對細菌感染的抗性的製作方法

2023-09-17 09:36:15

專利名稱：對細菌感染的抗性的製作方法
技術領域：
本發明涉及鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物，並任選地，選擇那些具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的方法。此外，本發明涉及預測動物對細菌感染的應答的方法。此外，本發明涉及用於產生對細菌感染有抗性的動物或增加對細菌感染的抗性的方法，且本發明涉及由所述方法產生的動物。本發明亦涉及在SALl位的一個或多個標記用於鑑定和任選地選擇具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的用途。此外，本發明涉及在SALl位的一個或多個標記用於預測動物對細菌感染的應答的用途。本發明還涉及用於在樣品中鑑定SALl位的一個或多個標記的基因型的試劑盒； 陣列(array)；和分離的寡核苷酸引物或探針。
背景技術：
動物如家禽的細菌感染，在畜牧業中是常見的問題，且可導致牲畜的嚴重損失。 而且，動物中細菌感染的存在和控制以減少人的食源性感染，是重要的公共衛生問題。對畜牧業具有顯著經濟影響，且若不受控制可導致人食物中毒的細菌感染的實例包括沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)(如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)和大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli))、梭菌屬(Clostridium)(如產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens))禾口葡萄球菌屬(Staphylococcus)(如金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus))。舉例而言，過去十年，每年僅在英格蘭和威爾斯就有10000 30000例人沙門氏菌病(salmonellosis)的報導(Health Protection Agency, 2008-www. hpa. org. uk)。受感染的禽肉和蛋的攝食是人類病例的主要來源。因此，雞群中沙門氏菌屬感染的存在和控制仍為重要的公共衛生問題。除了潛在的人疾病問題之外，一些高度適應於動物宿主的極端病原性血清型，如禽類中的腸沙門氏菌(S. enterica)血清變型fellIinarum，可導致嚴重的疾病，常常導致整群死亡。對抗生素增加的抗性是其持續使用不可避免的副作用，這導致歐共體強制家禽養殖者(poultry producer)儘量避免種禽(breeder)和蛋禽(layer)中沙門氏菌汙染(Zoonosis Directive EC/92/117)。此外，歐共體於2006年禁止在禽類養殖中抗微生物劑的預防性使用(除非是非常有限的情況下，如基於動物衛生和福利原因)，以儘量避免抗生素抗性的發展。對於近交雞種系的廣泛分析揭示一些種系對於沙門氏菌的許多血清變型(即類型)持續地易感或有抗性，表明常見的抗性機制(Bumstead和Barrow 1993 ；Kaiser和 Lamont 2001)。此外，種系Wlj1和N中的抗性亦表現為顯性的(與主要定量性狀位-QTL的遺傳一致)，且並非性連鎖或MHC連鎖的(Wigley，Hulme等200 。抗性禽類對經口和肌肉內感染均表現抗性，然而，在幼禽的靜脈內感染中差異最為明顯，其中易感的禽類死於低於 IOcfu 的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的劑量(Bumstead 禾口 Barrow 1993)。在小鼠中的研究確立了沙門氏菌病易感性方面廣泛的遺傳差異，並鑑定出了許多涉及疾病抗性的候選基因，包括SLCllal (之前稱為Nrampl)、NOS和TLR-4(PoItorak， Smirnova 等 1998 ；Abies, Takamatsu 等 2001 ；0 『 Brien, Wang 等 2005)。儘管已暗示 Slcllal、TRAIL、TGFb2 和 TGFb3、PSAP、TLR4 (Hu，Bumstead 等 1997 ；Sebastiani, Olien 等 1998 ；Leveque, Forgetta 等 2003 ；Malek 禾口 Lamont 2003)禾口 MHC 複合物(Zhou 禾口 Lamont
2003)在雞中對沙門氏菌群集(colonization)的抗性，它們在種系6lX15I的雜交中並未顯示與對沙門氏菌病的抗性顯著相關(Mariani，Barrow等2001)。因此，很明顯其他尚未鑑定出的基因涉及該多因子性狀。Mariani ,Barrow等QOO1)鑑定出沙門氏菌病疾病抗性與雞染色體5 (Chr 5)的區域(命名為SAL1)顯著相關。在該研究中，使用種系151和種系的第一代回交以定位沙門氏菌病的疾病抗性，其顯示出與在其他三個獨立實驗中的觀察一致的巨大作用。雞Chr 5 上的該區與人Chr 14和小鼠Chr 12顯示保守的同線性(synteny)。在該區內存在兩個鑑定為潛在候選的基因，肌酸激酶(CKB)和動力蛋白(DNCHl) (Mariani,Barrow等2001)。然而，由於該第一代回交中有限數量的減數分裂，以及僅使用了寬間距的微衛星標記，定位的解析度不足以確保這些有望候選的進一步表徵(MarianLBarrow等2001)。此後發現了在 Chr 5該區內沙門氏菌病抗性位的其他證據。在檢查雞中腸沙門氏菌群集的組合的F2和回交研究中，Tilquin等Q005)鑑定出了七個高度顯著的QTL。其中之一為SAL1，位於Chr5 上約150cM處，並在F2和回交中分別以ρ = 0. 0514和0. 0034在兩個數據組中均得到確證 (Tilquin, Barrow等2005)。在一個獨立研究中，Kaiser和Lamont Q002)觀察到微衛星 ADL0298 (Chr 5上 198cM處)與數日齡的雞經口接種一周之後，盲腸和脾臟中腸沙門氏菌的水平相關(Kaiser和Lamont 2002)。該顯著的QTL，儘管與之前鑑定出的SALl位相距 48cM，是僅使用Fl雜交和非常有限組的微衛星標記鑑定出的。使用該設計分辨QTL的有限能力可解釋QTL的不良分辨。雞基因組包含超過10億鹼基對，其中至少3百萬個位置具多態性(Wong，Liu等
2004)。這些序列差異可導致表型差異，如對疾病抗性的差異，或可用作標記，因為其與成因基因(causative gene)的接近性(close proximity)。挑戰(challenge)在於定位目標基因並確定有助於(contribute to)疾病抗性的等位基因的特性。

發明內容
本發明人發現使用與緻密填充的(densely packed) SNP和微衛星標記組合的定位方法和第六代回交群，能夠精確定位(refine)雞染色體5上的SALl位。本發明人顯示 SALl位位於雞染色體5長臂的54. 0 54. 8MB之間。此外，本發明人鑑定出了位於精確定位的SALl位之內潛在的位置候選基因。在一個方面，本發明人提供了鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型或與對細菌感染的易感性相關的基因型的動物的方法，包括下述步驟(a)提供來自所述動物的樣品；(b)確定在SALl位的一個或多個標記的等位基因以鑑定該標記的基因型，其中所述SALl位位於雞染色體5或其等同物(or an equivalent thereof)的54. 0MB至54. 8MB 之間；和(c)確定該基因型是否為(i)與對細菌感染的抗性相關的基因型或(ii)與對細菌感染的易感性相關的基因型。在另一個方面，本發明提供了鑑定與對細菌感染的抗性相關的基因型或與對細菌感染的易感性相關的基因型的方法，包括下述步驟(a)提供來自多於一個動物的樣品；(b)確定在SALl位的標記存在等位變體以鑑定多態性標記，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物；(c)確定所述多態性標記的基因型與對細菌感染的抗性相關；或(d)確定所述多態性標記的基因型與對細菌感染的易感性相關。