用於個人識別的13個snp位點多色螢光複合擴增試劑盒的製作方法
2023-09-12 14:07:30 2
專利名稱：用於個人識別的13個snp位點多色螢光複合擴增試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於個人識別的體外一次性複合擴增13個SNP基因座的試 劑盒，屬於法醫學個人識別領域的發明。
背景技術：
1996年美國的E. Lander首次提出了稱之為"第三代遺傳標記"的"單核 苷酸多態性"(single nucleotide polymorphism, SNP) 。 SNP是指在染色體 基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態性，而其中最少的一種等 位基因在群體中的頻率不小於1%。它包括單鹼基的轉換、顛換、插入及缺失等 形式。SNP具有如下特點首先，SNP位點非常豐富。幾乎分布於整個基因組， 基因組中大約平均每1000bp就會出現l個SNP，總數約有300萬個。其次，SN P的突變率較低，每代每鹼基突變率約為2 X 10—8。尤其是處於編碼區的(cod ing region) SNP (又稱cSNP ),是高度穩定的，而串聯重複的微衛星位點的高 突變率使得對群體的遺傳分析出現困難。第三，具有代表性。cSNP經常引起表 達蛋白的多態性變異，並進而影響他們的功能、特性。第四，擴增片斷短，易 於符合擴增，易實現分析的自動化。第五，每個人均有獨特的SNP圖譜，SNP由 於其片段短、擴增效率高，對PCR的條件要求也相對較低，即使是法醫學上常 見的細胞已經被破壞，DNA降解嚴重的腐敗檢材或是放置時間很長的檢材，同樣 可以用PCR技術擴增出特異的DNA片段來進行基因分型，就可以達到個人認定 的目的。
SNP基因座的研究大多是逐個位點進行的，檢測手段或者使用測序技術，或
者釆用限制性內切酶消化的方法，前者技術複雜，費用昂貴；後者操作煩瑣、 準確性差。複合擴增(Multiplex PCR)又稱為多重PCR，即在一個反應體系中 使用多套引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域進行擴增的過程。它 可大幅度地簡化操作程序、節省時間和試劑，同時能滿足同時分析不同基因位 點的需要。
複合擴增(Mult i pl ex PCR)又稱為多重PCR,即在一個反應體系中使 用多套引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域進行擴增的過程。它可 大幅度地簡化操作程序、節省時間和試劑。並且滿足同時分析不同DNA序列的 需要，特別是在法醫學鑑定中可以用極微量的檢材同時擴增出多個遺傳標誌而 更顯其優越性。
基於檢測體系的不同，目前世界上將複合擴增主要可以分為兩大類硝酸 銀染色複合擴增和螢光複合擴增。前者是複合擴增後的產物利用普通電泳槽分 離，進行硝酸銀染色檢測的方法。方法簡單，成本較低，在普遍實驗室可以開 展這個項目。但由於所得結果只是單種顏色，故其複合擴增試劑盒的位點數不 能太多， 一般1次複合擴增的位點不能超過4個，否則會因為不同位點的擴增 產物互相重疊，難以區分檢材的基因型。再加上所得結果是用肉眼觀察，所以 其靈敏度受到一定的限制。
螢光複合擴增是在普通複合擴增PCR的其中一條引物一端加上螢光標記， 利用自動雷射螢光遺傳檢測儀檢測PCR擴增產物，結果準確、靈敏度高，自動 化程度高、可重複性強等。用一種顏色的螢光素標記一組3或4個基因位點(其 擴增片段不能相重疊)，另一種顏色的螢光素標記另一組3或4個基因位點，多 種螢光素則可以標記多組不同的基因位點。目前自動雷射螢光遺傳檢測儀可以 檢測幾十種螢光素，但在一個反應體系中，最多可以同時檢測5種螢光素，除
其中一種用作內標外，其餘四種螢光素可以用於標記產物，加在一起，就可以
達到l次檢測io個以上的基因位點的目的。
螢光複合擴增已成為目前先進的複合擴增方法。
發明內容
