用於妊娠性高血壓和先兆子癇的預後和風險評估的標誌物的製作方法

2023-09-17 02:45:45

專利名稱：用於妊娠性高血壓和先兆子癇的預後和風險評估的標誌物的製作方法
技術領域：
本發明屬於臨床診斷學領域。具體而言，本發明涉及通過測定標誌物的水平而對孕婦中發展出妊娠性高血壓和/或先兆子癇進行預測和風險評估。
背景技術：
高血壓是妊娠期間遇到的最常見的醫療問題，使2-3%的妊娠複雜化。正如國家高血壓教育項目之妊娠高血壓工作組(National High Blood Pressure Education ProgramWorking Group on High Blood Pressure in Pregnancy)所推薦的，妊娠期間的高血壓疾病被分為4類:1)慢性高血壓，2)先兆子癇-子癇，3)先兆子癇加慢性高血壓，以及4)妊娠期或妊娠性高血壓(在妊娠後半期鑑定的妊娠短暫性高血壓或慢性高血壓)。慢性高血壓被定義為在妊娠前或懷胎20周之前，血壓超過140/90mmHg。在婦女妊娠期間首次鑑定到高血壓而且她懷胎不足20周的時候，血壓升高通常表示慢性高血壓。相反，在懷胎20周後新發的血壓讀數升高要求考慮並排除先兆子癇。先兆子癇以高達所有妊娠的5%、首次妊娠的10%以及有慢性高血壓史的婦女的20-25%的比率發生。妊娠時的高血壓疾病可能造成母體和胎兒的發病率，並且它們仍然是母體死亡率的主要來源。妊娠期高血壓所指的高血壓出現在妊娠後半部分(懷胎>20周)，沒有任何其它先兆子癇的特徵，並且隨後是產後血壓正常化。在起初表現出明顯的妊娠期高血壓的婦女中，約三分之一發展出先兆子癇症候群。正因為如此，應該密切觀察這些患者這方面的進展。妊娠期高血壓的病理生理學是未知的，但在沒有先兆子癇的特徵的情況下，母體和胎兒的結果一般是正常的。但是，妊娠期高血壓可能是以後生命中慢性高血壓的先兆。先兆子癇是妊娠中的多系統疾病，其特徵在於先前血壓正常的婦女在懷胎20周後發展出的新發高血壓(收縮壓和舒張壓分別> 140和90mmHg)以及蛋白尿(在24小時的尿液收集中蛋白排洩> 300mg,或者浸量尺> 2+) (Magee等2008.J Obstet Gynecol Canada30(3) Suppl J.S1-S48)。取決於全身的參與情況，幾種其它症狀例如水腫、止血障礙、腎功能或肝功能衰竭、和HELLP症候群(溶血、肝酶升高和低血小板計數)也使臨床現象複雜化。先兆子癇可以具有早髮型(在懷胎34周前開始)或晚髮型(在懷胎34周後開始)。而且，先兆子癇可以表現出輕度或重度症狀(收縮壓> 160mmHg或舒張壓> IlOmmHg,蛋白尿>5g/24小時，少尿，神經系統症狀，其它臨床症狀如肝功能紊亂、血小板減少〈100000mm3、HELLP症候群)，並且在最嚴重的情況下可以發展成為子癇。此外，它可以僅表現為母體疾病而具有合適的胎兒生長，或者可以將其自身表現為生長受限的胎兒(子宮內生長受限(RJGR))或者突然的胎兒窘迫。先兆子癇在極端的孕產婦年齡(〈18歲或>35歲)中更常見。在大於35歲的婦女中慢性高血壓和其它共病性醫學疾病的患病率增加可以解釋大齡孕婦中先兆子癇的頻率增高。儘管尚未清楚了解先兆子癇確切的病理生理機制，但先兆子癇主要是一種胎盤功能障礙疾病，導致伴隨有血管痙攣的內皮功能障礙症候群。在大部分情況下，病理學證據顯示出胎盤功能不全和相關異常例如瀰漫性胎盤血栓形成、炎性胎盤蛻膜血管病變和/或異常滋養層細胞入侵子宮內膜。這支持異常的胎盤發育或來自瀰漫性微血栓形成的胎盤損害是該疾病發展的關鍵。證據也表明，母體對胎兒/胎盤組織的免疫反應改變可能促成了先兆子癇的發展。普遍的內皮功能 障礙可表現為母體症候群、胎兒症候群、或兩者。妊娠婦女可能表現出多器官系統，包括中樞神經系統、肝、肺、腎和血液系統的功能障礙。內皮損傷導致病理性毛細血管滲漏，在母體中表現為重量迅速增加、非依賴性水腫(臉或手)、肺水腫、血濃縮、或其組合。病變胎盤也可以經由子宮-胎盤血流量減少而影響胎兒。這種灌注減少在臨床上可以表現為不可靠的胎兒心率測試、對生物物理情況的評分低、羊水過少、或者胎兒生長受限。迄今為止，儘管有大量的臨床試驗，但還沒有可用於治療或預防先兆子癇的任何治療手段。抗高血壓藥、用於肺成熟的皮質激素或用於防止子癇的硫酸鎂被用來應付(或防止惡化)所述症狀，因此可以在短期內拖延，從而讓更成熟的胎兒安全分娩。