在本發明的另一個方面，提供了預測動物對細菌感染的應答的方法，包括下述步驟(a)提供來自所述動物的樣品；(b)確定在SALl位的一個或多個標記的等位基因以鑑定該標記的基因型，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物；禾口(c)確定該基因型是否為(i)與對細菌感染的抗性相關的基因型或(ii)與對細菌感染的易感性相關的基因型，以預測動物對細菌感染的應答。在另一個方面，本發明提供了用於產生對細菌感染具有抗性的動物，或增加動物對細菌感染的抗性的方法，其中所述方法包括用來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl 位或其相應部分替代至少SALl位一部分的步驟，其中所述SALl位位於雞染色體5的 54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。在另一個方面，本發明通過用來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位或其相應部分替代至少SALl位一部分提供了對細菌感染具有抗性的動物，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。在另一個方面，本發明提供了用於產生對細菌感染具有易感性的動物，或增加動物對細菌感染的易感性的方法，其中所述方法包括用來自對細菌感染具有易感性的動物的 SALl位或其相應部分替代至少SALl位一部分的步驟，其中所述SALl位位於雞染色體5的 54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。在另一個方面，本發明通過用來自對細菌感染具有易感性的動物的SALl位或其相應部分替代至少SALl位一部分提供了對細菌感染具有易感性的動物，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。此外，本發明提供了位於SALl位的一個或多個標記用於鑑定⑴具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物或(ii)具有與對細菌感染的易感性相關的基因型的動物的用途，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。本發明進一步提供了位於SALl位的一個或多個標記用於選擇(i)具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物或(ii)具有與對細菌感染的易感性相關的基因型的動物的用途，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。在另一個方面，本發明提供了位於SALl位的一個或多個標記用於預測動物對細菌感染的應答的用途。在另一個方面，本發明提供了用於在樣品中鑑定位於SALl位的一個或多個標記的基因型的試劑盒，其中所述SALl位位於雞染色體5的OMB至8MB之間或其等同物，其中所述試劑盒包含用於確定一個或多個標記的等位基因的物質(means)。在另一個方面，本發明提供了用於在樣品中鑑定位於SALl位的一個或多個標記的基因型的試劑盒，其中所述SALl位位於雞染色體5的OMB至8MB之間或其等同物， 其中所述試劑盒包含用於確定一個或多個標記的等位基因的物質，其中所述一個或多個標記選自下組單核苷酸多態性SNP2 ；微衛星標記ADL166 ；在編碼AKT(I)的核苷酸序列ENSGALG00000011620中的多態性；禾口在編碼CD-27結合蛋白的核苷酸序列ENSGALG00000011619中的多態性。在另一個方面，本發明提供了本文中提及的試劑盒的用途。本發明在另一個方面提供了陣列，其中所述陣列包含一種或多種能夠在樣品中確定在SALl位在一個或多個標記的等位基因的寡核苷酸探針，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。本發明在另一個方面提供了陣列，其中所述陣列包含一種或多種能夠在樣品中確定在SALl位在一個或多個標記的等位基因的寡核苷酸探針，其中所述一個或多個標記選自下組單核苷酸多態性SNP2 ；微衛星標記ADL166;在編碼AKT(I)的核苷酸序列ENSGALG00000011620中的多態性；和在編碼CD-27結合蛋白的核苷酸序列ENSGALG00000011619中的多態性。本發明在另一個方面提供了分離的寡核苷酸引物或寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針或寡核苷酸引物選自下組SEQ ID NO :39至41和44至49。


圖1 用於在SALl位的定位分析中精確定位SALl位的SNP和微衛星標記。SNP間隔單位顯示為以分摩根(cM)計的重組距離，所述距離是從對於雞染色體5公開的基因組序列中的平均重組率計算出的。圖2 對於位於雞染色體5上SALl位側翼的40個標記的10 轉化細菌計數的間隔定位分析。預測的QTL位置4. 8-6. 2cM具有高度顯著的相關性(P = 0. 0047)。顯著性水平是通過使用IcM間隔的1000種排列的排列分析計算出的。較低的水平線為P < 0. 05而較高的線為P < 0. 01的顯著性水平。示出了具有基於在精確定位的SALl位(54. 0-54. 8MB) 內的原雞(Gallus gallus)(雞)Build 2. 1的基因組位置的候選基因。
具體實施例方式鑑定本文中提及的具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的方法可進一步包括下述步驟(d)選擇具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物。如本文中提及，鑑定具有與對細菌感染的易感性相關的基因型的動物的方法可進一步包括下述步驟
(d)選擇具有與對細菌感染的易感性相關的基因型的動物。細菌感染如本文中使用的短語「對細菌感染具有抗性」和「對細菌感染的抗性」指下述動物 其中在給定時間期間，一種類型的細菌的感染頻率低於給定時間期間內(如在三個月期間內或六個月期間內)一般種群中的平均感染頻率(即感染的平均數)；和/或在給定時間期間內一種類型的細菌的感染的嚴重程度低於在給定時間期間內(如在感染後1日內，或感染後第1日和第2日，或感染後第1至3日或感染後第1至5日)在一般種群中的感染的平均嚴重程度(即感染嚴重程度的平均值)；和/或清除細菌感染(在缺乏抗微生物劑治療的情況下)所用的時間長度短於一般種群中所用的平均時間；和/或在感染之後的給定時點(如感染後2日)細菌感染的程度(如血清中的細菌計數和/或感染的器官數和/ 或感染的嚴重程度，通過定量PCR測量以檢測細菌增殖的水平)低於一般種群中的平均值。 為了實施此類比較，必須將動物置於相同環境條件下以使除了基因型之外影響感染進行的因素最小化。細菌感染可為由能夠在人中導致食物中毒的一種或多種細菌所致的感染-換言之，所述一種或多種細菌能夠導致食物傳播的疾病。所述細菌感染可為，例如，由一種或多種選自下組的細菌所致的感染沙門氏菌屬(CampyIcAacter)、彎曲桿菌屬 (Campylobacter)、梭菌屬(Clostridium)禾口葡萄球菌屬(Staphylococcus)。在一個實例中，所述細菌感染是沙門氏菌屬和/或彎曲桿菌屬的感染。在另一個實例中，所述細菌感染是沙門氏菌屬的感染。由沙門氏菌屬和彎曲桿菌屬所致的細菌感染導致顯著量的與雞相關的食物中毒病例。所述細菌感染可為由一種或多種細菌菌株所致的感染。能夠在人中導致食物中毒的沙門氏菌屬菌株的實例包括腸沙門氏菌(如腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清變型(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium)禾口腸沙門氏菌腸亞種腸炎血i青變型(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis)，腸沙Π 氏菌傷寒ili青型(Salmonella enterica serotype Typhi), 沙門氏菌聖保羅血清變型(Salmonella serovar Saintpaul)和羅森沙門氏菌(Salmonella Rissen)。沙門氏菌屬對動物的感染可在所述動物中造成沙門氏菌病。如本文中使用的術語 「沙門氏菌病」指由沙門氏菌屬細菌所致的感染或導致的疾病。沙門氏菌病通常的跡象為胃腸炎，但也可複合敗血病、腦(脊)膜炎、心內膜炎和多種局灶性損害(focal lesion)(如在腎臟中)。