用於pcr的試劑和方法

2023-10-11 14:35:24

專利名稱：用於pcr的試劑和方法
用於PCR的試劑和方法相關專利申請的交叉引用本申請要求2009年3月12日提交的^iang的美國臨時專利申請No. 61/202, 565 的權益，該專利申請據此通過引用整體併入。領域提供了包括實時和端點均相聚合酶鏈反應(PCR)單重和多重擴增測定的核酸擴增反應和測定。背景對於擴增和檢測核酸靶序列，熟知的是使用DNA引物和DNA聚合酶的擴增和擴增測定。用於指數式擴增的方法包括聚合酶鏈反應(PCR)、鏈置換擴增(SDA)、基於核酸序列的擴增(NASBA)、轉錄介導的擴增(TMA)、和滾環擴增(RCA)。這些引物依賴性擴增方法(例如PCR)中的某些包括熱循環，而其它方法(例如NASBA)是等溫的。在眾多DNA聚合酶中，通常使用的是粞熱水生菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶(Taq聚合酶)和逆轉錄酶。線性DNA寡核苷酸擴增引物的設計通常是藉助於為該目的而設計的電腦程式來實現。可用的程序中，可以使用的是PRIDE(Haas等人，Nucl. Acids Res. 26 =3006-3012 1998) ；OLIGO(Rychlik 等人，Nucl. Acids Resl7(21) :8543-51 1989) ；OSP(Hilber 等人， OSP :a computer program for choosing PCR and DNA sequencing primers. PCR Methods Appl. 1(2) :124-128 1991) ；Primo (Li 等人，Genomics 40(3) :476-85 1997)；和 Primer Master (Proutski ^A, Comput Appl Biosci 12(3) :253-5 1996)。採用PCR的核酸擴增是熟知的，如包括PCR擴增的測定。參見美國專利4，683，202、 4,683，195 和 4,965，188，以及通常參見 PCRPR0T0C0LS，a guide to Methods and Applications, Innis 等人編，Academic Press (San Diego, CA(USA) 1990)。均相 PCR 測定也是熟知的，其不需要洗滌來移除未結合的檢測試劑或探針，因此不用打開擴增反應容器便可進行。均相PCR測定包括其中在擴增反應結束時檢測到擴增產物的端點測定和其中反應進行時在一些和所有熱循環期間檢測到擴增產物的實時測定。參見美國專利5，994，056、 5，487，972,5, 925，517 和 6，150，097。PCR擴增反應，如上文所述的其它擴增方法，一般被設計為對稱的，即通過使用 「匹配」的正向引物和反向引物來製備雙鏈擴增子；即，它們的解鏈溫度儘可能接近，並且將它們以等摩爾濃度加入反應中。已發現的有限地用於在PCR反應中直接製備單鏈DNA 的技術為「不對稱 PCR，，。Gyllensten 和 Erlich，「Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus, "Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85 :7652-7656(1988)；和美國專利5，066，584。不對稱PCR與對稱PCR不同之處在於，一個引物以通常為另一引物濃度的 1-20%的有限量加入。已知最近發展的不對稱PCR擴增方法稱為「指數後線性(Linear-After-The-Ex ponential) 」PCR 或簡稱為 「LATE-PCR」。參見 Sanchez 等人(2004) PNAS 101:1933-1938， Pierce 等人(2005)PNAS102 :8609_8614，和公布的國際專利申請 WO 03/0M233 (2003 年 7月3日)，該專利申請以引用方式整體併入本文。LATE-PCR將擴增起始時PCR引物的實際濃度調節的解鏈溫度納入考慮，該溫度稱為Tm[(l]。TmM可以通過經驗測定(在使用非天然核苷酸時是必要的)或計算。多種螢光探針可用於LATE-PCR，包括下列及其他分子信標， 其為能夠形成莖-環結構的單鏈，當不結合到靶標時該結構可封閉，從而使一端上的螢光團和另一端上的淬滅劑相互靠近；線性單鏈探針，其在一端上具有螢光團而在另一端上具有淬滅劑；FRET探針對，其為鄰近地雜交於靶序列上的雙標記、單鏈探針，允許它們的標記通過FRET在其間傳遞能量；螢光團標記線性探針，其具有DNA染料的FRET ；和線性雙鏈探針，其中螢光團在結合到靶標的鏈上，並且淬滅劑位於在靶標不存在的情況下相等Tm下結合到探針的互補鏈上。對稱PCR擴增的不利特徵是，在擴增指數期後，通過實時監測重複擴增而獲得的螢光曲線在不同水平發散和達到穩定。發散表明重複不具有相同的反應效率並且降低檢測精確度。這對PCR測定來說是個一般性問題，但就端點分析而言是特別不期望的。雖然重複間的發散顯著降低但在LATE-PCR測定和不對稱PCR測定中依然存在，這兩個測定均具有指數期和線性期。線性期的發散部分反映出當限制性引物耗盡時指數擴增結束處平穩階段中的發散。引物依賴性擴增反應(包括PCR擴增)的另一個重要問題為引導錯誤，我們認為其顯示為幾種不同類型1型引導錯誤，其發生在擴增起始前製備反應混合物期間；2型引導錯誤，如果溫度(其在PCR擴增中意味任何熱循環中的溫度)由於任何原因降到引物解鏈溫度以下則發生在擴增期間；和3型引導錯誤，其發生在已產生高濃度擴增子後繼續進行的擴增(包括PCR擴增)後期階段。當在LATE-PCR和不對稱反應中發生3型引導錯誤時，單鏈擴增子引物的3，端引導入另一 ss-DNA分子上，從而將ss-DNA轉換為ds_DNA。