酯酶的製備的製作方法

2023-10-11 20:22:54 4

專利名稱：：酯酶的製備的製作方法酯酶的製備本發明涉及製備具有酯酶活性的蛋白的方法，所述方法包括在^c/^r/c/n'aco/z'(Eco//)菌株中表達編碼此類蛋白的基因。具有豬肝酯酶活性的蛋白的高水平表達並不容易實現。Lange"W[1]的報導顯示ft'c/^戸加^中對豬肝酯酶(7-rPLE)的7-同工酶的生產很低但可檢測到。更近來，B6ttcher"a/.(2007)[2]已描述了一種方法。這些作者的工作表明，豬肝酯酶(7-rPLE)的7-同工酶在五.//菌株中的表達並非直接簡單的過程。如果不採用額外的手段，此類表達完全失敗。這勝手段暗示不僅要正確選擇合適的Eco/Z菌株，還要共表達伴侶蛋白。特別地，僅可能在Eco/廠菌株Origami中製備功能性7-rPLE，該菌株共表達相當大量的、被稱為GroEL和GroES的伴侶蛋白。在7-rPLE的正確表達中遇到的問題的至少--部分涉及蚩l'l屮多個-:硫令人非常吃驚地，並且與B6ttchere,a/.(2007)[l]所報導的教導相悖地，本發明揭示可以在沒有B6ttcher"fl/.(2007)[l]所公開的多種額外丁-段的情況下，特別是不共表達其它基因的情況下，實現具有豬肝酯,(PLE)活性的蛋白的功能表達。因此，本發明涉及製備具有酯酶活性的蛋白的方法，所述方法包括在Eco//菌株中表達編碼此類蛋白的基因，其特徵在於編碼具有酯酶活性的蛋A的基因與SEQIDNO:11、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:44的多核苷酸具有至少70%同一性，優選至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，最優選至少99%同一性，並且所述基因編碼分別與SEQIDNO:12、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43或SEQIDNO:45具有節少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。本發明的優點之一是獲得了經正確摺疊的酯酶，而無需從質粒共表達GroEL和/或GroES。在一種優選的實施方式中，表達在不從質粒共表達GroEL和/或GroES的情況下進行。在本發明的上下文中，同一性按照TatianaA.Tatusova,ThomasL.Madden(1999),"Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences",FEMSMicrobiolLett.174:247-250所述來計算，其中使用http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi的下述標準參數對蛋白序列而言Matrix:BLOSUM62開放缺口5延伸缺口2懲罰缺口x_dropoff:11預期10字長11對核苷酸序列而言匹配獎勵1錯配懲罰-2開放缺口11延伸缺口1懲罰缺口x—dropoff:50預期10字長3更優選地，本發明涉及製備具有酯酶活性的蛋白的方法，所述方法也括在ECO/Z菌株中表達編碼此類蛋白的基因，其特徵在T編碼具有酯酶活性的蛋白的基因與SEQIDNO:11的多核苷酸具有至少70%同-一性，優選至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，最優選至少99%同一性，並且所述基因編碼與SEQIDNO:12具有至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。根據另一實施方式，本發明涉及製備具有酯酶活性的蛋白的方法，所述方法包括在五."//菌株中表達編碼此類蛋白的基因，其特徵在於所述基因編碼與SEQIDNO:12具有至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。SEQIDNO:12代表了APLE的胺基酸序列。根據另一實施方式，本發明涉及適於製備具有酯酶活性的蛋廣l的重組&//菌株，其特徵在於，所述生物含有編碼具有酯酶活性的蛋白並Fl與SEQIDNO:11、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:44的多核苷酸具有至少70%同一性，優選至少80%同一性，優選至少85%同性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同…性，最優選至少99%同一性的基因，並且，所述基因編碼分別與SEQIDNO:12、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43或SEQIDNO:45具有至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同-性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。在一種優選的實施方式中，重組Eco/z'菌株不包含用於共表達GroEL和/或GroES的質粒，並.冃.能生產具有酯酶活性的蛋白。特別地，本發明涉及適於根據上文所述的方法製備具有酯酶活性的蛋白的重組Ew/r菌株，其中，所述生物含有編碼具有酯酶活性的蛋卜'1並1L與SEQIDNO:11的多核苷酸具有至少70%同一性，優選至少80%同-性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95。/。同一性，優選至少98%同一性，最優選至少99%同一性的基因，並且，所述基因編碼與SEQIDNO:12具有至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。特別地，本發明還涉及適於根據上文所述的方法製備具有酯酶活性的蛋白的重組五.co//菌株，其中，所述生物含有編碼與SEQIDNO:12具有至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白的基因。