結果，治療先兆子癇的唯一但極端的方法是取出胎盤，在早產的情況下，還有分娩出早產兒的不利後果。因此，有或沒有IUGR的先兆子癇依然是世界範圍內母體和新生兒的發病率和死亡率的主要原因。雖然缺乏現有的針對先兆子癇的預防和治療方法，但是尋找可以預測該危及生命的妊娠疾病的發展或者有助於該疾病的檢測的非侵入性生物標誌物仍然是最重要的。多年以來，基於在先兆子癇的情況中所注意到的病理生理學觀察結果，例如胎盤功能障礙、全身性炎症反應、內皮功能障礙和凝血系統的活化(綜述參見Grill等2009，生殖生物學和內分泌學(Reproductive Biology and Endocrinology) 7:70),已研究了不同的生物物理和生物化學標誌物。這些潛在的標誌物包括血管生成因子(例如^^^、？16 、8行卜1)、可溶性內皮因子(sEng)、P-選擇素、無細胞胎兒DNA、ADAM12、胎盤蛋白13 (PP-13)、正五聚素蛋白3 (PTX3)和妊娠相關血漿蛋白A (PAPP-A)(綜述參見Grill等2009，生殖生物學和內分泌學，7:70 )。而且，用於預測先兆子癇的最廣泛使用的成像技術是子宮胎盤都卜勒超聲。可以通過測定流量波形比率或通過檢測子宮弓形血管的舒張期切跡來評估受損的胎盤灌注。然而，據顯示，在低風險和高風險兩種患者組中，預測值都沒有高到足以推薦為常規篩查(Conde-Agudelo 等 2004.0bstet Gynecol104:1367-1391)。腎上腺髓質素(ADM)和內皮素-1 (ET-1)是已知存在於循環系統中的具有血管活性的肽類激素。所述兩種肽都被合成為較大的激素原，並通過肽轉化酶的蛋白水解切割而從它們的前體肽中釋放出來。ADM和ET-1被指參與高血壓的病理生理(綜述參見=Murakami等 2006.Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets 6 (2):125-132 ;Dhaun 等 2008.Hypertension 52:452-459)。已經探討了 ADM用於診斷先兆子癇的作用，結果是相互矛盾的。Senna等2008證明了在不同胎齡下，先兆子癇患者中的母體循環ADM值不同於血壓正常孕婦中的那些值(Senna等2008.Medscape J Med 10(2):29)。然而,來自於患有先兆子癇的孕婦的血液樣品是在已表現出疾病症狀後抽取的。類似地，Minegishi等1999測定了非孕婦女、正常孕婦和患有先兆子癇的孕婦血漿中的ADM濃度。隨著孕期進展，觀察到血漿ADM逐漸增加。在第三個三個月中，有和沒有先兆子癇的婦女之間的血漿ADM濃度沒有顯著差異(Minegishi等1999.Mol Hum Reprod 5 (8): 767-70)。Di 1rio等1998能夠顯示出孕婦比非孕對象的腎上腺髓質素水平高，但正常孕婦和先兆子癇婦女之間的母體血漿腎上腺髓質素濃度沒有差異(Di 1rio等1998.Hypertension 32 (4): 758-63)。相反,有些研究不能證明ADM的增力口，反而是減少(Dikensoy 等 200928 (4):383-9 ;Hata 等 1997.Lancet 350 (9091): 1600)。然而，這些研究都沒有探討ADM作為用於對孕婦發展出妊娠性高血壓或先兆子癇的預後或風險評估的標誌物的應用。在很多研究中也已經探討了 ET-1用於診斷先兆子癇的作用，並且與ADM類似，結果是相互矛盾的。Baksu等2005和Nishikawa等2000顯示,先兆子癇組中的血眾ET-1水平顯著高於健康非孕婦女和血壓正常孕婦中的水平(Baksu等2005.1nt J Gynaecol Obstet90(2):112-7 ;Nishikawa 等 2000.Life Sci 67 (12): 1447-54)。相反，Zunker 等 1998 顯示，在先兆子癇患者和血壓正常且無併發症的妊娠患者之間的ET-1水平沒有統計學差異(Zunker 等 1998.Fetal Diagn Ther.13(5):309_14)。然而，這些研究都沒有探討 ET-1 作為用於對孕婦發展出先兆子癇的預後或風險評估的標誌物的應用。Gao等1996能夠檢測出，與相匹配的正常孕婦相比，妊娠性高血壓患者中的血漿ET-1水平顯著升高。