反應中的引導錯誤還可導致重複反應中的發散。引導錯誤包括可發生於擴增任何階段的引物二聚體形成。已採用若干方法來解決1型引導錯誤。一種方法為在化學修飾聚合酶使其在被加熱到高溫如95°C之前是失活的。參見美國專利5，677，152和5，773，258。另一方法為將抗體結合到聚合酶，以在反應被加熱到高溫如95°C以不可逆地變性抗體之前抑制聚合酶。參見美國專利5，338，671。化學修飾的和抗體結合的DNA聚合酶常常稱為「熱啟動"DNA聚合酶。 另一「熱啟動」方法為使反應混合物中包括適配體。參見Doug和Jayasena(1996)，J. Mol. Biol. 264 :268-278和美國專利6，020，130。適配體為約30個核苷酸長度的單鏈寡核苷酸， 其結合到聚合酶並且抑制聚合酶在低溫下延伸3』凹端的能力。適配體未在95°C (PCR循環來說通常是最高溫)不可逆地變性。Eppendorf-5 Prime Inc.銷售一種專有配體，其據說以溫度依賴性方式結合到Taq聚合酶，並且抑制Taq聚合酶在溫度低於約50°C時結合到雙鏈DNA。儘管做了這許多嘗試，引導錯誤仍然是PCR擴增的一個問題。在引物依賴性擴增反應(包括PCR擴增)期間的另一類型的引導錯誤稱為引物二聚體形成和引物二聚體擴增。根據該現象，一個引物雜交到其它引物或其自身另一拷貝，然後經歷3』端延伸以生成小雙鏈擴增子，然後所述擴增子可進一步擴增或可多聚化並進一步擴增。可在不存在靶標的情況下發生引物二聚體形成。通過實時檢測方法已使擴增反應(包括PCR擴增)的定量分析成為可能。在PCR擴增中，高於閾值循環時螢光信號變得可見的PCR循環或反應的Ct指示起始靶標濃度。端點分析最好為半定量的，部分由於反應退出指數擴增時的重複間發散。雙鏈擴增子的電泳分析為半定量的，並且可以使用螢光標記引物。使用螢光標記探針的端點分析(等位基因辨別探針或容許錯配的探針)也最好為半定量的。通過減少發散和製備單鏈產物，LATE-PCR 在端點分析中提供顯著提高，但重複間發散通常並未完全消除，使定量和多重檢測不夠準確並且問題比預期更加嚴重。多重PCR測定的設計和構建通常遇到引導錯誤的問題，因為單個反應中多個引物對的使用幾何級數地增加了引物與靶序列或可能存在的其它DNA鏈可能的非預期相互作用數目。實際上，在對稱多重PCR測定中，很難設計所有引物對具有相同解鏈溫度，並且在不對稱或LATE-PCR多重PCR測定中，很難設計所有限制性引物具有單個解鏈溫度並且所有過量引物具有單個解鏈溫度。因此，在多重PCR測定中，用於一個或多個熱循環的特定退火溫度不可能對於所有引物對為最優。如果PCR循環的引物退火步驟設定為允許最低Tm引物的雜交，則該反應對於具有較高Tm的引物將具有降低的嚴格性，從而增加引導錯誤發生機會。此外，LATE-PCR測定中，所用限制性引物(無論單重或多重)的解鏈溫度通常比過量引物的解鏈溫度高5°C或更多，又使其可以將單個引物退火溫度匹配到兩個引物的解鏈溫度。引物依賴性擴增(包括PCR擴增)中的DNA聚合酶的性能為選擇性的標稱量，特別是在完全互補於引物的靶序列與除了在引物3』端核苷酸處的錯配以外完全互補的序列之間辨別的標稱能力。已試圖通過設計引物使其3』端核苷酸互補於遭受突變的靶核苷酸， 利用該標稱選擇性來檢測單核苷酸突變或SNP。稱為擴增阻滯突變系統(ARMQ的擴增測定方法試圖這樣做(Newton 等人，Nucl. Acids Res. 17，2503-2516 (1989) ；Wu 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :2757-2760 (1989))。由於引導錯誤和引物二聚體形成，ARMS測定易於產生假陽性信號。某些引導錯誤事件可涉及不正確雜交的引物，使得存在3』錯配核苷酸。 引物二聚體形成還可能涉及錯配的3』核苷酸。在LATE-PCR擴增的最後階段，反應混合物中另一單鏈上的單鏈擴增子的引導錯誤還可能涉及錯配的3』核苷酸。因此，除了其它效果外，增強聚合酶對3』端錯配的辨別可減少引導錯誤。已試圖通過使擴增引物其自身更具選擇性，以提高超過上述標稱選擇性的擴增期間的選擇性。例如，Tyagi等人向引物的5』端加入互補於引物3』端的序列以形成莖-環結構，其中環和莖的3』部分互補於靶鏈(美國專利6，277，607)。經觀察，該方法並未降低設計用於多個測定的引物的難度(如上所述)。 當然，使引物更具選擇性不會提高DNA聚合酶的選擇性。為提高選擇性，修飾引物的替代方式為影響DNA聚合酶自身。美國專利申請US 11/242, 506描述了一類試劑添加物，稍微提高產物特異性並且大大降低或在某些情況下可行地消除PCR擴增反應中引導錯誤的影響。該類試劑包含單一寡核苷酸分子，其能在溫度低於莖的解鏈溫度時摺疊成具有莖和環的髮夾結構。雖然雙鏈莖封閉，但3』和5』端的核苷酸往往會解旋。因此，這些添加物在其3』和5』端上被化學修飾以保持末端封閉。這種方式的末端封閉有效地提高了莖的解鏈溫度。在封閉構型中，這些試劑添加物與DNA聚合酶相互作用，以便提高選擇性。在封閉構型中，它們還抑制DNA聚合酶的聚合酶活性。雖然這些添加物優於所有類型PCR中現有的「熱啟動」方法，並且可用於在反應的早期階段和在具有許多循環(通常60個循環和更多)的LATE-PCR反應期間防止非所需產物(包括引物二聚體和引導錯誤的擴增子)的積聚，但它們的確具有其包含單一寡核苷酸固有的局限性。特別地，莖長度不能大於約12個核苷酸，因為如果這樣並且還在其末端被化學修飾，則其解鏈溫度會變得很高，以致於當PCR被加熱到延伸溫度時，其不容易打開。甚至當以低濃度加入時，具有長莖和高Tm的髮夾分子往往抑制反應。這些添加物固有的另一難點在於，它們為非線性對稱，即，閉合髮夾的一端為打開的而另一端為環。如美國專利申請US 11/242, 506中所述，具有包含3-22個核苷酸的環的分子往往比其中使用3碳或6碳連接子形成環的分子更容易傾向於抑制擴增。