根據另一實施方式，本發明涉及適於製備具有酯酶活性的蛋白的重組五.co//菌株，其特徵在於，穀胱甘肽還原酶和/或硫氧還蛋白(thioredoxin)還原酶的表達的表達被消除，例如通過突變實現。根據本發明的另一實施方式，重組五.//菌株的穀胱甘肽還^,和硫氧還蛋白還原酶兩者的表達都被消除。Prinz"a/(1997)[3]已教導，如果是在還原酶活性被消除的菌株屮卞.產時，含有二硫橋的蛋白(特別是鹼性磷酸酶)在E//中表達的'活性較高。還已顯示，如果兩種還原酶都被消除的話，將發生自發突變，這使得能在需氧條件下生長。Beckw池e"/.(2005)[4]鑑定了恢復生物在^築條件下生長的能力的可能的自發突變。他們指出，AhpC基因屮的突變(也括該基因的大約36-39位密碼子的TCT三體富集區域中插入三個核fh'俊)提供了這種作用。Bessette"fl/.(1999)[5]已更詳細地分析了Prinzeffl/.(1997)描述的-^達系統，他們顯示，輔助蛋白DsbC(二硫鍵異構酶)的共表達增強了活性組織血纖維蛋白溶酶原活化因子的表達和活性鹼性磷酸酶的表達。此外，還公開了，DsbC的截短版本的細胞內表達導致產生功能性的二硫鍵異構酶蛋臼。根據本發明的另一實施方式，已經對重組E//進行了進一歩修飾，以生產低分子量的輔助蛋白，其能引入二硫鍵用於需要二硫鍵的蛋ri的ii:確摺疊，或者其能改正不適當的二硫鍵導致的錯誤摺疊。上文提到的合適的低分子量輔助蛋白是二硫化物異構酶。在一種特別優選的實施方式中，輔助蛋G是五.co/Z的被稱為DsbC的蛋fi(Bessettes8a/(1999))。適於根據本發明使用的五.co/Z菌株較之野生型E""菌株而言具有較少還原性的細胞內環境。此類五.co/z'菌株的一個具體例子是EOrigami菌株，其在穀胱甘肽還原酶基因和硫氧還蛋白還原酶基因上具有突變(Terpe(2006)[6])。當這些基因功能性表達時，其抵消細胞質中的二硫鍵形成。因此，含有二硫鍵的蛋白的異源表達迄今為止被認為需要分別消除穀胱甘肽和硫氧還蛋白還原酶活性。但是，我們發現，僅一種突變就足以使得具有PLE活性的蛋白的功能性表達增加。令人吃驚地，合適的編碼酯酶的基因是編碼酯酶蛋白並且具有針對P/c/》改造的密碼子使用的多核苷酸。更特別地，本發明涉及下述基因，所述基因編碼功能性酯酶蛋D，並且具有較之SEQIDNO:11的多核苷酸而言具有至少70%同性，優選至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選.節少95%同一性，優選至少98%同一性，最優選至少99。/。同一性的核苷酸序列，並且，所述基因編碼與SEQIDNO:12具有至少80%同一'性，優選至少85%同一性，優選至少90%同-一'性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。在本發明的一種實施方式中，本發明涉及經分離的多核苷酸，其編碼具有酯酶活性的功能性蛋fl，所述多核苷酸具有與SEQIDNO:11、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:44的多核苷酸具冇至少70%同一性，優選至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同-性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，最優選至少99%同一性的核苷酸序列，並且編碼分別與SEQIDNO:12、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43或SEQIDNO:45具有至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同-性，更優選至少99%同一性的蛋白。通過在可大量發酵生產的微生物宿主(例如細菌和酵母等)中表達編碼感興趣的蛋白的基因，可實現對蛋白的大量生產。Terpe(2006)近來已對細菌蛋白表達系統進行了綜述。根據本發明，在經轉化的Eco/Z菌株中表達編碼感興趣的蛋白的此類基因。可通過任何合適的方法，例如通過電穿孔、通過熱激轉化或者通過化學轉化，來用異源基因轉化五.co仏為轉化五.co/z'，編碼具有酯酶活性的蛋白的基因可以是載體(例如質粒、噬菌體或噬粒)的一部分。本發明還涉及適於在Eco//中複製和表達的載體，所述載體含有編碼具有酯酶活性的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸具有與SEQIDNO:11、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:44的多核苷酸具有至少70%同一性，優選至少80%同-」性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，最優選至少99%同一性的核苷酸序列，並且，編碼分別與SEQIDNO:12、SEQTDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43或SEQIDNO:45具有至少80%同'性，優選節少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。載體應當含有適於進行例如選擇、複製、基因調控轉錄(起始和終止)以及克隆所需的基因序列的必要的功能元件。對適用於本發明的五.co/r菌株、載體、載體兀件、轉染方法、經轉染生物的培養方法以及所需的多肽的收穫和分離方法的選擇將是本領域技術人員顯而易見的。通過豬肝提取從動物來源獲得的商業豬肝酯酶(PLE)廣泛用於合成有機化學領域。商業酶製劑已顯示出至少由可能具有不同底物特異性的若干PLE同工酶構成。商業PLE廣泛用於多種生物催化反應，這利用了其寬廣的底物特異性10以及酯水解的對映異構選擇性。例如，WO01/09079描述了動物源的PLE用於對(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯的(R)-對映異構體進行選擇性水解的用途。