在血漿ET-1水平與平均動脈壓或PIH嚴重度評分指數之間存在顯著的正相關性(Gao 等 1996.Chin Med J (Engl).109 (11): 823-6) Zhang 等 1994 揭不了高血壓妊娠中的ET-1水平高於正常妊娠中的那些水平(Zhang等1994.Zhonghua Fu Chan KeZa Zh.29 (11 ):645-7)ο然而，在Gao等和Zhang等兩者所描述的患者中，ET-1水平是在已表現出高血壓的時候測得的。因此，本發明的發明人已經探討了來自於孕婦的體液樣品中的pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平、特別是MR-pro-ADM和/或CT-pro-ET-Ι水平的測定結果是否可用於在這些對象中對妊娠性高血壓和/或先兆子癇的預後和風險評估。

發明內容
本發明涉及用於妊娠性高血壓和/或先兆子癇的發展的預後或者用於對孕婦中發展出妊娠性高血壓和/或先兆子癇進行風險評估的方法，所述方法包括步驟:(i)提供對象的體液樣品，(ii)測定所述樣品中的pro-ADM或其片段和/或ρι.0-ΕΤ_1或其片段的水平，(iii)將pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平與對孕婦的預後或風險評估相關聯，其中所述片段的長度為至少6個胺基酸殘基。


圖1:MR-pro_ADM的箱線圖分析圖2:CT-pro-ET-l的箱線圖分析圖3:用於在對照和將會發展出晚髮型先兆子癇的患者之間進行區分的MR-pro-ADM的ROC曲線分析圖4:用於在對照和將會發展出晚髮型先兆子癇的患者之間進行區分的CT-pro-ET-1的ROC曲線分析
圖5:用於在對照和將會發展出妊娠性高血壓(PIH)的患者之間進行區分的CT-pro-ET-Ι的ROC曲線分析
具體實施例方式本發明涉及用於妊娠性高血壓和/或先兆子癇的發展的預後或者用於對孕婦發展出妊娠性高血壓和/或先兆子癇進行風險評估的方法，所述方法包括步驟:(i)提供對象的體液樣品，(ii)測定所述樣品中的pro-ADM或其片段和/或ρι.0-ΕΤ_1或其片段的水平，(iii)將pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平與對孕婦的預後或風險評估相關聯，其中所述片段的長度為至少6個胺基酸殘基。所述片段的優選長度為至少6個胺基酸，更優選的長度為至少12個胺基酸殘基。優選可用本文描述的免疫分析法檢測這樣的片段。根據本發明，當與來自於不具有妊娠性高血壓和/或先兆子癇風險的對象的樣品中的pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平相比時，pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平降低預示妊娠性高血壓和/或先兆子癇的風險增加。在本發明的一種實施方式中，在第一個三個月至第二個三個月(妊娠第8至26周)內，更優選在第一個三個月至第二個三個月早期(妊娠第8至20周)內，甚至更優選在第一個三個月(妊娠第8至14周)內，最優選在第一個三個月早期(妊娠第8至10周)內，進行pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的測定。在本發明的一種實施方式中，在妊娠第25周前，優選在第8和第24周之間進行pro-ADM或其片段和/或pro_ET_l或其片段的測定。在本發明的又一種實施方式中，所述預後與先兆子癇的早髮型(在懷胎20至34周之間)或晚髮型(在懷胎34周之後)相關。在本發明的另一種實施方式中，可以另外測定選自下列的其它標誌物:sflt_l、sEng、PIGF, VEGF, PP-13、ADAMl2, P-選擇素、無細胞胎兒 DNA、PTX3、PAPP-A、內脂素、抑制素A、激活素A、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、β-hCG、α-甲胎蛋白(AFP)、金屬蛋白酶-9(MMP-9)、超聲標誌物(子宮動脈搏動指數和/或舒張期切跡)以及心房利鈉肽原(pro-ANP)或其片段、腦利鈉肽原(pro-BNP)或其片段和加壓素原或其片段。