本發明篩選了 13個在亞洲人群中具有較高多態性(其中最少的一種等位基 因在群體中的頻率不小於30y。)的SNP基因座，根據引物特異性PCR的原理，每 個SNP基因座設計了 3條引物。在每一個SNP基因座側面100-280bp範圍內設 計了一條引物，作為該基因座的共享引物，並在引物5'末端選用一種螢光物質 標記;針對SNP基因座的不同等位基因，又設計了分別與SNP基因座不同等位基 因相匹配的兩條引物，作為特異引物，引物3，末端的最後一個鹼基分別與SNP 基因座不同等位基因的鹼基匹配，但由於只有3'末端的最後一個鹼基不匹配往 往不能抑制擴增，所以為了防止錯誤性擴增，3'末端第3或4位鹼基人為引入 一個錯配鹼基，這是引物設計最為關鍵的部分；最後為了在檢測時自動區分不 同的等位基因，設計引物時兩條引物長度相差4bp (如果兩條引物Tm值相差過 大，則人為引入TATA四個鹼基，這是引物差異設計的另一個關鍵，因為TATA 對引物的退火溫度影響最小，同時又滿足了擴增片斷長度不同的要求)，所有引 物長度1848bp，為了便於複合擴增，所有引物的Tm值保持在60士0.5。C，為 了減少引物之間的竟爭抑制，對反應體系中不同SNP位點的引物濃度進行調整， 獲得了最佳引物濃度配比，防止了非特異性擴增片斷的產生。利用該試劑盒， 就能方便地同時對13個高個人識別能力的SNP基因座進行複合擴增，獲得各基因座的基因型結果；同時，利用該試劑盒提供的等位基因分型標準物，利用基
因分析軟體(Genetyper2. 5.2)，還可以方便地自動檢測、分析擴增結果。
圖1為藍色螢光標記物6-FAM的結構式；
圖2位黃色螢光標記物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)的結構式；
圖3為綠色螢光標記物JOE(6-carboxy畫4，，5，-dichloro-2，，7，-dimethoxy-fluorescein)
的結構式；
圖4為紅色螢光標記物6-ROX(X-RHODAMINE)的結構式。
具體實施例方式
本試劑盒由是由分離包裝的13個SNP位點引物混合物、DNA聚合酶、反應
緩衝液(含MgC12)、以及13個SNP位點等位基因分型標準物和質控DNA構成。
13個SNP基因座的引物混合物2. 0ml(不同基因座引物濃度不相同，從30nM-240
nM,每個20ul的複合PCR反應體系中用量為2ul ); DNA聚合酶1000u(5u/
pl每個20ul的複合PCR反應體系中用量為lu);緩衝液2. Oml (IO倍濃縮緩衝
液，每個20ul的複合PCR反應體系中用量為2ul);等位基因分型標準物混合物
總量1 ml (40nM,供1000次檢測使用)，等位基因分型標準物混合物中所含各
個基因座的等位基因分型標準物等量；質控DNAO. lml (10ng/ul)。
螢光複合擴增的技術核心主要在於引物序列與螢光標記的位置以及各種引 物的濃度配比。
在本發明試劑盒中，13個SNP位點其參考序列均可通過NCBI查閱，13個
SNP位點的名錄為iVga/(Serl87Pr。) ， /L45^/^(Alal33Ser) ， Af5iM(Glu346Lys)， APD(Lys751Gln) ，A7 (X7(194Trp/Arg) ，AD屍及rO/76"/a) ， CT屍75J(Val432Leu)， OG(77(Ala85Ser)， /^EK/(Phe257Ser)， APC(Lys939Gln)， GS7M《T2517C)， ^A7iV2(Pro50Ser)， 屍丄O/(Thr706Ala)。
13個高個人識別能力SNP位點引物序列為
NQO1 -pub-5 ， -F1-TGCGTTTCTTCCATCCTTCC-3 ， ( NQO1位點共享引物，F1
螢光素標記)
NQ01-spel-5， - TGTGGCTTCCAAGTCTTAGCAC -3， ( NQOl位點特異性引物 1,針對C等位基因)
NQ01-spe2-5， - TATATGTGGCTTCCAAGTCTTAGCAT -3， (NQOl位點特異性 引物2,針對T等位基因)
RASSFl-pub畫5，國Fl-GAAGCCCTGGGTTCCTCAA隱3， (RASSF1位點共享引物， Fl螢光素標記)
RASSFl-spel-5，-GATCTTCTGCTCAATCTCGGC-3， ( RASSF1位點特異性引物 1，針對C等位基因)