由於病毒和朊病毒等導致的傳染性疾病方面的顧慮，對於藥物生產而言，僅使用非動物源性原材料的興趣在逐漸增加，使用重組DNA技術對酯酶進行微生物生產可針對此提供解決方案。基於鑑定和表達PLE主要(Y-)同工酶方面可獲得的信息(Matsushima"a/(1991)[7].,Langeetal.(2001))，製備來自豬肝的cDNA，並針對PLEY-同工酶相關序列加以篩選。就此目的而言，設計能識別編碼PLEY-異構酶相關蛋白的cDNA片段的PCR引物。通過對多種這類y-PLE相關cDNA片段進行DNA測序，如預計的那樣，找到了已知的Y-PLE編碼DNA序列，此外還鑑定出了第二種PLE同工酶，其與成熟的Y-PLE蛋白在548個胺基酸中有21處不同。該新的PLE同工酶被稱為APLE，艮卩，另外的豬肝酯酶(AlternativePigLiverEsterase)。為針對底物特異性對y-PLE禾BAPLE同工酶進行功能分析，將編碼y-PLE禾卩APLE的DNA序列都插入進針對屍/c/n'a戶M/or"、屮分泌的蛋「l農込而設計的表達盒中，類似於Langeetal.所述。爐,與後者文獻相反，甚至在編碼蛋白中存在C-末端胺基酸序列HAEL時，也實現了兩種蛋白的成功發達。通過使用a-乙酸萘酯，通過通常的酯酶檢驗，進行活性測定，來鑑定酯酶活性。令人吃驚地，雖然胺基酸序列具有超過95%的同一性，在對5-滷-2-烷基戊-4-烯酸酯的水解方面觀察到Y-PLE和APLE之間有明顯的不同。APLE能非常高效地水解外消旋(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-熵酸甲酯，而y-PLE根本不能水解該化合物。此外，還顯示，外消旋(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸l卩酯的水解是通過僅對R-對映異構體的選擇性水解來進行APLE則對(2S,4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯沒有反應活性。可推斷如WO01/09079所述的動物源性的PLE對5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯的己知的對映異構選擇性水解可歸功於商業豬肝提取物中存在的次要的同工酶APLE。ii對於大量生產非動物源性的能對映異構選擇性水解5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯的酯酶製備物，APLE基於ft'cZ^/Eton's的表達水平是不足的。因此，考慮到經濟性生產必須要以工業規模快速可靠地進行生產，我們提出了另外的蛋白生產系統。PLE同工酶結構上非常相關，已知蛋白需要細胞內二硫鍵來保持其結構完整性和活性。很多有吸引力的蛋白表達系統僅在蛋白靶向細胞外環境時允許二硫鍵形成，基本上如上文針對屍/c/n'apwtor^所述。大多數細菌，特別是^c/^hc/n'Gco//，保持細胞內的還原性環境，但是己經描述了可在細胞質中表達的蛋白內形成二硫鍵的Eco//突變體(PrinzeZfl/.(1997))，多種菌株可商業獲得(Eco"Origami，Novagen)。B6ttcheretal.已使用此類Eco//菌株，其顯示只要通過過量表達熱激蛋白，採取額外的手段確保Y-PLE蛋白的正確摺疊，就可成功生產y-PLE;這些熱激蛋白或伴侶蛋白作為摺疊或再摺疊的輔助分子發揮功能，以協助蚩fi獲得其大然構象。B6加here,fl/.(2007)報導稱，沒有大量伴侶蛋I'N'l勺1竹況下，觀察不到活性Y-PLE的表達。令人吃驚地，較之y-PLE而言在548個胺基酸中僅有21處不同的APLE可在￡.co//Origami菌株中作為活性酯酶產生，並凡無須隨之共農達伴侶蛋白；甚至注意到，存在若干過量表達的伴侶分子吋，對APLE活性水平並無影響。更令人吃驚地，改變天然APLE基因(如從豬肝cDNA分離的)的密碼子使用，提供了對Eco/ZOrigami菌株中APLE表達的額外推動。進--)P更令人吃驚地，特別是將密碼子使用改造為近似一組P/c/'fl/Wor/s基因，證明能比針對五.co//進行的"密碼子優化"更為^j效(關f密碼子表，見http:〃www.kazusa.or.ip/)。該結果表明，DNA和源於它的信使RNA序列對於產生活性APLE蛋白摺疊效率有直接影響，而不是優化的密碼子誘導了增加的翻譯效率和蛋白生產水平。通過過量表達五.co//內源二硫鍵異構酶(DsbC)來實現活性APLE1'悔生產的進一歩改進；如Bessette"fl/.(1999)已所示，可構建DsbC蛋匚l的截短版本，這導致該蛋白定位於細胞內。組合此類截短的DsbC蛋白的表達導致多種重組五.co//宿主表達的APLE活性大大增加。APLE的功能性表達並非絕對需要破壞trxB和gor基因兩者導致的E細胞中的完全非還原性環境。在Eco/ZEL21Star(完全還原性環境！)中和在trxB或gor基因中僅一種被失活的co//菌株中，活性APLE表達也是可能的。優化的APLE基因——C8P的基因結構已用於構建多種酯酶異構體，這允許它們在簡單的可上規模的工業五.發酵工藝中以高水平生產。附圖描述圖1/6:A.經APLE或7-PLE表達盒轉化的菌株X-33的平板檢驗，其中使用外消旋(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯作為底物。B.經APLE或7-PLE表達盒轉化的P.戸Wor^:菌株X-33的平板檢驗，其中使用(2S,4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯作為底物。圖2/6:A.農達質粒pMS470—C8P的功能性圖譜；B.表達質粒pMS470—dsbC—C8P的功能性圖譜。圖3/6:使用外消旋(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯作為底物，Eco"BL21Star菌株的無細胞提取物作為APLE的來源，進行的平板檢驗。