在人中，沙門氏菌病由忽然發作的腹痛、嘔吐、噁心和發熱所表徵。在一個實例中，與對細菌感染的抗性相關的基因型是與對沙門氏菌病或沙門氏菌屬感染的抗性相關的基因型。能夠在人中導致食物中毒的彎曲桿菌屬菌株的實例為空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌。在人中，彎曲桿菌屬可造成胃腸炎，導致噁心、胃部痙攣(stomach cramp)，在極少的情況下導致稱作吉蘭-巴雷症候群(Guillain-Barre syndrome)的神經病狀。在另一個實例中，與對細菌感染的抗性相關的基因型是與對彎曲桿菌屬感染如空腸彎曲桿菌和/或大腸彎曲桿菌的感染的抗性相關的基因型。能夠在人中導致食物中毒的梭菌屬菌株的實例包括產氣莢膜梭菌。在人中，梭菌可導致噁心和嚴重的腹部疼痛。在另一個實例中，與對細菌感染的抗性相關的基因型為與對梭菌屬感染如產氣莢膜梭菌感染的抗性相關的基因型。能夠在人中導致食物中毒的葡萄球菌屬菌株的實例包括金黃色葡萄球菌。在人中，葡萄球菌屬可造成胃腸炎，導致噁心、嘔吐、胃部痙攣和腹瀉。在另一個實例中，與對細菌感染的抗性相關的基因型是與對葡萄球菌屬感染如金黃色葡萄球菌感染的抗性相關的基因型。如本文中使用的短語「對細菌感染的易感性」和「對細菌感染具有易感性」指下述動物其中在給定時間期間，一種類型的細菌的感染頻率高於給定時間期間內(如在三個月期間內或六個月期間內)一般種群中的平均感染頻率(即感染的平均數)；和/或在給定時間期間內一種類型的細菌的感染的嚴重程度高於在給定時間期間內(如在感染後1日內，或感染後第1日和第2日，或感染後第1至3日或感染後第1至5日)在一般種群中的感染的平均嚴重程度(即感染嚴重程度的平均值)；和/或清除細菌感染(在缺乏抗微生物劑治療的情況下)所用的時間長度長於一般種群中所用的平均時間；和/或在感染之後的給定時點(如感染後2日)細菌感染的程度(如血清中的細菌計數和/或感染的器官數和/或感染的嚴重程度，通過定量PCR測量以檢測細菌增殖的水平)高於一般種群中的平均值。為了實施此類比較，必須將動物置於相同環境條件下以使除了基因型之外影響感染進行的因素最小化。然而，「對細菌感染具有易感性」的個體並非免疫妥協的個體，因為其與一般種群相比，並不顯示針對例如病毒感染的易感性增加。基因型如本文中使用的術語「基因型」指在個體中在本文中提及的一個或多個標記處存在的等位基因組。在任何一個常染色體位點處，基因型可為純合的(具有兩個相同的等位基因)或雜合的(具有兩個不同的等位基因)。如本文中使用的術語「等位基因」指染色體上標記的給定形式(即類型)。在雙倍體細胞或生物中，給定標記的兩個等位基因通常佔據一對同源染色體上的對應位。對於特定標記，個體的等位基因，以及因此基因型可使用重組DNA技術如PCR、DNA 測序、雜交、ASO探針和對DNA微陣列或珠的雜交來確定。用於確定標記處的等位基因(即，確定動物的基因型)的樣品包含基因組DNA。如本文中使用的術語「多態性」指在標記處出現兩種或更多種不同形式(類型)的等位基因——換言之，變體。在標記處的多態性可通過使用重組DNA技術如PCR、DNA測序和雜交來鑑定。SALl位的標記在本文中用於短語「一種或多種SALl位的標記」的術語「標記」指位於SALl位的基因組的特徵(例如存在於基因組中的核苷酸或多核苷酸序列)。用於本文中所述的方法中的標記是多態性標記，例如所述標記具有至少兩種不同形式的等位基因。標記的類型的實例包括單核苷酸多態性(SNP)、indel (即插入/缺失)、簡單序列重複(SSR)、限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態DNA(RAPD)、切割擴增多態序列(CAPQ標記、多樣性陣列技術(DArT)標記和擴增片段長度多態性(AFLP)、微衛星或單純序列重複(SSR)，以及其他實例。標記可例如用於定位含有有助於染色體上表型性狀表達中的可變性的等位基因的基因位點(genetic locus)。一種或多種位於SALl位的標記可用於本發明中所述的方法。舉例而言，SALl位中的兩個或更多個標記可用於本文中所述的方法。此外，SALl位中三個或更多個標記可用於本文中所述的方法。如本文中使用的術語「SAL1位」指數量性狀位(quantitative trait locus，QTL)。 SALl位是與對動物中細菌(如沙門氏菌屬)感染的進行相關(即連鎖)的基因組區。在一些動物中，SALl位與對細菌感染的抗性相關。在另一些動物中，SALl位與對細菌感染的易感性相關。在雞(原雞)中，例如，SALl位位於染色體5的長臂上，在染色體5長臂的M.0至 54. 8MB 之間。在其他動物中，SALl位位於等價於雞染色體5上的SALl位的區。舉例而言，人染色體14和小鼠染色體12顯示與雞染色體5的54. 0至54. 8MB的保守的同線性；因此雞 SALl位在人中的等同物位於人染色體14上，而雞SALl位在小鼠中的等同物位於染色體12上。因此在短語「其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物」中的「或其等同物」指與雞染色體5的54. OMB至54. 8MB具有保守的同線性的除了雞之外的動物的染色體區。通常，在所述等同物的染色體區中的基因的順序與雞染色體5的 54. OMB至54. 8MB中是類似或相同的。在雞染色體5上SALl位處的標記的實例包括但不限於單核苷酸多態性SNP2(rsl6511470)；微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)；核苷酸序列ENSGALG00000011620 (AKTl)中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011619 (SIVAl)中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011698中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011696中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000020365中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011692中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000023023中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011690中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011687中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011656中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011646中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011639中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000023025中的多態性；核苷酸序列ENSGALG00000011618中的多態性；禾口核苷酸序列ENSGALG00000011608中的多態性。本文中提及的一些標記在本文中亦可稱作候選基因。如本文中使用的術語「候選基因」指任何位於SALl位(雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物)之內，可編碼多肽序列的標記。候選基因可具有造成對細菌感染(如沙門氏菌屬感染)的抗性/易感性的作用。在一個實例中，雞染色體5上SALl位處的標記為單核苷酸多態性SNP2(rsl6511470)；微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)；核苷酸序列ENSGALG00000011620 (AKTl)中的多態性；和核苷酸序列ENSGALG00000011619 (SIVAl)中的多態性。在另一個實例中，雞染色體5上SALl位處的標記為單核苷酸多態性SNP2(rsl6511470)；或微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)。