一種增強靶細胞攝取治療劑的方法和藥物組合物的製作方法

2023-09-16 17:17:50 2

專利名稱：一種增強靶細胞攝取治療劑的方法和藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種已有藥物的新用途，具體而言，本發明涉及一種通過促進靶細胞對治療劑的攝取而提高其療效的方法和組合物，並具體涉及脂筏-膜穴依賴型內吞通路調節劑與某些藥物(如抗腫瘤藥物)組成的藥物組合物。特別地，本發明還涉及篩選對抗腫瘤藥物具有增效作用的脂筏-膜穴依賴型內吞通路調節劑的方法。
背景技術：
腫瘤的生長和遷移依賴於新生血管/淋巴管的生成。因此，腫瘤新生血管和淋巴管內皮細胞為癌症治療提供了新的靶標(Folkman, J. N Engl JMed 1971 ；285 =1182-1186,Witte MH et al. Lymphology. 1987 ；20(4) =257-66) 同時，肥胖症、糖尿病型視網膜病、持續性玻璃體增生、牛皮癬、過敏性皮炎、關節炎、動脈硬化、子宮內膜異位、哮喘、腹水、腹膜粘連等疾病也被證明與新生血管異常生成密切相關(Carmeliet P. , Nature Medicine2003 ；9(6) :653-660)。血管內皮抑制素(endostatin，以下簡稱ES)是膠原X VDI羧基端的一段分子量為20kDa的酶切產物，是一種內源性血管/淋巴管生成抑制劑，具有抑制血管/淋巴管內皮細胞增殖、遷移，和抑制新生血管/淋巴管生成的活性。進一步實驗發現，重組血管內皮抑制素在動物模型中可以抑制多種腫瘤的生長、轉移，而且不產生耐藥性(Folkman J. etal. Cell 1997 ；88 :277-285,Folkman J. et al. Nature 1997 ；390 :404-407,Zhuo W. et al,Journal of Pathology ;222 :249-260)。目前，有一種通過基因工程手段製備的重組人血管內皮抑制素(商品名恩度，Endu)，與天然血管內皮抑制素相比具有9個額外的N-末端胺基酸((M)GGSHHHHH)，已作為血管抑制劑類抗腫瘤藥物，在以非小細胞肺癌為主要適應症的臨床應用中得到了廣泛的驗證。研究顯示，ES會被腫瘤部位高度活躍的血管/淋巴管內皮細胞內吞，但是具體機制尚不清楚。表皮生長因子受體(EpithelialGrowth Factor Receptor,以下簡稱 EGFR)在腫瘤細胞表面異常過量表達，並與癌細胞的增殖和轉移密切相關。因此，已有多個靶向EGFR的單克隆抗體成為抗腫瘤藥物。抗EGFR單克隆抗體西妥昔單抗是一個抗體類抗腫瘤藥物，能夠特異性地結合腫瘤細胞表面的EGFR。制黴菌素(nystatin，以下簡稱NT)是一種多烯類抗生素，具有廣譜抗真菌作用，可以安全用於口腔含服或外用，且不與其他藥物發生相互作用。NT對念珠菌屬的抗菌活性高，新型隱球菌、曲菌、毛黴菌、小孢子菌、莢膜組織漿胞菌、皮炎芽生菌及皮膚癬菌通常對NT也敏感。NT也常用於易患真菌感染病人的預防，如AIDS患者或接受化療的患者。NT這一類藥物抗真菌的作用原理是能夠結合真菌細胞膜上的主要成分麥角固醇(ergosterol)，並最終造成真菌細胞膜的穿孔以及鉀離子洩露直至真菌死亡。由於麥角固醇是真菌細胞膜特有的脂類物質，因此應用於人體或動物體時NT和AMB不會對真核細胞膜造成誤殺傷。
NT可在細胞水平上影響膽固醇相關的內吞作用。在細胞生物學領域，尤其是哺乳類細胞內吞活動的研究中，NT被廣泛用來作為脂後(lipid raft)-膜穴(caveolae)依賴型內吞通路的抑制劑。其作用原理是脂筏-膜穴依賴型內吞需要依靠細胞膜上的膽固醇(cholesterol)這一重要物質，NT可以通過與膜上的膽固醇結合從而抑制這條內吞通路。與NT作用原理相似的試劑還有兩性黴素B(amphotericin B),甲基化￠-環糊精(methyl-0-cyclodextrin)和菲律賓菌素(filipin)等,都會與細胞膜上的膽固醇結合抑制脂筏-膜穴內吞通路。兩性黴素B (amphotericin B，以下簡稱AMB)與NT作用機理相同，是目前臨床上治療隱球菌、麴黴菌等真菌感染的一種有效的多烯類廣譜抗真菌藥物。Wickstrom et al (2002, 2003)報導了在內皮細胞膜上 ES 與 alpha5betal 型整合素(integrin alpha5betal)以及小窩蛋白(caveolin,是膜穴的組成蛋白)有相互作用，而且ES會與脂筏發生相互作用，揭示出在細胞膜上ES與脂筏-膜穴的相互關聯(Wickstromet al, Cancer Res. 2002 ；62 :5580-9, Wickstrom et al, J. Biol. Chem. 2003 ；278 (39)37895-37901)。