耐熱保護劑、豬瘟可室溫保存活疫苗及其製備方法和應用與流程

2023-10-11 10:25:54 1

本發明屬於疫苗製造保存領域，具體涉及耐熱保護劑、豬瘟可室溫保存活疫苗及其製備方法和應用，尤其涉及一種豬瘟可室溫保存活疫苗及其製備方法。

背景技術：

豬瘟(classicalswinefever，csf)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，流行性廣、病死率高，給養豬業造成巨大的安全隱患和經濟損失。目前市場上用以預防豬瘟效果較好的是豬瘟細胞活疫苗和豬瘟成兔組織脾淋苗，均是以c株為基礎。

豬瘟病毒對熱非常敏感，有文獻報導，豬瘟病毒在37℃中半衰期僅有3小時；目前常用的豬瘟活疫苗主要採用冷凍乾燥工藝製備，市場上常用的凍幹保護劑組方簡單，大多含有蔗糖、明膠、硫脲、牛血清白蛋白、水解乳蛋白、磷酸鹽等成分，疫苗耐熱性能有限，僅能在37℃保存7-10天，或-15℃長期保存，或2～8℃保存1-2年，一旦冷鏈斷裂，常溫條件下僅幾個小時就會使產品效價損失50％以上，甚至完全失效；同時，由於在冷凍過程中形成的冰晶對病毒囊膜或細胞壁造成不同程度的機械性損傷，會大大降低病毒活性。因此，減少疫苗乾燥損失、提高疫苗耐熱性能以保證疫苗品質，是充分發揮免疫效力的重要關鍵技術。近年來，很多研究者都在研究、改進耐熱工藝，例如噴霧乾燥、仿生礦化等，但都處於實驗室研究水平。

糖玻璃疫苗技術可以將疫苗製備成玻璃態，該技術主要通過梯度真空乾燥工藝得以實現，在真空梯度降低過程中，包含疫苗的高黏度糖通過沸騰、起泡、水分揮發，逐步固相化成為一種玻璃體，由於非還原糖很穩定，因此包裹疫苗的糖玻璃不會與蛋白質產生反應。此技術不需冷凍、在常溫中即可進行，避免了傳統凍幹中「冷凍」產生的冰晶對病毒的機械性損傷，此外，由於疫苗含糖量較高、粘度較大，形成的玻璃態疫苗具有更高的玻璃化轉變溫度，可以在室溫或「冷鏈」環境以外進行長期保存。

玻璃化轉變溫度tg(glasstransitiontemperature)是物質的重要特性熱參數，是物質從玻璃態轉變為高彈態的溫度。在tg以下，高聚物處於玻璃態，分子鏈和鏈段都不能運動，只是構成分子的原子(或基團)在其平衡位置作振動；而在tg時分子鏈雖不能移動，但是鏈段開始運動，表現出高彈性質，溫度再升高，就使整個分子鏈運動而表現出粘流性質。對於乾燥的疫苗而言，tg越高，tg與儲存溫度的差值越大，越有利於疫苗的長期儲存。

基於以上原理，在對疫苗進行梯度真空乾燥前需要加入增稠劑增加疫苗的黏度，同時真空度下降速率不能太快，以保證在乾燥過程中可以起泡且樣品不噴瓶。需要注意的是，糖玻璃疫苗的殘餘水分不能太高，控制在1-3％為宜，在此殘水情況下，疫苗可以較好地保持玻璃態且穩定。

技術實現要素：

發明目的：本發明所要解決的技術問題是提供了一種耐熱保護劑。

本發明還要解決的技術問題是提供了一種耐熱保護劑的製備方法。

本發明還要解決的技術問題是提供了耐熱保護劑在製備疫苗方面的應用。

本發明還要解決的技術問題是提供了耐熱保護劑在製備豬瘟可室溫保存活疫苗方面的應用。

本發明最後要解決的技術問題是提供了豬瘟可室溫保存活疫苗的製備方法。

技術方案：本發明的目的通過以下技術方案實現：一種耐熱保護劑，所述耐熱保護劑按質量百分含量包括但不僅限於以下組分：棉子糖1％～5％、麥芽糖5％～10％、蔗糖15％～30％、乳糖1％～5％、葡萄糖1％～5％、聚山梨酯800.1％～1.5％、聚乙二醇80000.1％～0.5％、酪氨酸0.5％～3％、絲素蛋白3％～6％、其餘為注射用水。

