LINC01094在診治缺血性腦卒中的應用的製作方法
2023-10-11 05:20:34 1
本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及缺血性腦卒中的分子生物標誌物，更具體的涉及linc01094及其相關基因在診治缺血性腦卒中的應用。
背景技術：
長鏈非編碼rna(longnon-codingrna，lncrna)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼rna，根據其基因位置可分為五種類型：正義lncrna(senselncrna)、反義lncrna(antisenselncrna)、雙向lncrna(bidirectionallncrna)、基因內lncrna(introniclncrna)及基因間lncrna(intergeniclncrna)。未來，lncrna有望成為腫瘤診斷、治療和預後新的標誌物，同時也為腫瘤的治療提供了新的靶點。但是腦卒中後1ncrnas的表達變化如何，1ncrnas是否參與腦卒中的病程調控，目前尚不清楚。
腦卒中是一種嚴重危害人類健康和生命安全的腦血管疾病，具有發病率高、致殘率高和死亡率高等特點，數據顯示，我國每年新發腦卒中患者約200萬人，其中70％-80％的腦卒中患者因為殘疾不能獨立生活，給家庭帶來巨大的生活壓力和精神壓力，全國每年用於該病的治療費用高達100億元之多，給國家造成了沉重的經濟負擔。探求腦卒中的發病機制及有效提前預防和治療方法的研究愈顯重要。由血栓形成或栓子脫落導致的大腦主幹血管或其分支血管阻塞而引起的缺血性腦卒中約佔全部腦卒中的80％左右。尋找到有效的分子調控靶點，通過血液檢測早期診斷缺血性腦卒中會使患者獲益良多，用血液標誌早期診斷缺血性腦卒中將有望成為一個具有實際應用價值的輔助診斷方法。
本發明通過高通量測序檢測腦卒中和正常對照人群中mrna和1ncrnas的表達譜變化，運用生物信息學工具分析在腦卒中組差異表達的mrna和1ncrnas，篩選出候選基因linc01094，繼而採用rt-pcr實驗進行大樣本驗證和相關性分析以及初步的幹擾實驗，結果表明本發明挑選的linc01094與缺血性腦卒中密切相關，為臨床早期缺血性腦卒中分子檢測奠定基礎。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種防治腦卒中的試劑，所述試劑包含：
(a)抑制劑和/或抑制劑組合物，所述抑制劑和/或抑制劑組合物下調linc01094的轉錄和/或阻斷linc01094的活性；
(b)藥劑學上能接受的載體。
進一步的，所述腦卒中為缺血性腦卒中。
優選的，通過sirna、shrna、反義核酸等方法下調linc01094的轉錄和/或阻斷linc01094的活性。
優選的，所用sirna靶序列為seqidno.8和seqidno.11。
優選的，所用sirna序列為seqidno.9和seqidno.10；或seqidno.12和seqidno.13。
本發明的目的在於提供調控linc01094表達的製劑在製備防治腦卒中試劑中的應用。
進一步，防治腦卒中試劑包括下調linc01094的轉錄，或抑制linc01094活性的試劑。
本發明的目的在於提供一種腦卒中診斷製劑，該試劑檢測linc01094表達。
進一步，腦卒中診斷製劑能夠檢測腦卒中樣本中linc01094的轉錄或免疫檢測方法檢測腦卒中樣本中linc01094調控的基因的表達情況。
進一步的，所述腦卒中為缺血性腦卒中。
優選的，缺血性腦卒中樣本為外周血。
進一步，診斷缺血性腦卒中試劑包括基於高通量測序方法和/或基於定量pcr方法和/或基於探針雜交方法檢測缺血性腦卒中樣本中linc01094轉錄或基於免疫檢測方法檢測缺血性腦卒中樣本中linc01094調控的基因的表達情況。
優選的，基於定量pcr方法包括特異性擴增linc01094的引物，進一步優選，特異性擴增linc01094的引物序列為seqidno.1和seqidno.2；基於探針雜交方法包括與linc01094的核酸序列雜交的探針；免疫檢測方法包括與linc01094調控基因表達蛋白特異性結合的抗體。
本發明的目的在於提供上述腦卒中診斷製劑在製備腦卒中檢測工具中的應用。