另外，Dixelius et al (2000)，Shi et al (2007) Zhuo et al (2010)分別報導了 ES特異性的被血管和淋巴管內皮細胞內吞的過程(Dixelius et al, Blood 2000，95,3403-3411 ；Shi et al, Blood 2007,110,2899-2906, Zhuo ff. et al, Journal ofPathology ；222 :249-260)。 2002年，Pike et al和Roepstorff et al分別發現抑制膽固醇和脂後，可以增加EGFR的配體(表皮生長因子，以下簡稱「EGF」)在細胞表面的結合(Pike etal, Biochemistry 2002 ；41 10315-22, Roepstorff et al, J Biol Chem 2002 ；277 18954-60)。Kojic et al (2008)報導了腫瘤細胞通過脂筏-膜穴依賴型內吞來攝取自分泌運動因子/磷酸葡糖異構酶(AMF/PGI)，且這一內吞過程具有細胞種屬特異性，脂筏-膜穴內吞可能成為針對特定腫瘤細胞靶向藥物的給藥途徑(Kojic et al, PLoS ONE 2008 ；3 e3597) 0Migalovich et al (2009)報導了 NT通過調節細胞脂筏-膜穴內吞從而增加了卵巢癌細胞對黃豆苷原-牛血清白蛋白(daidzein-BSA)的內吞。黃豆苷原-牛血清白蛋白是一種潛在的腫瘤顯影劑，NT增加黃豆苷原-牛血清白蛋白在腫瘤細胞的內吞可能會使這種腫瘤顯影劑發揮出更好的實用效果(Migalovich et al, Cancer Res. 2009 ;69 :5610-5617)。由此可見，脂筏-膜穴依賴型內吞可能參與許多重要物質如細胞因子、外源蛋白甚至藥物分子的內吞，通過調節和控制此類內吞可能在細胞水平上影響機體對這些物質的攝取，具有應用潛力。發明概述本發明基於以下發現ES可以藉助脂後-膜穴(caveola/lipid raft pathway)和籠形蛋白包被小泡(clathrin-coated pits pathway)這兩條途徑被內皮細胞內吞,如果用抑制劑NT幹擾脂筏-膜穴依賴型內吞通路，可以獲得提高藥物在血管/淋巴管內皮細胞中內吞攝取水平的意想不到的效果，並進一步促進ES對內皮細胞活性、腫瘤血管生成和腫瘤生長的抑制效果。無意於受任何理論的限制，推測這一發現的原因可能為在脂筏-膜穴依賴型內吞通路受到抑制的情況下，籠形蛋白包被小泡高效內吞途徑代償性的活躍導致了總體內吞攝取的增強。相似地，EGFR配體被報導具有與ES相似的內吞機制。其中，EGFR單抗是一類有效的抗腫瘤藥物，通過結合到腫瘤細胞特有的EGFR起到抑制相關信號傳導和腫瘤增殖的療效。本發明人發現，NT還可以通過影響脂筏依賴型內吞，顯著增強抗腫瘤藥物EGFR單克隆抗體在癌細胞中的內吞和積累，促進EGFR單抗的療效，具有進一步應用於腫瘤治療和腫瘤顯像等領域的潛力。此外，與ES具有相似內吞機制的還有endothelin receptor type A,cholera toxin, transforming growth factor-3 receptors, B cell antigen receptor,bone morphogenetic protein receptor, HM I. 24 以及 integrins 等，都具備與 NT 聯用產生增效作用的條件。因此，在一個方面，本發明提供脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑在製備用於提高對象中靶細胞對治療劑的攝取的藥物組合物中的用途。在另一個方面，本發明提供提高對象中靶細胞對治療劑的攝取的方法，其包括給所述個體施用脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑。在另一個方面，本發明提供脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑，其用於提高對象中靶細胞對治療劑的攝取。在另一個方面，本發明提供脂筏-膜穴依賴型內吞通路調節劑與某些藥物(如抗 腫瘤藥物)組成的藥物組合物。在本發明的以上各方面的具體實施方式
