梭菌神經毒素的定量檢測方法

2023-10-11 08:01:59 2

專利名稱：梭菌神經毒素的定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及參照參考樣品中梭菌毒素的已知濃度，用於體外確定樣品中梭菌神經毒素的未知濃度的方法。該方法可包括電刺激與所述樣品接觸過的肌肉組織，比較各自對所述肌肉組織誘導的效果，從而確定所述未知濃度。該方法也可用於評價樣品中梭菌神經毒素相對於參考標準的相對效價。
背景技術：
近年來，肉毒神經毒素已經成為治療局部肌張力異常和痙攣適應症的標準製劑。藥物製劑可市售獲得，例如易普森公司(Ipsen Ltd.) (Dysport^)或愛力根公司(AllerganInc.) (Botox^。不含其它任何梭菌蛋白的高純度神經毒素可從例如梅爾茨製藥(MerzPharmaceuticals) (Xeomin )獲得。另一種製劑由 Solstice Neurosciences 公司(Myobloc )註冊。還有另一種製劑由Mentor公司(PurTox1 )註冊。這些製劑在所使用的肉毒毒素類型或生物效力和效價各方面均不同。對患者的治療通常是將神經毒素注射到受侵襲的肌肉組織，使製劑位於神經肌肉終板附近，即靠近細胞受體，介導其吸收進入到控制所述受侵襲肌肉的神經細胞。已觀察了神經毒素擴散的各種不同程度。這種擴散可以認為是與注射量和注射的特定神經毒素製劑有關。由於擴散，可在附近的肌肉組織觀察到因乙醯膽鹼釋放抑制引起的系統性副作用。通過將注射劑量減少到治療相關的水平，可很大程度上避免未治療肌肉的意外麻痺事件。超劑量也會給患者的免疫系統帶來問題，因為注射的神經毒素會導致形成中和抗體。如果發生這種情況，毒素會失活，不能緩解不隨意肌的活動力。在已確定效價的製劑如可售產品或生產過程中生產的批次中，劑量當量或變化的差異會通過可能的副作用和免疫力的進展增加患者的風險。因此，儘可能精確地確定包含在所述市售產品或批次產品(即沒有明顯差異)中梭菌神經毒素的濃度是至關重要的，以便將毒素濃度調整至對患者有益的可靠有效劑量。這可以激勵生產者針對不同治療目的提供使生物活性即效價得到最佳開發的製劑。EP I 597 584 BI提供了用於體外確定樣品如含有肉毒神經毒素的樣品中突觸前神經肌肉阻滯物質的量的方法。該方法包括在含有突觸前神經肌肉阻滯物質的樣品存在下，電刺激肌肉組織，優選小鼠的肋骨肌肉，比較該樣品誘導的效果和參考物質誘導的效果，從而確定樣品中突觸前神經肌肉阻滯物質的量。GB 2 416 849 A和GB 2 398 636 A提供了用於體外確定樣品如含有肉毒神經毒 素的樣品中突觸前神經肌肉阻滯物質的量的方法。該方法包括在含有突觸前神經肌肉阻滯物質的樣品存在下，電刺激平滑肌肉組織，優選小鼠或大鼠的肋骨肌肉，比較該樣品誘導的效果和參考物質誘導的效果，從而確定樣品中突觸前神經肌肉阻滯物質的量。US 2003/0032891 Al提供了體內測量物質如梭菌毒素效價的方法，其中將所述物質施用於哺乳動物，使哺乳動物受到刺激並且監測所述哺乳動物對所述刺激產生的耳廓反射響應。EP 2 015 065 Al提供了定量神經毒素如梭菌神經毒素效力的方法，其中將所述毒素施用於非人類哺乳動物的後腿，對所述非人類哺乳動物施加電刺激，測量所述後腿的收縮並與其它後腿的收縮進行對比。Pearce 等，Toxicon，Vol. 35，No. 9，pp. 1373-1412，1997，公開了大鼠 / 小鼠膈神經
偏側膈結合肉毒神經毒素的適宜性。Wohlfahrt 等，Naunyn-Schmiedeberg，s Arch Pharmacol 355, 335-340 (1997)米用小鼠橫膈膜通過劑量依賴響應曲線比較了兩種市售肉毒毒素A製劑的效力。

Chang 等，Naunyn-Schmiedeberg，s Arch. Pharmacol. 282,129-142 (1974)比較了A型肉毒毒素和P-環蛇毒素對分離的神經-肌肉標本如小鼠和大鼠橫膈膜的突觸前行為。Sheridan 等，J. Appl. Toxicol. 19，S29-S33 (1999)描述了基於傳統的毒素濃度生物檢測法確定肉毒菌拮抗劑的效力。James等，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285,G291-G297 (2003)描述了肉毒毒素對幽門和竇平滑肌的抑制效果。GGschel等，Exp. Neurol. , vol. 147,1,1997描述了與含有已知量毒素的樣品的效價相比，用於確定樣品中肉毒毒素相對效價的濃度響應曲線。進行了不同肉毒毒素製劑對小鼠偏側膈的試驗。然而，上述引用的現有技術的定量方法缺少管理機構認證要求的精確性。因此，那些公開的方法不能用於管理目的，而是需要進行不合時宜的小鼠殺死試驗。發明目的本發明的一個目的是改進現有技術的方法並且開發一種分別用於確定效價以及樣品中影響所述效價的梭菌神經毒素濃度的可靠且精確的方法，其可用於管理目的。這種改進的方法也將滿足安全和有效給藥的巨大需求。發明概述在一個方面中，本發明涉及測定梭菌神經毒素對肌肉組織誘導的效果的方法，其包括(a)使肌肉組織與含有所述梭菌神經毒素的樣品接觸；(c)測定所述梭菌神經毒素對所述肌肉組織誘導的效果；其中步驟(C)在不含所述樣品的情況下進行。在一個實施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個實施方案中，該方法的步驟(a)之後包括步驟(b)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織。在另一個實施方案中，在不含所述樣品的情況下進行步驟(b)。在另一個方面中，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度的方法，該方法包括(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第二效果；(d)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)不同濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集；
(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(h)測定對所述肌肉組織誘導的第一效果；
(k)確認出所述第一和第二效果相同的濃度；(I) (k)中所述濃度等於所述未知濃度；其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。在一個實施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個實施方案中，該方法的步驟(a)之後包括步驟(b)，且步驟(f)之後包括步驟(g)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。在另一個方面中，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素相對效價的方法，該方法包括(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第二效果；(d)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(h)測定對所述肌肉組織誘導的第一效果；(i)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對應濃度下測得的第一效果，從而記錄第一數據集；其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。在一個實施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個實施方案中，該方法的步驟(a)之後包括步驟(b)，且步驟(f)之後包括步驟(g)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。在一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(m)和(n)(m)從最佳擬合於第一和第二數據集的濃度範圍中選擇所述不同濃度；(n)根據統計學檢驗確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(a )_( S ):(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數據集的數值範圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數據集的數值範圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在一個實施方案中，所述統計學檢驗為F-檢驗，或X2-檢驗，或t_檢驗。在一個實施方案中，每個子步驟(ci)-(S)的誤拒絕概率為彡5 (以％表示)。在一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(e ):( e )根據所述線性化的擬合曲線和所述平行化的擬合曲線彼此間的相對位移，計
算第一樣品相對於第二樣品的相對效價。在本發明的一個實施方案中，根據第二和第三個方面中的方法，步驟(b)或(g)在不含第二或第一樣品的情況下進行，或步驟(b)和(g)在不含第二和第一樣品的情況下進行。在本發明的一個實施方案中，根據本發明的三個方面中的任一種方法，肌肉組織暴露於所述梭菌神經毒素的時間，也就是，使肌肉組織與樣品(分別為第一或第二含梭菌神經毒素的樣品)接觸的時間，根據步驟(a)在不含所述樣品(分別為第一或第二樣品)之前，根據步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)分別測定所述效果，其為l-60min。在一個實施方案中，根據本發明的三個方面中的任一種方法，在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)所述測定之前，所述肌肉組織暴露於所述梭菌毒素的時間為5_30mino
在又一個實施方案中，根據本發明的三個方面中的任一種方法，所述肌肉組織暴露於所述神經毒素的時間約為15min。在一個實施方案中，根據本發明的三個方面中的任一種方法，在步驟(a)和/或步驟(f)之前，所述肌肉組織已經過電刺激。在另一個實施方案中，在步驟(a)和/或步驟(f)過程中，所述肌肉組織已經過電刺激。在另一個實施方案中，在步驟(a)之前和步驟(a)過程中，和/或步驟(f)之前和步驟(f)過程中，所述肌肉組織已經過電刺激。在一個實施方案中，所述記錄測得的第二效果是通過繪製所述第二效果對應於濃度的曲線進行的，且記錄所述第二數據集是通過記錄校準曲線進行的。在一個實施方案中，所述第二效果是在至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml所表示的至少一個濃度下確定的。在另一個實施方案中，所述濃度為10-1000，或10-70，或15-60，或20-45。在另一個實施方案中，所述濃度為20-400，或為100-800。在一個實施方案中,所述小鼠LD5tl單位為Xeomin 單位。在一個實施方案中，所述效果(分別為所述第一和第二效果)選自下組所述肌肉組織的麻痺時間、所述肌肉組織收縮率的變化、所述肌肉組織收縮距離的變化、所述肌肉組織收縮力的變化、所述肌肉組織在終板電位或微型終板電位中的變化。在一個實施方案中，所述效果(分別為所述第一和第二效果)為麻痺時間。在一個實施方案中，所述肌肉組織選自肋間肌、後肢肌肉和後肢趾長伸肌、後爪蹠肌、膈神經偏側膈、耳長提肌、娃神經肌接頭、雛雞頸二腹肌(biventer cervic muscle)、肋骨肌肉、腦組織或海鰩(sea ray)的電器官。 在一個實施方案中，所述膈神經偏側膈來自大鼠或小鼠。在一個實施方案中，所述梭菌神經毒素為肉毒毒素。在另一個實施方案中，所述肉毒神經毒素為選自下組的血清型A、B、C、D、E、F和G ;或為選自血清型A、B、C、D、E、F和G的經化學或遺傳修飾的肉毒神經毒素衍生物。在一個實施方案中，所述神經毒素不含複合蛋白。在另一個實施方案中，所述神經毒素為血清型A或B。在一個實施方案中，所述電刺激是在含有消泡劑的緩衝液中進行的。在一個實施方案中，所述消泡劑選自含矽化合物。