圖4/6:A.使用外消旋(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯作為底物進行的平板檢驗。1.用0.1mMIPTG誘導的co//Origami[pMS470—C8E]2.用0.5mMIPTG誘導的co//Origami[pMS470—C8E]3.在存在編碼伴侶分子的質粒pTfl2時，用0.1mM1PTG誘導的co//Origami[pMS470—C8E]4.用0.1mMIPTG誘導的五.co//Origami[pMS470—C8P]5.在存在編碼伴侶分子的質粒pTfl2時，用0.1mMIPTG誘導的Eco//Origami[pMS470—C8P;)B.使用外消旋(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯作為底物進行的平板檢驗。左側，將2pl全細胞懸浮液的樣品應用到平板上；右側則是向每種樣品中加入1ial1M磷酸鉀緩衝液(pH8.0)，以突出最高效的水解。按字母順序的各點具有下述含義A:co//Origami未轉化菌株B:五.co//Origami[pMS470—C8P]，在4。C貝亡存1個月C:五.co//Origami[pMS470—C8P]D:五.co//Origami[pMS470—dsbC—C8P]E:技術PLE(商業豬肝酯酶，Boehringer)圖5/6:A.Coomassie染色的SDS-PAGE1=技術PLE2=co//Origami未轉化菌株3=co//Origami[pMS470—C8P]4=co//Origami[pMS470—dsbC一C8P]5=PageRuler預染色蛋白標準物B.Western雜交印跡，其中使用針對PLE的多克隆抗體。1=技術PLE2=&co/.Origami未轉化菌株3=E.co//Origami[pMS470—C8P]4=co//Origami[pMS470—dsbC—C8P]圖6/6。使用甲基琥珀酸二甲酯作為底物，對多種酯酶基因構建體進行的定量平板檢驗(TPLE和APLE都對該底物有活性)。1=五.co//OrigamiB[pMS470一dsbC—y-PLE](天然^PLE)2=五.cWOrigamiB[pMS470_dsbC—APLE](天然APLE)3=五.OrigamiB[pMS470—dsbC—APLE-C8A](APLEC8A基因)4=Eco//OrigamiB[pMS470一dsbC—APLE國C8CpO](APLEC8CpO基因)5=五.co/z'OrigamiB[pMS470_dsbC—APLE-C8P](APLEC8P基因)6=五.co//OrigamiB[pMS470_dsbC—APLE-C8E2](APLEC8E2基因)7=co//OrigamiB[pMS470—dsbC—7-PLE-C8P](7-PLEC8A基因)8=￡.co//OrigamiB[pMS470—dsbC一APLE匿C8E](APLEC8E基因)9=co//OrigamiB[pMS470—dsbC—BosTaurus](io57^"n^下-PLE樣基因)10=陰性對照實施例實施例1分離mRNA和cDNA合成；鑑定另外的豬肝酯酶(APLE)將來自當地屠宰場的0.7g新鮮豬肝冷凍在液氮屮，使用研缽和杵將H均質化。使用FastTrack2.0mRNA分離試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,USA)按照廠商指導，從均質物提取mRNA。該提取方案產生丫13將mRNA。取0.26將mRNA作為模板用於cDNA合成，其屮使川用於RT-PCT的SuperscriptIII第一鏈合成系統(Invitrogen,Carlsbad,USA)按照廠商指導來進行。將獲得的cDNA用作為模板，用於PCR反應，其中使.m特異性引物fw-PLE和rv-PLE，它們被設計來擴增與Matsushimaetal.(GenBankAccessionNoX63323;SEQIDNO1)所述的基因相關的豬肝酯酶/醯胺嗨序列。15fw-cPLE:5'-CAG^4rrCATGGCTATCGGGCAGCCAGCCTCGC-3'(SEQIDNO:3)rv-cPLE:5'-CCGG^7TCAGCCTCCCCTTCACAGCTCAG-3'(SEQIDNO:4)為了克隆的目的引入了EcoRI限制性位點(斜體)。與已知的豬肝酯酶/醯胺酶序列同源的序列被下劃線示出。使用1UPhusionDNA聚合酶(Finnzymes,Espoo,Finland)、500ngcDNA作為模板、20/miol的各正反引物，根據Phusion高保真DNA聚合酶手冊(Finnzymes)來進行擴增。PCR條件為98。C變性30秒，接著是30個循環(98°C10秒，68°C20秒，72°C1分鐘)用於擴增，最後在72。C孵育8分鐘，以確保全長擴增產物。使用QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN,Hilden，Germany)來清潔得到的1.7kbpDNA片段，用EcoRI限制性內切核酸酶消化，並插入質粒載體pHILZ和pHIL-D2(Invitrogen，Carlsbad,USA)屮，將其轉入i乜感受態的Eco//TOP10細胞。對來自隨機選擇的轉化子的質粒DNA的DNA測序揭示了兩條不問的DNA片段，其中一條與Matsushimaetal.所述的基因完全相同，它後來還被B6ttcheretal.鑑定為7-PLE編碼基因；第二條片段具有核苷酸序列SEQIDNO:5，其編碼的蛋白(APLE;SEQIDNO:6)與yPLE在成熟蛋l'l序列在548個胺基酸中的21處有所不同。實施例2APLE的功能性表達以及對APLE活性的分析針對在屍/c/z/fl;^ton'屮的分泌性表達，通過與載體pPICZa(Invitrogen,Carlsbad,USA)屮存在的a-交配型因子分泌信號序列融合，對7-PLE和APLE基因二者都進行改造。