本領域人員熟知，本發明提供的lncrna序列既可通過生物學方法獲得，又可通過化學合成方法獲得，若通過化學合成方法製備，只要將其核苷酸序列提供給有關專業公司，委託其合成即可。lncrna還可含有另外的或可替換的鹼基修飾體或取代體，如硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。與其90％以上同源的核苷酸序列也在本發明保護範圍之內。
本發明的目的在於提供一種診斷腦卒中生物製劑，該生物製劑檢測與linc01094表達相關的基因。
所述與linc01094表達相關的基因包括正相關基因和負相關基因。所述正相關基因為表達趨勢與loc105372881表達一致的基因，所述負相關基因為表達趨勢與loc105372881表達相反的基因。
進一步，正相關的基因為tesc、jazf1、nedd4l、eif3b、anp32b、rad23a、stradb、bckdk、ccny、ascc2、uts2或/和mmp17。
進一步，負相關的基因為kiaa1324l、mis18a、c1qtnf6、mterf2、map6d1、znf530、dnah1、cracr2a、ttc22和/或mib2。
優選的，與linc01094表達相關的基因為jazf1。
進一步，腦卒中為缺血性腦卒中。
進一步，診斷缺血性腦卒中生物製劑包括基於高通量測序方法和/或基於定量pcr方法和/或基於探針雜交方法檢測缺血性腦卒中樣本中與linc01094表達相關的基因轉錄或基於免疫檢測方法檢測缺血性腦卒中樣本中與linc01094表達相關的基因的表達情況。
優選的，缺血性腦卒中樣本為外周血。
優選的，基於定量pcr方法包括特異性擴增與linc01094表達相關的基因的引物，進一步優選，特異性擴增jazf1基因的引物序列為seqidno.3和seqidno.4；基於探針雜交方法包括與jazf1核酸序列雜交的探針；免疫檢測方法包括與jazf1基因表達蛋白特異性結合的抗體。
本發明的目的在於提供上述生物製劑在製備診斷腦卒中工具中的應用。
本發明的目的在於提供一種防治腦卒中的試劑，該試劑調控與linc01094表達相關的基因的表達。
進一步，腦卒中為缺血性腦卒中。
進一步，防治腦卒中試劑包括下調與linc01094表達正相關的基因的轉錄，或上調與linc01094表達負相關的基因的轉錄。
優選的，通過sirna、shrna、反義核酸等方法下調與linc01094表達正相關的基因的轉錄或通過構建過表達載體等方法上調與linc01094表達負相關的基因的轉錄。
本發明的目的在於提供上述防治腦卒中的試劑在製備腦卒中治療藥物中的應用。
定義：
在此所用的「同源的」是指兩個聚合分子之間(例如，兩個核酸分子如兩個dna分子之間)的亞單元序列相似性。當兩個分子中的亞單元位置都被相同的單體亞單元所佔據(例如，如果兩個dna分子的一個位置都被腺嘌呤所佔據)，則它們在那個位置上是同源的。兩個序列之間的同源性是相配的或同源的位置的數量的直接函數。例如，兩個化合物序列的10個位置中的5個是相配的或同源的，則兩個序列是50％同源的，如果10個位置中的9個是相配的或同源的，則兩個序列是90％同源的。
「診斷」表示對病理狀況的存在或特性進行檢測。診斷方法在敏感度和特異性上是有區別的。診斷方法的「靈敏度」是指被檢測為陽性的患病個體的百分比(「真陽性」的百分比)。方法未檢測到的患病個體是「假陰性」。在所述方法中，未患病的且被檢測為陰性的受試者被稱為「真陰性」。診斷方法中的「特異性」為1減去假陽性率的差值，其中「假陽性」率被定義為：無病卻並檢測為陽性的個體比例。雖然某一特定診斷方法不能夠為一種病狀提供權威性的診斷，但它足以提供作為輔助診斷的陽性指示方法。
現階段檢測lncrna的表達水平的方法主要包括基於高通量測序技術、基於核苷酸雜交和基於pcr的lncrna檢測方法。基於探針雜交技術的lncrna檢測方法是一種直接檢測法，不需要對樣本rna進行預擴增。
實時螢光定量pcr技術(real-timepcr，rt-pcr)
螢光檢測pcr儀可對整個pcr過程中擴增序列的累積速率繪製動態變化曲線。在反應混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴增產物某特定產量的pcr循環數(一般用特定閾值循環數ct來表達)越少。qrt-pcr具有特異性高、靈敏度好、快速簡單等多種優點。