在一個實施方案中，所述緩衝液中已清除氧。在另一個方面中，本發明涉及電腦程式產品，其包括包含用於實施本發明方法的軟體工具的電腦程式。在另一個方面中，本發明涉及試劑盒，其包括(A)-用於刺激已暴露於梭菌神經毒素的肌肉組織，以選擇所述神經毒素對肌肉組織誘導的效果的裝置；-用於測定並記錄所述效果的裝置；以及 (B)電腦程式產品，其包括包含用於實施本發明方法的軟體工具的電腦程式。在另一個方面中，本發明涉及肌肉組織在本發明任一種方法中的應用。在另一個方面中，本發明涉及根據本發明的三個方面中的任一種方法在控制含有梭菌神經毒素的樣品效價中的應用。在一個實施方案中，所述樣品為貯存的樣品。在一個實施方案中，所述樣品為凍幹樣品或為重組樣品。在一個方面中，本發明涉及，例如在梭菌神經毒素生產過程的質量控制中，根據本發明的第一個方面，在參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度中的應用；或在參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價中的應用。發明詳述已發現，通過應用本文公開的方法，現有技術的量化方法中觀察到的變化可以顯著減少到不明顯的程度。根據第一個方面，本發明涉及測定梭菌神經毒素對肌肉組織誘導的效果的方法，包括(a)使肌肉組織與含有所述梭菌神經毒素的樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的效果；其中步驟(C)在不含所述樣品的情況下進行。術語「使肌肉組織與所述樣品接觸(根據本發明進一步的方面，其可以是方法中的第一或第二樣品)」是指在所述接觸過程中，所述樣品中至少部分神經毒素被所述肌肉組織接收，即樣品中所含的至少部分神經毒素被所述肌肉組織中含有的適當受體結合。術語「不含樣品的情況下」是指步驟(C)中測定效果是在含10重量％或更低，例如不含任何樣品，或換句話說不含任何樣品的神經毒素的介質(通常為適當的緩衝液)中進行。在一個實施方案中，所述肌肉組織不連續地但僅暫時地暴露於含梭菌神經毒素的樣品(根據本發明進一步的方面，其可以是該方法中的第一或第二樣品)。這意味著，在將所述肌肉組織暴露於神經毒素預定的時間後，即在步驟(a)中進行接觸以使所述肌肉組織對這種暴露作出響應，相應效果的測定(或根據本發明進一步的方面，分別為方法中的第一或第二效果)，其中例如所述肌肉組織接受電刺激，採用下述方法在不含所述樣品的情況下進行(根據本發明進一步的方面，其可為該方法中的所述第一或第二樣品)。
在一個實施方案中，在進行所述測定之前，所述肌肉組織，例如被從含有所述樣品的器官浴槽(organ bath)中移出，並轉移到如下所述的包括不含神經毒素的成分的器官浴槽中。隨後，進行電刺激和效果(當樣品為第一或第二樣品時，可以為第一或第二效果)幅度的測定。這意味著，用含有所接收的神經毒素的肌肉組織進行電刺激以及對所述刺激的響應。在另一個實施方案中，將含有神經毒素的成分，即樣品(可為第一或第二樣品)，替換為不含神經毒素的成分。替換後，進行效果(當樣品為第一或第二樣品時，可以為第一或第二效果)幅度的測定。術語「梭菌神經毒素(或梭菌毒素)」包括梭菌毒素複合物以及高純度的神經毒素，即神經毒素製劑，不含任何其它梭菌蛋白。在一個實施方案中，所述梭菌神經毒素是肉毒神經毒素。在另一個實施方案中，所述肉毒神經毒素為選自下組的血清型A、B、C、D、E、F和G0術語「肉毒毒素複合物」包含與至少另一種無毒蛋白相關的肉毒毒素。顯然，文中使用的術語肉毒毒素複合物包括450kDa和900kDa的肉毒毒素複合物，其例如可從肉毒梭菌培養物中獲得。這類基於A型肉毒毒素複合物的製劑可市售獲得，如易普森公司(Dysporf)或愛力根公司(Botox )。另一種基於B型肉毒複合物的製劑可獲自SolsticeNeurosciences公司(Myobloc.U:丨純度的不含任何其它梭菌蛋白的A型神經毒素可獲自Merz Pharmaceuticals (Xeomin、。它是改善幾種形式局限性肌張力障礙的首選藥物。 在另一個實施方案中，所述肉毒神經毒素為選自血清型A、B、C、D、E、F和G的經化學或遺傳修飾的衍生物。所述經化學修飾的神經毒素衍生物可以為經丙酮酸化、磷酸化、硫酸化(sulfatation)、脂化和/或糖基化修飾的衍生物。所述經遺傳修飾的神經毒素衍生物可以為所述血清型蛋白中含有的一個或多個胺基酸經缺失、添加或替換得到的衍生物。經修飾後的毒素優選具有生物活性。生物活性毒素是能夠被攝入到細胞的毒素，從而蛋白裂解SNARE複合物中含有的一個或多個多肽。在一個實施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個實施方案中，該方法進一步包括(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織。在一個實施方案中，步驟(b)在不含所述樣品的情況下進行。令人驚訝的是，已發現所述肌肉組織於神經毒素中暴露過之後，在不含所述樣品的情況下進行所述電刺激和效果測定，各自劑量響應曲線發生位移，從而本發明方法的靈敏度顯著增加。樣品中以小鼠LD5tl單位/ml表示的低濃度的所述梭菌神經毒素的靈敏度顯著增加。例如，如果分別測定響應、麻痺時間作為效果，與樣品存在的情況下測定所述效果的方法相比，所述麻痺時間增加。這使該方法的靈敏度得到有益的增加，特別適用於低濃度神經毒素的區域。如果效價是在較低的濃度下確定的，一般神經毒素會顯示出最大的差異，然而在相當高的濃度下，效價彼此趨於一致。
靈敏度的增加可使各自的劑量-響應曲線的分析更精確、更可靠。反過來可使用相對少量的實驗動物如小鼠，否則，為實施本發明的任一種方法而不得不將其處死。因此，本發明的實施方案不僅在技術方面，而且在倫理方面都具有進步。本文中使用的術語「靈敏度」是生理學常用的含義，即它定義了肌肉組織響應外部刺激的能力。這裡，通過使肌肉組織與梭菌神經毒素接觸來進行外部刺激。在本發明的範圍內，可選擇一定的濃度範圍，如相對較低濃度梭菌神經毒素的濃度範圍，其中所述靈敏度是增加的，即可以確定響應，否則不能確定則只能在非容忍偏差(non-tolerabIe deviation)內分別測定。根據第二個方面，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度的方法，該方法包括(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第二效果；(d)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(h)測定對所述肌肉組織誘導的第一效果；(k)確認出所述第一和第二效果相同的濃度；(I) (k)中所述濃度等於所述未知濃度；其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。在一個實施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個實施方案中，該方法在步驟(a)之後包括步驟(b)，或在步驟(a)之後包括步驟(b)且在步驟(f)之後包括步驟(g)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。在另一個實施方案中，步驟(b)或(g)在不含第二或第一樣品的情況下進行，或步驟(b)和(g)在不含第二和第一樣品的情況下進行。因此，在一個實施方案中，第二和/或第一效果的確定在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。在另一個實施方案中，所述肌肉組織的電刺激在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。這意味著，在步驟(a)之後和在步驟(b)之前和/或在步驟⑴之後和在步驟(g)之前，如上文所述，將肌肉組織從第二和/或第一樣品中移出。術語「確認出所述第一和第二效果相同的濃度」(步驟(k)和(I))表示所述第一和第二效果在定性和定量上是相同的，即誘導效果為如麻痺時間，且所述效果具有相同的測量值。在一個實施方案中，為了獲得能進行可靠地比較的結果，肌肉組織分別暴露於第二樣品中和第一樣品所含的神經毒素中的時間應該具有可比性。在一個實施方案中，所述暴露時間是相同的。
在一個實施方案中，步驟(e)中所述記錄測得的第二效果是通過測定所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經毒素的第二效果，並繪製測得的所述第二效果對應於濃度的曲線，從而記錄校準曲線來進行的。如上所述，如果所述第二樣品對所述肌肉組織誘導的效果是基於以小鼠LD5tl單位/ml表示的不同濃度確定的，那麼可獲得校準曲線。例如，在選擇的濃度範圍內可確定IOLD5tl單位/ml或5LD5(I單位/ml的步驟中所述誘導的效果。因此，通過步驟(e)中記錄的第二數據集繪製校準曲線，通過該校準曲線，根據步驟(k)及後面的步驟(I)確定所述第一樣品中所述梭菌神經毒素的未知濃度。在一個實施方案中，繪製生成的校準曲線，通過圖形分析完成步驟(k)-(l)的所述確認出和等於的步驟。 所述第一樣品的未知濃度可通過確認出校準曲線上與所述第一和第二效果具有相同值的濃度來確定，例如相同的麻痺時間，根據步驟(I)使所述濃度等於所述未知濃度。所述確定的前提條件是，第一樣品中梭菌毒素的未知濃度對肌肉組織產生效果，其可通過所述校準曲線進行定量。本領域技術人員容易理解，必要時可對未知濃度的第一樣品進行一次或多次稀釋或濃縮，從而使達到的濃度範圍可與第二樣品進行比較，即達到相同的第一和第二效果。然後，已知稀釋或濃縮係數，可通過計算來確定未稀釋或未濃縮的第一樣品中初始存在的神經毒素的濃度。在另一個實施方案中，所述確認出和等於不是通過步驟(h)和後面的步驟(k)和(I)中僅一個濃度的單點測量，而是通過多個不同濃度的測量進行的。鑑於管理機構的要求，這一點尤為重要。根據本發明的另一個方面，最好對濃度範圍進行優化，從而使在該濃度範圍內的所述第二和第一樣品能夠進行可靠的比較。這不僅適用於關於迄今已知的和商品化梭菌神經毒素製劑的生物效力的可比性，也可適用於未來開發的或正在開發的製劑。在一個實施方案中，為了優化以小鼠LD5tl單位/ml表示的濃度範圍，從而使在該濃度範圍內的所述第二和第一樣品能夠進行可靠的比較，最好是首先確定步驟(e)和/或步驟(h)中記錄的校準曲線的標準差。通過採用合適的逐步回歸分析，則可能產生回歸模型以基於劑量-響應曲線預測未知毒素樣品的效價。採用這種方法，可確認出代表兩個不同數據群體的第一和第二樣品的濃度範圍，其中各自的劑量-響應曲線之間的相關性達到最大值，即確定為最佳擬合。在一個實施方案中，根據預定的回歸模型，通過以擬合曲線表示第一和第二樣品的各自數據集的數值範圍，以及在預定的置信區間分別線性化和平行化所述擬合曲線，可進一步精確所述檢驗。因此，根據第三個方面，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價的方法，該方法包括(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(c)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第二效果；(d)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(a)-(c)；
(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織；(h)測定對步驟(g)中獲得的所述肌肉組織誘導的第一效果；(i)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對應濃度下測得的第一效果，從而記錄第一數據集；其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。在一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(m)和(n)(m)從最佳擬合於第一和第二數據集的濃度範圍選擇所述不同濃度；(n)根據統計學檢驗確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟U )_( S ):(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數據集的數值範圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數據集的數值範圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在一個實施方案中，所述肌肉組織接受電刺激。在一個實施方案中，該方法在步驟(a)之後包括步驟(b)，且在步驟(f)之後包括步驟(g)(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。在一個實施方案中，步驟(b)或(g)在不含第二或第一樣品的情況下進行，或步驟(b)和(g)在不含第二和第一樣品的情況下進行。因此，在一個實施方案中，第二和/或第一效果的確定在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。在另一個實施方案中，所述肌肉組織的電刺激在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。這意味著，在步驟(a)之後和在步驟(b)之前和/或在步驟(f)之後和在步驟(g)之前，如上文所述，將肌肉組織從第二和/或第一樣品中移出。完成上述程序的合適的統計學檢驗是眾所周知，如可能性-商-檢驗(likelihood-quotient-test)。這種可能性-商-檢驗的一個實例是已知的F-檢驗。也可使用檢驗如X2-檢驗(卡方檢驗或X2-分布檢驗)或t-檢驗。所述檢驗也是本領域已知的。在一個實施方案中，所述統計學檢驗是F-檢驗。通過所述檢驗，可確定在預定的置信區間內，取自兩個不同群體的兩個隨機樣本相對於其方差是否有本質不同。因此，這種檢驗用於檢驗兩個統計學樣本(此處為第二和第一樣品)的差異。 在一個實施方案中，為了獲得可靠的結果，置信區間應該較寬，即誤拒絕的概率應該是較低的。在一個實施方案中，誤拒絕的概率為< 5 (以％表示；(或0. 05))，以及置信區間為彡95 (以％表示；(或0.95))。在一個實施方案中，每個子步驟(ci)-(S)的誤拒絕概率為<5 (以％表示)。