RASSFl畫spe2-5，-TATAGATCTTCTGCTCAATCTCGGA -3， (RASSF1位點特異 性引物2，針對A等位基因)
MBD4-pub-5，-Fl-TTTCCTGGTTGGTGAGCAGTT匿3， ( MBD4位點共享引物， Fl螢光素標記)
MBD4-spel-5，-GCCAAAGACTCAGAACACACCA-3， ( MBD4位點特異性引物 1，針對A等位基因)
MBD4-spe2-5，- TATATCCAAAGACTCAGAACACATCG-3， ( MBD4位點特異性 引物2,針對G等位基因)
XPD—pub隱5，-Fl-CGGACATCTCCAAATTCATTCA-3， (XPD位點共享引物，Fl 螢光素標記)
XPD—spel-5，-CTGAGCAATCTGCTCTATCCTGTT-3， (XPD位點特異性引物1， 針對T等位基因)
XPD —spe2-5，-TATACTGAGCAATCTGCTCTATCCTATG-3， ( XPD位點特異性引 物2,針對G等位基因)
XRCCl畫pub畫5，國Fl-TCCAGACAAAGATGAGGCAGAG-3， ( XRCC1位點共享引 物，Fl螢光素標記)
XRCCl-spel-5，-CTGGGGATGTCTTGTTGAACC-3， ( XRCC1位點特異性引物 1，針對G等位基因)
XRCCl-spe2-5，-TATATTGGGGATGTCTTGTTGAGCT—3， ( XRCC1位點特異性 引物2，針對A等位基因)
ADPRT-pub-5 ，一F2-CAGCAGGAGGGTTTGCCA畫3 ， ( ADPRT位點共享引物，F2
螢光素標記)
ADPRT—spe 1 -5 ， - AGC AGGTTGTC AAGC ATTTACG-3 ， ( ADPRT位點特異性引
物1，針對C等位基因)
ADPRT—spe2-5，-TATAAGCAGGTTGTCAAGCATTTACA-3， ( ADPRT位點特異 性引物2，針對T等位基因)
CYPlBl-pub誦5，誦F2誦GAGGGACCGTCTGCCTTGTA國3， (CYP1B1位點共享引物， F2螢光素標記)
CYPlBl-sepl-5，-CCGGGTTAGGCCACTTGAG-3， ( CYP1B1位點特異性引物1, 針對C等位基因)
CYPlBl-sep2陽5，-TATACCGGGTTAGGCCACTTTAC-3， (CYP1B1位點特異性引 物2,針對G等位基因)
OGGl-pub-5，-CTTATGTCCAAGAACCCTAACCC-3， ( OGG1位點共享引物，F2 螢光素標記)
OGGl-spel-5，-ACGAGGAGACAAGAGCCTGG-3， ( OGG1位點特異性引物1, 針對G等位基因)
OGGl-spe2-5，-TGTACCGAGGAGACAAGAGCTAGT-3， ( OGG1位點特異性引 物2,針對T等位基因)
REVl-pub-5，-F2-AGTCAATGGCATGAACAGTTGG-3， ( REV1位點共享引物， F2螢光素標記)
REVl-spel-5，-CCTTATCCTCCTCCTGGGAAA-3， ( REV1位點特異性引物1, 針對T等位基因)REVl-spe2-5，-TATACCTTATCCTCCTCCTGGGTAG-3' ( REV1位點特異性引物 2,針對C等位基因)
XPC —pub-5 ，-F2-TGATTACTAACCCTCGCCTGTG-3 ， ( XPC位點共享引物，F2
螢光素標記)
XPC—spel-5，-GGCGCTCAGCTCACAGGTT-3， ( XPC位點特異性引物1,針對 A等位基因)
XPC —spe2-5，-TATAAGCGCTCAGCTCACAGTTG-3， ( XPC位點特異性引物2， 針對C等位基因)
GSTM4-pub畫5,—F3-GGAAAGGCGTCCAAGCAGT-3， ( GSTM4位點共享引物， F3螢光素標記)
GSTM4-sepl-5，-GGCCATGGTTTGTTGGACAC-3， ( GSTM4位點特異性引物1, 針對C等位基因)