在另一個實例中，雞染色體5上SALl位處的標記為單核苷酸多態性SNP2(rsl6511470)；和微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)。本文中提及的雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2具有核苷酸C或核苷酸T。所述 SNP 具有通用標識符(universal identifier)rsl6511470。雞染色體5上的微衛星標記ADL166為二核苷酸(TG)x 15重複(PCR產物大小 135-156 (bp)，原雞)。所述微衛星具有通用標識符UniSTS :71823。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011620」指雞染色體5上核苷酸討12沈70至M193661處的多核苷酸序列。該多核苷酸序列亦可稱作AKTl。所述多核苷酸序列編碼多肽AKT(I)。由該多核苷酸序列編碼的多核苷酸序列亦可稱作v-akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1。在核苷酸序列ENSGALG00000011620 (AKTl)中的多態性的一個實例是微衛星標記ADR006(正向引物GCATTGCTCCTCATTCAGA-SEQ ID NO :50-和反向弓丨物 TGTAAAAGAGCAGGGTCATTG-SEQ ID NO 51 ；PCR 產物大小約 l%bp，原雞)。在雞染色體 5 上的微衛星標記ADR006具有通用標識符UniSTS :462634。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011619」指雞染色體5上核苷酸 M107622至^1095 處的多核苷酸序列。該多核苷酸序列亦可稱作SIVAl。所述多核苷酸序列編碼CD27結合(Siva)蛋白。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011698」指雞染色體5上核苷酸討739263至討790063處的多核苷酸序列。該多核苷酸序列亦可稱作NUDT14。所述多核苷酸序列編碼類似於UDPG焦磷酸酶(EC 3.6. 1.45)的多肽。由該多核苷酸序列編碼的多核苷酸序列亦可稱作nudix(核苷二磷酸連接部分X)型基序14。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011696」指雞染色體5上核苷酸 54641798至M703903處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼類似於derrate-2的多肽。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000020365」指雞染色體5上核苷酸 54495759至M496625處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼多肽「可能的G蛋白偶聯受體 132 (Probable G-protein coupled receptor 132)，，。
如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011692」指雞染色體5上核苷酸 54472833至M473582處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼多肽「細胞分裂周期相關 4(cell division cycle associated 4)，，。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000023023」指雞染色體5上核苷酸M4568M至M457755處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼類似於轉錄調節子 TRIP-Br2的多肽。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011690」指雞染色體5上核苷酸 54442595至M450587處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼類似於BC02^87蛋白 (cl4orf79)的多肽。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011687」指雞染色體5上核苷酸M346493至M376693處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼類似於脊椎動物 Periaxin(PRX)的多肽。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011656」指雞染色體5上核苷酸 54336971至M344962處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼類似於KIAA2019的多肽 AHNAK2。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011646」指雞染色體5上核苷酸 54320538至M332563處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼多肽PLD4。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011639」指雞染色體5上核苷酸 54263981至討313擬9處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼類似於KIAA0284的多肽。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000023025」指雞染色體5上核苷酸 54222335至^2237 處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼多肽。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011618」指雞染色體5上核苷酸 54073641至M096083處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼多肽腺嘌呤琥珀酸合成酶同工型1(ADSS Li)。如本文中使用的術語「核苷酸序列ENSGALG00000011608 」指雞染色體5上核苷酸M024011至M038102處的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列編碼多肽反向的 Formin-2 (HBEBP2-結合蛋白 C)。本文中使用的編號(如表A和圖2中)基於雞基因組的ENSEMBL Release50。圖 2詳明了 SALl位中候選基因的ENSGALG標識符。等位變體如本文中使用的短語「確定在SALl位的標記處有等位變體」指在位於SALl位的標記處兩種或更多種類型的等位變體的存在的鑑定。在標記處等位變體的鑑定可使用重組DNA技術如PCR和DNA測序來確定。基因型與對細菌感染的抗性/易感性的關係存在對細菌感染(如沙門氏菌屬感染)具有抗性或對細菌感染(如沙門氏菌屬感染)具有易感性的近交雞種系。對沙門氏菌屬感染具有抗性的近交雞種系的實例包括種系Wl、61*N(Wigley， Hulme 等 2002 ；Microbes and Infection 4 :1111-1120)。這些禽類可從 PoultryProduction Unit, Institute for Animal Health, Compton, UK 獲得。對沙門氏菌屬感染具有易感性的近交雞種系的實例包括種系72、C和151 (Wigley， Hulme 等 2002 ；Microbes and Infection 4 :1111-1120)。這些禽類可從 Poultry Production Unit, Institute for Animal Health, Compton, UK 獲得。與對細菌感染(如由沙門氏菌屬所致的感染)的抗性相關的基因型可通過下述方法確定例如，確定對於對細菌感染具有抗性的近交種系的動物的SALl位處的標記為何種基因型-以其為參照物。