在一個實施方案中，步驟(Y)中的線性化是以最佳擬合直線表示各自數據集來進行的。在一個實施方案中，步驟(S)中的平行化是通過確定最佳擬合直線的共同斜率來進行的。步驟(S )之後，根據所述線性擬合曲線和所述平行擬合曲線彼此的相對位移確定第一樣品相對於第二樣品的相對效價。因此，在一個實施方案中，該方法在步驟(5 )之後進一步包括步驟(e ):( e )根據所述線性擬合曲線和所述平行擬合曲線彼此的相對位移計算出第一樣品相對於第二樣品的相對效價。 在一個實施方案中，術語「相對效價」是指分別根據線性化和平行化的擬合曲線各自的相同濃度，在相同濃度下確定的第一樣品相對於第二樣品的效價。在一個實施方案中，第二樣品的效價相當於100%，第一樣品的相對效價以％表示。例如，相對於第二樣品該第一樣品獲得了 110%或90%的效價。應用三分律即比例運算法(the rule of three),通過分別將具有110%效價的第一樣品稀釋至100%效價,獲得第一樣品中梭菌神經毒素的有效濃度(目前未知的濃度)。計量單位現在變成相對效價，且數值以活性單位(效價)表示，其根據參考標準(第二樣品)的活性(效價)來定義。在另一個實施方案中，相對效價是以第一和第二樣品的效價的比率表示的。在一個實施方案中，上述模型用於預測使用的神經毒素劑量的對數值。在另一個實施方案中，無論是刺激效果的量還是樣品中神經毒素劑量的量均以對數值記錄。在一個實施方案中，分別在第二樣品和第一樣品中至少三個不同的梭菌神經毒素濃度下，分別測定第二效果和第一效果。在一個實施方案中，所述數據集的記錄、各自校準曲線的記錄、各自的校準曲線以半對數圖的形式表示。在另一個實施方案中，採用雙對數圖。確定相對效價的方法記載於歐洲藥典中。在一個實施方案中，以例如10小鼠LD5tl單位/ml為起始濃度，確定相對效價的方法適用於整個數據集的範圍。隨後，將大於10小鼠LD5tl單位/ml的值作為起始點，如11、12、13、14、15、16、17小鼠LD5tl單位/ml。進行迭代直到該應用模型達到期望和要求的精度。在一個實施方案中，一旦通過統計學檢驗確定了最佳擬合及濃度範圍，任何含有未知濃度(對應於有效濃度)梭菌神經毒素的第一樣品可與根據本發明方法確定的在所述濃度範圍內的第二樣品中所述梭菌神經毒素的已知濃度進行比較。在一個實施方案中，記錄所述測定的第二效果是通過繪製所述第二效果對應於濃度的曲線來進行的，記錄所述第二數據集是通過記錄校準曲線來進行的。相對效價評價的應用，以及檢測中包含參考標準(第二樣品)，可形成更精確且更具重現性的評價，其為減少動物的使用提供了機會。在一個實施方案中，根據本發明的三個方面的任一種方法，在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測定之前，使所述肌肉組織暴露於所述梭菌毒素中5-30min。在一個實施方案中，根據本發明的三個方面的任一種方法，在步驟(a)和/或步驟(f)之前所述肌肉組織已經過電刺激。在另一個實施方案中，在步驟(a)和/或步驟(f)過程中所述肌肉組織已經過電刺激。在另一個實施方案中，在步驟(a)之前和步驟(a)過程中，和/或步驟(f)之前和步驟(f)過程中，所述肌肉組織已經過電刺激。統計學檢驗通常採用合適的電腦程式和合適的計算機來進行。在一個實施方案中，所述統計學檢驗採用合適的包含用以實施所述統計學檢驗的 合適軟體工具的電腦程式來進行。因此，在一個實施方案中，本發明涉及包括包含用於實施本發明方法的軟體工具的電腦程式的電腦程式產品。在一個實施方案中，所述第二樣品選自可市售獲得的和註冊的肉毒毒素製劑。由於這些產品為註冊的，並允許分別作為藥物製劑、藥劑，它們分別包括明確界定的數量和肉
毒毒素的濃度。在另一個實施方案中，在標準條件下生產的任何肉毒毒素製劑均可使用。在一個實施方案中，上述商業製劑可作為第二樣品。因此，第二樣品可以為
Xeomin' Botox' Dysport' Myoblocli'或pUfTox 。這些製劑或者使用的肉毒毒素
類型不同，或者生物效力/活性即效價不同，例如肉毒神經毒素的濃度或其中所含肉毒菌的類型不同。以小鼠LD5tl表示的小鼠單位為確定樣品中所含梭菌神經毒素濃度的常用單位。LD5tl值表示將所述的量施用於小鼠群體的小鼠時，導致50%小鼠群體死亡的致死劑量。確定該值的方法是本領域技術人員已知的。該方法記載於歐洲藥典中。眾所周知，在基於肉毒神經毒素的產品上標記的LD5tl單位可具有產品特異性、生產商特異性，且由於缺少標準而無法互換。在一個實施方案中，本文中涉及的LD5tl單位是表徵和標iL!XeominK:時確定的單位。例如，第二樣品為Xeomin'8'。因而有關特定效價的單位為Xeomin 單位。因此，本發明的檢測系統可用於比較評價含梭菌神經毒素的任何樣品相對於Xeomin 的效價。然後，該方法可直接以Xeomin 單位比較含有梭菌神經毒素(未知的濃度)的第一樣品。Xeomin 和Botox 具有大致相當的效力或效價。為獲得與Xeomin 和Botox 相同的效力或效價，必須分別使用約2. 5倍量的Dysport18^P 10倍量的Myobloc 。在一個實施方案中，將這些市售製劑稀釋或濃縮至其中所含肉毒神經毒素的預定濃度，根據所述第二樣品中所述肉毒神經毒素的不同濃度來測定所述第二效果。繪製測得的效果對應於肉毒毒素濃度的曲線，從而記錄校準曲線。分別通過所述第二數據集、所述校準曲線，可確定第一樣品中肉毒神經毒素的未知濃度。已發現，以至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml表示樣品(可為第一或第二樣品)中肉毒神經毒素的濃度，本發明的方法可以有利地應用。須指出，本應用中給出的濃度均為小鼠LD5tl單位/ml。在一個實施方案中，所述濃度至少為15。在另一個實施方案中，所述濃度至少為20。
在另一個實施方案中，所述濃度為10-1000。在一個實施方案中，所述濃度為10-70。在另一個實施方案中，所述濃度為15-60。在另一個實施方案中，所述濃度為20-45。在一個實施方案中，所述第二樣品為Xeomin'
在一個實施方案中，已發現如果將Xeomin 作為第二樣品，如果以10-70之間的至少一個濃度確定第二效果，可獲得特別可靠的結果。在另一個實施方案中，濃度為15-60。在另一個實施方案中，濃度為25-45。在一個實施方案中，已發現如果將BotoX'"作為第二樣品，如果以10-70之間的至少一個濃度確定第二效果，可獲得可靠的結果。在另一個實施方案中，濃度為15-60。在另一個實施方案中，濃度為25-45。根據步驟(e)，如果第二樣品用於確定校準曲線，與XeomhiR^Botox:'RMBttj二樣品具有更低濃度的或含有更低效力或效價的肉毒神經毒素，為達到可與Xeomin 或Botoxs'誘導效果相比的第二效果的強度需要較高濃度的神經毒素，即較高的LD5tl單位/ml值。在一個實施方案中，其中所述第二樣品比Xeoniii '或Botox'K;具有更低的肉毒神經毒素的濃度或效價，以20-400或100-800之間的至少一個濃度確定第二效果。在一個實施方案中，其中所述第二樣品為Dyspord 20-400，或25-300，或30-250之間的至少一個濃度確定第二效果。在另一個實施方案中，其中所述第二樣品為Myobloc^，以100-800，或150-700，或200-600之間的至少一個濃度確定第二效果。在其它實施方案中，所述濃度範圍可為30-600，或30-400，或30-200，或30_100，或 30-80，或 40-500，或 40-400，或 40-300，或 40-200，或 40-100，或 40-90，或 50-300，或50-200，或50-100，或60-100，取決於與Xeomin'('或801(^19相比第二樣品中神經毒素的效力或效價的濃度。在一個實施方案中，所述LD5tl單位為Xeomir^單位。根據本發明的第一變量，用於確定所述未知濃度的效果為肌肉組織的麻痺時間。測得的時間可以例如秒或分鐘計量。根據子變量，可基於肌肉收縮的距離(一旦收縮的距離等於0，則達到麻痺)，或基於肌肉抽搐頻率(一旦抽搐頻率等於0，則達到麻痺)確定麻痺時間。收縮距離可以例如釐米或毫米計量。「麻痺(的)時間」可被定義為達到最大抽搐一半的時間。這嚴格取決於毒素的濃度。根據本發明的其它變體，誘導的效果為肌肉組織收縮率的變化，或肌肉組織收縮的變化，或肌肉組織收縮力的變化，或肌肉組織終板電位或微型終板電位的變化。這些方法為本領域已知的，例如公開於EP 1597584B1。在一個實施方案中，所述效果(分別為誘導的第一和第二效果)為肌肉組織的麻痺時間。基本上，可選擇具有神經肌肉特點的任何肌肉組織用於本發明方法中，也就是能響應電刺激的肌肉組織。經由肌肉組織，是指包括一種或多種含一個神經細胞或多個神經細胞或粘附有神經細胞的肌肉纖維標本(preparation)，其可接受電刺激。可使用平滑肌和橫紋肌組織。根據本發明教導，肌肉組織包括肋間肌，如小鼠和大鼠的後肢肌肉和後肢趾長伸肌，如小鼠和大鼠的後爪蹠肌，如小鼠和大鼠的膈神經偏側膈，如小鼠和大鼠的耳長提肌，娃神經肌接頭，雛雞頸二腹肌(biventer cervic muscle)。也可使用例如小鼠和大鼠的肋骨肌肉或腦組織，或海鰩(sea ray)的電器官。此外，在一個實施方案中，實驗表明，使用小鼠的膈神經偏側膈是一種適於測定梭菌毒性的工具。因此，它可用作確定梭菌毒性的檢測。在一個實施方案中，由於所述小鼠偏側膈檢測的可靠性，它可符合管理機構的認證要求且滿足肉毒毒素A血清型或B血清型的安全及有效施用的需要。 在一個實施方案中，所述偏側膈是齧齒動物如大鼠或小鼠的偏側膈。 在一個實施方案中，所述偏側膈是小鼠的偏側膈。術語「小鼠或大鼠偏側膈」是指小鼠或大鼠的膈神經偏側膈。在另一個實施方案中，所述第一樣品中的梭菌毒素及所述第二樣品中的梭菌毒素是相同的梭菌毒素。在另一個實施方案中，所述第一樣品中的梭菌毒素或神經毒素和所述第二樣品中的梭菌毒素或神經毒素彼此不同。為了本方法在實驗上的實現，通常從動物如小鼠或大鼠中摘取附著有運動神經元的肌肉組織，置於含有緩衝液如生理緩衝液的器官或組織浴中，對其中的條件如離子組成、葡萄糖、溫度、pH值和氧合作用(oxygenation)進行控制,從而優化組織的活力和性能。當將肌肉連接到力傳感器上時，可以測定電刺激後的肌肉收縮力，這可直接測定毒素對神經肌肉功能的影響。在一個實施方案中，緩衝液中的溫度為35_39°C，或36_38°C。在另一個實施方案中所述溫度為36. 5-37. 5°C。在另一個實施方案中，所述溫度為或約為37°C。在一個實施方案中，所述緩衝液的pH值為7-8，或7. 2-7.8。在一個實施方案中，所述PH值約為7.5。在一個實施方案中，氧合作用由含氧的混合氣體來完成。在一個實施方案中，氧合作用由二氧化碳和氧的混合氣體來完成。在一個實施方案中，使用含95份氧(基於體積)和5份二氧化碳(基於體積)的混合氣體。市售混合物已知為Carbogene。進行電刺激以測定效果(分別為第二和第一效果)，基本上可使用引用的現有技術中的方法。在一個實施方案中，所述方法按照如下進行，在步驟(b)或(g)中以至少等於超最大電壓的電壓進行電刺激。採用超最大電壓被認為是獲得肌肉組織最大抽搐反應的最小電壓。一般地，重複該實驗幾次，結果取平均值，以獲得可靠的結果。所述電刺激可按照如下進行，在至少等於該組織超最大電壓的電壓下，在一定的時間間隔進行脈衝刺激。脈衝刺激是指持續一段時間的刺激作用彼此間隔一段無刺激作用的時間。該方法公開於，例如G6sc.he丨等，Exp. Neurol, vol. 147,1,1997, Wohlfahrt 等，Naunyn-SchmiGdebergj s Arch Pharmacol(1997)355 :335-340。或者，電刺激可為成串脈衝刺激(train pulse stimulation)。該方法公開於EPI 597 584 BI 中。在一個脈衝刺激的實施方案中，刺激的持續時間可以為lOiis-lms。期間，無刺激作用的持續時間可以為0. I-IOs0超最大電壓的範圍可以在例如lmV-15V之間。例如，通過兩個電極，以例如IHz頻率的脈衝例如連續電刺激所述肌肉組織。微電極可放置於或靠近神經肌肉接頭，可以記錄自發及誘發的膜電位的胞內記錄。這些膜電位是由乙醯膽鹼激活的配體門控離子通道產生的，其反過來又受到毒素的影響。終板電位的分析可用於獲取與毒素對乙醯膽鹼的量子釋放(quantal release)的效果有關的息。具體地，合適的肌肉組織，例如可從例如雄性或雌性小鼠切除左膈神經偏側膈 (膈神經)，並放置於器官浴中。在一個實施方案中，這種器官浴為含有克-林二氏溶液(Krebs-Ringer-Solution),或厄爾平衡鹽緩衝液(Earle ' s Balanced Salt Solution)(EBSS)，或生理鹽水的浴。所述溶液為本領域技術人員已知的。然後，按照已知的方法，分別在第一、第二樣品存在的情況下通過膈神經刺激所述肌肉組織。採用已知的方法，例如引用的現有技術中描述的方法，記錄並評價所述誘導的效果。肌肉組織可浸潰於緩衝液如生理緩衝液中。所述緩衝液可包括能量源。所述能量源可以為ATP能量源，例如以下的一種或多種ATP、糖如葡萄糖和/或肌酸、脂肪酸、胺基酸、糖原、表面活性劑和丙酮酸。所述緩衝液可為含氧的，特別是用於較長檢測中。優選地，可向器官浴中加入氧氣和葡萄糖(或其它ATP源)，以延長所述肌肉組織的保質期。添加表面活性劑尤其有助於減少泡沫，這些泡沫可能對本發明的方法有負面影響。在一個實施方案中,所述表面活性劑為消泡劑。術語「消泡劑」包括所有影響包埋於液體中的氣泡表面張力的試劑。一種類型的消泡劑降低了包埋於液體中的氣泡表面的張力，從而破裂了氣泡。然而，消泡劑也可能增加氣泡表面的張力，使氣泡合併成較大的氣泡，其比小氣泡更容易從液體中逃逸。可採用本領域技術人員已知的方法測定表面張力的影響，如接觸角和潤溼角測定。因此，消泡劑是防止形成泡沫形成或破裂已經形成的泡沫的試劑。常用消泡劑為水不溶性油、二甲基聚矽氧烷和其它聚矽酮、醇類、硬脂酸鹽和乙二醇類。在一個實施方案中，從至少一種含矽化合物中選擇所述消泡劑。在又一個實施方案中，至少一種含矽化合物為矽氧烷。術語「矽氧烷」包括寡聚矽氧烷(oligosiloxanes)和多聚矽氧烷(polysiloxanes)。在一個實施方案中，所述矽氧烷被烷基和/或芳基取代。這種矽氧烷是本領域眾所周知的。可以應用單個化合物形式或一種以上含矽化合物的混合物形式的含矽化合物。合適的矽化合物及合適的矽氧烷的實例可分別為a-(三甲基甲矽烷基)- _甲基聚[氧(二甲基亞矽烷)]和聚二甲基矽氧烷，但不限於此。這些化合物可市售獲得且作為藥物使用，例如商品名為_■甲基娃油和_■甲基娃氧燒。本領域技術人員容易知曉，其它具有類似活性的化合物，如二甲基矽氧烷和二甲基矽油也可用於本發明的方法中。在另一個方面，本發明涉及包含器官浴的試劑盒，於其中刺激所述已暴露於梭菌神經毒素的肌肉組織，其中測定所述刺激的效果(如上所述)，以及進行統計學檢驗的電腦程式產品，從而優化濃度範圍內，在該濃度範圍內測定神經毒素產生的效果以獲得可靠的結果。因此，在一個實施方案中，本發明涉及試劑盒，其包括