中，所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑是脂筏-膜穴依賴型內吞通路的抑制劑，例如所述抑制劑是多烯類抗真菌藥(如制黴菌素或兩性黴素B)，或者所述抑制劑例如是甲基化3 -環糊精或菲律賓菌素。根據本發明，所述治療劑可以通過脂筏-膜穴依賴型內吞通路和籠形蛋白包被小泡內吞通路這兩條通路被靶細胞攝取。根據本發明，所述對象患有血管發生相關性疾病或淋巴管發生相關性疾病。根據本發明，所述對象患有腫瘤，例如肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、食道癌、鼻咽癌、惡性黑色素腫瘤、骨癌、淋巴癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、血管瘤、神經內分泌瘤、口腔癌、肉瘤、腎癌或膽癌。 根據本發明，所述治療劑是血管或淋巴管生成抑制劑，例如血管內皮抑制素或其衍生物，其中所述血管內皮抑制素例如是天然血管內皮抑制素或重組血管內皮抑制素，例如重組人血管內皮抑制素。根據本發明的一個具體實施方式
，所述血管內皮抑制素具有SEQID NO. USEQ IDN0. 2,SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的胺基酸序列。根據本發明的一個具體實施方式
，所述血管內皮抑制素衍生物是聚乙二醇(PEG)修飾的血管內皮抑制素。優選地，所述聚乙二醇(PEG)是平均分子量為5-40kD的單甲氧基聚乙二醇，例如是單甲氧基聚乙二醇丙醛。在本發明的一個具體實施方式
中，所述單甲氧基聚乙二醇丙醛的平均分子量是20kD，且聚乙二醇(PEG)修飾的位點是血管內皮抑制素的N-末端的a -氨基。根據本發明，所述治療劑是能夠抑制腫瘤細胞生長的抗體。根據本發明的一個具體實施方式
，所述抗體是表皮生長因子受體(EGFR)的抗體，例如EGFR單克隆抗體，EGFR單克隆抗體的實例是西妥昔單抗。在本發明的以上各方面的具體實施方式
中，所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑通過選自靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動脈注射的胃腸外途徑施用。優選地，所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑被配製為脂質體包埋的形式。本發明還提供一種藥物組合物，其包含前面所述的血管內皮抑制素或者抗體，以及前面所述的脂筏-膜穴依賴型內吞通路的抑制劑。
在另一個方面，本發明還涉及篩選對抗腫瘤藥物具有增效作用的脂筏-膜穴依賴型內吞通路調節劑的方法。本發明還涉及與NT作用原理相似的藥物或試劑(如兩性黴素B)，和與ES或EGFR單抗作用機理或內吞途徑相似的藥物試劑之間的聯合用藥方法、聯合製劑和藥物組合物。


圖IA-E NT及其同類試劑(兩性黴素B，甲基化@ -環糊精和菲律賓菌素)可以劑量依賴方式促進ES及其衍生物和修飾物在內皮細胞中的內吞攝取。A :使用Western Blotting方法檢測出NT促進了 ES在血管內皮細胞中的內吞，且該促進作用與NT的濃度正相關。這種促進作用體現在ES內吞後在細胞質、細胞核組分，以及全細胞中的含量較沒有NT時顯著增加。
B :使用Western Blotting方法檢測出NT促進了 ES在淋巴管內皮細胞中的內吞，且該促進作用與NT的濃度正相關。C :使用Western Blotting方法檢測出兩性黴素B,甲基化0 -環糊精和菲律賓菌素也能夠促進ES在內皮細胞中的內吞，且該促進作用與NT的濃度正相關。D :使用Western Blotting方法檢測出NT也能夠促進PEG化ES在內皮細胞中的內吞，且該促進作用與NT的濃度正相關。E :使用Western Blotting方法檢測出NT也能夠促進N-末端帶有附加胺基酸(M)GGSHHHHH的重組人血管內皮抑制素(Endu)及N-末端被PEG單點修飾的Endu(PEG-Endu)在內皮細胞中的內吞，且該促進作用與NT的濃度正相關。圖2 :使用Western Blotting方法檢測出ES與NT的聯合用藥通過增加ES在內皮細胞中的內吞，增強了 ES對於內皮細胞ERK與p38MAPK信號通路的抑制效果。圖3A-B ES與NT聯合應用抑制細胞遷移A :細胞遷移實驗證實，ES與NT的聯合用藥增強了 ES對於內皮細胞活性的抑制效果，使得發生遷移的內皮細胞數目較沒有NT時進一步減少。B :細胞遷移實驗中遷移細胞數目的統計結果，反映了在不同藥物處理下內皮細胞的遷移能力。圖4A-E ES與NT聯合應用抑制腫瘤生長並改善ES在腫瘤組織中的分布A ES與NT的聯合用藥在A549肺癌動物模型中能夠進一步增強ES對於腫瘤生長的抑制效果。B :使用免疫螢光方法發現ES與NT的聯合用藥能夠增強ES對於A549肺癌動物模型中腫瘤組織新生血管生成的抑制效果。C ES與NT聯合用藥在H22肝癌動物模型中能夠進一步增強ES對於腫瘤生長的抑制效果。D :使用免疫螢光方法發現ES與NT的聯合用藥能夠增強ES對於H22肝癌動物模型中腫瘤組織新生血管生成的抑制效果。E :使用動物螢光成像系統發現ES與NT的聯合用藥能夠增強ES (帶有羅丹明螢光標記)在荷瘤動物腫瘤組織中的攝取和分布。圖5A-B NT促進EGFR單抗進入腫瘤細胞