此外，可確定多於一種參照動物的基因型。之後其他動物在該標記處的基因型可與參照物相比較，且可鑑定與參照物具有相同基因型的那些動物。該比較可對於SALl位處多於一個標記進行。此外，在一個或多個標記處具有與參照物相同的基因型的動物可預測為對由細菌如沙門氏菌屬所致的感染具有抗性。然而，在一個或多個標記處具有與參照物不同的基因型的動物可預測為對細菌如沙門氏菌屬所致的感染不具有抗性。 如本文中使用的短語「預測應答(predict/predicting the response) 」指該類型的比較。與對細菌感染(如沙門氏菌屬)的易感性相關的基因型可通過下述方法確定，例如，確定確定對於對細菌感染具有易感性的近交種系的動物的SALl位處的標記為何種基因型——以其為參照物。可確定多於一種參照動物的基因型。之後其他動物在該標記處的基因型可與參照物相比較，且可鑑定與參照物具有相同基因型的那些動物。該比較可對於 SALl位處多於一個標記進行。此外，在一個或多個標記處具有與參照物相同的基因型的動物可預測為對由細菌如沙門氏菌屬所致的感染具有易感性。然而，在一個或多個標記處具有與參照物不同的基因型的動物可預測為對細菌如沙門氏菌屬所致的感染不具有易感性。 同樣，如本文中使用的短語「預測應答(predict/predicting the response) 」指該類型的比較。數量性狀位^TL)動物對細菌如沙門氏菌屬感染的抗性/易感性為數量性狀。通過使用QTL分析，如實施例1中所述，本發明人將對細菌感染的抗性/易感性與雞染色體5上的54. OMB至54. 8MB區(即SALl位)相聯繫。如本文中使用的術語「數量性狀位」(QTL)指標記與影響目標性狀的表型的染色體區之間的聯繫，在本案中，目標性狀為對細菌感染的抗性/易感性。通常，該聯繫是用統計學方法確定的；例如，基於一種或多種文獻中公開的方法(參見，例如kng等1994 Genetics,VoI 136，1457-1468 ；Sen 和 Churchill，2001 Genetics,Vol. 159,371-387)。QTL 可為具有至少兩個不同地影響目標表型性狀表達的等位基因的基因位點和/或染色體區。動物在一個實例中，本文中提及的動物為非人動物。所述動物可為禽類如家禽或雞形禽類(gallinaceous bird)。家禽的實例包括火雞、雞、鴨、珍珠雞(guinea fowl)、鵪鶉和鵝。在一個實例中，所述動物可為雞(原雞)。用於本文的樣品可為血樣。用於本文的樣品可為基因組DNA製備物，如(可)來源於血樣的基因組DNA。對細菌感染具有抗性的動物對細菌感染具有抗性或對細菌感染具有增加的抗性的動物可通過選擇性育種項目(selective breeding program)或通過遺傳工程或通過飼育轉基因動物來產生。在一個實例中，當例如所述動物為禽類時，該動物為受精卵的形式。如本文中使用的短語「對細菌感染具有抗性的動物」指在SALl位的一個或多個標記具有與對細菌感染(如沙門氏菌屬感染)的抗性相關的基因型動物。如本文中使用的短語「增加對細菌感染的抗性」指下述方法，其中在一個或多個標記處具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的SALl位的至少一部分由具有與對細菌感染更強抗性相關的基因型的相應SALl位的至少一部分所替代。通過比較(i)在SALl位的一個或多個標記處具有一種類型的與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物與(ii)在SALl位的一個或多個標記處具有不同類型的與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物對細菌感染的抗性，可鑑定出與其他相比對細菌感染具有更強(即更佳)抗性的在一個標記處的基因型和/或在幾個標記處的基因型組合。在用來產生對細菌感染具有抗性的動物的選擇性育種項目中，鑑定和選擇至少一種在SALl位的一個或多個標記處具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物，並將其用於育種。然後鑑定在SALl位的一個或多個標記處具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的雜交的後代。然後可使用這些後代用於選擇性育種。同樣，對在選擇性育種項目中育種對(breeding pair)的後代進行選擇，即確定其是否在SALl位的一個或多個標記處具有與對細菌感染的抗性相關的基因型。可使用在SALl位的一個或多個標記處具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物進行許多輪次的選擇性育種。在任何一對育種對中，每個動物可來源於不同的遺傳背景(株或種系)，例如，以最小化不期望的遺傳疾病(如隱形疾病)的發生和最大化遺傳多樣性。在用來產生具有對細菌感染的增加抗性的動物的選擇性育種項目中，鑑定和選擇至少一種在SALl位的一個或多個標記處具有與對細菌感染的更強抗性相關的基因型的動物，並將其用於育種。然後鑑定在SALl位的一個或多個標記處具有與對細菌感染的更強抗性相關的基因型的雜交的後代。然後可使用這些後代用於選擇性育種。同樣，對在選擇性育種項目中育種對的後代進行選擇，即確定其是否在SALl位的一個或多個標記處具有與對細菌感染的更強抗性相關的基因型。可使用在SALl位的一個或多個標記處具有與對細菌感染的更強抗性相關的基因型的動物進行許多輪次的選擇性育種。在任何一對育種對中，每個動物可來源於不同的遺傳背景(株或種系)，例如，以最小化不期望的遺傳疾病(如隱形疾病)的發生和最大化遺傳多樣性。所述選擇性育種項目使用常規育種技術。然而，此外，為了鑑定出合適的抗性/易感性動物，確定了 SALl位(其位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物)處一個或多個標記的基因型。在一個方面，本發明涉及在SALl位的一個或多個標記在選擇性育種項目中用於產生對細菌感染具有抗性或對細菌感染的抗性增加的動物中的用途，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。在另一個方面，本發明涉及在SALl位的一個或多個標記在選擇性育種項目中用於產生對細菌感染具有易感性或對細菌感染的易感性增加的動物中的用途，其中所述SALl 位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。作為選擇性育種的備選方案，可通過遺傳工程方法產生對細菌感染具有抗性或對相互幹擾具有增加的抗性的動物。此類遺傳工程方法包括將SALl位的至少一部分用來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位或其相應部分替代的步驟。術語「SAL1位的一部分」可包含，例如SALl位的一個、兩個或三個標記。如本文中使用的短語「來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位或其相應部分」 指來源於或可來源於在一個或多個標記處具有與對細菌(如沙門氏菌)感染的抗性相關的基因型的動物的SALl位。用於本文中所述的方法中的載體包含來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位的至少一部分。用「來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位或其相應部分」替代「SAL1位的至少一部分」可通過同源重組進行。將包含至少部分SALl位的載體導入動物細胞可通過任何可使用的技術來實現， 包括轉化/轉染，通過病毒或非病毒載體遞送和顯微注射。這些技術的每一個在本領域均為已知的。關於產生轉基因動物的技術的有用的一般性教科書為Houdebine，Transgenic animals-Generation and Use (Harwood Academic，1997)，其為用於生成轉基因動物的技術的廣泛綜述。用於胚胎顯微操作的技術目前允許將合適的載體導入例如受精卵。舉例而言，可通過顯微注射、磷酸鈣介導的沉澱、脂質體融合、逆轉錄病毒感染或其他手段來轉化全能型或多能性幹細胞，然後將轉化細胞導入胚胎，然後該配套發育為轉基因動物。在一個實例中，用包含替代DNA(例如，包含來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位至少一部分的載體)的逆轉錄病毒載體感染髮育中的胚胎，並從感染的胚胎產生轉基因動物。