GSTM4-sep2-5，-TATAGGCCATGGTTTGTTGGATAT-3， ( GSTM4位點特異性引 物2，針對T等位基因)
AXIN2-pub-5，-F4-CAGCAGCAGCTTCCGTGAG-3， ( AXIN2位點共享引物，F4 螢光素標記)
AXIN2-spel-5，-CCTGGTGTTGGAAGAGACTGG-3， ( AXIN2位點特異性引物 1，針對C等位基因)
AXIN2-spe2-5 ，TATACCTGGTGTTGGAAGAGACCGA-3 ， ( AXIN2位點特異性
引物2，針對T等位基因)
PLOI-pub-5 ，—F4-CAGATAGCCATAAGCAAACAGTAGC-3 ， ( PLOI位點共享引
物，F4螢光素標記)
PLOI—spel-5，-ATGTGGAAATCTGATCCGGC-3， ( PLOI位點特異性引物1,針 對G等位基因)
PLOI—spe2-5，-TATAATGTGGAAATCTGATCCGGT-3， ( PLOI位點特異性引物2， 針對A等位基因)
四種螢光素的名稱和結構分別為 Fl:藍色螢光標記物6-FAM，結構式為圖l。
F2:黃色螢光標記物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)，結構式為圖2。 F3:綠色螢光標記物
J0E(6-carboxy-4， ,5， -dichloro-2， ,7， -dimethoxy-fluorescein),結構式
為圖3。
F4:紅色螢光標記物6-R0X(X-rhodamine)，結構式為圖4。 需要說明的是四種螢光標記物可以互換。
本發明的試劑盒中包含了上述13個SNP基因座的所有引物，每個位點3條
引物，其中一條是共享引物，分別用不同的螢光素標記，另外兩條引物針對不 同的SNP等位基因設計，與共享引物分別配對擴增不同的等位基因，由於引物 長度不同，所以不同的等位基因擴增產物長度不同， 一般相差4bp，通過自動激 光螢光遺傳檢測儀檢測，就可以根據產物長度的不同區分不同的等位基因，如果是純合子，只能得到l個產物峰；而如果是雜合子，則可以得到兩個產物峰。 對於SNP等位基因的檢測，最直接最準確的方法是基因測序，但這種方法
只能逐個位點進行，效率低下、技術要求高而且費用昂貴；其次常用的方法是 根據SNP位點的等位基因，尋找適合的限制性內切酶，根據限制性內切酶消化
後產物長度的不同，區分不同的等位基因，但這種方法也只能逐個位點SNP進
行檢測，而且有時會由於酶的消化不完全而得出錯誤結論，所以具有效率低下、
準確性差的缺點。本方法將13個SNP位點在一個反應管中同時擴增，同時檢測， 效率大大提高，結合基因分析軟體(GenoTyper2. 5.2)可以自動對結果進行分 析， 一天可以完成上百例樣品的檢測；由於螢光檢測具有高靈敏性，所以檢測 所需要的樣品量極其微量， 一次只需要5-10ng;不同等位基因的擴增產物長度 相差4bp，完全能滿足檢測的要求；通過調試引物濃度，獲得最佳引物濃度配比， 可以有效抑制非特異性擴增產物的出現。
在進行複合擴增反應時，可在PCR反應體系中同時加入本試劑盒中分離包 裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩衝浪和常規反應所需的四種脫氧核苷三磷酸， 就可以進行有效地PCR擴增。具體反應體系如下
樣品DNA ( 5-10ng) lul
引物混合物 2ul
dNTPs 1. 6ul
緩衝液 2ul
DNA聚合酶 0.2ul (lu)
無菌去離子水補充至 20ul
本方明的試劑盒中還提供了用於規範不同實驗室檢驗結果的質控DNA樣品 和13個SNP位點等位基因分型標準物(Ladder),質控DNA樣品是已經過測序 確證了的按照本試劑盒的操作說明能夠準確分型的DNA樣品，可以作為陽性對 照或質控DNA樣品使用；等位基因分型標準物是發明人收集了所有13個SNP位 點所有等位基因的擴增產物，用於基因分析軟體自動分型時作為標準使用，釆 用該等位基因分型標準物，可以快速、準確對檢測結果進行分型；同時只要將 等位基因分型標準物與樣本PCR擴增產物同步電泳，不同的實驗室，不同的設 備，不同的電泳方法，均可得到一致的可重複性結果，可以用於規範不同實驗 室的檢測結果，避免了因電泳引起的誤差。