其中，所述耐熱保護劑按質量百分含量包括但不僅限於以下組分：棉子糖1.5％～4％、麥芽糖6％～9％、蔗糖20％～25％、乳糖2％～4％、葡萄糖2％～4％、聚山梨酯800.5％～1％、聚乙二醇80000.2％～0.4％、酪氨酸1％～2％、絲素蛋白4％～5％、其餘為注射用水。

本發明內容還包括耐熱保護劑的製備方法，包括以下步驟：

1)將棉子糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚山梨酯80溶於水，採用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌得到溶液1；

2)將聚乙二醇8000、酪氨酸、絲素蛋白溶於水，採用過濾法進行除菌得到溶液2；

3)將溶液1和溶液2混合，補足水，得到耐熱保護劑。

本發明內容還包括上述的耐熱保護劑在製備疫苗方面的應用。

本發明內容還包括上述的耐熱保護劑在製備豬瘟可室溫保存活疫苗方面的應用。

本發明內容還包括一種豬瘟可室溫保存活疫苗的製備方法，將豬瘟病毒液與所述的耐熱保護劑按體積比1～3：1混合均勻製得豬瘟活疫苗溶液，經過梯度真空乾燥後得到所述豬瘟活疫苗。在乾燥過程中，真空度逐級降低、而溫度維持在室溫，水分揮發，液體變得粘稠、沸點下降，當真空度和溶液粘稠度達到一定閾值時，溶液開始鼓泡、水分揮發的表面積增大，加速了疫苗的乾燥。該工藝沒有冷凍階段，避免冰晶對病毒造成損傷。

具體的，梯度真空乾燥方法如下：

將豬瘟活疫苗溶液在常溫常壓下平衡0.5～2小時，在真空度為500mbar～800mbar、溫度為5℃～30℃條件下保持0.5～1小時，在真空度為80mbar～500mbar、溫度為10℃～35℃條件下保持0.5～2小時，在真空度為30mbar～80mbar、溫度為10℃～40℃條件下保持0.5～2小時，在真空度為0.01mbar～0.05mbar、溫度為20℃～40℃條件下保持8～12小時，在真空度為0.001mbar～0.01mbar、溫度為20℃～40℃條件下保持12～24小時，得到乾燥的豬瘟活疫苗。

其中，本發明製備的豬瘟活疫苗在37℃保存3個月，25℃保存一年。

本發明所述乾燥的豬瘟活疫苗在掃描電鏡下呈現呈現出玻璃樣片層結構，其玻璃化轉變溫度高達50℃以上。其中，上述玻璃化轉變溫度高達65～70℃。

其中，上述豬瘟病毒液為細胞毒(c株)。

有益效果：與現有技術相比，本發明具備以下優點：

1、本發明的耐熱保護劑，由於成分搭配合理，使得豬瘟活疫苗耐熱、耐儲存，可讓病毒處於休眠狀態，降低病毒乾燥和保存期的生命活動；

2、本發明中的梯度真空乾燥技術，可避免冰晶損傷，使得豬瘟活疫苗在製造過程中的損失降到最低，極大保持了豬瘟病毒的活性；

3、本發明製備的豬瘟活疫苗可在37℃保存3個月，25℃保存一年。

4、本發明製備的疫苗外觀為緻密的乾燥泡沫狀，掃描電鏡下呈現出玻璃樣片層結構，其玻璃化轉變溫度高達50℃以上，比常規凍幹疫苗高30℃以上。

附圖說明

圖1豬瘟活疫苗外觀(緻密的乾燥泡沫狀)；

圖2豬瘟活疫苗掃描電鏡照片(玻璃樣片層結構)。

具體實施方式

下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。

實施例1耐熱保護劑1以及豬瘟活疫苗1的製備

如果沒有特殊說明，本實施例中的百分比為重量百分比。

耐熱保護劑1配方：

耐熱保護劑1的具體製備步驟如下：將棉子糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚山梨酯80溶於水，採用高壓蒸汽滅菌法(110℃20min)進行滅菌；將聚乙二醇8000、酪氨酸、絲素蛋白溶於水，採用0.22μm過濾法進行除菌；將高壓滅菌部分和過濾除菌部分等體積混合，補足注射用水，得到所述耐熱保護劑1。

製備豬瘟活疫苗1：將耐熱保護劑1與豬瘟病毒液(c株，病毒含量50×104rid/ml)以體積比3：1混合，分裝至7ml西林瓶中，1ml/瓶，用丁基膠塞半加塞後，置入凍幹機箱內進行梯度真空乾燥，得到豬瘟活疫苗1。