在另一個實例中，將適當的載體共注射入胚胎的前核或細胞質，優選在單細胞階段注射，並允許胚胎發育為成熟的轉基因動物。這些技術是公知的(參見將DNA顯微注射入哺乳動物受精卵的標準實驗方法的綜述，包括 Hogan 等，Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Press 1986) ；Krimpenfort Bio/Technology 9 :844(1991) ；PalmiterCell, 41 :343 (1985) ；Kraemer 等，Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985) ；Hammer 等，Nature, 315 :680(1985) ；Wagner等， U. S. Pat. No. 5，175，385 ；Krimpenfort 等，U. S. Pat. No. 5，175，384，其相應內容通過提述併入本文)。然後培養經注射的卵，之後將其轉移至假妊娠的(pseudopregnant)受體的輸卵管中。對可包含轉基因序列的動物的分析通常應通過PCR或Southern印跡遵循標準方法進行。若需要，可將所述生物繁殖至純合。在一個實例中，可通過下述方法產生轉基因禽類(如雞)，所述方法包括用包含來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位的至少部分的載體感染禽卵。舉例而言，將所述禽卵的胚胎胚盤與所述載體相接觸。更具體而言，轉基因禽類是通過將載體遞送至早期禽類胚胎的原生殖細胞來生成的。舉例而言，獲取新產下的卵，並將其置於溫控加溼的培養箱中。逐漸旋轉卵中的胚胎胚盤至其位於卵黃頂部。這可通過任何本領域中已知的方法來實現，如通過有規律地振蕩卵。之後將載體遞送至胚盤和卵周膜之間的空間；儘管載體可通過任何已知方法遞送。在一個實例中，在殼上開一個口，將載體通過該口注入，然後將殼上的口封閉。然後孵育該卵直至孵化。可將孵化的雞飼育至性成熟並使其交配。
在一個實例中，可通過如khnieke，A. Ε.等，1997, Science, 278 :2130和Cibelli， J. B.等，1998，Science, 280 :1256中所述的核轉移技術來產生轉基因哺乳動物。使用該方法，將來自供體哺乳動物的成纖維細胞用摻入目標序列的載體(如包含來自對細菌感染具有抗性的哺乳動物的SALl位的至少部分的載體)穩定轉染。然後將穩定的轉染體融合於去核卵母細胞，培養並轉移至雌性受體。試舉構建轉基因哺乳動物的具體實例，將載體(如包含來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位的至少部分的載體)使用例如美國專利No. 4，873，191中所述的技術顯微注射入得自剛從動物去除的卵巢的卵母細胞。將所述卵母細胞從濾泡吸取(aspirate)，並允許其沉降，然後用經凍融的精子授精，所述鏡子經肝素催熟(capacitate)並經Percoll 梯度預分級以分離活動級分(motile fraction) 0將受精的卵母細胞例如以15，OOOg離心8分鐘以使得用於注射的前核可見，然後將其在輸卵管組織條件培養基中從合子孵育至桑葚胚或胚泡階段。該培養基是通過使用從輸卵管刮取的腔組織並在培養基中稀釋來製備的。合子必需在顯微注射之後兩小時之內置於該培養基中。然後通過施用糞留醇(coprostanol)使意欲作為受體的哺乳動物的發情期同步。 在兩日內獲得了發情，並在發情之後5-7日將胚胎轉移入受體。成功的轉移可在子代中通過Southern印跡來衡量。或者，可將載體(如包含來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位的至少部分的載體)導入胚胎幹細胞(ES細胞)，然後培養該細胞以確保通過轉基因的修飾。然後將經修飾的細胞注射入囊胚期，並將囊胚替換入假妊娠的宿主。所得的子代對於ES和宿主細胞是嵌合的，而排他地包含ES後代的非嵌合株可使用常規雜交來獲得。該技術描述於例如 W091/10741。可用於本文中提及的方法中的載體包括表達載體如腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、杆狀病毒載體和皰疹病毒載體。而且此類技術已在本領域中得到描述，例如^iang等 (Nuc1. Ac. Res.，1998，26 :3687-3693)。在一個實例中，使用慢病毒載體如馬傳染性貧血病毒(EIAV)載體以產生轉基因禽類如雞。使用慢病毒載體產生轉基因禽類可允許基因在可觀數量的世代中表達，而不致發生在一些逆轉錄病毒載體中觀察到的外源基因沉默。包含來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位的至少部分的載體可用於通過注射轉導在新產下的卵中處於囊胚期的細胞。或者，可使用載體使用如那些描述於WO 90/13616或類似的公開技術轉導處於更早期的胚胎以允許胚胎正常發育。簡言之，將子宮的(uterine)胚胎通過手動或通過誘導過早產卵從母雞中取出。 用所述慢病毒載體轉導該胚胎，然後孵育至成熟(fruition)。這允許在存在的細胞數量較少時轉導胚胎細胞，並增加產生的其中導入基因存在於種系並遺傳的禽只的數量。用於本發明方法的載體的構建可採用常規的連接技術。將分離的病毒載體、質粒或DNA片段切割、定製(tailor)並重連接為所需的形式以生成所需的質粒。若需要，以已知方法如通過Southern印跡、點印跡法、PCR或原位雜交，使用適當標記的探針進行分析以確證構建的載體中具有正確序列。若需要，本領域技術人員會容易地想到如何修飾這些技術。有利地，將標記基因提供給可用於本發明的載體以便利鑑定和定位。
試劑盒用於在樣品中鑑定SALl位處一個或多個標記的基因型的試劑盒包含用於確定一個或多個標記的等位基因的物質(means)。如本文中使用的術語「用於確定等位基因的物質」指通過其可鑑定SALl位處標記的不同等位基因的任何物質。舉例而言，用於確定標記的等位基因的物質為至少一種寡核苷酸引物或寡核苷酸探針。此類物質的實例包括對SNP具有特異性的寡核苷酸引物或探針。其他物質的實例包括對微衛星標記具有特異性的寡核苷酸引物或探針。根據本發明的試劑盒為包含用於確定選自下組的一個或多個標記的等位基因的物質的試劑盒雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2(rsl6511470)；雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)；雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011620 (AKTl)中的多態性；禾口雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011619(SIVA1)中的多態性。使用本領域已知技術，可產生對於每個標記的每個等位基因的寡核苷酸引物和寡核苷酸探針。本發明的試劑盒的實例包括下述試劑盒，其包含用於確定雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2(rsl6511470)和/或雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)的等位基因的物質。用於確定雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2(rsl6511470)標記的等位基因的物質的實例包括具有下述序列的寡核苷酸引物5 『 -ATCTCAGCCCCATAAAAACGC-3 『 (SEQ ID NO 44) , 5 『 -TAGAGTCGGGGTATTTTTGCG-3 『 (SEQ ID NO: 45)，5 『 -ATCTCAGCCCCATAAAAACGT-3 『 (SEQ ID NO 46)禾口 5' -TAGAGTCGGGGTATTTTTGCA-3『 (SEQ ID NO :47)。用於確定雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)標記的等位基因的物質的一個實例包括具有下述序列的寡核苷酸引物對或寡核苷酸探針 5' -TGCCAGCCCGTAATCATAGG-3『 (SEQ ID NO :40)和 5' -MGCACCACGACCCAATCTA-3『 (SEQ ID NO 41)。