高通量測序(high-throughputsequencing)又稱下一代測序技術(nextgenerationsequencing)是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條dna分子進行序列測定，極大提高了測序效率。這類大規模測序技術極大的提高了多個物種遺傳信息的解讀速度，為獲取所有lncrna的序列信息，解密lncrna圖譜提供了保證。同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細緻全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。高通量測序平臺的代表是羅氏公司(roche)的454測序儀(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因組分析儀(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid測序儀(abisolidsequencer)。
包含在本發明的藥劑學組合物的藥劑學上許可的載體為在製劑時通常利用的載體，該載體包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、澱粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素(cellulose)、水、糖漿、甲基纖維素(methylcellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂(stearicacidmagnesium)及礦物油(mineraloil)等，但並非局限於此。
本發明的藥劑學組合物除了上述成分以外還可以包含潤滑劑、溼潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學上許可的適合的載體和製劑詳細記載於雷明登氏藥學全書。
本發明的藥劑學組合物能通過口服或非口服進行給藥，作為非口服給藥時，能通過靜脈內注射，鼻腔內注射，局部注射，腦室內注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經皮給藥等方式進行給藥。
本發明的藥劑學組合物的適合的給藥劑量根據製劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態、食物、給藥時間、給藥途徑、排洩速度及反應靈敏性之類的因素而可以進行多種處方，通常，熟練的醫生能夠容易地決定及處方對所希望的治療或預防有效的給藥劑量。
本發明的藥劑學組合物根據本發明所屬技術領域的普通技術人員可以容易實施的方法，利用藥劑學上能接受的載體和/或賦形劑來進行製劑化，從而能夠以單位用量形態製備或者內裝在多容量容器內來製備。此時，劑型是油性或者水性介質中的溶液、懸浮液或乳化液形態，或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態，還可以包括分散劑或者穩定劑。
附圖說明
圖1是linc01094在腦卒中組和健康對照組相對表達情況圖
圖2是jazf1在腦卒中組和健康對照組相對表達情況圖
圖3是轉染後各組linc01094相對表達情況圖
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由權利要求及其等同物限定。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。
實施例1高通量測序及分析
lncrna是一類長度大於200nt的非編碼rna，測序實驗採用illuminatruseqtmrnasampleprepkit方法進行鏈特異文庫構建，包括：
提取總rna。從組織樣品中提取totalrna，利用nanodrop2000對所提rna的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。單次建庫要求rna總量5ug,濃度≥200ng/μl,od260/280介於1.8～2.2之間。
去除rrna。細胞內一部分(>24％)的長鏈非編碼rna都是缺少傳統polya尾的，因此採用去除rrna的方式建庫可以獲得更加全面的lncrna信息