本發明試劑盒能夠髙效率地對13個高識別率的SNP基因座進行複合擴增， 通過自動螢光測序儀進行檢測分型，達到高自動化水平，實驗結果準確、可重 現性好的目的，本發明的試劑盒用於法醫學個人識別具有很大的優勢和潛力。
權利要求
1、一種13個高個人識別能力SNP位點多色螢光複合擴增試劑盒，該試劑盒包括a)引物混合物，b)DNA聚合酶，c)緩衝液(含MgCl2)，d)質控DNA，e)等位基因分型標準物混合物，其特徵是引物混合物由13條螢光標記共享引物和26條針對不同等位基因的長度特異性引物組成；分別針對13個肺癌易感性相關SNP基因位點，分別為NQO1(Ser187Pro)，RASSF1(Ala133Ser)，MBD4(Glu346Lys)，XPD(Lys751Gln)，XRCC1(194Trp/Arg)，ADPRT(Val762Ala)，CYP1B1(Val432Leu)，OGG1(Ala85Ser)，REV1(Phe257Ser)，XPC(Lys939Gln)，GSTM4(T2517C)，AXIN2(Pro50Ser)，PLOI(Thr706Ala)。
2、 根據權利要求1所述的13個高個人識別能力SNP基因位點，引物序列為NQO1 -pub-5 ，畫F 1-TGCGTTTCTTCCATCCTTCC-3 ， ( NQO1位點共享引物，F1螢光素標記)NQ01畫spel-5，畫TGTGGCTTCCAAGTCTTAGCAC國3， (NQOl位點特異性引物 1,針對C等位基因)NQ01-spe2國5， - TATATGTGGCTTCCAAGTCTTAGCAT -3， ( NQOl位點特異性 引物2,針對T等位基因)RASSFl-pub-5，國Fl-GAAGCCCTGGGTTCCTCAA-3， (RASSF1位點共享引物， Fl螢光素標記)RASSFl-spel-5，-GATCTTCTGCTCAATCTCGGC-3， (RASSF1位點特異性引物 1，針對C等位基因)RASSFl-spe2-5，畫TATAGATCTTCTGCTCAATCTCGGA -3， (RASSF1位點特異性引物2，針對A等位基因)MBD4-pub-5 ，-Fl-TTTCCTGGTTGGTGAGCAGTT-3 ， ( MBD4位點共享引物，Fl螢光素標記)MBD4-spe 1 -5 ，-GCCAAAGACTCAGAACACACCA-3 ， ( MBD4位點特異性引物1，針對A等位基因)MBD4-spe2國5，誦TATATCCAAAGACTCAGAACACATCG-3， (MBD4位點特異性 引物2，針對G等位基因)XPD-pub-5，-Fl-CGGACATCTCCAAATTCATTCA-3， (XPD位點共享引物，Fl螢光素標記)XPD -spel-5，-CTGAGCAATCTGCTCTATCCTGTT-3， (XPD位點特異性引物1 ， 針對T等位基因)XPD—spe2-5，-TATACTGAGCAATCTGCTCTATCCTATG-3， (XPD位點特異性引 物2，針對G等位基因)XRCCl-pub-5，-Fl-TCCAGACAAAGATGAGGCAGAG-3， (XRCC1位點共享引 物，Fl螢光素標記)XRCC 1 -spe 1 -5 ， -CTGGGGATGTCTTGTTGAACC-3 ， ( XRCC1位點特異性引物1，針對G等位基因)XRCCl-spe2-5，-TATATTGGGGATGTCTTGTTGAGCT—3， (XRCC1位點特異性 引物2，針對A等位基因)ADPRT-pub-5，一F2-CAGCAGGAGGGTTTGCCA-3， (ADPRT位點共享引物，F2 螢光素標記)ADPRT—spe 1 -5 ，-AGCAGGTTGTCAAGCATTTACG-3 ， ( ADPRT位點特異性引物l，針對C等位基因)ADPRT-spe2畫5，-TATAAGCAGGTTGTCAAGCATTTACA畫3， (ADPRT位點特異 