酸鹽還原反應、脲酶、氧化酶反應為陰性，酪素水解反應、β–半乳糖苷酶反應、檸檬酸生長、明膠水解、澱粉水解、vp反應、接觸酶反應陽性。能夠利用l-丙氨酸、l-天冬氨酸、d-果糖-6-磷酸、l-組氨酸、葡糖醛醯胺、d-天冬氨酸、乙醯乙酸、l-蘋果酸、糊精、α-d-葡萄糖、奎寧酸、甲酸進行生長，對林可黴素、8％nacl、1％乳酸鈉、四唑紫、ph5.0化學因素不敏感，對二甲胺四環素、鹽酸胍、十四烷硫酸鈉、利福黴素sv、d-絲氨酸、溴酸鈉、醋竹桃黴素敏感。該菌株的生長特性為：生長溫度範圍為15～50℃，生長ph範圍為4～10，生長的nacl濃度為0％～8％，最適生長溫度為35℃，最適生長ph為6,最適生長的nacl濃度為0％。實施實例2，一種如實施例1所述巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)p6產普魯蘭酶的方法，其步驟如下：(1)搖瓶培養：將巨大芽孢桿菌p6接種到牛肉膏蛋白腖培養基中，裝液量15％，搖床轉速160r/min，25℃培養10h，得種子液，將種子液以1％的接種比例接種到產酶培養基中，裝液量15％，搖床轉速160r/min，25℃培養48h，得發酵液；所述的牛肉膏蛋白腖培養基的組成為：牛肉膏0.3％，蛋白腖1％，nacl0.5％，蒸餾水配製，ph7；所述的產酶培養基的組成為：普魯蘭糖1％，酵母粉1％，磷酸鹽緩衝液配製，ph7；其中，磷酸鹽緩衝液的濃度為0.1m、ph值為7；(2)粗酶液製備：取上述發酵液在12000r/min條件下離心15min得到沉澱，沉澱通過超聲波細胞破碎儀進行細胞破碎，超聲溫度0℃，超聲功率250w，超聲處理5min，取上清即為粗酶液。實施實例3，一種如實施例1所述巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)p6產普魯蘭酶的方法，其步驟如下：(1)搖瓶培養：將巨大芽孢桿菌p6接種到牛肉膏蛋白腖培養基中，裝液量15～30％，搖床轉速200r/min，25℃培養15h，得種子液，將種子液以1％的接種比例接種到產酶培養基中，裝液量30％，搖床轉速200r/min，25℃培養96h，得發酵液；所述的牛肉膏蛋白腖培養基的組成為：牛肉膏0.3％，蛋白腖1％，nacl0.5％，蒸餾水配製，ph7；所述的產酶培養基的組成為：普魯蘭糖1％，酵母粉1％，磷酸鹽緩衝液配製，ph7；其中，磷酸鹽緩衝液的濃度為0.1m、ph值為7；(2)粗酶液製備：取上述發酵液在12000r/min條件下離心15min得到沉澱，沉澱通過超聲波細胞破碎儀進行細胞破碎，超聲溫度0℃，超聲功率300w，超聲處理10min，取上清即為粗酶液。實施實例4，一種如實施例1所述巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)p6產普魯蘭酶的方法，其步驟如下：(1)搖瓶培養：將巨大芽孢桿菌p6接種到牛肉膏蛋白腖培養基中，裝液量20％，搖床轉速180r/min，25℃培養12h，得種子液，將種子液以1％的接種比例接種到產酶培養基中，裝液量20％，搖床轉速180r/min，25℃培養72h，得發酵液；所述的牛肉膏蛋白腖培養基的組成為：牛肉膏0.3％，蛋白腖1％，nacl0.5％，蒸餾水配製，ph7；所述的產酶培養基的組成為：普魯蘭糖1％，酵母粉1％，磷酸鹽緩衝液配製，ph7；其中，磷酸鹽緩衝液的濃度為0.1m、ph值為7；(2)粗酶液製備：取上述發酵液在12000r/min條件下離心15min得到沉澱，沉澱通過超聲波細胞破碎儀進行細胞破碎，超聲溫度0℃，超聲功率280w，超聲處理8min，取上清即為粗酶液。實施實例5，一種如實施例2-4任何一項所述的巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)p6產普魯蘭酶的方法中，所述的粗酶液採用以下方法進行分離純化：(1)取粗酶液置於磁力攪拌器上冰浴攪拌，向粗酶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨的飽和度達到60％％，攪拌40min後，冰浴靜置1h，離心處理，收集沉澱，用磷酸鹽緩衝液溶解沉澱，0℃下透析過夜，再用聚乙二醇20000在4℃進行濃縮，得初步純化的濃縮酶液；(2)將上述濃縮酶液上葡聚糖凝膠層析柱，以磷酸鹽緩衝液為洗脫液洗脫，收集洗脫液並檢測其活性，即得進一步純化的普魯蘭酶酶液。實施實例6，一種如實施例2-4任何一項所述的巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)p6產普魯蘭酶的方法中，所述的粗酶液採用以下方法進行分離純化：(1)取粗酶液置於磁力攪拌器上冰浴攪拌，向粗酶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨的飽和度達到80％，攪拌40min後，冰浴靜置1.5h，離心處理，收集沉澱，用磷酸鹽緩衝液溶解沉澱，0℃下透析過夜，再用聚乙二醇20000在4℃進行濃縮，得初步純化的濃縮酶液；(2)將上述濃縮酶液上葡聚糖凝膠層析柱，以磷酸鹽緩衝液為洗脫液洗脫，收集洗脫液並檢測其活性，即得進一步純化的普魯蘭酶酶液。實施實例7，一種如實施例5或6所述的巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)p6產普魯蘭酶的方法的步驟(1)和(2)中，所述的磷酸鹽緩衝液為磷酸鉀緩衝液、磷酸鈉緩衝液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液，濃度為0.2m，ph值為7。實施實例8，一種如實施例5或6所述的巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)p6產普魯蘭酶的方法的步驟(2)中：所述的葡聚糖凝膠層析柱的填料為sephadexg100，葡聚糖凝膠層析柱的徑高比為1:60，洗脫的流速為0.5ml/min。實施實例9，一種實施例2-8任何一項所述的方法所產生的普魯蘭酶，其特徵在於：所述的普魯蘭酶理化性質為：普魯蘭酶的最適作用溫度為45℃，30℃和65℃均有20％的酶活力，在35℃～50℃溫度範圍時有70％以上的催化活力，在45℃下保溫5h後酶活仍能保持70％以上，但在65℃下保溫1h後酶活即為0％；該酶在ph6.5時活性最高，在ph5～7.5範圍內具有70％酶活力；該酶在45℃下保溫5h後，在ph6.0～7.5範圍內穩定，殘餘酶活力保持在50％以上，在ph3.0和ph8.5沒有酶活性，在ph4和ph8保持20％以上殘餘酶活力。