片段化mrna。利用金屬離子，可以將mrna隨機斷裂成200bp左右的小片段。
反轉合成cdna。在逆轉錄酶的作用下，利用隨機引物，以mrna為模板反轉合成一鏈cdna，進行二鏈合成時，dntps試劑中用dutp代替dttp，使cdna第二鏈中鹼基包含a/u/c/g。
連接adaptor。鏈的cdna結構為粘性末端，加入endrepairmix將其補成平末端，隨後在3』末端加上一個a鹼基，用於連接y字形的接頭。
ung酶消化cdna二鏈。在pcr擴增前，用ung酶將cdna第二鏈消化，從而使文庫中僅包含cdna第一鏈。
illuminahiseq4000上機測序。
由於原始測序數據中會包含測序接頭序列、低質量讀段、n率較高序列及長度過短序列，這將嚴重影響後續組裝的質量。為保證後續的生物信息分析的準確性，首先對原始測序數據進行過濾，從而得到高質量的測序數據(cleandata)以保證後續分析的順利進行。
進一步，將質控後得到的高質量測序序列與指定的參考基因組比對，參考基因組版本是grch38。首先，tophat使用其內置軟體bowtie將高質量clean序列map到基因組上，這時所有參加mapping的序列將被分為兩組：一組為已map到基因組上，另一組為沒有map到基因組上。之後，tophat將這些map到基因組上的序列進行組裝，這時就可以認為這些連續的序列即為一組外顯子。同時，tophat會檢測到沒有map到基因組上的序列map至剪切位點的兩端。通常tophat所檢測的一對外顯子之間的距離為70bp～20kb之間的距離。如果小於70bp的話，tophat會認為這兩個外顯子可能屬於同一個外顯子，由於基因的表達量比較低，中間的部分沒有測到，因而形成了一個gap。通常採用默認參數運行軟體，同時根據實際情況，如測序數據量，基因組情況對參數做適當的調整。
最後，使用軟體cuffquant和cuffnorm用來進行表達量評估和標準化。cuffdiff利用tophat比對的結果，調用cufflinks計算每個基因/轉錄本的表達量。通常採用默認參數運行軟體，同時根據實際情況，如測序數據量，基因組情況對參數做適當的調整。顯著差異lncrna&mrna篩選條件：q-value＝6時，使用pearson相關係數法分析樣本間lncrna與蛋白編碼基因的相關性；採用pearson相關係數法分析樣本間lncrna與蛋白編碼基因的相關性，閾值使用0.9。
結果：linc01094在缺血性腦卒中組中上調表達顯著，tesc、jazf1、nedd4l、eif3b、anp32b、rad23a、stradb、bckdk、ccny、ascc2、uts2和mmp17基因在缺血性腦卒中組中也明顯表達上調，kiaa1324l、mis18a、c1qtnf6、mterf2、map6d1、znf530、dnah1、cracr2a、ttc22和mib2基因在缺血性腦卒中組中明顯表達下調，他們和linc01094具有很好的相關性。挑選jazf1基因進行相關性驗證。
實施例2大樣本驗證linc01094和jazf1基因
一、樣本採集
46例腦卒中患者及31例健康人群對照均來自醫院(2014年1月-2015年9月)，抽取他們的外周血，4000rpm離心分離血漿加trizoi試劑(l:3)並保持在-80℃直至進行rna提取。所有受試者均籤署了知情同意書。
二、實驗方法
2.1引物設計
linc01094擴增引物：
上遊引物：catacctgagccaacatacaat(seqidno.1)
下遊引物：taactgcctaactaacgatgaag(seqidno.2)
擴增長度：150bp。
jazf1基因擴增引物：
上遊引物：attgtattgcggtggtat(seqidno.3)
下遊引物：tgtgagttgatgtgttga(seqidno.4)
擴增長度：102bp。
2.2rna提取及反轉錄
1)解凍含trizoi試劑的血漿，震蕩後靜止5分鐘。
2)加氯仿(三氯甲烷0.2m1)，劇烈震蕩30秒，靜止15分鐘。
3)離心15分鐘(12000g，15分鐘、4℃)。
4)取上清，加異丙醇(0.5m1)劇烈震蕩，靜止10分鐘。
5)離心10分鐘(12000g，10分鐘，4℃)，然後棄上清。
6)加75％去汙乙醇1ml(無水乙醇用depc處理的去離子水配，無水乙醇：depc水＝3:1)。用震蕩器震蕩0.5分鐘。