(A)-用於刺激已暴露於梭菌神經毒素的肌肉組織，以選擇所述神經毒素對肌肉組織誘導的效果的裝置；-用於測定並記錄所述效果的裝置；以及(B)電腦程式產品，其包括包含用於實施本發明方法的軟體工具的電腦程式。根據第四個方面，本發明還提供一種確定濃度範圍的改進方法，在該濃度範圍內，可在預定的置信區間或誤拒絕可能性內，測定含有梭菌神經毒素的第一樣品相對於含有梭菌神經毒素的第二樣品的效價。在一個實施方案中，提供確定濃度範圍的方法，其中在該濃度範圍內，可測定含有梭菌神經毒素的第一樣品相對於含有梭菌神經毒素的第二樣品的效價，該方法包括以下步驟(a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸；(b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織；(c)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第二效果；(d)以不同濃度的所述神經毒素重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織；(h)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第一效果；(i)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對應濃度下測得的第一效果，從而記錄第一數據集；其中所述濃度選自最佳擬合於所述第一和第二數據集的濃度範圍，且其中所述最佳擬合濃度範圍是按照統計學檢驗來確定的，其包括以下子步驟(a)-(S)(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數據集的數值範圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數據集的數值範圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在所述實施方案中，所述第二效果和所述第一效果在性質上是相同的。為了優化所述方法，可將上述方法與本發明的第三個方面的方法結合使用。在本發明的另一個方面，將本發明的方法用於質量控制是有利的，即含梭菌神經毒素的樣品相對於諸如生產過程中要求的參考標準的效價。
因此，在這方面，本發明涉及本發明方法在質量控制中的應用，即含梭菌神經毒素的樣品的效價。在一個實施方案中，待確定其效價的樣品是忙存的樣品。在一個實施方案中，所述樣品已存放至少一小時，或至少一天。在一個實施方案中，所述樣品為凍幹樣品，或為重組樣品。根據另一方面，本發明涉及本發明第一方面的方法的應用，即參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度；或參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價 。根據另一方面，本發明涉及肌肉組織的應用，尤其是小鼠或大鼠的偏側膈，用本發明的任一方法確定梭菌活性，或藉助本發明的試劑盒確定梭菌活性。以下實施方案也屬於本發明，並且應該理解以上描述的實施方案反之亦適用以下的方法。因此，本發明還涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，檢測第一樣品中梭菌神經毒素未知濃度的體外方法，該方法包括(a)將肌肉組織接觸第二樣品；(b)電刺激步驟(a)中所述肌肉組織；(c)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測定的所述第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸；(g)電刺激步驟(f)中所述的肌肉組織；(h)測定步驟(g)中對所述肌肉組織誘導的第一效果；其中，在以至少為10的小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃度下確定所述第二效果。在一個實施方案中，所述第一效果與所述第二效果相同時確認出所述濃度，並且其與所述第一樣品中所述梭菌神經毒素的未知濃度相等。因此，在一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(k)和(I)(k)確認出所述第一效果與第二效果相同時的濃度；(I) (k)中所述濃度等於所述未知濃度。在一個實施方案中，在步驟(a)和/或步驟(f)之前，所述肌肉組織已進行電刺激。在另一個實施方案中，在步驟(a)和/或步驟(f)中，所述肌肉組織已進行電刺激。在另一個實施方案中，在步驟(a)之前和在步驟(a)過程中和/或在步驟(f)之前和在步驟(f)過程中，所述肌肉組織已進行電刺激。可在第二和/或第一樣品不存在或存在下，對所述肌肉組織進行所述電刺激，前提是所述肌肉組織已暴露於所述第二和/或第一樣品中存在的梭菌神經毒素。在一個實施方案中，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，檢測第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度的體外方法，該方法包括
(i)在所述第二樣品存在下電刺激肌肉組織，選擇所述第二樣品對所述肌肉組織誘導的第二效果，(ii)在所述第二樣品中不同的梭菌神經毒素濃度下，測定(i)中的所述第二效果，繪製所述測定的第二效果對應於濃度的曲線，從而記錄第二數據集，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，(iv)選擇所述第一樣品對所述肌肉組織誘導的第一效果，(V)確認出所述第一和第二效果相同時的濃度，和
(vi) (V)中所述濃度等於所述未知濃度，其中，在以至少為10的小鼠LD5tl單位/ml所表示的至少一個濃度下確定所述第二效果。在一個實施方案中，通過測定所述第二樣品中不同濃度的所述梭菌神經毒素的第二效果進行步驟(e)或步驟(ii)中所述測定的第二效果的所述記錄，繪製所述測定的第二效果對應於濃度的曲線，從而記錄校準曲線。因此，用步驟(e)或(ii)記錄的第二數據集繪製校準曲線，藉助該曲線分別通過步驟(k)和後續步驟(1)，步驟(V)和後續步驟(vi)確定所述第一樣品中所述梭菌神經毒素的未知濃度。在一個實施方案中，繪製生成校準曲線，通過圖表分析進行分別進行步驟(k)-(l)以及步驟(V)和後續步驟(vi)的確認和等於的步驟。在一個實施方案中，所述濃度為至少15，或為至少20。在另一個實施方案中，所述濃度為10-1000。在一個實施方案中，第二樣品的濃度為1070。在另一個實施方案中，第二樣品的濃度為15-60。在又一個實施方案中，濃度為20-45。在一個實施方案中，上述提到市售製劑可用作第二樣品。因此，第二樣品可以為Xeomin , Botox1(、Dy sport 、Myobioc 或 PurTox'在一個實施方案中，所用單位是Xeomin 單位。在一個實施方案中，這些市售可獲得的製劑可稀釋或濃縮成本文包括的肉毒神經毒素的預定濃度，且根據所述第二樣品中所述梭菌神經毒素的各種濃度而進行所述第二效果的測定。繪製所述測定的效果對應於肉毒毒素濃度的曲線，從而記錄成校準曲線。分別用所述第二數據集，所述校準曲線，確定第一樣品中肉毒神經毒素的未知濃度。在一個實施方案中，發現如果將XeomirriM乍為第二樣品，如果在10-70的至少一個濃度下確定第二效果，可以得到特別可靠的結果。在另一個實施方案中，濃度為15-60。在另一個實施方案中，濃度為25-45。在一個實施方案中，發現如果將Botox 作為第二樣品，如果在10-70的至少一個濃度下測定第二效果，可以得到可靠的結果。在另一個實施方案中，濃度為15-60。還是在另一個實施方案中，濃度為25-45。如果按照步驟(ii)，用第二樣品確定校準曲線，第二樣品相比Xeomin 或Botox'6'具有更低濃度的或包含更低效力或效價的梭菌神經毒素，為了使第二效果達到與Xeomin 或Botox 誘導的效果相當的強度需要較高的神經毒素濃度，即更高的LD5tl單位/ml 值。 在一個實施方案中，其中第二樣品含有比Xeom in R或Botox a更低的肉毒神經毒素的濃度或效價，在20-400，或100-800的至少一個濃度下確定第二效果。在一個實施方案中，其中第二樣品是Dysport'在20-400，或25-300，或30-250
的至少一個濃度下確定第二效果。在另一個實施方案中，其中第二樣品是Myobloc'在100-800，或150-700，或200-600的至少一個濃度下確定第二效果。在其它實施方案中，濃度範圍可以為30-600，或30-400，或30-200，或30-100，或 30-80，或 40-500，或 40-400，或 40-300，或 40-200，或 40-100，或 40-90，或 50-300，或50-200，或50-100，或60-100，取決於與Xeoniii/或Botox*相比，第二樣品中神經毒素的
效力或效價的濃度。如上所述，如果基於以小鼠LD5tl單位/ml表示的不同濃度確定所述第二樣品對所述肌肉組織誘導的效果，可得到校準曲線。例如，可以確定在指示的濃度範圍內的IOLD5tl單位/ml或5LD5(I單位/ml的步驟中誘導的所述效果。通過從校準曲線確認出其中所述第一和所述第二效果具有相同的值(例如相同的麻痺時間)的濃度，按照步驟(I)所述濃度即等於所述未知濃度，從而可確定第一樣品的所述未知濃度。所述確定的前提是，第一樣品中未知濃度的梭菌毒素對肌肉組織產生效果可通過所述校準曲線定量。本領域技術人員容易獲知，必要時可對未知濃度的第一樣品稀釋或濃縮一次或幾次，從而達到一定濃度範圍，其與第二樣品具有可比性，即達到相同的第一和第二效果。然後，已知稀釋或濃縮係數，可計算確定未稀釋或未濃縮樣品中初始存在的神經毒素的濃度。在一個實施方案中，該方法的實施為，使用前述現有技術的方法，在至少等於超大電壓的電壓下，分別實施步驟(b)或(g)，⑴和(iii)的電刺激。在一個實施方案中，肌肉組織是小鼠橫隔膜。因此，參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度的方法包括⑴在所述第二樣品存在下電刺激小鼠偏側膈，選擇所述第二樣品對所述小鼠偏側膈誘導的第二效果，(ii)在所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經毒素下，測定(i)中所述第二效果，繪製所述測定的第二效果對應於濃度的曲線，從而記錄校準曲線，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，(iv)測定所述第一樣品對所述肌肉組織誘導的第一效果，(V)確認出所述第一和第二效果相同時的濃度，和(vi) (V)中所述濃度等於所述未知濃度，其中，在至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃度下確定所述第二效、果。在一個實施方案中，所述肌肉組織是大鼠或小鼠膈神經偏側膈，誘導效果是麻痺時間，且所述梭菌肉毒毒素是A血清型肉毒神經毒素。在本發明的一個具體實施方案中，該方法包括參照第二樣品中A型肉毒毒素的已知濃度，確定第一樣品中A血清型肉毒神經毒素的未知濃度的方法，所述方法包括(i)在所述第二樣品存在下電刺激小鼠偏側膈，選擇所述第二樣品對所述小鼠偏側膈誘導的第二麻痺時間，(ii)在所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經毒素下，測定(i)中所述第二效果，繪製所述測定的第二效果對應於濃度的曲線，從而記錄校準曲線，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，