A :使用Western Blotting方法檢測出NT促進了 EGFR單抗在癌細胞中的內吞。B :使用活體螢光標記示蹤方法發現NT與EGFR單抗聯合用藥能夠加強EGFR單抗在小鼠移植腫瘤中的分布和攝取。發明詳述本發明的目的是提供多烯類廣譜抗生素NT及其同類藥物的一種新用途。同時，為ES和EGFR單抗等藉助脂後-膜穴依賴型內吞途徑(caveola/lipid raft pathway)和籠形蛋白包被小泡內吞途徑(clathrin-coated pits pathway)這兩條途徑發生內吞的蛋白藥物提供一種增強療效的新藥物組合物和新用藥方法。脂後(lipid raft)是質膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結構域(microdomain)。鞘磷脂和鞘糖脂的飽和脂肪鏈緊密聚集，飽和脂肪鏈之間的空隙填滿了作為間隔分子的膽固醇，形成液態有序相(liquid-ordered phase,即脂後)，直徑大約在50nm左右。脂後是一 種動態結構，與細胞膜的信號轉導、蛋白質分選均有密切關係。膜穴(也稱細胞膜穴樣內陷，質膜微囊，caveolae)是脂筏的一種結構，具有和脂後一樣的膜脂組成，不含籠形蛋白(也稱網格蛋白，clathrin),含有caveolin(—種小分子量蛋白，21KD)。大量存在於脂肪細胞、內皮細胞、上皮細胞和平滑肌細胞等，與內吞有關。另外，膜穴中還富含某些信號分子，說明它與細胞的信號轉導有關。籠形蛋白包被小泡(clathrin-coated pits)是籠形蛋白參與介導的內吞過程中形成的一種膜轉運動態結構。依賴於該種結構的內吞方式即稱為籠形蛋白包被小泡依賴型內吞途徑。血管發生相關性疾病(Angiogenesis related diseases)和淋巴管發生相關性疾病(Lymphangiogenesis related diseases)即與血管和淋巴管異常生成密切相關的疾病，包括腫瘤，關節炎和牛皮癬等多種自身免疫性疾病，糖尿病，肥胖症以及多種眼科疾病。本發明顯示，將脂筏-膜穴依賴型內吞通路的抑制劑NT與ES共同加入到血管內皮細胞的液體培養環境中，可以顯著增強ES在血管內皮細胞中的內吞，且這種增強效果與NT的濃度正相關。同時，我們在淋巴管內皮細胞中也觀察到了同樣的結果。基於進一步實驗事實，本發明還將NT的增效作用擴展至與NT作用原理相似的其他藥物和試劑。如實施例I中所述，與NT作用原理相似的一類物質，如兩性黴素B(AMB)、甲基化￠-環糊精(M3-CD)和菲律賓菌素(filipin)，也能夠增強ES在內皮細胞中的內吞。AMB與filipin也是已經成藥的抗真菌抗生素，與NT同樣具有應用於實際聯合用藥的潛力。與此相類似的，兩性黴素Wamphotericin B)，甲基化￠-環糊精(methyl-0-cyclodextrin)和菲律賓菌素(filipin)可以顯著增強ES在血管內皮細胞中的內吞，且這種增強效果與上述多稀類抗生素的濃度正相關。同樣的，NT還可以顯著促進PEG修飾的ES (PEG-ES)，N-末端帶有(M) GGSHHHHH附加胺基酸的ES (Endu)，以及N-末端被PEG單點修飾的Endu (PEG-Endu)在血管內皮細胞中的內吞，且這種增強效果與NT的濃度正相關。在分子細胞生物學水平上，本發明還通過實驗證明了通過NT聯合用藥促進ES在血管內皮細胞中的內吞，並進一步增強ES對血管內皮細胞存活相關信號通路(如ERK和P38MAPK)的抑制效果。在細胞水平上，本發明證明了 NT與ES的聯合用藥增強了 ES對內皮細胞遷移活性的抑制效果。更進一步地，在A549肺癌和H22肝癌的動物腫瘤模型中，證明了 NT能夠增強ES對於腫瘤生長以及腫瘤新生血管生成的抑制效果。更進一步的，NT還能夠增強ES在腫瘤組織中的攝取和分布。本發明還發現，EGFR單抗藥物作為EGFR的配體，其內吞的機制與ES有一定的相似性，它在腫瘤細胞中的內吞也能夠被NT所調節。在分子細胞生物學水平上，本發明通過細胞學實驗證明了通過NT聯合用藥促進EGFR單抗在癌細胞中的內吞。更進一步地，本發明還通過動物實驗證明了 NT與EGFR單抗的聯合用藥促進了 EGFR單抗在小鼠移植腫瘤中的分布和攝取。因此，本發明公開了 NT這個現有的抗真菌抗生素藥物的一種新用途，即通過聯合用藥的方式促進了現有抗腫瘤藥物ES或EGFR單抗的攝入和藥效，具有進一步應用於腫瘤治療和腫瘤顯像等領域的潛力。用高分子聚合物對蛋白進行修飾，是改變和控制藥物的動力學特性如半衰期、免 疫學特徵、毒理特性的常用方法。其中聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是應用最為普遍的一種蛋白修飾分子。