首先單獨擴增o;-交配型因子分泌信號序列以及7-PLE和APLE基因PCR1:a-交配型因子分泌信號序列，使用引物fw-a:、k5J_/V^丄，V^//y5'-GAGGCTGGCTGCCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'(SEQIDNO:8)PCR2(7陽PLE)禾卩PCR3(APLE)，使用引物fw-PLE:嚴lAA▲/"mrri/"""l*A/^"tP/"IA/"</~</~<Ar/"IT/~</"~1/"<，'(SEQIDNO:9)rv-PLE:(SEQIDNO:10)用於克隆0的的EcoRI限制性位點以斜體示出，與模板同源的序列則以下劃線示出。用於所有反應的PCR條件50反應混合物，其具有2ng稅板DNA，0.5各引物，0.2mMdNTPs，lxPhusionHF緩衝液和1UPhusionDNA-聚合酶，反應按照Phusion高保真DNA聚合ft手冊(Finnzymes)來進行，85°C變性3分鐘，以30個循環(95。C30秒，57。C30秒，72。C15秒)擴增，最後72。C孵育7分鐘。用於ce-交配型因子分泌信號擴增(PCR1)的模板是質粒pPICZa;川於7-PLE和APLE基因擴增(分別是PCR2和PCR3)的模板是實施例1所述的pHILZ載體中的cDNA。隨後，在a-交配型因子片段和每種豬肝酯酶基因之間進行的融合反應中組合獲得的各片段，如下所述ce-交配型因子片段(PCRO十7-PLE片段(PCR2);Q!-交配型因子片段(PCR1)十APLE片段(PCR3)。反應以45/xl的總體積進行，其具有來自PCR1和(分別來自)PCR2或PCR3的每種3/zl，0.2mMdNTPs，lxPhusionHF緩衝液和1UofPhusionDNA-聚合酶，95。C3分鐘，接著是10個循環——95°C30秒和72°C45秒。隨後，將引物fw-a和rv-PLE加至0.5的終濃度，通過95°C3分鐘變性、30個循環的擴增(95°C30秒，57°C30秒，72°C15秒)以及72°C最後孵育7分鐘來實現全長產物擴增。使用QIAquickPCR純化試劑盒(QIAGEN,Hilden,Germany)來純化得到的片段，用EcoRI消化之後，插入載體pGAPZA(Invitrogen,Carlsbad,USA)中，得到質粒pGAPZAjy-PLE和pGAPZA—APLE。將質粒pGAPZA—7-PLE禾PpGAPZA—APLE的DNA線性化，按照Pichia表達試劑盒手冊(Invitrogen,Carlsbad,USA)，將其引入屍/c/〃'"pwtor/\X-33。在含100mg/1Zeocin的YPD瓊脂上選擇轉化子。將帶有pGAPZA—7-PLE和pGAPZA—APLE的P/c//fl/^to^轉化子劃線到補充有00mg/1Zeocin的YPD瓊脂上，在30°C培養48小時。然匸將細胞材料上樣至UWhatman541加硬無塵7Omm0過濾器(WhatmanInternationalLtd.,Maidstone,GreatBritain)上，並乾燥。然後，將過濾器浸泡進6mga-乙酸萘酯(Sigma，溶於500丙酮屮)、2.5mgFastBlueSaltBN(Sigma，溶於125pi水中)和5ml0.1M磷酸鉀緩衝液(pH7.0)中，孵育到通過a-乙酸萘酯水解產生有色產物觀察到酯酶活性。較之未經轉化的屍fc/^X-33親本菌株，經7-PLE和APLE表達盒轉化的所有A'c/nV菌株都顯示了增加的酯酶活性。開發與通常的酯酶檢驗所述類似的設置，來測定7-PLE和APLE針對5-滷-2-垸基戊-4-烯酸酯的活性。現在將過濾器浸泡於由14mM磷酸鉀緩衝液(pH8.0)、10%(v/v)外消旋(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酷(DSMFineChemicalsAustriaNfgGmbH&CoKG,Linz，Austria)、1%(v/v)Emulgen913去恥齊ll(KaoCorporation,Tokyo,Japan)、2mg/ml〖份紅構成的檢驗混合物中。酶活性通過(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯水解以及相關的酸性基閉釋放導致的由紅(鹼性和中性pH)至黃(酸性pH)的顏色變化來顯示。18如圖1A所示，僅APLE產生了陽性信號，這表明該酶能水解外消旋(4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯；7-PLE不能將該底物水解至可檢測到的程度。更重要地，可推斷出，APLE選擇性水解(2R,4E)-5-氯-2-異丙基戊-4-烯酸甲酯僅向過濾器應用底物的S-對映異構體的平板檢驗中，沒有檢測到S-形式的水解(圖1B)。實施例3對合成的APLE基因的設計基於源於APLE編碼基因(SEQIDNO:5)的成熟APLE的胺基酸序列(SEQIDNO:6)，設計並化學合成具有改變的密碼子使用並且缺乏天然分泌信號序列的合成基因(供應商DNA2.0,MenloPark,USA)。合成的APLE基因變體C8P(SEQIDNO11)、C8A(SEQIDNO13)、C8CpO(SEQIDNO14)和C8E(SEQIDNO15)都編碼具有額外N-木端;甲硫氨酸(作為必需的翻譯起始密碼子)的APLE蛋白(SEQIDNO:12)。為在￡.co//屮進行表達研究，將合成的APLE基因插入質粒pMS47(Balzeretal.(1992)[8])屮。使用PCR擴增(條件見實施例l)，分別向5'末端添加AWel限制性位點(包括ATG起始密碼子)和向3'末端添加///;^/in限制性位點，其中使用下述引物對基因APLEC8P而，設計下述PCR弓I物Fw-C8P(SEQIDNO:16):Rv-C8P(SEQIDNO:17)對基因APLEC8A而言，設計下述PCRFw-C8A(SEQIDNO:18):Rv-C8A(SEQIDNO:19):對基因APLEC8CpO而言，設計下述PCR引物Fw-C8CpO(SEQIDNO:20):ATTTATAC4rGGGCCAACCTGCTTCTCCACCTGTTGRv-C8CpO(SEQIDNO:21):對基因APLEC8E而言，設計下述PCR引物Fw-C8E(SEQIDNO:22):ATTTATAC4rGGGACAACCAGCTTCGCCGCCTGTCGRv-C8E(SEQIDNO:23):用於克隆g的的Ndel和HindIII限制性位點以斜體示出，勺同源的序列則以下劃線示出。