(iv)測定所述第一樣品對所述肌肉組織誘導的第一效果，(V)確認出所述第一和第二效果相同時的濃度，和(vi) (V)中所述濃度等於所述未知濃度，其中，在10-70，或15-60，或20-45以小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃度下確定所述第二麻痺時間，其中第二樣品為Xeomin1IBotox^在一個實施方案中，所述濃度是在16. 6小鼠LD5tl單位/ml至56. 3小鼠LD5tl單位/ml範圍內。在另一個實施方案中，所述濃度是在20小鼠LD5tl單位/ml至55小鼠LD5tl單位/ml範圍內。在又一個實施方案中，所述濃度是在25小鼠單位/mlLD5Q至50小鼠LD5tl單位/ml範圍內。在本發明的另一個具體實施方案中，該方法包括參照第二樣品中A型肉毒毒素的已知濃度，確定第一樣品中A血清型肉毒毒素的未知濃度的方法，所述方法包括(i)在所述第二樣品存在下電刺激小鼠偏側膈，選擇所述第二樣品對所述小鼠偏側膈誘導的第二麻痺時間，(ii)在所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經毒素下，測定(i)中所述第二效果，繪製所述測定的第二效果對應於濃度的曲線，從而記錄校準曲線，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，(iv)測定所述第一樣品對所述肌肉組織誘導的第一效果，(V)確認出所述第一和第二效果相同時的濃度，和(vi) (V)中所述濃度等於所述未知濃度，其中，在20-400，或25-300，或30-250以小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃度下確定所述第二麻痺時間，其中第二樣品為Dysportl在本發明的另一個具體實施方案中，該方法包括參照第二樣品中B型肉毒毒素或A型肉毒毒素的已知濃度，確定第一樣品中B血清型肉毒神經毒素的未知濃度的方法，所述方法包括(i)在所述第二樣品存在下電刺激小鼠偏側膈，選擇所述第二樣品對所述小鼠偏側膈誘導的第二麻痺時間，(ii)在所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經毒素下，測定(i)中所述第二效果，繪製所述測定的第二效果對應於濃度的曲線，從而記錄校準曲線，(iii)在所述第一樣品存在下，電刺激所述肌肉組織，(iv)測定所述第一樣品對所述肌肉組織誘導的第一效果，(V)確認出所述第一和第二效果相同時的濃度，和(vi) (V)中所述濃度等於所述未知濃度，其中，在100-800，或150-700，或200-600以小鼠LD5tl單位/ml表示的至少一種濃
度下確定所述第二麻痺時間，其中第二樣品為MyobIoc'然而，確定神經毒素濃度或神經毒素效價的檢測方法不僅在前述描述的組織上進行，也可在細胞培養物上進行。根據又一個方面，本發明涉及基於細胞培養物確定梭菌神經毒素活性的檢測方法，參照參考樣品中梭菌毒素的已知濃度，測定樣品中梭菌神經毒素的未知濃度。該方法應用於蛋白的定量，如當將對梭菌肉毒神經毒素敏感的細胞培養物暴露於所述神經毒素時，從SNARE複合物的裂解物中得到的SNAP25。該方法也應用於參照參考標準評價樣品中梭菌神經毒素的相對效價。Pellet, S.，等，大鼠原代脊髓細胞(RSC)檢測方法和確定A型肉毒神經毒素的小鼠生物檢測方法的比較，藥理學與毒理學方法雜誌(Journal of Pharmacological andToxicological Methods) (2010), doi :10. 1016/j. vascn. 2010. 01. 003,提供了確定純化 A血清型肉毒神經毒性效價的細胞檢測方法作為小鼠生物檢測方法的替代方法。Keller, J. E.，等，培養的脊髓細胞中肉毒神經毒素作用的持久性，FEBS Letters456(1999) 137-142，公開了肉毒神經毒素A(BoNT/A)和肉毒神經毒素E (BoNT/E)活性持久性不同的機制。本發明的進一步目的是改進現有技術的方法，開發一種可靠且精確的方法用於分別確定影響所述效價的樣品中梭菌神經毒的效價和濃度，所述方法可用於管理目的。這種改進的方法可滿足安全和有效施用的廣泛需要。通過本方法達到該進一步目的，其將細胞培養物暴露於或接觸包含梭菌神經毒素的樣品，其中在測定效果(其由所述梭菌神經毒素誘導細胞培養物中的細胞而產生)之前，用水介質取代所述樣品，該水介質為例如緩衝液，或例如不包含梭菌神經毒素或所述梭菌神經毒素的中性緩衝液，並且所述細胞培養物在所述水介質中暴露一段時間，例如大於I小時，或大於2小時，或大於3小時，或大於4小時，或大於5小時。測定之前,細胞培養物與所述水介質接觸時間可達到100小時或甚至更多。令人驚奇的是，已經發現，將所述細胞培養物在包含神經毒素的樣品中暴露過或接觸後，與不包含梭菌肉毒神經毒素的水介質接觸，隨後在不含所述樣品的情況下測定所述效果，各自的劑量響應曲線發生位移，從而本發明方法的靈敏度明顯增力口。尤其在所述樣品中以LD5tl小鼠單位/ml表示的低濃度的所述梭菌神經毒素下，靈敏度增加。因此，在第一個方面中，本發明涉及測定梭菌神經毒素對細胞培養物誘導的效果的方法，其包括 (a)使細胞培養物與包含所述梭菌神經毒素的樣品接觸；(c)測定所述梭菌神經毒素對所述細胞培養物誘導的所述效果；其中，
步驟(c)在不含所述樣品的情況下進行；並且在所述步驟(C)中的測定前和所述步驟(a)中的接觸後，所述細胞培養物與不包含梭菌毒素的水介質接觸0. 5-100小時。在第二個方面中，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，測定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度的方法，該方法包括(a)使細胞培養物與所述第二樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述細胞培養物誘導的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中測定的對應濃度下所述第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使細胞培養物與所述第一樣品接觸；(h)測定對所述細胞培養物誘導的第一效果；(k)確認出所述第一效果與第二效果相同時的濃度；(I) (k)中所述濃度等於所述未知濃度。其中，步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行；並且在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測定前和步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸後，所述細胞培養物與不包含梭菌毒素的水介質接觸0. 5-100小時。在第三個方面中，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價的方法，該方法包括(a)使細胞培養物與所述第二樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述細胞培養物誘導的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測定的所述第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使細胞培養物與所述第一樣品接觸；(h)測定對所述細胞培養物誘導的第一效果；(i)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對應濃度下測定的所述第一效果，從而記錄第一數據集；其中，步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行；並且在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測定前和步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸後，所述細胞培養物與不包含梭菌毒素的水介質接觸0. 5-100小時。在一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(m)和(n)(m)從最佳擬合於第一和第二數據集的濃度範圍內選擇所述不同濃度；(n)根據統計學檢驗確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(a )_( S ):(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數據集的數值範圍；
(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數據集的數值範圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；
( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在一個實施方案中，統計學檢驗是F-檢驗，或X2-檢驗，或t_檢驗。在一個實施方案中，各子步驟(ci)-(S)的誤拒絕概率彡5 (以％表示)。在一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(e ):( e )根據所述線性化的擬合曲線和所述平行化的擬合曲線彼此間的相對位移，計
算第一樣品相對於第二樣品的相對效價。在一個實施方案中，所述效果(包括第一和/或第二效果)是來自SNARE複合物的蛋白裂解物。

在一個實施方案中，所述蛋白是SNAP25。在一個實施方案中，在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測定前，所述細胞培養物與所述梭菌毒素接觸5-45小時，或15-40小時，或25-35小時。在一個實施方案中，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測定前和所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸後，所述細胞培養物與不包含梭菌毒素的水介質接觸0. 5-100小時，或1-95小時，或6-90小時，或7_80小時，或8-70小時，或9-60小時，或10-50小時，或11-50小時，或12-40小時，或15-40小時。在一個實施方案中，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測定前和所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸後，裂解細胞培養物。在另一個實施方案中，步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸前，裂解細胞培養物。在一個實施方案中，所述測定通過Western-Blot分析或ELISA方法進行。在一個實施方案中，所述細胞培養物選自神經細胞系或原代神經細胞的細胞培養物。在一個實施方案中，繪製所述第二效果對應於濃度的曲線，記錄所述測定的第二效果，通過記錄校準曲線記錄所述第二數據集。在一個實施方案中，在至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml所表示的至少在一種濃度下測定所述第二效果。在另一個實施方案中，所述濃度是10-1000，或10-70，或15-60，或20-45。在另一個實施方案中，所述濃度是20-400，或100-800。在一個實施方案中，所述小鼠LD5tl單位是Xeomin 單位。在一個實施方案中，所述梭菌神經毒素是肉毒毒素。在另一個實施方案中，所述肉毒神經毒素是選自A、B、C、D、E、F和G的血清型；或選自A、B、C、D、E、F和G血清型的肉毒神經毒素經化學或遺傳修飾的衍生物。在另一個實施方案中，所述神經毒素是A或C或E血清型。在一個實施方案中，神經毒素不包含複合蛋白。在另一個方面，本發明涉及電腦程式產品，其包括包含用於實施本發明方法的軟體工具的電腦程式。在另一個方面，本發明涉及細胞培養物在本發明任一方法中的應用。在另一個方面，本發明涉及根據本發明第一、第二和第三個方面中任一方面的方法在控制包含梭菌神經毒素的樣品效價中的應用。在一個實施方案中，樣品是貯存的樣品。在一個實施方案中，樣品是凍幹樣品，或重組樣品。在另一個方面中，本發明涉及根據本發明第一個方面的方法在參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度測定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度中的應用；或在參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價測定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價中的應用，例如，梭菌神經毒素生產過程中的質量控制。與現有技術中應用細胞培養物的已知方法相比，根據本發明的方法定量梭菌肉毒神經毒素的生物活性的準確度和精確度明顯提高。本發明的方法可滿足管理要求。已發現，應用本文公開的方法，可將現有技術中觀察到的應用細胞培養物定量的 變化明顯減少至微小程度。在一個實施方案中，本發明涉及測定梭菌神經毒素對細胞培養物誘導的效果的方法，包括(a)使細胞培養物與包含所述梭菌神經毒素的樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述細胞培養物誘導的效果。其中，步驟(C)在不含所述樣品的情況下進行。術語「使細胞培養物與所述樣品(根據本發明另一個方面的方法，樣品可以為第一或第二樣品)接觸」是指在所述接觸中所述細胞培養物接收所述樣品中至少部分所述神經毒素，即，包含於所述樣品的至少部分神經毒素與細胞培養物的所述細胞中含有的合適受體結合。術語「在不含樣品的情況下」是指在介質中中測定步驟(C)中的效果，所述介質通常為合適的緩衝液，其包含10wt%或更少的樣品，例如不含任何樣品或換句話說不含任何樣品的神經毒素。在一個實施方案中，所述細胞培養不是連續地，而僅僅是短暫地，暴露於(接觸)包含梭菌神經毒素的樣品(根據本發明另一個方面的方法，其可以為第一或第二樣品)。這是指將所述細胞培養物暴露於神經毒素預定時間，即步驟(a)中進行接觸以使所述細胞培養物對暴露產生響應，然後在不含所述樣品(根據本發明其它方面的方法，可以為所述第一或第二樣品)的情況下應用以下描述的方法相應地測定效果(根據本發明其它方面的方法，分別為第一或第二效果)。在一個實施方案中，在所述測定之前，將所述細胞培養物從含有所述樣品的浴(bath)中移除，轉入如下所述的不含神經毒素成分的浴中。之後，測定效果強度(當樣品為第一或第二樣品時，其可以為第一或第二效果)，即對效果進行定量。這是指在含有接收的神經毒素的細胞培養物中產生了對所述刺激的響應。在另一個實施方案中，含有神經毒素的成分，即樣品(可以為第一或第二樣品)被不含神經毒素的成分替換。在一個實施方案中，通過例如傾出將樣品從細胞培養物中移除，並被如下所述的不含神經毒素的成分替換。替換之後，測定效果強度(當樣品為第一或第二樣品時，其可以為第一或第二效果)。術語「梭菌神經毒素(或梭菌毒素)」包含梭菌毒素複合物和高純度神經毒素，即不含任何其它梭菌蛋白的神經毒素製劑。