7)離心5分鐘(7500g，4℃)棄上清，倒扣於衛生紙上片刻後正置5分鐘。
8)加5uldepc-h2o手掌離心機瞬時離心，60℃水浴10分鐘。
9)測濃度，用rna濃度測量儀器。
接著採用採用takara試劑盒primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)(貨號rr047a)對提取的總rna反轉錄合成第一鏈cdna。
2.3標準dna模板的製備
將逆轉錄反應得到的cdna進行常規pcr，反應體系和條件如下：10×extaqbuffer10μl，dntpmixture(各2.5mmol/l)4μl，sequenceno.3(10pmol)4μl，sequenceno.4(10pmol)4μl，cdna(0.1-2μg)5μl，extaqdna聚合酶0.5μl，雙蒸水補齊至100ul。反應條件為94℃預變性5min；94℃變性50s，50℃退火50s，72℃延伸50s，35cycles；最後72℃延伸10min。
取樣5μl，對pcr擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，進行切膠回收並純化(回收使用試劑盒：ez-10spincolumndnagelextractionkit)，將純化產物連接到pgm-t克隆載體，隨後轉化到dh5α感受態細胞中。通過序列為seqidno.3和seqidno.4的特異性引物篩選陽性克隆。陽性克隆擴增後提取質粒dna，質粒dna採用nanodropnd-1000核酸定量儀定量(nanodroptechnologies，wilmington，delaware)並做10倍系列稀釋作為標準品用於標準曲線的製備(標準dna模板濃度範圍在108-102copies/μl)。
2.4敏感性實驗
取重組質粒按比例稀釋為108、107、106、105、104、103、102個拷貝/μl，進行螢光定量pcr，以檢測為陽性的最低濃度為該方法的檢測靈敏度。本研究所建立的方法檢測範圍為108-102copies/μl，最小檢出濃度為100copies/μl。
2.2rt-pcr實驗
採用takarasybrpremixextaqtmⅱ(tiirnasehplus)螢光定量試劑盒(貨號rr820a)。50μlqrt-pcr反應體系包括：上遊引物(10μmol/l)2μl；下遊引物(10μmol/l)2μl；樣品cdna4μl；50×roxreferencedye1μl；2×sybrpremexextaqⅱ(tiirnasehplus)25μl，加離子水至50μl。儀器採用appliedbiosystems7300。螢光定量pcr程序：95℃30s預變性，接40個循環：95℃5s，60℃35s。
對qrt-pcr反應結果使用spssforwindows11.5軟體，相關數據採用χ2檢驗和fisher確切概率法進行處理，p＜0.05有統計學意義；qrt-pcr反應利用medcalc統計分析軟體來計算。
根據qrt-pcr的相對定量公式：2-δct×100％，比較linc01094和jazf1在缺血性腦卒中患者和健康人群中的表達水平。結果顯示qrt-pcr擴增結果穩定，其中linc01094在缺血性腦卒中患者組中較健康人群整體高表達，表達量約為健康人群的4倍(見圖1)，jazf1在缺血性腦卒中患者組中較健康人群整體高表達，表達量約為健康人群的1.8倍(見圖2)，以上結果說明在腫瘤組織中高表達。進一步分析發現，二者的相關係數r高達0.98。
實施例4rnai抑制linc01094表達
一、材料
sirna構建與合成
根據linc01094在genbank(ncbireferencesequence:nr_038303.1)中序列設計相應的sirna。設計後送往合成公司合成。
sirna的設計與合成：
設計3條rna幹擾靶序列(表1)，陰性對照由公司提供。
表1linc01094-sirna轉錄模板序列
二、實驗方法
(一)rna幹擾技術抑制hek293細胞中linc01094的表達
1、細胞分組及瞬時轉染
(1)細胞分組
c組：空白對照組；c1組：轉染非特異性的sirna組；s1，s2，s3組：轉染特異性的sirna組。
(2)轉染
按照lipofectaminetm2000transfectionreagent提供的步驟進行。