性引物2，針對T等位基因)CYPlBl-pub-5，誦F2-GAGGGACCGTCTGCCTTGTA-3， (CYP1B1位點共享引物， F2螢光素標記)CYPlBl-sepl-5，-CCGGGTTAGGCCACTTGAG-3， (CYP1B1位點特異性引物1， 針對C等位基因)CYPlBl-sep2-5，-TATACCGGGTTAGGCCACTTTAC-3， (CYP1B1位點特異性引 物2，針對G等位基因)OGGl國pub畫5，-CTTATGTCCAAGAACCCTAACCC-3， ( OGG1位點共享引物，F2 螢光素標記)OGGl-spel-5，-ACGAGGAGACAAGAGCCTGG-3， ( OGG1位點特異性引物1， 針對G等位基因)OGGl-spe2-5，- TGTACCGAGGAGACAAGAGCTAGT畫3， ( OGG1位點特異性引 物2,針對T等位基因) REV 1 -pub-5 ，-F2-AGTCAATGGCATGAACAGTTGG-3 ， ( REV 1位點共享引物，F2螢光素標記)REVl-spel-5，-CCTTATCCTCCTCCTGGGAAA-3， (REV1位點特異性引物1， 針對T等位基因)REVl-spe2-5，-TATACCTTATCCTCCTCCTGGGTAG-3' (REV1位點特異性引物 2，針對C等位基因)XPC -pub-5，-F2-TGATTACTAACCCTCGCCTGTG-3， (XPC位點共享引物，F2 螢光素標記)XPC—spel-5，-GGCGCTCAGCTCACAGGTT-3' (XPC位點特異性引物1，針對A等位基因)XPC —spe2-5，-TATAAGCGCTCAGCTCACAGTTG-3， (XPC位點特異性引物2， 針對C等位基因)GSTM4-pub-5 ，—F3-GGAAAGGCGTCCAAGCAGT-3 ， ( GSTM4位點共享引物，F3螢光素標記)GSTM4-sepl-5，-GGCCATGGTTTGTTGGACAC-3， (GSTM4位點特異性引物1， 針對C等位基因)GSTM4國sep2-5，-TATAGGCCATGGTTTGTTGGATAT—3， (GSTM4位點特異性引 物2，針對T等位基因)AXIN2-pub-5，-F4-CAGCAGCAGCTTCCGTGAG-3， (AXIN2位點共享引物，F4 螢光素標記) AXIN2-spel-5，-CCTGGTGTTGGAAGAGACTGG-3， (AXIN2位點特異性弓I物 1，針對C等位基因)AXIN2-spe2-5，TATACCTGGTGTTGGAAGAGACCGA-3， (AXIN2位點特異性 引物2，針對T等位基因)PLOI-pub-5 ，—F4-CAGATAGCCATAAGCAAACAGTAGC-3 ， (PLOI位點共享引物，F4螢光素標記)PLOI—spel-5，-ATGTGGAAATCTGATCCGGC-3， (PLOI位點特異性引物1，針 對G等位基因)PLOI—spe2-5，-TATAATGTGGAAATCTGATCCGGT-3， (PLOI位點特異性引物2， 針對A等位基因)四種螢光素的名稱分別為Fl:藍色螢光標記物FAM; F2:黃色螢光標記物TAMRA; F3:綠色螢光標記物JOE; F4:紅色螢光標記物ROX;四種螢光標記物可以互換。
3、權利要求1所述的試劑盒在法醫學個人識別中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種用於體外一次性多色螢光複合擴增具有較高個人識別能力的13個SNP基因座的試劑盒，是由分離包裝的引物混合物、DNA聚合酶、緩衝液、質控DNA樣品和等位基因分型標準物混合物構成。引物混合物由13條螢光標記的共享引物和26條針對不同等位基因的長度特異性引物組成。採用本試劑盒可以快速、準確獲得13個具有較高個人識別能力的SNP位點的基因型，並通過自動螢光測序儀進行檢測分型，達到高自動化水平。本發明的試劑盒用於法醫學個人識別具有很大的優勢和潛力。
文檔編號G01N21/00GK101183067SQ200710011670
公開日2008年5月21日 申請日期2007年6月11日 優先權日2007年6月11日
發明者王瑞恆 申請人:遼寧師範大學