在一個實施方案中，所述梭菌神經毒素是肉毒神經毒素。在另一個實施方案中，所述肉毒神經毒素選自A、B、C、D、E、F和G血清型。術語「肉毒毒素複合物」包括與至少另一個非毒素蛋白有關的肉毒毒素。明顯地，本文所用術語肉毒毒素複合物包含450kDa和900kDa的肉毒毒素複合物，其例如可從肉毒桿菌的培養物中得到。以A型肉毒毒素複合物為基礎的製劑可市售獲得，例如易普森公司(Dysport )或愛力根公司(Botox )。以B型肉毒複合物為基礎的另一製劑可從SolsticeNeurosciences公司(MyoblocR)儀得。不包含其它任何梭菌蛋白的高純度A型神經毒素
由梅爾茨製藥公司(Xeomin )提供。這是 改善一些類型局部肌張力障礙的首選藥物。在另一個實施方案中，所述肉毒神經毒素是A、B、C、D、E、F和G血清型經化學或遺傳修飾的衍生物。所述神經毒素經化學修飾的衍生物是指經丙酮酸化、磷酸化、硫酸化、脂化和/或糖基化修飾的衍生物。所述神經毒素經遺傳修飾的衍生物是指通過缺失、添加或替換所述血清型蛋白中含有的一個或多個胺基酸進行修飾的衍生物。這種經修飾的毒素優選具有生物活性。具有生物活性的毒素是能夠被細胞吸收的毒素，由此可通過蛋白水解切割一個或多個多肽，例如SNARE複合物中的SNAP25。可通過測定和定量蛋白水解切割的多肽例如SNAP25的濃度，計算所用毒素的濃度或效價。在一個實施方案中，根據本發明的三個方面的任一種方法，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測定前，使所述細胞培養物暴露於(接觸)所述梭菌毒素5. 0-45小時，或15-40小時，或25-35小時。在另一個實施方案中，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測定前和所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸後，使所述細胞培養物與不包含梭菌毒素的水介質接觸0. 5-100小時，或1-95小時，或6-90小時，或7_80小時，或8-70小時，或9-60小時，或10-50小時，或11-50小時，或12-40小時，或15-40小時。術語「水介質」定義為含水的液體或流體。在一個實施方案中，所述水介質是緩衝液。在一個實施方案中，所述緩衝液是中性緩衝液。術語「中性」包括pH範圍為6-8，或 6. 5-7. 5，或約 7。在一個實施方案中，所述緩衝液是磷酸鹽緩衝液。在一個實施方案中，所述水介質的溫度是20_40°C，或25_40°C，或30_40°C。在一個實施方案中，溫度是約37 °C。在一個實施方案中，在所述步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)中的所述測定前和所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)中的接觸後，裂解細胞培養物。術語「裂解」是例如通過危害其完整的病毒、酶或滲透機制破壞細胞。含有裂解的細胞成分的液體稱為「裂解物」。例如，裂解物可用於Western和Southern印跡,分別分析單獨的或作為複合物的特定蛋白、脂質和核苷酸的組分。裂解中，可使用公知的裂解緩衝液。在另一個實施方案中，在所述步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)的接觸之前，裂解細胞培養物。令人驚奇的是，已經發現，將所述細胞培養物在包含神經毒素的樣品中暴露過或接觸後，與不包含梭菌肉毒神經毒素的水介質接觸，隨後在不含所述樣品的情況下測定所述效果，各自的劑量響應曲線發生位移，從而本發明方法的靈敏度明顯增力口。尤其在所述樣品中以LD5tl小鼠單位/ml表示的低濃度的所述梭菌神經毒素下，靈敏度增加。例如，通過確定從SNARE複合物切割的蛋白如SNAP25，分別作為響應、效果，該方法產生的優點是方法的靈敏度增加，尤其適用於較低濃度神經毒素的區域。如果在較低濃度下確定效價，神經毒素通常會顯示最大的差異，而在相當高濃度下，效價會彼此趨於一致。靈敏度的增加可以更精確和更可靠地分析各自的劑量響應曲線。反過來可使用相 對少量的實驗動物，例如為實施本發明的任一種方法而不得不被處死的小鼠。因此，本發明的實施方案不僅是技術方面，而且在倫理方面具有進步。本文使用的術語「靈敏度」是指生理學中普遍使用的含義，即它定義了細胞培養物對外部刺激響應的能力。本文中，通過使細胞培養物與梭菌神經毒素接觸來進行外部刺激。在發明的範圍內可選擇一定濃度範圍，例如相對較低濃度的梭菌神經毒素濃度範圍，其中所述靈敏度是增加的，即可以確定響應，否則不能確定則只能在非容忍偏差內分別確定。在另一個實施方案中，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，測定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度的方法，該方法包括(a)使細胞培養物與第二樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述細胞培養物誘導的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測定的所述第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使細胞培養物與所述第一樣品接觸；(h)測定對所述細胞培養物誘導的第一效果；(k)確認出所述第一效果與第二效果相同時的濃度；(I) (k)中所述濃度等於所述未知濃度。其中，步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。因此，在一個實施方案中，在不含所述第二和/或第一樣品的情況下，確定第二和/或第一效果。這是指在步驟(a)和/或步驟(f)之後，分別從第一和/或第二樣品中移除所述細胞培養物，從上述的細胞培養物中移除第二和/或第一樣品。術語「確認出所述第一效果與第二效果相同時的濃度」(步驟(k)和(I))是指所述第一和第二效果在性質上和數量上相同，即所述誘導效果是例如蛋白或多肽的裂解物如SNARE複合物的SNAP25，所述效果有相同的測量值。在一個實施方案中，為了能夠獲得可靠的比較結果，細胞培養物分別暴露於第二和第一樣品中神經毒素的時間應該具有可比性。在一個實施方案中，所述暴露時間相同。在一個實施方案中，步驟(e)中所述記錄測得的第二效果是通過測定所述第二樣品中不同濃度的梭菌神經毒素的第二效果，並繪製測得的所述第二效果對應於濃度的曲線，從而記錄校準曲線來進行的。如上所述，如果所述第二樣品對所述肌肉組織誘導的效果是基於以小鼠LD5tl單位/ml表示的不同濃度確定的，那麼可獲得校準曲線。例如，可在選擇的濃度範圍內以IOLD5tl單位/ml或5LD5(I單位/ml的步驟確定所述誘導的效果。因此，根據步驟(e)中記錄的第二數據集，繪製校準曲線，通過該校準曲線，根據步驟(k)及後面的步驟(I)確認出所述第一樣品中所述梭菌神經毒素的未知濃度。 在一個實施方案中，繪製生成的校準曲線，依據步驟(k)-(l)，通過圖形分析完成確認和等於的步驟。所述第一樣品的未知濃度可由校準曲線上與所述第一和第二效果具有相同值的濃度來確定，例如，產生的SNAP25的濃度相同，根據步驟(I)所述濃度等於所述未知濃度。所述確定的前提是第一樣品中未知濃度的梭菌毒素對細胞培養物產生效果，其可通過所述校準曲線進行定量。本領域技術人員容易理解，必要時可對未知濃度的第一樣品稀釋或濃縮一次或多次，從而使達到的濃度範圍可與第二樣品進行比較，即達到相同的第一和第二效果。然後，已知稀釋或濃縮係數，可通過計算來確定未稀釋或未濃縮的第一樣品中初始存在的神經毒素的濃度。在另一個實施方案中，所述確認和等於不是通過步驟(h)和後面的步驟(k)和(I)中僅一個濃度的單點測量，而是通過多個不同濃度的測量進行的。鑑於管理機構的要求，這一點尤為重要。根據本發明的另一實施方案，最好優化濃度範圍以使所述第二和第一樣品能夠進行可靠的比較。這不僅適用於迄今已知的和商業化的梭菌神經毒素製劑的生物效力的可比性，也適用於未來開發的或正在開發的製劑。在一個實施方案中，為了優化以小鼠LD5tl單位/ml表示的濃度範圍，從而使所述第二和第一樣品能夠進行可靠的比較，最好首先確定步驟(e)和/或步驟(h)中記錄的校準曲線的標準差。運用合適的逐步回歸分析，可生成回歸模型，以基於劑量響應曲線預測未知毒素樣品的效價。採用這種方法，可確認代表兩個不同數據群體的第一和第二樣品的濃度範圍，其中各自的劑量響應曲線之間的相關性達到最大值，即確定為最佳擬合。在一個實施方案中，分別通過預定的回歸模型，以擬合曲線表示第一和第二樣品的各自數據集的數值範圍，以及在預定的置信區間分別線性化和平行化所述擬合曲線，可進一步精確所述檢驗。因此，根據第三個方面，本發明涉及參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價的方法，該方法包括(a)使細胞培養物與第二樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述細胞培養物誘導的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測定的所述第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使細胞培養物與所述第一樣品接觸；
(h)測定步驟(g)中獲得的對所述細胞培養物誘導的第一效果；(i)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對應濃度下測定的所述第一效果，從而記錄第一數據集；其中，步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。在一個實施方案中，該方法進一步包括步驟(m)和(n)(m)從最佳擬合於第一和第二數據集的濃度範圍選擇所述不同濃度；(n)通過統計學檢驗確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(a )_( S ):(a)以擬合曲線表示出步驟(e)得到的第二數據集的數值範圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)得到的第一數據集的數值範圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在一個實施方案中，在不含所述第二和/或第一樣品的情況下，確定第二和/或第
一效果。在另一個實施方案中，在不含所述第二和/或第一樣品的情況下，測定效果。這是指在步驟(a)和/或步驟(f)之後，分別從第一和/或第二樣品中移除所述細胞培養物，或從細胞培養物中移除第二和/或第一樣品。適合處理上述數序列的統計學檢驗是已知的，例如可能性-商-檢驗。所述可能性-商-檢驗的實例是已知的F-檢驗。也可運用例如X2-檢驗(卡方檢驗或X2-分布-檢驗)或t-檢驗。所述檢驗是本領域公知的。在一個實施方案中，所述統計學檢驗是F-檢驗。通過所述檢驗，可確定在預定置信區間內，取自兩個不同群體的兩個隨機樣本相對於其方差是否有本質不同。因此，這種檢驗用於檢驗兩個統計學樣本的差異，本文指第二和第一樣品的差異。在一個實施方案中，為了得到可靠結果，置信區間很寬。例如，誤拒絕概率相對較低。在一個實施方案中，誤拒絕概率< 5 (以％表示；(或0. 05))，置信區間彡95 (以％表示；(或0. 95))。在一個實施方案中，每個子步驟(ci)-(S)的誤拒絕概率彡5 (以％表示)。在一個實施方案中，步驟U)中的線性化是通過以最佳擬合直線表示各自數據集進行的。在一個實施方案中，步驟(S)中的平行化是通過確定最佳擬合直線的共同斜率來進行。步驟(S )之後，根據所述線性擬合曲線和所述平行擬合曲線彼此的相對位移確定第一樣品和第二樣品的相對效價。因此，在一個實施方案中，該方法在步驟(5 )之後進一步包括步驟(e ):( e )根據所述線性擬合曲線和所述平行擬合曲線彼此間的相對位移計算出第一樣品相對於第二樣品的相對效價。在一個實施方案中，術語「相對效價」是指在相同濃度下，分別在來自各自線性化和平行化的擬合曲線的相同濃度下，確定第一樣品相對於第二樣品的效價。