該梯度真空乾燥的具體步驟為：將豬瘟活疫苗溶液在常溫常壓下平衡0.5小時，在真空度為500mbar、溫度為20℃條件下保持0.5小時，在真空度為500mbar、溫度為20℃條件下保持1小時，在真空度為80mbar、溫度為25℃條件下保持0.5小時，在真空度為0.05mbar、溫度為40℃條件下保持12小時，在真空度為0.01mbar、溫度為40℃條件下保持24小時，得到乾燥的豬瘟活疫苗1。

實施例2耐熱保護劑2以及豬瘟活疫苗2的製備

如果沒有特殊說明，本實施例中的百分比為重量百分比。

耐熱保護劑2配方：

耐熱保護劑2的具體製備步驟如下：將棉子糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚山梨酯80溶於水，採用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌；將聚乙二醇8000、酪氨酸、絲素蛋白溶於水，採用過濾法進行除菌；將高壓滅菌部分和過濾除菌部分等體積混合，補足注射用水，得到所述耐熱保護劑2。

製備豬瘟活疫苗2：將耐熱保護劑2與豬瘟病毒液(c株，病毒含量50×104rid/ml)以體積比1：1混合，分裝至7ml西林瓶中，1ml/瓶，用丁基膠塞半加塞後，置入凍幹機箱內進行梯度真空乾燥，得到豬瘟活疫苗2。

梯度真空乾燥的具體步驟為：將豬瘟活疫苗溶液在常溫常壓下平衡1小時，在真空度為800mbar、溫度為10℃條件下保持1小時，在真空度為80mbar、溫度為10℃條件下保持0.5小時，在真空度為50mbar、溫度為15℃條件下保持2小時，在真空度為0.02mbar、溫度為20℃條件下保持12小時，在真空度為0.001mbar、溫度為20℃條件下保持24小時，得到乾燥的豬瘟活疫苗2。

實施例3耐熱保護劑3以及豬瘟活疫苗3的製備

如果沒有特殊說明，本實施例中的百分比為重量百分比。

耐熱保護劑3配方：

耐熱保護劑3的具體製備步驟如下：將棉子糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚山梨酯80溶於水，採用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌；將聚乙二醇8000、酪氨酸、絲素蛋白溶於水，採用過濾法進行除菌；將高壓滅菌部分和過濾除菌部分等體積混合，補足注射用水，得到所述耐熱保護劑3。

製備豬瘟活疫苗3：將耐熱保護劑3與豬瘟病毒液(c株，病毒含量50×104rid/ml)以體積比3：1混合，分裝至7ml西林瓶中，1ml/瓶，用丁基膠塞半加塞後，置入凍幹機箱內進行梯度真空乾燥，得到豬瘟活疫苗3。

梯度真空乾燥的具體步驟為：將豬瘟活疫苗溶液在常溫下平衡2小時，在真空度為700mbar、溫度為5℃條件下保持0.7小時，在真空度為300mbar、溫度為10℃條件下保持0.5小時，在真空度為30mbar、溫度為25℃條件下保持2小時，在真空度為0.01mbar、溫度為25℃條件下保持12小時，在真空度為0.001mbar、溫度為25℃條件下保持12小時，得到乾燥的豬瘟活疫苗3。

實施例4耐熱保護劑4以及豬瘟活疫苗4的製備

如果沒有特殊說明，本實施例中的百分比為重量百分比。

耐熱保護劑4配方：

耐熱保護劑4的具體製備步驟如下：將棉子糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚山梨酯80溶於水，採用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌；將聚乙二醇8000、酪氨酸、絲素蛋白溶於水，採用過濾法進行除菌；將高壓滅菌部分和過濾除菌部分等體積混合，補足注射用水，得到所述耐熱保護劑3。

製備豬瘟活疫苗4：將耐熱保護劑4與豬瘟病毒液(c株，病毒含量50×104rid/ml)以體積比3：1混合，分裝至7ml西林瓶中，1ml/瓶，用丁基膠塞半加塞後，置入凍幹機箱內進行梯度真空乾燥，得到豬瘟活疫苗4。