期望具有結構對稱的端-到-端的試劑。Kainz 等人 Q000) Biotechniques 28 :278-282 報導，具有 16-21 個核苷酸長度的 DNA片段(雙鏈DNA寡核苷酸)可抑制在對稱PCR反應的最佳退火溫度或略低於退火溫度下發生的引導錯誤，從而防止非特異性產物的擴增。DNA低聚物在PCR循環的解鏈步驟期間被可逆地變性。在所有情況下，Kainz等人採用的測定均顯示存在和抑制引導錯誤，所述引導錯誤是在95°C下的第一次解鏈事件後溫度降低到最佳退火溫度時發生的。這並未解決1 型引導錯誤，如Kainz等人證實並且他們的數據顯示，在1型引導錯誤發生時僅為雙鏈的雙鏈片段(即，解鏈溫度大於5°C而小於反應的退火溫度)不能防止引導錯誤。來自Kainz等人的一人推斷他們的方法在多重反應中可能更不可靠，因為如上所解釋，退火溫度不可能同時對所有引物對為最佳。Kainz等人還承認，雖然他們未在其具體實驗中觀察到這一點， 但如果它們變為反應中的一個或多個引物雜交的靶標，則雙鏈DNA寡核苷酸可以觸發引導錯誤。概述一個實施方案為用於引物依賴性DNA擴增反應(優選PCR擴增反應)的反應混合物，所述擴增反應包括通過擴增至少一個DNA靶序列的DNA聚合酶來引物延伸，所述反應混合物包括至少一個引物對、熱穩定DNA聚合酶和dNTP，改良處包括在擴增開始前將至少一個雙鏈寡核苷酸添加物包括在反應混合物內，該雙鏈寡核苷酸添加物具有6-50個核苷酸長的雜交物長度，在32°C下至少50%為雙鏈，在其每條鏈上具有末端區並且包括1-4個修飾基團(優選2個、3個或4個修飾基團)，每個修飾基團均共價連接到不同末端區(優選連接到末端核苷酸)，所述修飾基團為不具有非平面大體積部分的多環部分，其中所包括的所述至少一個雙鏈寡核苷酸添加物的濃度與所述DNA聚合酶濃度有關並且對於以下功能的至少一個是有效的抑制引導錯誤、提高聚合酶對具有未完全互補的3』凹端序列的雜交物的選擇性、提高聚合酶對具有富含AT的3』凹端序列的雜交物的選擇性、降低重複反應間的發散、抑制聚合酶5』核酸外切酶活性、以及抑制聚合酶活性；條件是，如果添加物為任何靶序列的引物或檢測探針，則其包括至少三個修飾基團。另一個實施方案為如前文所述的反應混合物，其包括兩種此類雙鏈添加物的混合物。另一個實施方案為上述反應混合物，其中該添加物包括第一鏈，其為所述至少一個靶序列的引物或探針；和反向互補鏈，其部分互補於第一鏈，並且其中添加物包括三個所述修飾基團。另一個實施方案為DNA (包括cDNA)靶標的引物依賴性擴增(優選PCR擴增)，使用上述反應混合物，並且其中需要逆向轉錄RNA以獲得待擴增的DNA靶序列。另一個實施方案為均相檢測測定(實時和端點測定)，其包括擴增此類引物依賴性產物及擴增產物的螢光檢測。
另一個實施方案為試劑盒，其包含針對至少一個DNA靶序列的引物、dNTP、熱穩定的DNA聚合酶、和如上所述至少一個修飾的雙鏈寡核苷酸添加物。另一個實施方案為此類試劑盒，其也包括用於均相地檢測擴增反應產物的至少一種螢光檢測試劑。另一個實施方案為修飾的的雙鏈寡核苷酸，其在各鏈上具有末端區，具有6-50個核苷酸長的雜交物長度，在40°C下(優選32°C下)至少50%為雙鏈，並且包括2-4個修飾基團，各修飾基團共價連接到不同末端區，優選連接到末端核苷酸，所述修飾基團為不具有非平面大體積部分的多環部分，所述修飾的寡核苷酸能夠結合到DNA聚合酶的5』核酸外切酶域。另一個實施方案為引物依賴性DNA擴增反應混合物，其包括通過用於擴增至少一個DNA靶序列的DNA聚合酶來引物延伸，所述反應混合物包括至少一個引物對、DNA聚合酶和dNTP，改良處包括在擴增起始前將至少一個雙鏈寡核苷酸添加物包括在反應混合物內，該雙鏈寡核苷酸添加物具有6-50個核苷酸長的雜交物長度，在32°C下至少50%為雙鏈，在其每條鏈上具有末端區並且包括1-4個修飾基團，每個修飾基團均共價連接到不同末端區，所述修飾基團為不具有非平面大體積部分的多環部分，其中所包括的所述至少一個雙鏈寡核苷酸添加物的濃度與所述DNA聚合酶濃度有關並且對於以下功能的至少一個是有效的抑制引導錯誤、提高聚合酶對具有未完全互補的3』凹端序列的雜交物的選擇性、提高聚合酶對具有富含AT的3』凹端序列的雜交物的選擇性、減少重複反應間的發散、 抑制聚合酶5』核酸外切酶活性、以及抑制聚合酶活性；條件是，如果添加物為任何靶序列的引物或檢測探針，則其包括至少三個修飾基團。另一個實施方案為擴增測定，其包括在擴增期間實時或在擴增後端點對反應的單鏈產物、反應的雙鏈產物、或兩者進行擴增和螢光檢測，其中所述反應的雙鏈產物用螢光 DNA染料檢測，所述反應的單鏈產物用至少一個螢光標記雜交探針檢測，或兩者均有。另一個實施方案為修飾的雙鏈寡核苷酸，在其各鏈上具有末端區，具有6-50個核苷酸長的雜交物長度，在32°C下至少50%為雙鏈，並且包括2-4個修飾基團，每個修飾基團均共價連接到不同末端區，所述修飾基團為不具有非平面大體積部分的多環部分，所述修飾寡核苷酸能夠抑制DNA聚合酶的5』核酸外切酶域。修飾的雙鏈寡核苷酸可以具有1到 4個單鏈突出端，並在未雜交於雙鏈寡核苷酸結構中時，其可以具有形成莖-環(髮夾)結構的1個或2個單鏈，在此情況下，該莖有6個或更少個鹼基對長度。附圖簡述