在一個實施方案中，第二樣品的效價等於100%，則第一樣品的相對效價以％方式表示。例如，相對於第二樣品，第一樣品獲得了例如110%或90%的效價。應用三分律即比例運算法(the rule of three),通過分別稀釋具有110%效價的第一樣品至100%效價,獲得目前未知的第一樣品中梭菌神經毒素的有效濃度。測定單位變為相對效價，數值表示為活性單位(效價)，所述活性單位以參考標準(第二樣品)的活性(效價)定義。在另一個實施方案中，相對效價表示為第一和第二樣品的效價的比值。在一個實施方案中，上述模型用於預測所用神經毒素劑量的對數值。在另一個實施方案中，刺激效果的量和樣品中神經毒素劑量的量均以對數值記錄。在一個實施方案中，分別在第二樣品和第一樣品中至少三個不同濃度的梭菌神經毒素下，分別測定第二效果和第一效果。 在一個實施方案中，所述數據集的所述記錄，各自校準曲線的所述記錄，各自的校準曲線分別以半對數圖的形式表示。在另一個實施方案中，以雙對數圖表示。確定相對效價的方法記錄在歐洲藥典。在一個實施方案中，以如10小鼠LD5tl單位/ml為起始濃度，確定相對效價的方法適用於整個數據集的範圍。之後，以大於10小鼠LD5tl單位/ml的值為起點，例如11、12、13、14、15、16、17小鼠LD5tl單位/ml。進行迭代直至所用模型達到期望和要求的精度。在一個實施方案中，一旦通過統計學檢驗確定了最佳擬合及濃度範圍，任何含有未知濃度(對應於有效濃度)梭菌神經毒素的第一樣品可與根據本發明方法確定的在所述濃度範圍內的第二樣品中所述梭菌神經毒素的已知濃度進行比較。在一個實施方案中，通過繪製所述第二效果對應於濃度的曲線記錄所述測定的第二效果，通過記錄校準曲線記錄所述第二數據集。相對效價評價的應用，以及檢測中包含參考標準(第二樣品)，可形成更精確且更具重現性的評價，為減少動物的使用提供了機會。統計學檢驗通常通過合適的電腦程式和合適的計算機執行。在一個實施方案中，所述統計學檢驗採用合適的包含用以實施所述統計學檢驗的合適軟體工具的電腦程式來進行。因此，在一個實施方案中，本發明涉及電腦程式產品，其包括包含用於實施本發明的方法的軟體工具的電腦程式。在一個實施方案中，所述第二樣品選自可市售獲得的和註冊的肉毒毒素製劑。因這些產品已註冊並可分別用於藥物製劑和藥劑，它們分別包含明確限定的量和肉毒毒素濃度。在另一個實施方案中，任何在標準條件下生產的肉毒毒素製劑均可使用。在一個實施方案中，上述提及的市售製劑可用作第二樣品。因此，第二樣品可以為XeominJ\ BotoxK ^ DysportR, Myob丨ocK或PurToxA。這些製劑所用的肉毒毒素類
型或生物效力/活性即效價不同，例如肉毒神經毒素的濃度或其所包含的肉毒類型不同。以小鼠LD5tl表示的小鼠單位為定義樣品中所含梭菌神經毒素濃度的常用單位。LD5tl值表示將所述的量施用於小鼠群體的小鼠時，導致50%小鼠群體死亡的致死劑量。確定所述值的方法對本領域技術人員來說是公知的。該方法記載於歐洲藥典中。已知，在基於肉毒神經毒素產品上標記的LD5tl單位有產品特異性，生產商特異性，由於缺少標準不能互換。
在一個實施方案中，本文涉及的LD5tl單位是表徵和標UXeominx時確定的單位，例如第二樣品是Xeominsi。相應地，涉及特定效果的單位是Xeomin 單位。因此，本發明的檢測系統可用於比較評價包含梭菌神經毒素的任何樣品相對於Xeomin 的效價。該方法可直接將含有梭菌神經毒素(未知濃度)的第一樣品以Xeomin 單位進行比較。 Xeomin 和Botox 具有大致相當的效力或效價。為了得到與Xeomin w和Botox 相同的效力或效價，需分別應用約2. 5倍量的DyspoiI^P 10倍量的Myobloc'在一個實施方案中，這些市售獲得的製劑被稀釋或濃縮成其中包括的梭菌神經毒素的預定濃度，根據所述第二樣品中所述梭菌神經毒素的不同濃度來測定所述第二效果。繪製測定的效果對應於肉毒毒素濃度的曲線，從而記錄校準曲線。分別用所述第二數據集，所述校準曲線，可確定第一樣品中肉毒神經毒素的未知濃度。已發現，以至少10的小鼠LD5tl單位/ml表示樣品(可為第一或第二樣品)中肉毒神經毒素的濃度，可有利地應用本發明的方法。須指出，本應用中給出的濃度均為小鼠LD5tl單位/ml。在一個實施方案中，除了神經毒素外，樣品還包括水。在一個實施方案中，樣品包括於水中的神經毒素的溶液或懸浮劑。在一個實施方案中，所述樣品中神經毒素的所述濃度至少是15。在另一個實施方案中，所述濃度至少是20。在另一個實施方案中，所述濃度是10-1000。在一個實施方案中，濃度是10-70。在另一個實施方案中，濃度是15-60。在另一個實施方案中，濃度是20-45。在一個實施方案中，第二樣品足Xeomin 。在一個實施方案中，發現Xeomin'R作為第二樣品時，如果以10-70之間的至少一個濃度確定第二效果，可得到特別可靠的結果。在另一個實施方案中，濃度是15-60。在另一個實施方案中，濃度是25-45。在一個實施方案中，發現Botox#作為第二樣品時，如果以10-70之間的至少一個
濃度確定第二效果，可得到可靠的結果。在另一個實施方案中，濃度是15-60。在另一個實施方案中，濃度是25-45。根據步驟(e)，如果用第二樣品確定校準曲線，與Xeomin 或Botox 相比，第二樣品具有更低濃度的或含有更低肉毒神經毒素效力或效價，為達到與Xeomin 或Botox 誘導效果具有可比性的第二效果的強度需要較高濃度的神經毒素，即較高的LD5tl單位/ml值。在一個實施方案中，其中第二樣品比Xeomin 或Botox 具有更低的肉毒神經毒素的濃度或效價，以20-400或100-800之間的至少一個濃度確定第二效果。
在一個實施方案中，其中第二樣品為Dysport ，以20-400，或25-300，或30-250
之間的至少一個濃度確定第二效果。在另一個實施方案中，其中第二樣品是Myoblock',以100-800，或150-700，或200-600之間的至少一個濃度確定第二效果。在另一個實施方案中，濃度範圍可以為30-600，或30-400，或30-200，或30-100，或 30-80，或 40-500，或 40-400，或 40-300，或 40-200，或 40-100，或 40-90，或 50-300，或50-200，或50-100，或60-100，取決於與Xeomin 或Botox 相比，第二樣品中神經毒素的
效力或效價的濃度。在一個實施方案中，LD5tl單位是Xeomin 單位。在一個實施方案中，由於所述細胞培養物檢測的可靠性，其可符合管理機構的認證要求和滿足施用肉毒毒素如血清型A或血清型C或血清型E的安全性和有效性的需要。在又一個實施方案中，第一樣品中所述梭菌毒素與所述第二樣品中所述梭菌毒素是相同的梭菌毒素。在又一個實施方案中，所述第一樣品中所述梭菌毒素或神經毒素與所述第二樣品中所述梭菌毒素或神經毒素是彼此不同的。為了在實驗上實現本方法，通常使用對暴露於肉毒毒素有響應的細胞培養物，SP肉毒毒素對細胞培養物產生效果，如在SNARE複合物中蛋白或多肽裂解物。術語「細胞培養物」包括在有機體外的控制條件下生長的細胞。在一個實施方案中，術語「細胞培養物」是指培養的源自多細胞真核生物的細胞，尤其是動物細胞。然而，該術語也包含植物、真菌和微生物包括病毒、細菌和原生生物的細胞培養物。培養細胞的方法在本領域是公知的。在一個實施方案中，細胞可從組織分離用於體外培養。在一個實施方案中，將組織塊置於生長培養基，生長出的細胞用於進行培養。在另一個實施方案中，通過用破壞細胞外基質的酶例如膠原酶、胰蛋白酶或鏈黴蛋白酶進行酶消化從軟組織中純化細胞。如果使用永久性細胞系，那麼通常這種細胞系通過隨機突變或有意的(deliberate)修飾而具有無限增殖能力。細胞可在懸浮液貼壁培養物中生長。根據細胞類型，細胞可以不粘附到表面上而在懸浮液中自然存活。粘附細胞需要表面，例如組織培養塑料或微載體(micocarrier),其被細胞外基質成分包被以增加粘附性能,並提供生長和分化所需的其它信號。在一個實施方案中，為使本發明的方法可在實驗中實現，細胞可在合適的溫度和混合氣體中生長和維持，例如在37°C、5% CO2的細胞培養箱中。每種細胞類型的培養條件都有很大不同，條件的變化對特定細胞類型會導致表達的表型不同。除了溫度和混合氣體，培養體系中最普遍的變化因素是生長培養基。生長培養基配方的PH值、葡萄糖濃度、生長因子和其它營養物等可以不同。本領域技術人員熟知培養細胞的不同種類。收穫後，可將細胞培養物用於本發明中的任一種方法。在一個實施方案中，細胞選自神經細胞系或原代神經細胞培養物。術語「細胞系」包括無限增殖的細胞類型。術語「原代細胞」包括從組織中直接獲得的非永久細胞系。、
在一個實施方案中，細胞培養物的細胞包括脊髓神經細胞。在一個實施方案中，細胞培養物的細胞如脊髓神經細胞從齧齒動物中獲得。在一個實施方案中，細胞培養物的細胞為小鼠脊髓神經細胞或大鼠脊髓神經細胞。在一個實施方案中，現有技術部分(見Pellet，S.等；Keller，J.E.等)所用的細胞培養物可用於本發明目的。根據一個方面，本發明還提供確定濃度範圍的改進方法，其中在預定的置信區間或誤拒絕概率內，可以確定包含梭菌神經 毒素的第一樣品相對於包含梭菌神經毒素的第二樣品的效價。在一個實施方案中，提供可在確認的濃度範圍內確定包含梭菌神經毒素的第一樣品相對於包含梭菌神經毒素的第二樣品的效價的方法，該方法包括以下步驟(a)使細胞培養物與第二樣品接觸；(c)測定所述神經毒素對所述細胞培養物誘導的第二效果；(d)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(a)-(c)；(e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測定的所述第二效果，從而記錄第二數據集；(f)使細胞培養物與所述第一樣品接觸；(h)測定所述神經毒誘導對所述細胞培養物誘導的第一效果；(i)在不同濃度的所述梭菌神經毒素下重複步驟(f)-(h)；(j)記錄步驟(i)中在對應濃度下測定的所述第一效果，從而記錄第一數據集；其中，所用濃度選自最佳擬合於第一和第二數據集的濃度範圍，其中通過包括以下子步驟(a ) - ( S )的統計學檢驗測定所述最佳擬合(a)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數據集的數值範圍；(￠)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數據集的數值範圍；( y )分別線性化所述擬合曲線；( 6 )平行化所述線性化的擬合曲線。在所述實施方案中，所述第二和所述第一效果性質上相同。為精確此方法，可將上述描述的方法與根據本發明第三方面的方法結合使用。在本發明的又一個方面中，本發明的方法可有利地用於質量控制，即包含梭菌神經毒素的樣品相對於生產過程中要求的參考標準的效價。因此，在所述的方面中，本發明涉及本發明方法在質量控制中的應用，即包含梭菌神經毒素的樣品的效價。在一個實施方案中，確定忙存樣品的效價。在一個實施方案中，樣品已忙存至少一小時，或至少一天。在一個實施方案中，樣品是凍幹樣品，或重組樣品。根據另一個方面，本發明涉及根據本發明第一個方面的方法，在參照第二樣品中已知濃度的梭菌神經毒素確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度中的應用；或在參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價確定第一樣品中梭菌神經毒素相對效價中的應用。根據又一方面，本發明涉及在本發明任一方法中，細胞培養物尤其是含有脊髓神經細胞如來自於大鼠或小鼠的細胞的細胞培養物，在確定梭菌活性中的應用。以下實施方案也屬於本發明，應當理解上述的實施方案反之可用於以下列出的方法中。圖I顯示以分鐘表示的麻痺時間(達到偏側膈初始收縮力一半時所需的時間)對應於以器官浴中小鼠LD5tl單位表示的肉毒神經毒素NT濃度(半對數量級)的曲線圖。曲線■表示樣品，其中在神經毒素存下測定誘導效果，以及曲線 表示樣品，其中組織已在包含神經毒素的樣品中暴露15分鐘。隨後，將肌肉組織從浴(bath)中移除，樣品被不含神經毒素的組分取代。進行電刺激後，測定誘導效果。曲線表示根據本發明的方法測定的擬合線。實施例I製備小鼠偏側膈，並加入到盛有厄爾平衡鹽緩衝液(Earle' s Balanced SaltSolution)的器官浴中，用於標準的測定。在偏側膈的膈神經上安裝鉬電極，通過鉬電極對神經進行電刺激，隨後對偏側膈收縮產生影響。將偏側膈夾在器官浴中。在夾持過程中，關閉刺激，但夾緊後立即開啟。選擇刺激的電流強度，從而使膈肌的收縮力可被測定。在可測定持續的收縮力之後，將介質更換為含有肉毒神經毒素的介質。針對每個濃度(每個濃度 至少數次)測定達到所述收縮力一半時所需的時間(麻痺時間)，並繪製其對應於所述器官浴中添加的肉毒神經毒素的濃度的曲線。
權利要求
1.測定梭菌神經毒素對細胞培養物誘導的效果的方法，包括 (a)使細胞培養物與含有所述梭菌神經毒素的樣品接觸； (C)測定所述梭菌神經毒素對所述細胞培養物誘導的效果； 其中步驟(C)在不含所述樣品的情況下進行；以及 在步驟(C)所述測定之前，且在步驟(a)所述接觸之後，使所述細胞培養物與不含梭菌毒素的水介質接觸O. 5-100h。
2.根據權利要求I所述的方法，參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度，該方法包括 (a)使細胞培養物與所述第二樣品接觸； (C)測定所述神經毒素對所述細胞培養物誘導的第二效果； (d)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(a)-(c)； (e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集； (f)使細胞培養物與所述第一樣品接觸； (h)測定對所述細胞培養物誘導的第一效果； (k)確認出所述第一和第二效果相同的濃度； (I) (k)中所述濃度等於所述未知濃度； 其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行；以及在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)測定之前，且在步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)所述接觸之後，使所述細胞培養物與不含梭菌毒素的水介質接觸O.5-100h。