sequencelisting淮海工學院；江蘇省海洋資源開發研究院（連雲港）一種巨大芽孢桿菌及其產普魯蘭酶的方法與產品2017-016patentinversion3.5125dna人工序列正向引物f11taatacatgcaagtcgagcgaactg25225dna人工序列反向引物r12accttaggcggctagctccttacgg25326dna人工序列正向引物f23ggcggcggcggctataaagtatctgg26426dna人工序列反向引物r24tgtaagctcacgagcttttttagctg2651434dna巨大芽孢桿菌p6（bacillusmegaterium）16srdna5taatacatgcaagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggac60gggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagc120taataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatca180cttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaac240gatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagact300cctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgc360cgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaca420agagtaactgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgcca480gcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgc540gcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattgga600aactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcg660tagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgag720gcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgat780gagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactc840cgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaag900cggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcc960tctgacaactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatg1020gttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttg1080atcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggagg1140aaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctaca1200atggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctc1260agttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggat1320cagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgaga1380gtttgtaacacccgaagtcggtggagtaaccgtaaggagctagccgcctaaggt14346866dna巨大芽孢桿菌p6（bacillusmegaterium）dna解旋酶b亞基基因（gyrb）6ggcggcggcggctataaagtatctggtggattacacggtgtaggtgcctcagttgttaat60gactttctacctcattggaagtgcacgtacatcgtgacggtaaagttcattatcaaaaat120atgaacgaggtgtaccggctgctgacttaaaagtagttggagaaacagataaaacaggta180ctgttattcaattccgtccagacggtgaaatttttacagaaacgcttgaatacgattttg240atacgttagctaatcgtctgcgtgagttagctttcttaaatcgcggcattaaaattacga300ttgaagacaaacgtgaagaagataaaagacgtgagtatcactatgaaggcggaattaagt360cttacgttgaacacttaaaccgttcgaaagaagtgattcacgaagagccaatctatattg420aaggtaatcgagacaacatttctgtagaaattgctattcaatataacgatagctatacaa480gtaatttatattcttttgcaaacaatattcacacatatgaaggtggaacgcacgaagcag540gatttaaaacagcgttaacgcgtgtaattaacgactatgcacgtaaaaacagcgtattta600aagacagtgacgccaatctaacaggtgaagatgttcgtgaaggaattacagctatcatct660ctattaagcacccagatccgcagttcgaaggacaaacaaaaacaaagctgggaaatagtg720aagcaagaacaattactgactctgtgtttgcagaacacttagaaacttacttgctagaga780accctattgtggcgaaaaaggtaattgaaaaaggtttaatggctgcaagagcaagaatgg840cagctaaaaaagctcgtgagcttaca866當前第1頁12