圖1示出在實施例1中描述的使用濃度為300nM的添加物16merA的LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖2示出在實施例1中描述的使用濃度為300nM的添加物16merB的LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖3示出在實施例1中描述的使用濃度為300nM的添加物ΕΡ049的LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖4示出在實施例1中描述的使用濃度為300ηΜ的添加物ΕΡ027的LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖5為STOR Green螢光作為在實施例1中描述的使用濃度為100ηΜ、300ηΜ、600ηΜ和IOOOnM的添加物EP027的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖6示出在實施例2中描述的使用濃度為IOOnM的添加物22merA和使用濃度為 IOOnM的添加物EP003的LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖7A為STOR Green螢光作為在實施例4中描述的使用總濃度為600nM和鏈濃度為25/600/575nM的三鏈添加物混合物EP043的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖7B為STOR Green螢光作為在實施例4中描述的使用總濃度為600nM和鏈濃度為50/600/550nM的三鏈添加物混合物EP043的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖7C為STOR Green螢光作為在實施例4中描述的使用總濃度為600nM和鏈濃度為75/600/525nM的三鏈添加物混合物EP043的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖7D為STOR Green螢光作為在實施例4中描述的使用總濃度為600nM和鏈濃度為100/600/500nM的三鏈添加物混合物EP043的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖8A為STOR Green螢光作為在實施例4中描述的使用總濃度為600nM和鏈濃度為25/600/575nM的三鏈添加物混合物EP045的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖8B為STOR Green螢光作為在實施例4中描述的使用總濃度為600nM和鏈濃度為50/600/550nM的三鏈添加物混合物EP045的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖8C為STOR Green螢光作為在實施例4中描述的使用總濃度為600nM和鏈濃度為75/600/525nM的三鏈添加物混合物EP045的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖8D為STOR Green螢光作為在使用實施例4中描述的總濃度為600nM和鏈濃度為100/600/500nM的三鏈添加物混合物EP046的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數變化的函數的圖。圖9A為來自兩種探針的螢光作為在實施例5中描述的未使用添加物和退火溫度為65°C的LATE-PCR雙重擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖9B為來自兩種探針的螢光作為在實施例5中描述的使用濃度為400nM的添加物EP020和65°C的退火溫度的LATE-PCR雙重擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖9C為來自兩種探針的螢光作為在實施例5中描述的使用濃度為400nM的添加物EP020和60. 7°C的退火溫度的LATE-PCR雙重擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖9D為來自兩種探針的螢光作為在實施例5中描述的使用濃度為300nM的添加物EP013和66°C的退火溫度的LATE-PCR雙重擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖9E為來自兩種探針的螢光作為在實施例5中描述的使用濃度為300nM的添加物EP013和64. 2°C的退火溫度的LATE-PCR雙重擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖9F為來自兩種探針的螢光作為在實施例5中描述的使用濃度為300nM的添加物EP013和60. 7°C的退火溫度的LATE-PCR雙重擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。
圖10為探針螢光作為實施例6中描述的使用若干添加物中的任何添加物或未使用添加物的不依賴引物的探針-裂解測定的溫度振蕩循環次數的函數的圖。圖IlA示出由實施例7中描述的未使用添加物的LATE-PCR擴增的重複引起的探針擴增子雜交物的解鏈曲線，以及單獨探針的解鏈曲線。圖IlB示出由實施例7中描述的使用濃度為600nM的添加物EP013的LATE-PCR 擴增的重複引起的探針擴增子雜交物的解鏈曲線，以及單獨探針的解鏈曲線。圖12為示出在實施例8中描述的未使用添加物、使用濃度為300nM的添加物 EP011、使用濃度為600nM的添加物EPOll由1000個線粒體基因組DNA(靶序列)拷貝起始的12重LATE-PCR擴增的產物的電泳凝膠。