梯度真空乾燥的具體步驟為：將豬瘟活疫苗溶液在常溫常壓下平衡0.5小時，在真空度為500mbar、溫度為15℃條件下保持0.5小時，在真空度為80mbar、溫度為15℃條件下保持2小時，在真空度為50mbar、溫度為20℃條件下保持1小時，在真空度為0.05mbar、溫度為20℃條件下保持12小時，在真空度為0.01mbar、溫度為25℃條件下保持18小時，得到乾燥的豬瘟活疫苗4。

實施例5耐熱保護劑5以及豬瘟活疫苗5製備

如果沒有特殊說明，本實施例中的百分比為重量百分比。

耐熱保護劑5配方：

耐熱保護劑5的具體製備步驟如下：將棉子糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚山梨酯80溶於水，採用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌；將聚乙二醇8000、酪氨酸、絲素蛋白溶於水，採用過濾法進行除菌；將高壓滅菌部分和過濾除菌部分等體積混合，補足注射用水，得到所述耐熱保護劑5。

製備豬瘟活疫苗5：將耐熱保護劑5與豬瘟病毒液(c株，病毒含量50×104rid/ml)以體積比2：1混合，分裝至7ml西林瓶中，1ml/瓶，用丁基膠塞半加塞後，置入凍幹機箱內進行梯度真空乾燥，得到豬瘟活疫苗5。

梯度真空乾燥的具體步驟為：將豬瘟活疫苗溶液在常溫常壓下平衡0.5小時，在真空度為800mbar、溫度為30℃條件下保持0.5小時，在真空度為80mbar、溫度為35℃條件下保持2小時，在真空度為50mbar、溫度為40℃條件下保持1小時，在真空度為0.05mbar、溫度為30℃條件下保持12小時，在真空度為0.01mbar、溫度為30℃條件下保持18小時，得到乾燥的豬瘟活疫苗5。

實施例6耐熱保護劑6以及豬瘟活疫苗6的製備

如果沒有特殊說明，本實施例中的百分比為重量百分比。

耐熱保護劑6配方：

耐熱保護劑6的具體製備步驟如下：將棉子糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、聚山梨酯80溶於水，採用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌；將聚乙二醇8000、酪氨酸、絲素蛋白溶於水，採用過濾法進行除菌；將高壓滅菌部分和過濾除菌部分等體積混合，補足注射用水，得到所述耐熱保護劑6。

製備豬瘟活疫苗6：將耐熱保護劑5與豬瘟病毒液(c株，病毒含量50×104rid/ml)以體積比1：1混合，分裝至7ml西林瓶中，1ml/瓶，用丁基膠塞半加塞後，置入凍幹機箱內進行梯度真空乾燥，得到豬瘟活疫苗6。

梯度真空乾燥的具體步驟為：將豬瘟活疫苗溶液在常溫常壓下平衡0.5小時，在真空度為500mbar、溫度為25℃條件下保持1小時，在真空度為80mbar、溫度為25℃條件下保持2小時，在真空度為50mbar、溫度為30℃條件下保持1小時，在真空度為0.05mbar、溫度為30℃條件下保持8小時，在真空度為0.01mbar、溫度為35℃條件下保持24小時，得到乾燥的豬瘟活疫苗6。

實施例7對照耐熱保護劑1

對照耐熱凍幹保護劑1(公開於cn103341176a)，具體製備方法如下：

(1)a液配製：取nz-胺(nzamine[商]nz胺[酪蛋白的酶促水解物])3g、穀氨酸單鉀鹽(cas：6382-01-0)0.375g，蔗糖25g、水解乳蛋白1.875g，將以上成分按順序溶於100ml注射用水中，充分溶解後搖勻，用0.22μm的濾膜過濾除菌後2～8℃備用；

(2)b液配製：取水解明膠20g，用70～80℃的注射用水100ml充分溶解後，121℃、15磅高壓滅菌30分鐘，滅菌後保存在37℃；

(3)將a液與b液按4：1的比例進行配比，混合均勻即為耐熱凍幹保護劑，其中各組分的質量體積百分比濃度如下：2.4％nz-胺、0.3％穀氨酸單鉀鹽、20％蔗糖、1.5％水解乳蛋白、4％水解明膠。

對照豬瘟活疫苗1：取對照耐熱凍幹保護劑2與豬瘟病毒抗原液(c株，病毒含量50×104rid/ml)按照體積比為1:4混合，分裝至7ml西林瓶中，1ml/瓶，用丁基膠塞半加塞後，凍幹機箱體內。