將得到的片段插入經M/eI////"din消化的pMS470屮，pMS470—C8P、pMS470—C8A、pMS470—C8CpO禾IJpMS470一C8E。質粒pMS470一C8P的圖譜描繪於圖2A中。APLE禾nyPLE的天然序列作為來自豬肝的cDNA獲得，如實施例1所述。擴增這些大然基因，並使用下述引物將其轉入五.《//表達載體Fw-PLEnat(SEQIDNO:24)Rv-PLEnat(SEQIDNO:25)》/1質來、、/:與模板向源用於克隆目的的Ndel和HmdIII限制性位點以斜體示出，的序列則以下劃線示出。因為這些天然基因具有內在的///mim限制性位點，必須要進行兩歩連接首先，將具有和州"dIII的較長片段插入pMS470屮，隨後，通過添加3，歷"dm片段來完成每個基因，這分別產生了最pMS470—7-PLE和pMS470—APLE。20實施例4將APLE表達載體轉化進合適的五.co/z'宿主APLE在五.co/Z為分析Eco/Z中的酯酶表達，使用下述流程來培養和製備用於活性分析的細胞。為進行平板檢驗，將攜帶多種表達質粒的五.co/z'菌株劃線到含有100ing/ml1氨節青黴素和0.1mMIPTG的LB-瓊脂平板上，37°C孵育16小時。為進行液體培養檢驗，將攜帶有各表達質粒的E"/Z菌株接種進5ml具有100lag/ml氨節青黴素的Luria-Bertani(LB)培養基，於28°C在持續振蕩下孵育16小時。然後用該培養物接種1L帶蓋搖瓶中250ml具有100jig/ml氨苄青黴素的LB培養基。當培養物達到600nm下0.6-0.8的光密度時，加入IPTG至終濃度為0.1mM，以誘導基因表達。28。C下16至20小時孵育後收穫細胞。平板檢驗實施例2中已經用多種酯酶底物描述了對瓊脂平板上牛長的細胞的檢驗。在液體Eco//培養物上的活性分析在具有5mM乙酸對硝基苯酷作為底物的MOPS緩衝液(lOOmM)屮，在細胞懸浮液上定覺測定I'指PS^性。釋放的對硝基苯酚的量在405nm處用分光光法度測定。l個單位的酯酶活性被定義為在測試條件(pH7.5，37°C)—F每分鐘釋放1微摩爾對硝基苯酚的酶的量。將針對不同APLE編碼基因的表達盒轉化進多種co/Z菌株常規拔因表達菌株(例如&"//8!^21菌株)和經特別工程改造的、允許需要分子內二硫鍵用於正確摺疊和酶促活性的蛋白的功能性細胞內表達的Eco//菌株(Prinzetal.，Bessetteetal.)兩者都用作為表達宿主菌株。就此R的II'IJ言，使用商業可獲得的Origami家族的五.co//菌株(Novagen)，特別是Origami1、Origami2禾卩OrigamiB。在￡.co//BL21Star中觀察到了APLE(SEQIDNO:12)的功能性表達(圖3)，但是活性遠低於使用Eco//Origami菌株所獲得的活性。中的功能性表達用各表達載體轉化Eco//Origami菌株，隨後通過在底物特異性檢驗平板上塗板或通過搖瓶培養，針對酯酶表達對選擇的轉化子加以評價。若干APLE基因變體的表達水平被概括於圖4A和表1中；基因C8E較之天然APLE基因僅具有較少改變。圖4A顯示了C8E和C8P原樣的以及在存在伴侶分子pTfl6時的表達差別；通過表1所示的搖瓶結果驗證了平板結果。表ltableseeoriginaldocumentpage22進行了一系列實驗，來評估若干熱激伴侶分子的共表達是否作川丁-APLE表達。結果(概括於表2屮)顯示，熱激蛋rV伴侶分子農達沒化u(著影響APLE生產、表2tableseeoriginaldocumentpage22實施例5通過添加DsbC來增加APLE表達沒有觀察到共表達的熱激蛋白的作用，我們研究了是否有其它輔助因子(例如，五.co//內源二硫異構酶基因dsbC(Bessetteetal.))將影響APLE在Eco//中的表達。用五.ToplOF'染色體DNA作為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用PhusionHigh-FidelityDNA聚合酶(Finnzymes,Espoo,Finland)，使用PhusionHF-緩衝液，來擴增五.co//dsbC基因的截短版本(天然DsbC蛋白分泌進周質，截短的DsbC蛋白保留在細胞內區室中)，其中使用下述條件95。C變性5分鐘，擴增進行30個循環(98°C10秒、66。C30秒、72。C30秒)，最後在72°C孵育8分鐘。設計使用的引物，使其在截短的DsbC編碼序列前包括Shine-Dalgamo序列Fw-dsbC(SEQIDNO:26):Rv陽dsbC(SEQIDNO:27):用SawHI消化PCR產物，將其插入APLE表達質粒pMS470—C8P的BamHI限制性位點。DsbC禾卩C8P之間隔開49bp。通過測序驗證了構讓體。構建體被命名為pMS470一dsbC—C8P，其大大增加了APLE的農達(平板檢驗見圖4，還有表3)。質粒pMS470一dsbC—C8P的功能性閣lff小於圖2B中。表3￡>0//宿主茼株質粒酯酶活性(u/ml)OrigamiB—0.8Origami1-0.8Origami1pMS470—C8P9.0Origami1pMS470—dsbC—C8P47OrigamiBpMS470一C8P10.5OrigamiBpMS470—dsbC_C8P59為驗證觀察到的酯酶活性確實是由於APLE編碼基因的功能表達，進行了Western雜交印跡實驗。發酵之後，在5000g對Eco//細胞離心10分23鍾。將得到的沉澱團重新懸浮於4倍體積的20mM磷酸鉀緩衝液(pH8.0)，將2-2.5^的細胞懸浮液與17.5-18piSDS上樣緩衝液合併，在95。C加熱10-15分鐘，並上樣到12.5%SDS-PAGE凝膠上。