本實驗證明，經PEG(單甲氧基聚乙二醇丙醛)進行N-末端a -氨基定點修飾的ES蛋白及其衍生物Endu在內皮細胞中的內吞也因NT聯合用藥而顯著增加。這一事實為NT與修飾、標記的ES或其衍生物聯合用藥達到增效目的的用藥方法提供了理論依據。基於另一部分實驗事實，本發明還將聯合用藥的適用範圍擴展至其他與ES具有相似內吞途徑和作用機理的藥物，包括EGFR單抗和經過修飾、標記的基於EGFR單抗的分子等能夠靶向腫瘤或腫瘤血管並用於治療或顯像用途的物質，也可因為NT等多烯類試劑的聯合用藥而促進藥物攝取和效果。本發明還涉及一種NT (或AMB等)與ES聯合用藥的新劑型和藥物組合物。ES應用於腫瘤治療中的給藥方式為靜脈滴注。NT屬多烯類廣譜抗真菌抗生素，難溶於水，口服後胃腸道不易吸收，直接注射用藥毒性較大。不過，有研究表明，NT可通過脂質體包埋方法實現靜脈滴注給藥，例如Aronex公司的NT脂質體劑型Nyotran已於1999年完成III期臨床試驗，有望近年上市，這將使NT實現靜脈滴注的給藥方式。AMB與NT同屬於多烯類廣譜抗真菌抗生素，作用機理完全相同。迄今為止，已有3種兩性黴素B脂質體劑型藥物在歐美上市(商品名分別為Abelcet、Amphocil和AmBisome),實現了這一類難溶性抗生素的靜脈滴注給藥。另一種兩性黴素B脂質體靜脈滴注液也於2003年上市，商品名為鋒克松。因此，結合脂質體劑型和靜脈滴注給藥來製備ES或EGFR單抗與NT或AMB等聯合用藥的新劑型或新的藥物組合物是完全可行的。
實施例實施例I :NT促進了 ES在血管及淋巴管內皮細胞中的內吞和攝取。人血管內皮細胞(HMEC) (ATCC保藏號分別為CRL 10636)，應用不完全弗氏佐劑誘導小鼠形成腹腔淋巴管瘤，消化法分離獲得鼠淋巴管內皮細胞mLEC(Zhuo ff. et al, Zhuoff. et al, Journal of Pathology ；222 :249-260), Endu(SEQ ID NO. 3 或 SEQ ID NO. 4, BPN末端具有9個額外的胺基酸(M)GGSHHHHH的ES，其中第一個胺基酸M在大腸桿菌中表達時可發生隨機刪除)(先聲麥得津公司)，ES (SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2，其中第一個胺基酸M在大腸桿菌中表達時可發生隨機刪除)(Protgen),特異性修飾蛋白N-末端a-氨基的PEG試劑採用20kD的單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)(北京鍵凱科技有限公司)，PEG-ES及PEG-Endu由Protgen公司按照所用PEG試劑說明書提示製備，ES單克隆抗體購自Oncogene公司，NT及其他試劑均購自Sigma Aldrich公司。待血管內皮細胞貼壁生長至密度約90%時，更換為含有NT的DMEM培養基(Hyclone):將NT儲液加入到培養基中，至一定終濃度(0 u g/ml, 25 u g/ml, 50 u g/ml)，於37°C ,5%C02培養箱中靜置20min進行NT預處理；預處理之後將濃度為5mg/ml的ES儲液加入培養基，至終濃度5 u g/ml，於37°C，5% CO2培養箱中靜置30min使ES被血管內皮細胞內吞。內吞結束時棄培養基，用冰PBS洗3次，收集內皮細胞。使用Western Blotting方法，檢測全細胞裂解液、細胞質及細胞核等組分中ES的攝入水平，與沒有NT共同處理的細胞中ES內吞量進行比較。結果表明，在ES劑量相同、內吞時間相同的情況下，全細胞裂解液、細胞質或細胞核組分中ES的含量均因NT的聯合使用而顯著增加，25 ii g/ml及50 y g/ml的NT分別可使ES內吞攝取量提高約2倍和15倍，且ES內吞增加的幅度與所用NT的濃度正相關(圖1A)。 用分別含有NT濃度為0，75，150和300 u g/ml的培養基於37°C對mLEC細胞進行預處理30min，然後在37°C條件下用含有ES濃度為g/ml的培養液孵育15min，用PBS清洗三遍，收細胞。利用Western blotting對不同濃度NT處理的淋巴管內皮細胞進行ES內吞測定，結果顯示75，150和300 u g/ml的NT可分別使ES在淋巴管內皮細胞中的內吞量提高約16，32和78倍，且ES內吞增加的幅度與所用NT的濃度正相關(圖1B)。在本實施例中，NT還可以被替換為與NT作用機理相同的藥物，如兩性黴素B (25-50 u g/ml)，甲基化P -環糊精(l_2mM)和菲律賓菌素(2. 5-5 u g/ml)，都能夠促進ES在內皮細胞中的內吞(圖1C)。在本實施例中，ES還可以被替換為與ES內吞機理相同的藥物，如PEG化修飾的 ES。