在本發明的優選實施方式中，所述其它標誌物選自:sflt_l、sEng、PIGF, VEGF,PP-13、ADAMl2, P-選擇素、無細胞胎兒DNA、PTX3、PAPP-A、內脂素、抑制素A、激活素A、hCG、β -hCG、AFP、MMP-9、超聲標誌物(子宮動脈搏動指數和/或舒張期切跡)、MR-proANP、NT-proBNP 以及和肽素(Copeptin)。本發明也涉及所描述的方法和試劑盒用於孕婦中妊娠性高血壓和/或先兆子癇的預後和風險評估的應用。術語「妊娠性高血壓」或者妊娠期高血壓被定義為在懷胎20周後的孕婦中新發展出的動脈高血壓(收縮壓和舒張壓分別> 140和90mmHg)。術語「先兆子癇」包括孕婦的高血壓的多系統疾病，其特徵在於高血壓和蛋白尿。先兆子癇最常見的症狀是高血壓、尿液中蛋白質增加、以及手和臉的腫脹或水腫。在本發明的某些實施方式中，先兆子癇被定義為高血壓(收縮壓和舒張壓分別> 140和90mmHg)和蛋白尿(在24小時的尿液收集中蛋白排洩彡300mg，或者浸量尺彡2+)。在本發明的具體實施方式
中，在測定時，妊娠性高血壓和/或先兆子癇是無症狀的和/或未表現出來。因此，無症狀的和/或未表現出來的指的是收縮壓和舒張壓低於140和90mmHg，和/或在24小時的尿液收集中蛋白排洩低於300mg或者浸量尺小於2+。「預後」是指對對象患有特定疾病或臨床病症的結果或具體風險進行預測。這可以包括對所述對象恢復的可能性或不利結果的可能性進行估計。在本文中使用時，術語「樣品」指的是出於診斷、預後或評估目標對象例如患者的目而獲得的體液樣品。優選的測試樣品包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、痰和胸腔積液。此外，本領域技術人員會意識到，在分級或純化步驟例如將全血分離成血清或血漿組分之後，某些測試樣品更易於分析。因此，在本發明的優選實施方式中，所述樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品和尿液樣品、或者任何前述樣品的提取物。優選情況下，所述樣品是血液樣品，最優選為血清樣品或血漿樣品。在本文中使用時，術語「對象」指的是活的人或非人類生物體。在本文中優選情況下，所述對象是妊娠的且在第一個三個月至第二個三個月(妊娠第8至26周)內、更優選在第一個三個月至第二個三個月(妊娠第8至24周)內、甚至更優選在第一個三個月至第二個三個月早期(妊娠第8至20周)內、甚至更優選在第一個三個月(妊娠第8至14周)內、最優選在第一個三個月早期(妊娠第8至10周)內的人類對象。在另一種優選實施方式中，所述對象是妊娠的且處於妊娠第25周之前、優選在第8和第24周之間的人類對象。
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當在本文中針對診斷和預後標誌物的應用而使用時，術語「相關聯」指的是將標誌物在患者中的存在或量與它在已知患有特定病症或者已知具有患特定病症的風險的人中的存在或量進行比較。患者樣品中的標誌物水平可以與已知與具體診斷相關的水平進行比較。據稱，樣品的標誌物水平與診斷相關聯；這指的是，技術人員可以使用所述標誌物水平來確定患者是否患有特定類型的診斷，並作出相應的響應。或者，樣品的標誌物水平可以與已知與良好結果(例如沒有疾病等)相關的標誌物水平進行比較。在優選的實施方式中，一組標誌物水平與總概率或特定結果相關聯。正如本文中在蛋白質或肽的語境中提到的，術語「片段」指的是可從較大的蛋白質或肽得到的較小的蛋白質或肽，因而所述片段包含所述較大的蛋白質或肽的部分序列。通過將一個或多個肽鍵皂化，可從所述較大的蛋白質或肽得到所述片段。在本發明的上下文中，術語「水平」指的是從患者的樣品獲得的標誌物肽的濃度(優選表示為重量/體積；w/v)。在本文中，使用檢測方法和/或診斷分析法來進行pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平的測定。優選的pro-ADM片段是MR-pro-ADM。優選的pro-ET-l片段是 CT-pro-ET-l。MR-pro-ADM具有下面的序列:SEQ ID N0.1:1ELRMSSSYPT GLADVKAGPA QTLIRPQDMK GASRSPEDSSCT-pro-ET-l具有下面的序列:
SEQ ID N0.2:I RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTH NRAHW在本文中提到時，「分析法」或「診斷分析法」可以是診斷學領域中所應用的任何類型。這樣的分析法可以是基於待檢測的分析物與一種或多種捕捉探針以一定的親和性進行的結合。關於捕捉分子和靶分子或目標分子之間的相互作用，優選親和常數大於IO8M'在本發明的上下文中，「捕捉分子」是可被用於與來自於樣品的靶分子或目標分子即分析物(即，在本發明的上下文中為心血管肽)結合的分子。因此，必須在空間上以及從表面特徵例如表面電荷、疏水性、親水性、路易斯供體和/或受體的存在或不存在的角度這兩方面使捕捉分子充分成形，以便與靶分子或目標分子特異性結合。因此，例如可以通過在所述捕捉分子和靶分子或目標分子之間的離子、範德華力、η-η、σ-π、疏水性或氫鍵相互作用或者兩種或更多種前述相互作用的組合來介導所述結合。在本發明的上下文中，捕捉分子例如可以選自核酸分子、糖類分子、RNA分子、蛋白質、抗體、肽或糖蛋白。優選情況下，所述捕捉分子是抗體，包括所述抗體的與靶分子或目標分子具有足夠的親和性的片段，並包括重組抗體或重組抗體片段，以及所述抗體的化學和/或生物化學修飾的衍生物或者從變體鏈衍生的且其長度為至少12個胺基酸的片段。優選的檢測方法包括各種形式的免疫分析法，例如放射性免疫分析法(RIA)、化學發光和螢光免疫分析法、酶聯免疫分析法(ELISA)、基於Luminex的磁珠陣列、蛋白質微陣列分析法、以及快速測試形式例如免疫層析試紙測試。所述分析法可以是均相或異相分析法、競爭性或非競爭性分析法。在特別優選的實施方式中，所述分析法是夾心分析法的形式，所述夾心分析法是非競爭性免疫分析法，其中將待檢測和/或定量的分子與第一抗體以及與第二抗體結合。可將第一抗體結合在固相例如珠子、孔壁或其它容器壁、晶片或條帶上，並且第二抗體是例如用染料、放射性同位素、或反應性或催化活性部分標記的抗體。然後通過合適的方法測定與分析物結合的標記抗體的量。「夾心分析法」所涉及的一般組成和步驟已被良好建立並且是技術人員已知的(免疫分析法手冊(The Immunoassay Handbook), David Wild 編輯，Elsevier LTD, Oxford ;第 3版(2005 年 5 月)，ISBN-13:978-0080445267 ；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006年2月；10(1):4-10.PMID: 16376134，通過參考結合於此)。在特別優選的實施方式中，所述分析法包含兩種均作為液體反應混合物中的分散體存在的捕捉分子，優選為抗體，其中第一標記組分與第一捕捉分子連接，其中所述第一標記組分是基於螢光-或化學發光-淬滅或放大的標記系統的一部分，並且所述標記系統的第二標記組分與第二捕捉分子連接，以便當兩種捕捉分子都與分析物結合後，產生可測定的信號，使得能夠在包含樣品的溶液中檢測所形成的夾心複合物。
甚至更優選的是，所述標記系統包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與螢光染料或化學發光染料、特別是花菁類染料的組合。在本發明的上下文中，基於螢光的分析法包含染料的使用，所述染料例如可以選自FAM (5-或6-羧基螢光素)，￥1(:，肥0，螢光素，異硫氰酸螢光素^11'0，11 -700/800，花菁染料例如 CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7，佔噸(Xanthen)，6-羧基-2』，4』，7』，4，7-六氯螢光素(HEX)，TET，6-羧基-4』，5』 - 二氯-2』，7』 - 二甲氧基-螢光素(J0E)，N，N，N』，N』 -四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)，6-羧基-X-羅丹明(ROX)，5-羧基羅丹明_6G (R6G5)，6_羧基羅丹明_6G(RG6)，羅丹明，羅丹明綠，羅丹明紅，羅丹明110，BODIPY染料例如BODIPY TMR,俄勒網綠，香豆素如傘形酮，苯甲亞胺例如Hoechst 33258 ;菲啶類，例如德克薩斯紅，亞基馬黃，Alexa Fluor, PET，溴化乙錠，吖啶染料，咔唑染料，吩噁嗪染料，葉啉染料，聚甲炔染料等。