圖13為STOR Green螢光作為在實施例9中描述的未使用添加物的Taq DNA聚合酶、未使用添加物的iTaq DNA聚合酶和抗體、使用濃度為600nM的添加物EP046的I^aq DNA 聚合酶、和使用濃度為600nM的添加物ΕΡ046的I1aq DNA聚合酶和抗體的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖14Α為探針螢光作為在實施例10中描述的使用濃度為600ηΜ的添加物ΕΡ010 由1000個、100個和10個靶標拷貝起始的具有低溫檢測步驟的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖14Β示出在實施例10中所描述的使用濃度為600ηΜ的添加物ΕΡ010由1000個、 100個和10個靶標拷貝起始的LATE-PCR ColdStop擴增的40個循環之後探針擴增子雜交物的解鏈曲線。圖14C示出在實施例10中所描述的使用濃度為600ηΜ的添加物ΕΡ010由1000個、 100個和10個靶標拷貝起始的LATE-PCR ColdStop擴增的70個循環之後探針擴增子雜交物的解鏈曲線。圖15Α為STOR Green螢光作為在實施例13中描述的使用總濃度為600ηΜ和鏈濃度為50/600/550ηΜ的添加物混合物ΕΡ043、用去尾引物和加尾引物的LATE-PCR擴增的重複的擴增循環次數的函數的圖。圖15Β示出具有添加物ΕΡ043的6種擴增產物的解鏈曲線，其中朝下的箭頭指示正確雙鏈DNA產物的解鏈溫度(86°C )。圓圈153標示具有去尾引物的一個重複，示出圖 15A中無產物進化(平穩段)的正確峰，並且圓圈巧4標示具有加尾引物的兩個重複，也示出圖15A中無產物進化(平穩段)。圖16A示出在實施例14中描述的使用5』 -Dabcyl化引物但無反向互補序列的 LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖16B示出在實施例14中描述的使用5，-Dabcyl化引物和濃度為IOOnM的反向互補序列的LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖16C示出在實施例14中描述的使用5』 -Dabcyl化引物和濃度為200nM的反向互補序列的LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖16D示出在實施例14中描述的使用5，-Dabcyl化引物和濃度為300nM的反向互補序列的LATE-PCR擴增的重複的解鏈曲線。圖17A為探針螢光作為在實施例15描述的使用濃度為2000nM的添加物EP020的具有RNA靶標逆轉錄的LATE-PCR擴增的重複循環次數的函數的圖。
圖17B為探針螢光作為在實施例15描述的使用濃度為200nM的添加物EP010的具有RNA靶標逆轉錄的LATE-PCR擴增的重複循環次數的函數的圖。圖17C為隨在實施例15描述的使用濃度為400nM的添加物EP003的具有RNA靶標逆轉錄的LATE-PCR擴增的重複循環次數變化的探針螢光圖。圖17D為探針螢光作為在實施例15描述的使用濃度為400nM的添加物EP010和濃度為IOOOnM的添加物EP020的混合物的具有RNA靶標逆轉錄的LATE-PCR擴增的重複循環次數的函數的圖。圖17E為探針螢光作為在實施例15描述的使用濃度為400nM的添加物EP003和濃度為IOOOnM的添加物EP020的混合物的具有RNA靶標逆轉錄的LATE-PCR擴增的重複循環次數的函數的圖。圖17F為探針螢光作為在實施例15描述的未使用添加物的具有RNA靶標逆轉錄的LATE-PCR擴增的重複循環次數的函數的圖。圖18A為根據本發明的由兩個線性(無規捲曲)寡核苷酸形成並且具有單鏈突出端的修飾雙鏈添加物的示意圖。圖18B為如圖18A中所述的修飾雙鏈添加物(但由一個線性寡核苷酸和一個髮夾形成寡核苷酸形成)的示意圖。圖18C為如圖18A中所述的修飾雙鏈添加物(但由兩個髮夾寡核苷酸形成)的示意圖。圖19A示出如實施例16中所述的利用Taq聚合酶加抗體、用或不用添加物SL04 的LATE-PCR擴增產物的解鏈曲線。圖19B示出如實施例16中所述的利用Taq聚合酶加抗體、用或不用添加物SL07 的LATE-PCR擴增的產物的解鏈曲線。圖19C示出如實施例16中所述的利用Taq聚合酶加抗體、用或不用添加物SL08 的LATE-PCR擴增的產物的解鏈曲線。圖19D示出如實施例16中所述的利用Taq聚合酶加抗體、用或不用添加物SL09 的LATE-PCR擴增的產物的解鏈曲線。圖20為探針螢光作為在實施例18中描述的使用不同濃度添加物的不依賴引物的探針-裂解測定的溫度振蕩循環次數的函數的圖。圖21為示出阻斷物寡核苷酸在限制性引物與靶標之間形成與引物完全互補的3』 端錯配的作用的示意圖。圖22A為針對如實施例19中描述的不用阻斷物的稀釋系列擴增的閾值循環(Ct) 與靶標起始濃度(拷貝數)的關係圖。圖22B為針對如實施例19中描述的利用阻斷物的稀釋系列擴增的閾值循環(Ct) 與靶標起始濃度(拷貝數)的關係圖。圖23A為示出抗體在實施例20中描述的擴增中的作用的STORGreen螢光與擴增循環次數的關係圖。圖2!3B為示出添加物EP010在實施例20中描述的擴增中的作用的STOR Green螢光與擴增循環次數的關係圖。圖23C為實施例20中描述的僅用DNA聚合酶製備的產物和用在測定的第一孵育步驟之後添加的抗體製備的產物的解鏈曲線。圖23D為實施例20中描述的用在測定的第一孵育步驟之前添加的抗體製備的產物的解鏈曲線。圖23E為實施例20中描述的用在測定的第一孵育步驟之前和之後添加的添加物 EP010製備的產物的解鏈曲線。詳述提及雙鏈添加物、引物和探針的解鏈溫度(Tm)。根據定義，Tm是指雙鏈寡核苷酸為50%雙鏈和50%單鏈時的溫度。對於添加物，Tm是指的雙鏈寡核苷酸的計算Tm，不說明取代基修飾物的任何效應。本說明書中所示的雙鏈添加物的Tm是根據以下文獻計算 Markhan 禾口 Zuker(2005)DINAMELT web server for nucleic acid melting prediction, Nucleic Acids Res 33 :W577_W581，以及 Markham 和 ZukeH2008)UNAF0LD :software for nucleic acid folding and hybridization。