3.根據權利要求I所述的方法，參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價，該方法包括 (a)使細胞培養物與所述第二樣品接觸； (C)測定所述神經毒素對所述細胞培養物誘導的第二效果； (d)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(a)-(c)； (e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集； (f)使細胞培養物與所述第一樣品接觸； (h)測定對所述細胞培養物誘導的第一效果； (i)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(f)-(h)； (j)記錄步驟(i)中在對應濃度下測得的第一效果，從而記錄第一數據集；其中步驟(c)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行；以及在步驟(C)或步驟(h)或者步驟(C)和步驟(h)測定之前，且在步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)所述接觸之後，使所述細胞培養物與不含梭菌毒素的水介質接觸O.5-100h。
4.根據權利要求3所述的方法，進ー步包括步驟(m)和(η) (m)從最佳擬合於第一和第二數據集的濃度範圍中選擇所述不同濃度； (η)根據統計學檢驗確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(α)-(δ) (α)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數據集的數值範圍； (β)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數據集的數值範圍；(Y)分別線性化所述擬合曲線； (δ )平行化所述線性化的擬合曲線。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述統計學檢驗為F-檢驗，或\2_檢驗，或卜檢驗。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其中每個子步驟(α)-(δ)的誤拒絕概率為≤5 (以％表不)。
7.根據權利要求3-6任一項所述的方法，進一步包括步驟(ε) (ε )根據所述線性化的擬合曲線和所述平行化的擬合曲線彼此的相對位移，計算第一樣品相對於第二樣品的相對效價。
8.根據權利要求1-7任一項所述的方法，其中所述效果是蛋白從SNARE複合體的裂解。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述蛋白為SNAP25。
10.根據權利要求1-9任一項所述的方法，其中在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測定之前，使所述細胞培養物與所述梭菌毒素接觸5-45h，或15-40h，或.25-35h。
11.根據權利要求1-10任一項所述的方法，其中在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測定之前，且在步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)所述接觸之後，使所述細胞培養物與不含梭菌毒素的水介質接觸O. 5-100h,或l-95h，或6-90h，或7_80h，或 8-70h，或 9-60h，或 10_50h，或 ll_50h，或 12_40h，或 15_40h。
12.根據權利要求1-11任一項所述的方法，其中在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測定之前，且在步驟(a)或步驟(f)或者步驟(a)和步驟(f)所述接觸之後，對所述細胞培養物進行裂解。
13.根據權利要求1-12任一項所述的方法,其中所述測定採用Western-Blot分析或ELISA進行。
14.根據權利要求1-13任一項所述的方法，其中所述細胞培養物選自神經細胞系或初級神經細胞的細胞培養物。
15.根據權利要求2-14任一項所述的方法，其中所述記錄測得的第二效果是通過繪製所述第二效果對應於濃度的曲線進行的，且記錄所述第二數據集是通過記錄校準曲線進行的。
16.根據權利要求2-15任一項所述的方法，其中所述第二效果是在至少為10的以小鼠LD50單位/ml所表示的至少一個濃度下確定的。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述濃度為10-1000，或10-70，或15-60，或.20-45。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述濃度為20-400，或為100-800。
19.根據權利要求16-18任一項所述的方法,其中所述小鼠LD5tl單位為Xeomin 單位。
20.根據權利要求1-19任一項所述的方法，其中所述梭菌神經毒素為肉毒毒素。
21.電腦程式產品，其包括包含用於實施權利要求3-20任一項所述方法的軟體工具的電腦程式。
22.權利要求1-20任一項所述的方法在控制含有梭菌神經毒素的樣品效價中的應用。
23.根據權利要求22所述的應用，其中所述樣品為貯存的樣品。
24.根據權利要求22或23所述的應用，其中所述樣品為凍幹樣品或為重組樣品。
25.權利要求I所述的方法在例如梭菌神經毒素生產過程的質量控制中，在參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度中的應用；或在參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價中的應用。
26.測定梭菌神經毒素對肌肉組織誘導的效果的方法，包括 (a)使肌肉組織與含有所述梭菌神經毒素的樣品接觸； (C)測定所述梭菌神經毒素對所述肌肉組織誘導的效果； 其中步驟(C)在不含所述樣品的情況下進行。
27.根據權利要求26所述的方法，參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第ー樣品中梭菌神經毒素的未知濃度，該方法包括 (a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸； (C)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第二效果； (d)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(a)-(c)； (e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集； (f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸； (h)測定對所述肌肉組織誘導的第一效果； (k)確認出所述第一和第二效果相同的濃度； (I) (k)中所述濃度等於所述未知濃度； 其中步驟(C)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。
28.根據權利要求26所述的方法，參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價，該方法包括 (a)使肌肉組織與所述第二樣品接觸； (C)測定所述神經毒素對所述肌肉組織誘導的第二效果； (d)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(a)-(c)； (e)記錄步驟(d)中在對應濃度下測得的第二效果，從而記錄第二數據集； (f)使肌肉組織與所述第一樣品接觸； (h)測定對所述肌肉組織誘導的第一效果； (i)以不同濃度的所述梭菌神經毒素重複步驟(f)-(h)； (j)記錄步驟(i)中在對應濃度下測得的第一效果，從而記錄第一數據集； 其中步驟(c)和/或步驟(h)在不含所述第二和/或第一樣品的情況下進行。
29.權利要求28所述的方法，進ー步包括步驟(m)和(η) (m)從最佳擬合於第一和第二數據集的濃度範圍中選擇所述不同濃度； (η)根據統計學檢驗確定所述最佳擬合，其包括以下子步驟(α)-(δ) (α)以擬合曲線表示出步驟(e)中獲得的第二數據集的數值範圍； (β)以擬合曲線表示出步驟(j)中獲得的第一數據集的數值範圍； (Y)分別線性化所述擬合曲線； (δ )平行化所述線性化的擬合曲線。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述統計學檢驗為F-檢驗，或X2檢驗，或t-檢驗。
31.權利要求29或30所述的方法，其中每個子步驟(α)-(δ)的誤拒絕概率為^ 5 (以％表不)。
32.根據權利要求28-31任一項所述的方法，進一步包括步驟(ε): (ε )根據所述線性化的擬合曲線和所述平行化的擬合曲線彼此的相對位移，計算第一樣品相對於第二樣品的相對效價。
33.根據權利要求26-32任一項所述的方法，其中所述肌肉組織接受電刺激。
34.根據權利要求26-33任一項所述的方法，其中在步驟(a)之後包括步驟(b)，或在步驟(a)之後包括步驟(b)且在步驟(f)之後包括步驟(g)； (b)電刺激步驟(a)中獲得的所述肌肉組織； (g)電刺激步驟(f)中獲得的所述肌肉組織。
35.根據權利要求26-34任一項所述的方法，其中步驟(b)或(g)在不含第二或第一樣品的情況下進行，或其中步驟(b)和(g)在不含第二和第一樣品的情況下進行。
36.根據權利要求33-35任一項所述的方法，其中在步驟(c)或步驟(h)或者步驟(c)和步驟(h)所述測定之前，使所述肌肉組織暴露於所述梭菌毒素5-30min。
37.根據權利要求26-36任一項所述的方法，其中所述記錄測得的第二效果是通過繪製所述第二效果對應於濃度的曲線進行的，且記錄所述第二數據集是通過記錄校準曲線進行的。
38.根據權利要求27-37任一項所述的方法，其中所述第二效果是在至少為10的以小鼠LD5tl單位/ml所表示的至少一個濃度下確定的。
39.根據權利要求38所述的方法，其中所述濃度為10-1000，或10-70，或15-60，或20-45。
40.根據權利要求38所述的方法，其中所述濃度為20-400，或為100-800。
41.根據權利要求38-40任一項所述的方法,其中所述小鼠LD5tl單位為Xeomin 單位。
42.根據權利要求26-41任一項所述的方法，其中所述第一和第二效果選自下組所述肌肉組織的麻痺時間、所述肌肉組織收縮率的變化、所述肌肉組織收縮距離的變化、所述肌肉組織收縮力的變化、所述肌肉組織在終板電位或微型終板電位中的變化。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述第一和第二效果為麻痺時間。
44.根據權利要求26-43任一項所述的方法，其中所述肌肉組織選自肋間肌、後肢肌肉和後肢趾長伸肌、後爪蹠肌、膈神經偏側膈、耳長提肌、蛙神經肌接頭、雛雞頸二腹肌、肋骨肌肉、腦組織或海鰩的電器官。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述膈神經偏側膈來自大鼠或小鼠。
46.根據權利要求26-45任一項所述的方法，其中所述梭菌神經毒素為肉毒毒素。
47.根據權利要求26-46任一項所述的方法，其中所述電刺激在含有消泡劑的緩衝液 中進行。
48.電腦程式產品，其包括包含用於實施權利要求28-47任一項所述方法的軟體工具的電腦程式。
49.試劑盒，其包括 (A)-用於刺激已暴露於梭菌神經毒素的肌肉組織，以選擇所述神經毒素對肌肉組織誘導的效果的裝置； -用於測定並記錄所述效果的裝置；以及 (B)-權利要求48所述的電腦程式產品。
50.權利要求26-47任一項所述的方法在控制含有梭菌神經毒素的樣品效價中的應用。
51.根據權利要求50所述的應用，其中所述樣品為貯存的樣品。
52.根據權利要求50或51所述的應用，其中所述樣品為凍幹樣品或為重組樣品。
53.權利要求26所述的方法在參照第二樣品中梭菌神經毒素的已知濃度，確定第一樣品中梭菌神經毒素的未知濃度中的應用；或在參照第二樣品中梭菌神經毒素的效價，確定第一樣品中梭菌神經毒素的相對效價中的應用。
全文摘要
測定梭菌神經毒素對肌肉組織誘導的效果的方法，包括(a)使肌肉組織或細胞培養物與含有所述梭菌神經毒素的樣品接觸；(c)測定梭菌神經毒素對所述肌肉組織誘導的效果；其中步驟(c)在不含所述樣品的情況下進行。
文檔編號A61B5/0488GK102639054SQ201080052392
公開日2012年8月15日 申請日期2010年11月16日 優先權日2009年11月18日
發明者卡爾·海因茨·艾斯勒, 哈羅德·泰勒, 傑德·J·曼德, 馬丁·韋 申請人:梅斯製藥兩合股份有限公司