在本發明的上下文中，基於化學發光的分析法包含根據所描述的化學發光材料的物理原理(Kirk-Othmer,化工技術百科全書(Encyclopedia of chemical technology),第 4版，執行主編 J.1.Kroschwitz ;編輯 M.Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993,第 15 卷，第518-562頁，通過參考結合於此，包括第551-562頁的引用)使用染料。優選的化學發光染料是B丫唳酯。診斷和/或預後試驗的靈敏度和特異性不僅僅依賴於試驗的分析「質量」，它們還依賴於對什麼構成異常結果的定義。在實踐中，通常通過將變量的值對它在「正常」(即明顯健康的)和「疾病」人群(即患有糖尿病、胰島素抗性和/或代謝症候群的患者)中的相對頻率作圖，來計算受試者工作特徵曲線(ROC曲線)。對於任何具體標誌物，有和沒有疾病的對象的標誌物水平分布都可能會重疊。在這種情況下，測試不能以100%的準確度完全區分正常與疾病，重疊的區域表示測試不能區分正常與疾病的情形。選擇閾值，使得在所述閾值之上(或在所述閾值之下，取決於標誌物如何隨疾病變化)，測試被認為是異常的，而在所述閾值之下，測試被認為是正常的。ROC曲線下面積是對所認知的測定允許正確鑑定病症的概率的度量。甚至當測試結果不一定給出準確數字的時候，也可以使用ROC曲線。一個人只要能夠對結果進行排序，就能創建ROC曲線。例如，可以按照程度(例如，1=低，2=正常，以及3=高)對「疾病」樣品的測試結果進行排序。可以將該排序與「正常」人群中的結果相關聯，並創建ROC曲線。這些方法是本領域公知的(參見，例如，Hanley等1982.Radiology 143:29-36)。優選情況下，閾值被選擇成提供大於約0.5、更優選大於約0.7、還更優選大於約0.8、甚至更優選大於約0.85、最優選大於約0.9的ROC曲線面積。在本文中，術語「約」指的是給定測定結果的+/_5%。ROC曲線的橫軸表示(1-特異性)，其隨著假陽性率而增加。所述曲線的縱軸表示靈敏度，其隨著真陽性率而增加。因此，對於所選定的具體截止點，可以確定(1-特異性)的值，並且可以獲得相應的靈敏度。ROC曲線下面積是對所測定的標誌物水平允許正確鑑定疾病或病症的概率的度量。因此，可以使用ROC曲線下面積來確定測試的有效性。在某些實施方式中，標誌物和/或標誌物組被選擇成表現出至少約70%的靈敏度，更優選至少約80%的靈敏度，甚至更優選至少約85%的靈敏度，還更優選至少約90%的靈敏度，最優選至少約95%的靈敏度，並且同時還表現出至少約70%的特異性，更優選至少約80%的特異性，甚至更優選至少約85%的特異性，還更優選至少約90%的特異性，最優選至少約95%的特異性。在特別優選的實施方式中，靈敏度和特異性兩者均為至少約75%，更優選至少約80%，甚至更優選至少約85%，還更優選至少約90%，最優選至少約95%。在本文中，術語「約」指的是給定測定結果的+/_5%。根據方法，當所述測定的MR-pro-ADM水平低於預定閾值水平時，在孕婦中預示了妊娠性高血壓和/或先兆子癇的發展。優選情況下，MR-pro-ADM的預定閾值水平在0.2和0.6nmol/L之間，更優選在0.2nmol/L和0.5nmol/L之間，甚至更優選在0.2nmol/L和0.4nmol/L之間,最優選在0.2nmol/L和0.3nmol/L之間。在優選實施方式中，當所述測定的MR-pro-ADM或其片段的水平低於0.6nmol/L、優選低於0.5nmol/L、更優選低於0.4nmol/L、最優選低於0.3nmol/L時，在孕婦中預示了妊娠性高血壓和/或先兆子癇的發展。根據方法，當所述測定的CT-pro-ET-l或其片段的水平低於預定閾值水平時，在孕婦中預示了妊娠性高血壓和/或先兆子癇的發展。優選情況下，CT-pro-ET-l或其片段的預定閾值水平在20和60pmol/L之間，更優選在20pmol/L和50pmol/L之間，甚至更優選在20pmol/L和40pmol/L之間，最優選的在20pmol/L和30pmol/L之間。在優選實施方式中，當所述測定的CT-pro-ET-l或其片段的水平低於60pmol/L、優選低於50pmol/L、更優選低於40pmol/L、最優選低於30pmol/L時,在孕婦中預示了妊娠性高血壓和/或先兆子癇的發展。實施例