Keith, J. M.編，BI0INF0RMATICS, vol. II, Structure, Functions and Applications, No. 453 Methods in Molecular Biology,第 1 章，第 3 頁至第 31 頁(Humana Press,Totowa,New Jersey. ISBN978-l-60327-428-9o 在使用提及的萬維伺服器時，進行以下輸入各鏈濃度，以μ M計，如實施例中所報導；70mM的鹽濃度；和3mM的鎂濃度。擴增起始時LATE-PCR擴增反應中的探針和引物的Tm稱為Tm[(1]。 Tm
可憑經驗測定(在使用結構探針時是必要的)，或使用鹽濃度調整根據「最近鄰」方法(Santa Lucia, J. (1998)PNAS(USA)95 :1460-1465 ；及 Allawi，H. Τ.和 Santa Lucia, J. (1997)Biochem. 36:10581-10594)計算，該文獻通過引用整體併入本文。在工作中，我們使用0. 07M的單價鹽濃度，但也可使用其它濃度。提及位於末端區寡核苷酸鏈上的修飾基團。「末端區」是指連接到5』或3』端核苷酸或連接到從5』或3』端不超過5個、不超過3個、或不超過2個核苷酸的內部核苷酸。在一些實施方案中，末端修飾物連接到5』或3』端核苷酸。提及選擇性。「選擇性」通常是指在滿足某些條件時DNA聚合酶延伸3』凹端的優選性。一般來講，結合到靶序列的3』凹端為熱不穩定的，即其交替地結合到鏈上和從其所雜交的鏈上局部解旋。據稱，這些端結合到受益於形成更多氫鍵的靶標時這些端是穩定的， 而在形成較少氫鍵時則是不穩定的。根據此觀點，完全互補於其靶標的3』凹端比未完全互補於其靶標的3』端更穩定。相似地，富含GC的3』凹端通常比富含AT的3』凹端更穩定， 因為GC 二核苷酸對形成3個氫鍵，而AT 二核苷酸對形成2個氫鍵。根據此理解，一種選擇性類型為當3』凹端的3』端區域(特別是包括3』末端核苷酸)完全互補(即，無錯配的雜交)時DNA聚合酶優選延伸雜交物的3』凹端。換句話說， 這種類型的選擇性為對未完全匹配到其靶標的3』端引導序列的選擇性。對3』端區域錯配的選擇性適用於引物-靶雜交物，其中它表明相比於在例如3』末端核苷酸上具有錯配的引物-靶雜交物，聚合酶優先選擇在引物3』端上完全互補的引物-靶雜交物。對3』端-區域錯配的選擇性也更一般地適用於通過任何2個DNA鏈在擴增反應混合物中形成的具有可延伸的3』凹端的雜交物，例如當一個擴增子鏈雜交到另一擴增子鏈上(即，引導入)時可能發生的。第二種類型的選擇性為DNA聚合酶優選具有富含GC而非富含AT的3』端區域的引物(或引物鏈)，或換句話說，對末端區富含AT的引物或其它引物鏈的選擇性。
對於任一類型的選擇性來說，選擇性的度量為來自非優選雜交物(例如，由引物和錯配靶標形成的雜交物)擴增的信號的閾值循環(Ct)與來自優選雜交物(例如，引物和錯配靶標形成的雜交物)擴增的信號的Ct之間的差值(ACt)。使用添加物引起的選擇性提高為淨Ct差異，其通過從具有添加物產生的ACt中減去沒有添加物的ACt而獲得。可包括在引物依賴性DNA擴增反應和使用此類反應(包括PCR擴增反應和PCR擴增測定)的核酸檢測測定中減少引導錯誤、抑制DNA聚合酶活性、提高任一類型的DNA聚合酶選擇性、抑制DNA聚合酶核酸外切酶活性或減少重複反應間的發散或上述任何組合的添加物。溶於DNA擴增緩衝液並且包括1到4個或2到4個共價結合部分(稱為修飾基團或簡稱修飾物)的化學試劑抑制引導錯誤並且提高聚合酶對引物和完全互補靶序列之間的雜交物的選擇性。共價結合的修飾基團是多環的(包括但不限於芳族)部分，其如果是大體積的，則為平面的並且可被構型成結合到具有核酸外切酶域的DNA聚合酶(活性或非活性的)，以便抑制引導錯誤和提高聚合酶對引物和完全互補靶序列之間的雜交物的選擇性。在一些實施方案中，淬滅劑Dabcyl (4- ' _ 二甲基氨基偶氮苯基))可以用作這些試劑的修飾基團。通過將這些多環部分連接到雙鏈寡核苷酸，可使這些多環部分溶解。如上所述的具有1-4個多環部分的某些雙鏈寡核苷酸可用作在引物依賴性DNA擴增反應和在使用此類反應(包括PCR擴增反應和PCR擴增測定)的核酸檢測測定中用於減少引導錯誤、抑制 DNA聚合酶活性、增加DNA聚合酶選擇性、抑制DNA聚合酶核酸外切酶活性、減少重複間發散或上述的任何組合的添加物。修飾的雙鏈寡核苷酸可以包含天然核苷酸，即，其可以為 DNA、RNA、或DNA和RNA的混合物。修飾雙鏈寡核苷酸還可包含非天然核苷酸，例如LNA和 2』 0-甲基核苷酸。擴增反應可能是對稱或非對稱的，包括不對稱PCR擴增反應，並且優選 LATE-PCR 反應。添加物可以是修飾的的線性雙鏈DNA寡核苷酸，其中互補核酸鏈為6-50個、優選 12-30個、更優選1616個核苷酸長度。修飾的雙鏈的寡核苷酸可以是平端的或可以在一個或兩個端上包含1-8個核苷酸、優選1-5個核苷酸的短突出端。圖18A-18C示出在添加物雙鏈區域的一個或兩個末端處的鏈中具有非互補末端區的若干不同實施方案。為了示例，示出所有構型含具有具體位置的3個修飾基團(M)，但應理解，諸如此類的實施方案不限於所示位置或不限於包括3個修飾基團。圖18A示出雜交以形成雙鏈添加物183的兩個部分互補、無規捲曲寡核苷酸181、182，所述雙鏈添加物183包括雙鏈區域184和單鏈突出端185、 186。雜交物184的解鏈溫度(Tm)可通過改變其長度和GC含量來調節。類似地圖18B示出雜交以形成雙鏈添加物189的兩個部分互補寡核苷酸187、188，所述雙鏈添加物189包括雙鏈區域190和單鏈突出端191、192。