使用針對豬肝酯嗨的兔多克隆抗體(abeam,Cambridge,UK)作為一抗，綴合有鹼性磷酸酶的山羊抗兔多克隆抗體(LeincoTechnologiesInc.,St.Louis，USA)作為二抗，通過Western雜交印跡分析來檢測APLE。Western雜交印跡檢測通過Lumi-PhosTMWB化學發光底物(AP)(Pierce,Rockford，USA)和G:BoxHR(Syngene,Cambridge,UK)中的化學發光檢測來進行，或者通過BCIP/NBT檢測溶液(CALBIOCHEM;LaJolla;USA)和對硝酸纖維素膜(Hybond-ECLTM，AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)的直接染色來進行。圖5顯7j〈-了經Coomassie染色的SDS-PAGE凝膠(圖5A)禾UWestern雜交印跡實驗的結果(圖5B)，其表明蛋白表達水平對應於活性的左異。圖5A還顯示截短的DsbC非常好地表達。實施例6新的co//宿主菌株的製備和對這些宿主的APLE卞產性質的Ew/wr/cA/aco//K12菌株RV308AtrxB;Agor從Eco//'齒株RV308(ATCC31608)開始構建。類似Prinzetal.所示，參與細胞內二硫化物還原的兩個基因被失活。根據Datsenkoetal.(2000)[9]描述的流程，使用定點重組技術，通過缺失來失活分別編碼硫氧還蛋白還原酶和穀胱廿)汰氧化還原酶的這兩個基因trxB和gor。這種修飾的最初結果導致除了在還原劑存在的情況下之外Eco//蘭株不再能有氧生長；但是，容易選擇出能恢復不存在還原劑時的有氧生長的阻遏子突變。這些性質和表型改變以前已在使用不同的手段使基因tncB和gor失活的EcW菌株中描述過。詳細描述通過PCR獲得缺失盒，其中使用質粒pKD3作為投板，使用下述引物24200fw-trxB(SEQIDNO:28):5，-GTAAATTCCCTACAATCCTGCCCA3，禾口rv-trxB(SEQIDNO:29):5，-CCCATAGTCGCATGGTGTCGCCT3'用於該反應，產生了針對基因trxB的缺失盒。fw-gor(SEQIDNO30):5'-CCTATTACGTCTCGCGCTACAATCGCC-3，和rv-gor(SEQIDNO):5'-CTGATAGCGGAAACGTAATTAAGGGAG-3'用於該反應，產生了針對基因gor的缺失盒。將trxB和gor缺失盒分別轉化進已經含有質粒pKD46的￡.co/fRV308菌株，基於其獲得的針對抗生素氯黴素的抗性選擇成功的轉化子。通過PCR對照或Southern雜交印跡來驗證各缺失盒對trxB基因或gor基因的it:確交換。隨後通過用質粒pCP20(編碼FLP重組酶[參考文獻6])轉化來除去氯黴素抗性基因。使用PCR禾PSouthern雜交印跡，針對trxB的T淨缺失，再次檢査得到的E.co"菌株RV308AtrxB。類似地，驗證了E.co//菌株RV308屮gor基因的乾淨缺失。從菌株菌株RV308AtrxB開始，進行完全相同的反應組，來開展對基因gor的乾淨缺失。因為該第二種修飾的最初結果(如Prinzetal.所述)是trxB和gor都缺失的該Eco//RV308菌株除了在還原劑存在的怙況下之外不再能有氧生長，在存在還原劑DTT時培養假設也具有gor缺失的￡.co//菌株。最後，因為有氧生長不再依賴DTT的存在，可選出自發的RV308AtrxB;Agor突變體。用選擇的APLE表達質粒轉化Eco//菌株RV308AtrxB;Agor和僅具有單種還原酶缺失的中間產物菌株，並針對APLE生產在搖瓶中(表4)。tableseeoriginaldocumentpage26實施例7化學合成編碼豬肝酯酶蛋白的多種天然異構體的其它合成基因。為氺產新的酯酶蛋ri，合成sw7-ple樣基因。其它新的基因編碼己知的PLE酯酶7-PLE和PICE;此外還設l「了APLE和7-PLE異構體之間的雜交體。後一組的共冋特徵是所有都甚apleC8P模板。從apleC8P開始，僅改變了獲得異構體或雜交休蛋I'I所需的密碼子。基因及其編碼蛋白由下述代表天然異構體新的可能的^wto腦"rPLE樣基因(SEQIDNO:32)C8P編碼的天然酯酶C8P-7-PLE(SEQIDNO:34)禾卩C8P-PICE(SEQIDNO:36)C8P編碼的雜交體酯酶C8P-H1(SEQIDNO:38)、C8P-H2(seqIDNO:40)、C8P-H3(SEQIDNO:42)禾卩C8P-H4(SEQIDNO:44)。所有序列都插入圖2B的五.co/Z表達載體(pMS470—dsbC—APLE)，有效替換了C8P基因。使用甲基琥珀酸二甲酯作為底物的定量平板檢驗(見實施例2)的結果證實每個設計的基因都編碼活性酯酶(圖6)。但是該平板檢驗並不能得出定量結論，因為酶變體針對甲基琥珀酸二甲酯的比活性未知。參考文獻LangeS.,MusidlowskaA.,Schmidt-DannertC.，SchmittJ.,BomscheuerU.T.(2001)C7zem5wC%em2,576-582B6ttcher，D.，Briisehaber,E.，Doderer，K.andBomscheuer,U.T.(2007)A^'croZn'o/.73,1282-1289Prinz,W.A.，Aslund,F.,Holmgren,A.andBeckwith,丄(1997)J.腸/.C/zem.272:15661—15667Beckwith,J.,Aslund,F.，Bessette,P.H.，Georgiou,G.,Ritz，D.andLim,J.E.OS戸fe"/6,872,563Bessette,P.H.,Aslund,F.,Beckwith,J.AndGeorgiou,G.(1999)RV/LS96(24),13703-13708Terpe，K.(2006)柳/.M/c油'o/.腸tec/mo/.72,211-222.MatsushimaM,InoueH,IchinoseM,TsukadaS,MikiK,K訓kawaK，TakahashiT，TakahashiK.