使用分子量為20kDa的特異性修飾蛋白N-末端的聚乙二醇修飾試劑(單甲氧基聚乙二醇並醛，mPEG-ALD)來修飾ES，其產物(簡稱PEG-ES)為一個聚乙二醇分子與一個重組人內皮抑制素相連，連接位點為蛋白的N-末端a-氨基的蛋白。結果表明，在PEG-ES劑量相同、內吞時間相同的情況下，血管內皮細胞對於PEG-ES的內吞也由於NT的聯合使用而顯著增加，而且PEG-ES內吞增加的幅度與所用NT的濃度正相關(圖1D)。在另一種ES的衍生物Endu的內吞實驗中也觀察到了類似的結果，即在Endu及其N-末端a -氨基單一定點PEG修飾產物PEG-Endu劑量相同、內吞時間相同的情況下，血管內皮細胞對於Endu及PEG-Endu的內吞也由於NT的聯合使用而顯著增加，而且Endu及PEG-Endu內吞增加的幅度與所用NT的濃度正相關(圖1E)。實施例2 :NT增加了 ES在內皮細胞中的內吞，從而增強了 ES對於內皮細胞信號通路的抑制作用。Kim et al (2002)發現ES在內皮細胞中可以抑制內皮細胞內細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,簡稱ERK)、p38促分裂素原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,簡稱p38MAPK)和 pl25 局部粘著斑激酶(pl25focal adhesion kinase,簡稱pl25FAK)介導的信號轉導通路,從而發揮抑制內皮細胞的活性(Kim et al，J. Biol. Chem. 2002，277，27872—27879)。本實施例選用 ERK 和 p38 MAPK 這兩條信號通路作為檢測指標，NT的聯合使用進一步增強了 ES對於這些信號通路的抑制作用。本實施例中，內皮細胞被分成四組加以不同處理。第一組陰性對照組，無NT處理，也無ES處理；第二組，NT處理組，只有NT(50ii g/ml，20min)處理，無ES處理；第三組，ES處理組，無NT處理，只有ES(5ii g/ml，30min)處理；第四組，NT與ES聯合用藥組，NT (50 y g/ml，先於ES 20min加入)和ES (5 y g/ml，30min)聯合處理。按實施例I中的方法對細胞進行NT或ES相應處理，收集細胞，檢測ERK和p38MAPK信號通路。結果顯示，與對照組相t匕，第二組僅用NT處理不會影響ERK和p38MAPK信號的水平；第三組ES處理抑制了 ERK和P38MAPK信號通路，與Kim et al的報導相符；第四組NT和ES聯合用藥增加了 ES的內吞，並進一步增強了 ES對ERK和p38MAPK信號通路的抑制作用。這證明了 NT的聯合用藥進一 步增強了 ES對細胞活化信號通路的抑制作用(圖2)。實施例3 NT增強了 ES對於內皮細胞遷移的抑制效果。細胞遷移的測定方法內皮細胞(HMEC，每孔2父104個細胞)接種到TranswellTM板(8 u m孔徑,Costar)的上層含 0. 5%胎牛血清(Hyclone)以及 10ng/ml VEGF(PeproTechEC)的DMEM(Hyclone)培養基中。同時在板的上層和下層加入一定濃度的ES(40 y g/ml)或NT (50 u g/ml)，在37°C和5% CO2中繼續培養6小時使細胞遷移。用戊二醛固定和結晶紫染色後，每個孔隨機選取5個高倍放大(400倍)視野(Olympus 1X71),計算其中完全穿過膜遷移到板下層的細胞數並取平均值，每一組平行三個孔，實驗重複兩次。本實施例中，內皮細胞也被分成四組加以不同處理。第一組陰性對照組，無NT處理，也無ES處理；第二組，NT處理組，只有NT (50 ii g/ml)處理，無ES處理；第三組，ES處理組，無NT處理，只有ES (40 u g/ml)處理；第四組，NT與ES聯合用藥組，NT (50 u g/ml)和ES(40 u g/ml)聯合處理。結果顯示，與對照組相比較，第二組僅用NT處理，基本不影響內皮細胞的遷移能力；第三組ES處理能抑制內皮細胞遷移，減少了內皮細胞遷移到下層膜的數量，抑制率為61%;第四組NT和ES聯合用藥，增強了 ES對內皮細胞遷移的抑制作用，發生遷移的細胞很少，抑制率為87% (相對於ES組結果，P < 0.001)。上述結果說明，NT增強了 ES對於內皮細胞遷移的抑制作用。各處理組遷移細胞代表性視野(圖3A)，各處理組遷移細胞計數平均值比較(圖3B)。實施例4 NT能夠在動物模型中增強ES對於腫瘤生長和新生血管生成的抑制作用，並促進ES在腫瘤組織中的攝取和分布。培養處於旺盛增殖狀態的人源肺腺癌A549細胞(ATCC保藏號為CCL-185)接種至6 8周齡的裸鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)皮下。