突出端191、192可以包含即便在低溫下也不相互雜交的序列。可選地，突出端可以包含僅在低溫下相互雜交的序列(Tm低於雙鏈區域184的Tm， 如由互補程度和GC含量決定)。圖18B中示出的實施方案不同於圖18A中所示實施方案， 在於一個寡核苷酸即寡核苷酸187，當未雜交於寡核苷酸188時，呈現包括多達6個核苷酸長度的雙鏈莖193的髮夾結構。圖18C示出雜交以形成雙鏈添加物196的兩個部分互補寡核苷酸194、195，所述雙鏈添加物196包括雙鏈區域197和單鏈突出端198-201。在圖18C所示實施方案中，寡核苷酸194和195兩者，當不相互雜交時，分別呈現包括莖202和203的髮夾結構。實施例16和17使用圖18C中所示結構。對於其中任一鏈或兩個鏈形成髮夾、 或莖-環結構的添加物，每個莖的Tm高於雙鏈區域的Tm，以確保在使用期間形成髮夾，但不會太高以致於當在使用期間反應溫度降低時，在合理時間段內阻止形成添加物的雙鏈構象。在一些實施方案中，其中寡核苷酸鏈不用作擴增引物或探針，兩個3』端均被阻斷以阻止通過DNA聚合酶延伸。阻斷可以通過以下方式實現共價連結修飾基團到鏈的3』端核苷酸，或否則阻斷延伸，例如通過包括3』端磷酸酯基。添加物可包括32°C下至少50%為雙鏈的雙鏈寡核苷酸，這一溫度與在組裝擴增反應混合物期間可能遇到的溫度相同。在線性雙鏈寡核苷酸中包括1-4個修飾基團，優選2個、3個或4個修飾基團。修飾物在其末端區中共價連接到添加鏈，即在末端核苷酸處，或在距離末端核苷酸不超過5個， 優選不超過2個核苷酸的核苷酸處。一些實施方案使用連接到雙鏈寡核苷酸的末端核苷酸的修飾物。這些修飾物可共價連接到寡核苷酸鏈。修飾基團的共價連接在例如用於摻入螢光團和淬滅劑的領域中是熟知的。修飾基團可以是多環部分，包括但不限於聚芳族，並且如果為大體積部分則具有總體平面形狀。例子包括地高辛配基，一種植物留體化合物；香豆素，一種雙環芳族； QSY-21，一種非平面的用作淬滅劑的小聚芳族化合物。據信包括了黃腐酸和腐殖酸。在一些實施方案中，修飾基團為熟知的淬滅劑Dabcyl，其為大體積並且是平面的聚芳族。因此， 修飾基團可為不具有非平面大體積部分的多環部分，優選為聚芳族。添加物可包括具有1個、2個、3個和4個修飾基團的各種可能構型的線性雙鏈DNA 寡核苷酸。就一個末端修飾基團而言，存在4種可能的構型修飾物可以連接到任一鏈的3』 或5』末端核苷酸。就2個末端修飾基團而言，存在6個可能的構型；就3個末端修飾基團而言，存在4個可能的構型；以及就4個修飾基團而言，僅存在一個可能的構型。連接修飾物到末端區的內部核苷酸產生了另外的可能構型。在其中鏈不是引物並且修飾基團未連接到鏈的3』端核苷酸的所有情況下，所述核苷酸以不同方式阻斷，如通過磷酸酯基團(實施例中以「P」在序列中標示)阻斷。在某些實施方案中，一個鏈還用作引物，並且其3』端未阻斷。在某些其它的實施方案中，一個鏈用作檢測探針，其中它的3』端可被阻斷，例如，通過末端修飾基團、末端螢光團、或末端磷酸酯基。對於引物的實施方案，通過包括互補於該引物的單鏈寡核苷酸(我們稱之為反向互補序列)，單鏈擴增引物可被轉變成添加物，從而其形成具有引物的雙鏈雜交物。當雜交物為雙鏈時其可作為添加物起作用。雜交物可包括3個修飾物，例如Dabcyl基。 引物鏈的反向互補序列的Tm可設計成5-30°C，優選15-25°C，低於擴增靶序列的引物鏈的 Tm。為實現Tm的差異，通過使其較短和/或在一個或多個核苷酸上錯配或通過兩者，可以使反向互補序列部分互補於引物鏈。對於探針實施方案，標記的單鏈雜交探針可類似於引物的轉變，被轉變為添加物並且Tm類似地低於探針靶雜交物的Tm。優選的探針的實施方案包括具有螢光團和淬滅劑的探針鏈以及具有兩個末端淬滅劑的反向互補序列。可以包括用於擴增至少一個DNA或cDNA靶的引物依賴性擴增反應混合物。反應混合物包括上述添加物中的至少一個以及靶核酸和包括引物、DNA聚合酶、dNTP和(通常地)擴增緩衝液的擴增試劑。如果擴增混合物是用於包括雙鏈擴增產物、單鏈擴增產物、或兩者的擴增和均相檢測的擴增測定，則反應混合物可包括至少一種用於產物檢測、優選螢光檢測的試劑。用於檢測雙鏈擴增產物的優選試劑為DNA染料，例如STOR Green0用於檢測單鏈產物的優選試劑為螢光標記檢測探針，其對單鏈產物的雜交導致可檢測螢光信號改變或其在擴增期間對單鏈產物的雜交引起可檢測螢光信號改變。許多均相檢測試劑是本領域所已知的，並且可使用任何適當的檢測試劑或試劑。也可使用其它試劑。如果所包括的靶核酸為RNA靶序列，則反應混合物將包括逆轉錄酶。反應混合物可包括用於多重擴增和測定的多個靶的多個引物對。實施例5示出反應混合物，用於針對包括2個引物對和每個擴增產物的螢光探針的兩個靶序列的雙重 LATE-PCR測定。實施例8示出高度多重擴增的反應混合物，包含用於12個不同靶標的12 個引物對的12重體。如果添加物包括引物鏈中的一個，則反應混合物還可包括合適的反向互補序列。反應混合物可為PCR反應混合物，在一些實施方案中為LATE-PCR反應混合物。 反應混合物可以包括2種添加物的組合或混合物。此類混合物可包含4個鏈，或者如果所述2個添加物共享共有鏈，則具有3個鏈。反應混合物可包括至少一個修飾的雙鏈添加物， 所述雙鏈添加物總濃度高達2000nM，優選高達IOOOnM並且更優選高達600nM。如果反應混合物包括添加物的混合物，則添加物的總濃度可保持如所述。提供了使用上述反應混合物用於一個或多個DNA或cDNA靶序列的引物依賴性擴增以及具有擴增產物的均相檢測(即，具有均相檢測的擴增測定)的一個或多個DNA或 cDNA靶序列的引物依賴性擴增的方法。擴增方法和擴增測定方法的可以包括等溫擴增反應或熱循環擴增反應。在一個實施方案中，擴增方法可為PCR，並且在一些實施方案中，為 LATE-PCR。經選擇用於具體擴增或擴增測定的添加物或添加物的組合，以及該添加物或添加物的組合的量取決於所需效果和擴增期間使用的溫度。