_7] 研究人群共323名患者被納入到回顧性研究中。這些患者被診斷為患有早髮型先兆子癇(n=25)，晚髮型先兆子癇(n=25)以及妊娠性高血壓(PIH) (n=25)。225名沒有這些疾病的孕婦作為對照。在每次產前檢查時採集EDTA-樣品，所述產前檢查在懷胎11至14周時進行。當時，所有被納入到研究中的患者均無症狀，並且沒有顯示出先兆子癇或PIH的任何跡象或症狀。所有孕婦都籤署了由國王學院醫院倫理委員會(King’s College Hospital EthicsCommittee)批准的知情同意書。如果在懷胎20周後檢測出高血壓(收縮壓或舒張壓分別> 140和90mmHg)和蛋白尿(在24小時的尿液收集中蛋白排洩彡300mg,或者浸量尺彡2+),則患者被診斷為患有先兆子癇。根據先兆子癇的發病時間，將診斷出先兆子癇的患者進一步分類為早髮型先兆子癇(在懷胎20周和34周之間出現症狀)和晚髮型先兆子癇(在懷胎34周之後出現症狀)。在沒有顯著蛋白尿的情況下，`如果在先前血壓正常的婦女中，在懷胎20周後相隔4小時的彡2次的場合下檢測到舒張壓彡90mmHg，則患者被診斷為患有PIH。測定在8.1 .八.！1.]\15KRYPT0R (B.R.A.H.M.S GmbH, Hennigsdorf/Berlin, Germany)上使用新型全自動化夾心免疫分析系統來檢測MR-pro-ADM和CT-pro-ET-l (Caruhel等2009.Clin Biochem42:725-8)ο該隨機存取分析儀採用了靈敏的時間分辨擴增穴狀化合物釋放(Time Resolved Amplified Cryptate Emission) (TRACE)技術，該技術是基於銪穴狀化合物和XL665這2種螢光團之間的非放射性轉移。用於檢測MR-pro-ADM的自動化分析法本質上是基於使用其它地方詳細描述的相同抗體對(Morgenthaler等2005 Clin Chem51:1823-9)進行的夾心螢光分析法。對於MR-pro-ADM檢測，將26 μ L血漿孵育29分鐘。測定範圍為0-100nmol/L，檢測限和定量限分別為0.05和0.23nmol/L。在1.17nmol/L時，批內CV為1.9%，實驗室間CV為9.8%。用於檢測CT-pioET-1的自動化夾心螢光分析法使用鼠單克隆抗體，其針對包含人pro-ET-l序列第167至183位胺基酸的肽(SEQ.1D N0.3);以及羊多克隆抗體，其針對包含人pro-ET-l序列第183至195位胺基酸的肽(SEQ.1D N0.4)。對於CT-proET_l檢測，將50 μ L血漿孵育24分鐘。該分析法的測定範圍為0-500pmol/L，檢測限和定量限分別為
2.8和9.78pmol/L。在44_324pmol/L的範圍內測定的批內和批間CV分別為1.3-4.6%和
6.3-9.6% (Caruhel 等 2008AACC 54:6，增刊 A119/C-63，摘要)。
結果患者特徵顯示在表I中。發展出晚髮型先兆子癇的婦女中的MR-pro-ADM水平的中值顯著低於妊娠對照(P〈0.007)或者發展出早髮型先兆子癇的婦女(p〈0.02)中的該值。在PIH組中，存在MR-pro-ADM濃度降低的傾向性，但無統計學顯著性。對於MR-pro-ADM，用於區分妊娠對照和將會發展出晚髮型先兆子癇的婦女的ROC曲線下面積(AUC)為0.66(p<0.007)(參見圖3)。表2給出了示例性MR-pro-ADM截止值的靈敏度和特異性。發展出晚發 型先兆子癇的婦女中的CT-pro-ET-l水平的中值顯著低於妊娠對照(p<0.03)中的該值。而且，與妊娠的非高血壓對照相比，發展出妊娠性高血壓的婦女中的CT-pro-ET-l濃度顯著較低(p〈0.03)。對於CT-pro-ET-l，用於區分妊娠對照和將會發展出晚髮型先兆子癇的婦女的ROC曲線下面積(AUC)為0.63 (p<0.05)(參見圖4)。表3給出了用於在妊娠的非高血壓對照和將會發展出晚髮型先兆子癇的婦女之間進行區分的示例性CT-PiO-ET-1截止值的靈敏度和特異性。