(1991).FEftSLe".293，37-41BalzerD，ZiegdinG,PansegrauW,KmftV，LankaE.(1992).A^c/e/c20，1851-1858Datsenko,K.A.&Wanner,B丄.(2000)PA^S97，6640-66452權利要求1.製備具有酯酶活性的蛋白的方法，所述方法包括在E.coli菌株中表達編碼此類蛋白的基因，其特徵在於編碼具有酯酶活性的蛋白的基因與SEQIDNO11、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42或SEQIDNO44的多核苷酸具有至少70％同一性，優選至少80％同一性，優選至少85％同一性，優選至少90％同一性，優選至少95％同一性，優選至少98％同一性，最優選至少99％同一性，並且所述基因編碼分別與SEQIDNO12、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43或SEQIDNO45具有至少80％同一性，優選至少85％同一性，優選至少90％同一性，優選至少95％同一性，優選至少98％同一性，更優選至少99％同一性的蛋白，並且其中，所述表達在不從質粒共表達GroEL和/或GroES的情況下進行。2.根據權利要求1的方法，其中所述基因編碼與SEQIDNO:12具冇至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選辛:少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋|'1。3.適於製備具有酯酶活性的蛋白的重組Eco/Z菌株，其特徵在於，該生物含有編碼具有酯酶活性的蛋A並且與SEQIDNO:11、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:44的多核苷酸具有至少70%同-性，優選至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%問一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，最優選至少99%同一性的芘因，並且，所述基因編碼分別與SEQIDNO:12、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43或SEQIDNO:45具有至少80%同一性，優選至少85%冋--性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同--性，更優選至少99%同一性的蛋白，並且其中，所述表達在不從質粒共&達GroEL禾卩/或GroES的情況下進行。4.根據權利要求3的適於製備具有酯酶活性的蛋白的重組五.CO"菌株，其特徵在於，所述菌株不能表達穀胱甘肽還原酶和/或硫氧還蛋白還原酶。5.根據權利要求3的適於製備具有酯酶活性的蛋白的重組E//菌株，其特徵在於，所述菌株不能表達穀胱甘肽還原酶和硫氧還蛋白還原酶兩者。6.根據權利要求3的適於製備具有酯酶活性的蛋白的重組co/z'菌株，其特徵在於，穀胱甘肽還原酶和/或硫氧還蛋白還原酶的表達通過突變消除。7.根據權利要求3-6中任意一項的重組Eco//菌株，獲得自五.co//Origami1、Origami2或OrigamiB菌株。8.經分離的多核苷酸，其編碼具有酯酶活性的功能性蛋D，所述多核苷酸具有與SEQIDNO:11、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:44的多核苷酸具有至少70%同一性，優選至少80%同一卩k，優選節少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選卞:少98%同---性，最優選至少99%同一性的核苷酸序列，並且編碼分別與SEQIDNO:12、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43或SEQIDNO:45具有至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。9.適於在五.cW中複製和表達的載體，所述載體含有編碼具有酯,活性的蛋A的多核苷酸，所述多核苷酸具有與SEQIDNO:11、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:44的多核苷酸具有至少70%同一性，優選至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%問一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，最優選至少99%同一性的核苷酸序列，並且，編碼分別與SEQIDNO:12、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43或SEQIDNO:45具有至少80%同一性，優選至少85%同一性，優選至少90%同一性，優選至少95%同一性，優選至少98%同一性，更優選至少99%同一性的蛋白。10.通過權利要求1的方法獲得的具有酯酶活性的蛋白用於水解酯類的用途。全文摘要本發明涉及重組E.coli菌株，其特徵在於，該生物含有編碼具有酯酶活性的蛋白的基因。此類E.coli適於製備具有酯酶活性的蛋白，其中，表達在不從質粒共表達GroEL和/或GroES的情況下發生。此外，該生物在富氧條件下生長的能力已通過突變恢復。具有酯酶活性的蛋白的基因的表達不伴隨編碼熱激伴侶蛋白的其它基因的表達。文檔編號C12N15/70GK101688208SQ200880023253公開日2010年3月31日申請日期2008年7月4日優先權日2007年7月4日發明者哈拉德·皮希勒,奧利弗·梅,米裡拉·伊萬科克,赫爾馬特·施瓦布,馬丁·基爾特茲曼,魯道夫·吉斯波特斯·瑪麗·路易坦申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司