用於確定雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)標記的等位基因的物質的另一個實例包括具有下述序列的寡核苷酸引物對或寡核苷酸探針 5' -ACGGTCGGGCATTAGTATCC-3『 (SEQ ID NO :4 和5『 -TTCGTGGTGCTGGGTTAGAT-3『 (SEQ ID NO 49)。如本文中所述的試劑盒可進一步包含用於鑑定所述一個或多個標記的基因型的說明。陣列如本文中使用的術語「陣列」指以系統性順序固定於或固化於固體基質上的寡核苷酸引物或寡核苷酸探針。陣列技術及其相關的多種技術和應用一般性描述於許多教科書和文獻中。用於 SNP 分析的陣列技術討論於 Wang 等，1998，Science 280(5366) :1077_82。DNA陣列的一個實例是原位(在晶片上)合成或通過常規合成繼以晶片上固化的寡核苷酸陣列( 20- 25寡聚物)探針的陣列。將該陣列暴露於經標記的樣品DNA，雜交並確定互補序列的身份(identity)。此種DNA晶片由Affymetrix，he.以GeneChip 商標出售。一些商業上可獲得的微陣列形式的實例列於例如，Marshall和Hodgson，1998， Nature Biotechnology 16(1) :27-31。現在將進一步通過實施例來描述本發明，所述實施例旨在協助本領域技術人員實現本發明，並不以任何方式限制本發明的範圍。實施例除非另行指明，本發明採用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學常規技術，這些均在本領域技術人員能力所及範圍內。實施例1材料和方法動物因為其對於系統性沙門氏菌病的易感性的歧異表型，選擇了種系G1 (抗性)和 151(易感性)親本禽只。在特定的無病原體條件下維持親本種系，並測試其不含沙門氏菌。 為了生成回交(BCl)，將Fl子代回交至易感性種系151親本儲備。BCl群曾用於最早鑑定出SALl的沙門氏菌病QTL的原始定位(Mariani，Barrow等2001)。所有後續世代是通過將每個回交世代的子代回交至易感性151親本系而產生的。對於每個世代用SALl側翼的微衛星標記(ADL166、C0M184、ADL233、MCW81、MCW29)篩選。僅保留攜帶這些標記的等位基因的禽只作為下一世代的同類系回交禽只的親本。在該研究中使用高度(advanced)回交(BC6)定位群。細菌攻擊所有雞在無疾病條件下培養至兩周齡。為了評估回交自帶的易感性水平，對兩周齡的雞用IO5個腸沙門氏菌鼠傷寒血清變型F98進行靜脈內攻擊。在感染5日後(dpi)，處死禽只，並在無菌條件下移除並稱量脾臟。為了評估細菌集群的水平，稱量脾臟，並將其在磷酸鹽緩衝鹽水中勻漿。對於勻漿液進行一系列10倍稀釋，並將100 μ 1鋪板於補充20 μ g/ ml萘啶酸的MacConkey Agar。細菌計數測量為每脾臟的總細菌計數。DNA 提取基因組DNA是如前所述(Bumstead，Messer等1987)從全血提取的。微衛星基因定型選擇微衛星標記(ADL166、MCW081、MCW(^9)以供親本種系之間多態性的歧異。使用IOOng基因組DNA、200yM每種dNTP、0. 25pmol每種引物以10 μ 1的總反應體積進行PCR 擴增。每對的一種引物經染色標記以供在片段分析中檢測。循環條件如下所述94°C進行4 分鐘；30個循環，每循環94°C進行1分鐘，50-600C (取決於測定法)進行1分鐘和72°C進行2分鐘。將產物在Beckman CEQ8000毛細管測序儀上使用大小標準(size standard) 600 運行。使用供片段分析的Beckman CEQ8000軟體評估基因型。SNP檢測和基因定型在親本種系中篩選將在現存SALl位(36 428 188-56 139 321bp，基於雞基因組 Build 2. 1 release 50)側翼的121個SNP以鑑定供定位研究的全部信息性標記，使用可通過ENSEMBL獲得的之前鑑定的SNP，和Illumina BeadStation基因定型平臺上可獲得的現存組的雞SNP。SNP是基於其在親本系中的純合度和純合等位基因之間的歧異來選擇的。 因此，對於完全信息性分析僅選擇了 37個SNP(參見表A)，這些SNP是完全固定的，並且在親本種系之間歧異的。對信息性SNP使用50-100ng基因組DNA，200 μ M的每種dNTP、400pM 的每種引物在12.5μ 1的總反應體積中進行PCR擴增，並在回交定位組中使用Beckman CEQ8000毛細管測序儀上使用片段分析測定法進行基因定型。使用「降落PCR」的循環條件如下所述95°C進行2分鐘，30秒變性，30秒退火，所述退火以計算出的退火溫度高5°C起始，並在每個循環中下降1°C，和在72°C延伸2分鐘。在退火溫度再進行25個循環，接著進行最後一個循環的72°C延伸4分鐘。通過與Ex0SAP-IT(Amersham)溫育45分鐘，接著在 80°C使酶失活15分鐘來純化PCR產物。在使用Iyl每種產物的單個反應中進行的2-5種PCR產物的多路分析。SNP 測定反應如下所述實施將(3. 5 μ 1)經清理(cleaned-up)的產物與4 μ ISNPStart Mastermix(Beckham)和50pm每種SNP測定引物在10 μ 1反應中合併。在給定多路分析中的每種測定引物設計為不同長度，以供在片段分析中精確地進行基因定型。表A詳述了用於基因定型測定中的引物的序列。當適用時，將通用標識符(rsSNP 號或UniSTS號)用於之前經驗證的SNP。那些不具有通用標識符(無dbSNP)的標記的染色體位置是以雞基因組(原雞基因組Build 2. 1)的ENSEMBL Release 50中使用的編號為基礎的。前綴「a」指測定SNP。本文中提及的微衛星描述於Mariani等2001。本文中提及的SNP可能已經用於Wong等2004中所述的研究。表 A
權利要求
1.一種鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的方法，包括下述步驟(a)提供來自所述動物的樣品；(b)確定在SALl位的一個或多個標記的等位基因以鑑定該標記的基因型，其中所述 SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物；禾口(c)確定該基因型是否為與對細菌感染的抗性相關的基因型。
2.權利要求1的方法，其中所述權利要求進一步包括下述步驟(d)選擇具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物。
3.一種鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的方法，包括下述步驟(a)提供來自多於一個動物的樣品；(b)確定在SALl位的標記存在等位變體以鑑定多態性標記，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物；(c)確定所述多態性標記的基因型與對細菌感染的抗性相關。
4.權利要求1至3任一項的方法，其中與對細菌感染的抗性相關的基因型是與對沙門氏菌病的抗性相關的基因型。
5.一種預測動物對細菌感染的應答的方法，包括下述步驟(a)提供來自所述動物的樣品；(b)確定在SALl位的一個或多個標記的等位基因以鑑定該標記的基因型，其中所述 SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物；禾口(c)確定該基因型是否為與對細菌感染的抗性相關的基因型，以預測動物對細菌感染的應答。
6.權利要求5的方法，其中所述細菌是沙門氏菌屬(Salmonella)。
7.權利要求1至6任一項的方法，其中所述一個或多個標記選自下組雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2(rs 16511470)；雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)；雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011620 (AKTl)中的多態性；和雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011619 (SIVAl)中的多態性。