當腫瘤體積達到IOOmm3左右時，將荷瘤裸鼠分為四組進行不同的給藥處理。第一組陰性對照，生理鹽水處理組；第二組，NT給藥組,只有NT (6mg/kg,腹腔注射,每天一次)給藥處理，無ES給藥處理；第三組，ES給藥組，無NT給藥處理，只有ES (12mg/kg,腹腔注射，每天一次)給藥處理；第四組，NT與ES聯合用藥組，NT (6mg/kg,腹腔注射，每天一次)和ES (12mg/kg,腹腔注射，每天一次)聯合給藥。給藥兩周後，裸鼠被處死，稱腫瘤並比較腫瘤體積。結果顯示，與對照組相比較，第二組僅用NT給藥處理對腫瘤生長沒有抑制作用；第三組ES處理能抑制腫瘤生長，抑瘤率約40% ;第四組NT和ES聯合用藥，增強了 ES對腫瘤生長的抑制作用，抑瘤率提高到60%左右。這說明在動物模型中，NT能夠顯著增強ES的抑瘤活性(圖4A)。各組實驗動物的體重、進食和日常活動均未發生異常改變。腫瘤內血管發生水平的檢測方法所有四組的裸鼠的腫瘤被取出、固定、切片。使用抗⑶31 (腫瘤血管內皮細胞的標誌分子)的一抗以及FITC標記的二抗(Santa Cruz)檢測，在Nikon Al雷射掃描共聚焦成像系統下觀察(Nikon Inc.)。各組腫瘤隨機選取高倍放大(400倍)視野，使用顯微鏡系統自帶軟體計算各個視野中血管截面積並取平均值進行比較。NT增強ES抑制腫瘤組織新生血管生成活性的作用與其增強ES抑瘤活性的作用相類似。各處理組腫瘤平均重量比較(圖4A)，各處理組腫瘤組織平均血管面積(相對單位，arbitrary unit)比較(圖 4B)NT顯著增強ES抑制腫瘤生長和腫瘤新生血管生成活性的作用在H22肝癌的動物模型中也得到了驗證。各處理組腫瘤平均重量比較(圖4C)，各處理組腫瘤組織平均血管面 積(相對單位,arbitrary unit)比較(圖4D)各組實驗動物的體重、進食和日常活動均未發生異常改變。螢光標記ES在荷瘤小鼠的腫瘤組織中攝取和分布的檢測方法培養處於增殖狀態的人源肺腺癌A549細胞接種至6 8周齡的裸鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)皮下。當腫瘤體積達到300mm3左右時給藥。荷瘤裸鼠分為兩組進行不同的給藥處理(每組四隻)。第一組ES給藥組，無NT給藥處理，只有羅丹明(Pierce)螢光標記ES (劑量20mg/kg)腹腔注射給藥；第二組，NT與ES聯合用藥組，NT (6mg/kg，腹腔注射)和羅丹明螢光標記ES (20mg/kg,腹腔注射)聯合給藥。給藥4小時後，取出腫瘤組織，利用動物螢光成像系統(清華大學生物醫學工程系)對腫瘤中螢光標記ES的攝取量進行顯像與定量分析。NT增強了 ES在動物腫瘤組織中的攝取和分布，增幅達到4倍(圖4E)。實施例5 :NT能夠顯著增加EGFR單抗(西妥昔單抗)在腫瘤細胞中的內吞和在動物腫瘤組織中的攝取和分布。本實施例中選用表達EGFR的人源肺腺癌A549細胞，待其貼壁生長至密度約90%時，更換為含有NT的DMEM培養基將NT儲液加入到培養基中，至一定終濃度(0 u g/ml,25 u g/ml, 50 u g/ml)，於37°C，5% CO2培養箱中靜置20min進行NT預處理；預處理之後將濃度為5mg/ml的EGFR單抗(西妥昔單抗，Merck公司)儲液加入培養基,至終濃度5 y g/ml，於37°C，5% CO2培養箱中靜置30min使EGFR單抗被內皮細胞內吞；內吞結束時棄培養基，用冰PBS洗3次，收集內皮細胞。使用Western Blotting方法，檢測細胞組分中EGFR單抗的攝入水平，與沒有NT共同處理的細胞中EGFR單抗內吞量進行比較。結果表明，在EGFR單抗劑量相同、內吞時間相同的情況下，細胞中EGFR單抗的內吞量因NT的聯合使用而顯著增加，即NT能夠促進內皮細胞中對EGFR單抗的內吞，而且EGFR單抗內吞量增加的幅度與所用NT的濃度正相關(圖5A)。培養處於增殖狀態的人源肺腺癌A549細胞接種至6 8周齡的裸鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)皮下，分兩組，每組4隻。當腫瘤體積達到500_3左右時，一組小鼠給以螢光(Cy5. 5，GE公司)標記的EGFR單抗，另一組小鼠給以螢光標記的EGFR單抗(與前一組劑量相等)加上NT的聯合用藥。使用螢光成像系統(清華大學生物醫學工程系)對這兩組取出的小鼠腫瘤中EGFR單抗的螢光信號進行檢測，證明NT可增強EGFR單抗在腫瘤組織中的攝取和分布，有促進藥物攝取、提高療效和用於腫瘤成像研究的作用(圖5B)。
權利要求
1.脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑在製備用於提高對象中靶細胞對治療劑的攝取的藥物組合物中的用途。