①轉染前24h，取對數生長期的細胞用胰酶消化並計數，用dmem培養基調整細胞濃度為1×105/ml，取2m1接種於六孔板，放置於37℃，5％co2培養箱中培養，在細胞達80％融合時用於轉染。在轉染前用不含血清的dmem培養基培養3-4h。
②配製轉染液體：
a液：250u1無血清培養基稀釋4.0ugdna，溫和混勻；
b液：250u1無血清培養基稀釋10u1lipofectamine，溫和混勻，室溫放置5min；
③轉染：a液與b液混合在一起，室溫保溫20min，直接將複合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。在co2培養箱中37℃保溫24-48h，6h後換液，加入含血清的培養基。
2、應用real-timepcr方法檢測轉染前後linc01094表達的變化
①標準曲線的構建：選取在50mi培養瓶中正常培養的hek293細胞1瓶，提取rna，測定rna濃度和純度，進行逆轉錄反應，將反應生成的dna模板十倍稀釋，得到相當於104-100copies/ul的dna模板，分別加入linc01094引物和內參引物，配製25u1反應體系，使用real-timepcr擴增儀，進行pcr擴增反應。得到linc01094和內參的標準曲線。
②real-timepcr方法檢測轉染前後linc01094表達的變化：提取各組細胞的rna，測定rna濃度和純度，進行逆轉錄反應，每組dna模板同時進行linc01094和內參的real-timepcr反應，實驗重複三次。
③對pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳。
三、實驗結果
應用real-timepcr方法構建linc01094和內參的標準曲線，相關係數分別為0.9937,0.9952，線性關係良好，符合要求。用雙標準曲線的方法比較各組linc01094的表達。空白對照組、非特異性轉染組基因的表達基本相似，差異無統計學意義。linc01094-sirna1、linc01094-sirna2、linc01094-sirna3三組轉染後均有抑制linc01094表達的作用，linc01094-sirna1和linc01094-sirna2的作用更明顯，抑制效率達65％和67％，而linc01094-sirna1的抑制作用為23％，與空白對照組、非特異性轉染組相比，差異有統計學意義，p<0.05(圖3)。
發明採用高通量測序篩選出腦卒中相關基因linc01094，結合分子細胞生物學實驗驗證，證實了linc01094與腦卒中具有很好的相關性。本發明為腦卒中臨床診療提供了新的靶標，具有很好的臨床應用前景。
sequencelisting
汕頭大學醫學院第一附屬醫院
linc01094在診治缺血性腦卒中的應用
13
patentinversion3.3
1
22
dna
人工序列
1
catacctgagccaacatacaat22
2
23
dna
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18
dna
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18
dna
人工序列
4
tgtgagttgatgtgttga18
5
23
dna
人工序列
5
ctcatcaataaaagattaaatta23
6
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rna
人工序列
6
auuuaaucuuuuauugaugag21
7
21
rna
人工序列
7
caucaauaaaagauuaaauua21
8
23
dna
人工序列
8
agcttttaaaattataaatatat23
9
21
rna
人工序列
9
auauuuauaauuuuaaaagcu21
10
21
rna
人工序列
10
cuuuuaaaauuauaaauauau21
11
23
dna
人工序列
11
tggcaatagcttttaaaattata23
12
21
rna
人工序列
12
uaauuuuaaaagcuauugcca21
13
21
rna
人工序列
13
gcaauagcuuuuaaaauuaua21