8.一種用於產生對細菌感染具有抗性的動物，或增加動物對細菌感染的抗性的方法， 其中所述方法包括用來自對細菌感染具有抗性的動物的SALl位或其相應部分替代至少 SALl位一部分的步驟，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。
9.權利要求8的方法，其中所述細菌感染是沙門氏菌屬的感染。
10.權利要求1至9任一項的方法，其中所述動物是禽類。
11.權利要求10的方法，其中所述禽類是雞。
12.位於SALl位的一個或多個標記用於鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物中的用途，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。
13.位於SALl位的一個或多個標記用於選擇具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物中的用途，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。
14.位於SALl位的一個或多個標記用於預測動物對細菌感染的應答的用途。
15.權利要求12至14任一項的用途，其中所述一個或多個標記選自下組雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2(rs 16511470)； 雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)； 雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011620 (AKTl)中的多態性；和雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011619 (SIVAl)中的多態性。
16.通過權利要求8至11任一項的方法產生的對細菌感染有抗性的動物。
17.一種用於在樣品中鑑定位於SALl位的一個或多個標記的基因型的試劑盒，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物，且其中所述試劑盒包含用於確定一個或多個標記的等位基因的物質，其中所述一個或多個標記選自下組雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2(rsl6511470)； 雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)； 雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011620 (AKTl)中的多態性；和雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011619 (SIVAl)中的多態性。
18.權利要求17的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包含用於鑑定所述一個或多個標記的基因型的說明。
19.權利要求17或18的試劑盒，其中所述標記為雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2 (rsl6511470)，且確定該標記的等位基因的物質是一種或多種選自下組的寡核苷酸引物或探針5 『 -ATCTCAGCCCCATAAAAACGC-3 『 (SEQ ID NO 44) , 5 『 -TAGAGTCGGGGTATTTTTGCG-3 『 (SEQ ID NO: 45)，5 『 -ATCTCAGCCCCATAAAAACGT-3 『 (SEQ ID NO 46)禾口 5 『 -TAGAGTCGGGGTATTTTTGCA-3 『 (SEQ ID NO 47)；和 / 或其中所述標記是雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS 71823)，且確定該標記的等位基因的物質是選自下組的寡核苷酸引物或探針5 『 -TGCCAGCCCGTAATCATAGG-3 『 (SEQ ID NO 40)、 5' -AAGCACCACGACCCAATCTA-3『 (SEQ ID NO 41),5' -ACGGTCGGGCATTAGTATCC-3『 (SEQ ID NO 48)和 5' -TTCGTGGTGCTGGGTTAGAT-3『 (SEQ ID NO :49)。
20.一種陣列，其中所述陣列包含一種或多種能夠在樣品中確定在一個或多個標記的等位基因的寡核苷酸探針，其中所述一個或多個標記選自下組雞染色體5上的單核苷酸多態性SNP2(rs 16511470)； 雞染色體5上的微衛星標記ADL166 (UniSTS :71823)； 雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011620 (AKTl)中的多態性；和雞染色體5上的核苷酸序列ENSGALG00000011619 (SIVAl)中的多態性。
21.權利要求20的陣列用於鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的用途。
22.權利要求20的陣列用於選擇具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的用途。
23.權利要求20的陣列用於預測動物對細菌感染的應答的用途。
24.一種分離的寡核苷酸引物或寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針或寡核苷酸引物選自下組SEQ ID NO :39至41和44至49。
25.—種基本上如本文中所述用於鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的方法。
26.—種基本上如本文中所述用於選擇具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的一種或多種動物的方法。
27.—種基本上如本文中所述用於預測動物對細菌感染的應答的方法。
28.—種基本上如本文中所述用於鑑定與對細菌感染的抗性相關的基因型的方法。
29.—種基本上如本文中所述用於產生對細菌感染具抗性的動物，或增加對細菌感染的抗性的方法。
30.基本上如本文中所述的位於SALl位的一個或多個標記用於鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的用途，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至 54. 8MB之間或其等同物。
31.基本上如本文中所述的位於SALl位的一個或多個標記用於選擇具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的用途，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至 54. 8MB之間或其等同物。
32.基本上如本文中所述的位於SALl位的一個或多個標記用於預測動物對沙門氏菌屬感染的應答的用途，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。
33.一種基本上如本文中所述的用於在樣品中鑑定位於SALl位的一個或多個標記的基因型的試劑盒，其中所述SALl位位於雞染色體5的54. OMB至54. 8MB之間或其等同物。
34.一種基本上如本文中所述的陣列。
35.一種基本上如本文中所述的分離的寡核苷酸引物或寡核苷酸探針。
全文摘要
本發明提供了一種鑑定具有與對細菌感染的抗性相關的基因型的動物的方法，包括下述步驟(a)提供來自所述動物的樣品；(b)確定SAL1位的一個或多個標記的等位基因以鑑定該標記的基因型，其中所述SAL1位位於雞染色體5的54.0MB至54.8MB之間或其等同物；和(c)確定該基因型是否與對細菌感染的抗性相關的基因型。
文檔編號C12Q1/68GK102459644SQ201080029301
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月28日 優先權日2009年4月29日
發明者M.法伊弗, N.薩爾蒙, P.凱澤 申請人:動物健康研究院