2.權利要求I的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑是脂筏-膜穴依賴型內吞通路的抑制劑。
3.權利要求2的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的抑制劑是多烯類抗真菌藥。
4.權利要求3的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的抑制劑選自製黴菌素和兩性黴素B。
5.權利要求2的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的抑制劑是甲基化￠-環糊精或菲律賓菌素。
6.權利要求1-5中任一項的用途，其中所述治療劑可以通過脂筏-膜穴依賴型內吞通路和籠形蛋白包被小泡內吞通路這兩條通路被靶細胞攝取。
7.權利要求1-6中任一項的用途，其中所述對象患有血管發生相關性疾病或淋巴管發生相關性疾病。
8.權利要求1-6中任一項的用途，其中所述對象患有腫瘤。
9.權利要求7或8的用途，其中所述治療劑是血管或淋巴管生成抑制劑。
10.權利要求9的用途，其中所述血管或淋巴管生成抑制劑是選自天然血管內皮抑制素和重組人血管內皮抑制素的一種血管內皮抑制素或其衍生物。
11.權利要求10的用途，其中所述血管內皮抑制素具有SEQID NO. I或SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。
12.權利要求10的用途，其中所述血管內皮抑制素是N-末端帶有附加胺基酸序列(M)GGSHHHHH的血管內皮抑制素，具有SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的胺基酸序列。
13.權利要求10-12中任一項的用途，其中所述血管內皮抑制素衍生物是聚乙二醇(PEG)修飾的血管內皮抑制素。
14.權利要求13的用途，其中所述聚乙二醇(PEG)是平均分子量為5-40kD的單甲氧基聚乙二醇。
15.權利要求14的用途，其中所述單甲氧基聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇丙醛。
16.權利要求15的用途，其中所述單甲氧基聚乙二醇丙醛的平均分子量是20kD。
17.權利要求13-16中任一項所述的用途，其中聚乙二醇(PEG)修飾的位點是血管內皮抑制素的N-末端的a -氨基。
18.權利要求8的用途，其中所述治療劑是能夠抑制腫瘤細胞生長的抗體。
19.權利要求18的用途，其中所述抗體是表皮生長因子受體(EGFR)的抗體。
20.權利要求18的用途，其中所述抗體是表皮生長因子受體(EGFR)的單克隆抗體。
21.權利要求18的用途，其中所述表皮生長因子受體(EGFR)的單克隆抗體是西妥昔單抗。
22.權利要求8-21中任一項的用途，其中所述腫瘤選自肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、食道癌、鼻咽癌、惡性黑色素腫瘤、骨癌、淋巴癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、血管瘤、神經內分泌瘤、口腔癌、肉瘤、腎癌和膽癌。
23.權利要求1-22中任一項的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑通過選自靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動脈注射的胃腸外途徑施用。
24.權利要求23的用途，其中所述脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑被配製為脂質體包埋的形式。
25.一種藥物組合物，其包含 (a)權利要求10-17中任一項所定義的血管內皮抑制素或者權利要求18-21中任一項所定義的抗體，和 (b)權利要求2-5中任一項所定義的脂筏-膜穴依賴型內吞通路的抑制劑。
全文摘要
本發明提供一種通過促進靶細胞對治療劑的攝取而提高其療效的方法和組合物，所述的組合物含有脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑，所述治療劑例如為抗腫瘤藥物。本發明也涉及含有脂筏-膜穴依賴型內吞通路的調節劑和治療劑的藥物組合物。本發明還涉及篩選對抗腫瘤藥物具有增效作用的脂筏-膜穴依賴型內吞通路調節劑的方法。
文檔編號A61K45/00GK102698270SQ201110085338
公開日2012年10月3日 申請日期2011年3月28日 優先權日2011年3月28日
發明者付彥, 常國棟, 羅永章, 賈琳, 陳陽 申請人:北京普羅吉生物科技發展有限公司, 清華大學