具體凍幹步驟為：將混合液置入凍幹箱中，選取預凍溫度為-50℃，預凍時低溫保持時間為2h、預凍前期控制在-15℃，待產品釋放解析熱後快速冷凍：升華階段產品溫度為-33℃、板層溫度設定為-8℃、升華時間為11h；解析溫度為26℃、解析時間為4h，凍幹全程為24h，加塞出箱，得到對照豬瘟活疫苗1。

實施例8對照耐熱保護劑2

對照耐熱凍幹保護劑2(公開於cn103041399a)，具體製備方法如下：

按照各耐熱保護劑的配方稱取各成分，獲得對照耐熱保護劑2。

對照豬瘟活疫苗2：取對照耐熱保護劑2與豬瘟病毒抗原液(c株，病毒含量50×104rid/ml)按照體積比為1:1混合，分裝至7ml西林瓶中，1ml/瓶，用丁基膠塞半加塞後，凍幹機箱體內。

具體凍幹步驟為：將對照豬瘟活疫苗2在常壓、溫度為-52℃條件下保持4小時，在真空度為5.0mbar溫度為-3℃條件下保持18小時，在真空度為2.5mbar溫度為20℃條件下保持5小時，即得對照豬瘟活疫苗2。

實施例9豬瘟活疫苗的理化特性檢測

測定實施例1～8中各豬瘟活疫苗的物理性狀、殘餘水分、玻璃化轉變溫度和真空度。乾燥疫苗的剩餘水分和真空度測定按照現行《中華人民共和國獸藥典》附錄的方法和標準進行，玻璃化轉變溫度用差示量熱掃描儀檢測。具體結果見表1。從表1可以看出，均符合《中華人民共和國獸藥典》附錄的規定，且豬瘟活疫苗1-6在殘餘水分和真空度等方面均符合規定，殘餘水分比對照豬瘟活疫苗1和2均略低。玻璃化轉變溫度方面，豬瘟活疫苗1-6均比對照豬瘟活疫苗1(傳統凍幹疫苗)高30℃以上。其中，豬瘟活疫苗5玻璃化轉變溫度tg最高，為69±1.68℃。

表1豬瘟活疫苗的物理性狀、殘餘水分測定結果

實施例10豬瘟活疫苗的耐熱性能測定

測定實施例1～8中各豬瘟活疫苗在乾燥前後、37℃條件下儲存10天、30天、60天、90天和120天的病毒含量，在25℃條件下儲存1月、3月、6月、9月、12月和15月的病毒含量。豬瘟活疫苗的病毒含量檢測方法按照現行《中華人民共和國獸用生物製品規程》進行。表2為豬瘟活疫苗37℃長期保存後病毒含量的測定結果；表3為豬瘟活疫苗25℃長期保存後病毒含量的測定結果。

表2中：乾燥損失是指乾燥前和乾燥後0d疫苗病毒含量的差值。耐熱損失是指疫苗乾燥第0天後與37℃保存不同天數後疫苗病毒含量的差值。

從表2可以看出，豬瘟活疫苗1～6在乾燥過程中病毒含量損失在0.4～0.52lgrid/ml；在37℃條件下儲存10天後，病毒含量損失均≤0.3lgrid/ml，37℃條件下儲存90天後，病毒含量損失在0.88～1.0lgrid/ml。豬瘟活疫苗1～6在耐熱過程中的病毒含量損失均小於對照豬瘟耐熱活疫苗。其中，豬瘟活疫苗4和豬瘟活疫苗5的耐熱性能最好，37℃儲存120天，耐熱損失均為1.22lg。

表3中：乾燥損失是指乾燥前和乾燥後0d疫苗病毒含量的差值。耐熱損失是指疫苗乾燥第0天後與25℃保存不同天數後疫苗病毒含量的差值。

通過表3可以看出，豬瘟活疫苗1～6在乾燥過程中病毒含量損失在0.4～0.52lgrid/ml；在25℃條件下儲存6月，病毒含量損失均≤0.6lgrid/ml，25℃條件下儲存12月，病毒含量損失在0.82～1.0lgrid/ml；對照豬瘟活疫苗1和2在25℃儲存1個月病毒含量損失在1.0～1.48lgrid/ml。豬瘟活疫苗1～6在耐熱過程中的病毒含量損失均小於對照豬瘟耐熱活疫苗。其中，豬瘟活疫苗5的耐熱性能最好，在25℃條件下儲存12月病毒含量損失僅0.82lgrid/ml，這個結果與其tg最高、37℃條件下儲存90天-120天耐熱性能最好呈現出相關性。