對於CT-PiO-ET-1，用於區分妊娠的非高血壓對照和將會發展出PIH的婦女的AUC為0.64 (p<0.03)(參見圖5)。表4給出了用於在妊娠的非高血壓對照和將會發展出PIH的婦女之間進行區分的示例性CT-pro-ET-l截止值的靈敏度和特異性。序列SEQ ID N0.1:I ELRMSSSYPT GLADVKAGPA QTLIRPQDMK GASRSPEDSSSEQ ID N0.2:I RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTHNRAHWSEQ ID N0.3:I NSVKSSFHDPKLKGKPSSEQ ID N0.4:I SRERYVTHNRAHW表1:患者特徵
權利要求
1.用於妊娠性高血壓和/或先兆子癇的發展的預後或者用於對孕婦發展出妊娠性高血壓和/或先兆子癇進行風險評估的方法，所述方法包括以下步驟: (i)提供對象的體液樣品， (ii)測定所述樣品中的pro-ADM或其片段和/或ρι.0-ΕΤ_1或其片段的水平， (iii)將pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平與對孕婦的預後或風險評估相關聯， 其中所述片段的長度為至少6個胺基酸殘基。
2.權利要求1的方法，其中在第一個三個月至第二個三個月(妊娠第8至第26周)內，更優選在第一個三個月至第二個三個月早期(妊娠第8至第20周)內，甚至更優選在第一個三個月(妊娠第8至第14周)內，最優選在第一個三個月早期(妊娠第8至10周)內，進行pro-ADM或其片段和/或pro-ΕΤ-Ι或其片段的水平的測定。
3.權利要求1和2的方法，其中預後或風險評估與先兆子癇的早髮型(在懷胎20至34周之間)或晚髮型(在懷胎34周之後)相關。
4.權利要求1至3任一項的方法，其中測定至少一種選自以下的其他標誌物:sflt-l、sEng、PIGF, VEGF, PP-13、ADAMl2, P-選擇素、無細胞胎兒 DNA、PTX3、PAPP-A、內脂素、抑制素A、激活素A、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-甲胎蛋白(AFP)、金屬蛋白酶-9 (MMP-9)、超聲標誌物(子宮動脈搏動指數和/或舒張期切跡)、心房利鈉肽原(ProANP)或其片段、腦利鈉肽原(proBNP)或其片段、以及加壓素原或其片段。
5.權利要求1至4任一項的方法，其中測定MR-pro-ADM和/或CT-pro-ET_l的水平。
6.權利要求1至5任一項的方法，其中將MR-pro-ADM和/或CT-pro-ET_l水平的測定與PAPP-A、PLGF和/或超聲標誌物(子宮動脈搏動指數和/或舒張期切跡)相組合。
7.權利要求1至6任一項的方法，其中在測定時，妊娠性高血壓和/或先兆子癇在所述孕婦中為無症狀的和/或未表現出來。
8.權利要求1至7任一項的方法，其中所述樣品是體液，特別是血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液或者胸腔積液。
9.權利要求1至8任一項的方法，其中MR-pro-ADM的預定閾值水平在0.2和0.6nmol/L之間，更優選在0.2nmol/L和0.5nmol/L之間，甚至更優選在0.2nmol/L和0.4nmol/L之間，最優選在0.2nmol/L和0.3nmol/L之間。
10.權利要求1至8任一項的方法，其中CT-pro-ET-Ι的預定閾值水平在20和60pmol/L之間，更優選在20pmol/L和50pmol/L之間，甚至更優選在20pmol/L和40pmol/L之間,最優選在20pmol/L和30pmol/L之間。
11.權利要求1至10任一項的方法，其中當所述測定的MR-pro-ADM或CT-pro-ET-Ι的水平低於預定閾值水平時，在孕婦中預示了妊娠性高血壓和/或先兆子癇的發展。
全文摘要
本發明涉及通過測定標誌物水平而對孕婦中發展出妊娠性高血壓和/或先兆子癇進行預後和風險評估。
文檔編號G01N33/74GK103109192SQ201180030104
公開日2013年5月15日 申請日期2011年6月17日 優先權日2010年6月18日
發明者布魯諾·達博萊特, 蓋亞尼·德米爾吉安 申請人:塞尚公司