等溫擴增可以僅包括反應混合物製備溫度，通常為室溫，然後在單個反應溫度如37°C下等溫擴增反應。PCR和其它熱循環擴增方法包括反應混合物製備溫度，然後是許多熱循環，所述熱循環包括引物退火溫度(退火溫度)、引物延伸溫度(延伸溫度)、和鏈變性溫度(解鏈溫度)。雖然退火溫度和延伸溫度可以相同，但更通常來說退火溫度應低於延伸溫度5-20攝氏度(V)。LATE-PCR測定還可以在一些或所有熱循環中包括低溫檢測步驟，在其間，反應混合物的溫度降低到退火溫度以下，以使得低溫探針結合到其靶序列。擴增反應可以在中間點被中斷，以便進行可能包括低溫(低於退火溫度)的一些操作，其後擴增反應可重新開始。擴增可以利用其它的減少引導錯誤的方法。例如，所用的DNA聚合酶可以是熱啟動聚合酶。另外，所用引物可被設計成具有富含AT的5』端，包括在必要時增加延伸。另外地或可選地，引物的3』端可被設計成富含GC或富含AT，以便改變擴增和擴增測定中的聚合酶抑制作用。擴增反應的產物可適用於測序，包括但不限於雙脫氧法測序。擴增測定可以包括在DNA靶序列的擴增期間例如在PCR擴增反應的一些或所有循環期間多次實時均相檢測單鏈產物、雙鏈產物或兩者。如上所述，可以使用螢光檢測。可選地，擴增測定可以包括在擴增反應完成之後在端點處均相檢測。檢測可以包括作為溫度的函數的解鏈擴增產物和檢測螢光改變。檢測可以為定性或定量的。對於靶標是RNA的測定可包括逆向轉錄。提供了用於進行擴增和擴增測定的試劑盒。此類試劑盒可包括製備反應混合物必需的試劑，包括至少一個靶序列的引物、dNTP、DNA聚合酶和至少一個修飾的雙鏈添加物，如上所述。用於擴增測定的試劑盒還可包括至少一種檢測試劑，例如，DNA螢光染料或螢光標記雜交探針。擴增試劑盒和擴增測定試劑盒還可包括用於樣品製備的試劑(例如，細胞裂解試劑)、用於核酸分離的試劑和逆轉錄酶。擴增測定試劑盒可以包括對照靶序列和用於其擴增的引物。對添加物或添加物混合物的選擇可考慮以下DNA聚合酶抑制作用的性質、對3』 端引物錯配的選擇性、對富含AT引物3』端區域的選擇性、聚合酶核酸外切酶活性的抑制、 引導錯誤的抑制和重複間發散的減少。添加物的效果又取決於添加物的固有性質、其濃度、 其解鏈溫度和其濃度。例如，固有聚合酶抑制作用往往隨添加物中所包括的修飾物數目而增加，並且添加物的有效抑制隨其濃度而增加。已發現，對3』端引物錯配的選擇性與DNA聚合酶的阻斷核酸外切酶活性有關，該DNA聚合酶具有該活性或至少具有核酸外切酶位點。 這可能是因為通過添加物阻斷了酶的核酸外切酶位點。添加物可以對於以下一個或多個功能有效的濃度加入擴增反應混合物中抑制引導錯誤、提高聚合酶對具有未完全互補的3』凹端序列的雜交物的選擇性、提高聚合酶對具有富含AT的3』凹端序列的雜交物的選擇性、減少重複反應間的發散、抑制聚合酶5』核酸外切酶活性、以及抑制聚合酶活性。因為添加物與DNA聚合酶相互作用，所需濃度隨擴增反應混合物中所包括的DNA聚合酶的濃度而變化。對有效用於上述功能中的一個或多個所需的添加物濃度的測定，以及對最佳濃度的測定，可常規通過嘗試在擴增反應或擴增測定中添加物所希望的若干濃度來測定，如在以下實施例中所示。例如，實施例3報導了若干濃度的若干添加物的經驗性試驗，以確定各種濃度的添加物的效果，以幫助選擇優選的添加物， 明確有效濃度，以及確定具體LATE-PCR測定中用於特定目的的最佳濃度。對於Taq DNA聚合酶(對擴增反應和測定而言最常使用的聚合酶)，通常的聚合酶濃度可能為25微升(μ 1 或ul)反應混合物中1.25個單位。在一些實施方案中，需要不超過2000納摩爾(nM)的添加物，在一些實施方案中，需要不超過ΙΟΟΟηΜ，以及在一些實施方案中，不超過600nM。對於可能以比Taq DNA聚合酶更高的濃度包含在反應混合物中的Tfi DNA聚合酶，相同濃度的添加物通常是有效的。對於充當「熱啟動」試劑的添加物，優選的是，在低於等溫擴增的反應溫度和低於熱循環反應例如PCR的退火溫度的溫度下，幾乎或完全抑制所用聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)的聚合酶活性的添加物。為此，添加物可具有對聚合酶活性的高抑制作用，和解鏈溫度(Tm)，其為至少32°C並等於或低於等溫反應溫度或PCR溫度，優選比其低1-15°C，更優選比其低1_5°C，並且濃度足以完全或至少基本上抑制聚合酶活性。當添加物通過在高於其 Tm的溫度下解鏈分開而沒有不可逆變性時，在PCR熱循環的等溫反應期間每次溫度降低足以使添加物變成雙鏈時添加物將起作用，例如，在低溫檢測步驟期間，如有時用於LATE-PCR 測定。在等溫擴增的反應溫度或在高於PCR擴增的退火溫度的溫度下，特別是在延伸溫度下，添加物也可用於減少弓I導錯誤和提高聚合酶選擇性。為此，添加物可具有低的至適度的對聚合酶活性的抑制作用，和這樣的解鏈溫度，其比等溫反應溫度或PCR延伸溫度低不超過2°C，優選至少等於該溫度，並且更優選高於該溫度，並且濃度僅與足以實現所需效應而不過度地抑制反應效率所必需的一樣高。另外，因為在PCR循環的鏈-解鏈步驟期間未使添加物不可逆變性，所以在每個PCR循環期間當溫度對於鏈-解鏈溫度而言降低至退火溫度或更低的溫度時，添加物可用於提高聚合酶選擇性。
添加物可單獨或組合使用。兩個修飾的雙鏈寡核苷酸的混合物可以包括4個鏈， 或者，如果兩個添加物共享共有鏈，則包括3個鏈。3個鏈混合物將不到一個鏈插入反應混合物，這在實施方案中可能是有利的，其中添加物不是針對擴增反應混合物中任何靶序列的引物和探針。使用組合的添加物賦予設計靈活性。例如，為抑制I型引導錯誤，混合物可包括第一添加物，所述第一添加物通過其固有性質(Tm和濃度)在低於擴增反應的引物退火溫度下充分抑制聚合酶活性，但其在擴增期間為單鏈以便不抑制聚合反應。與此類添加物組合以抑制II型引導錯誤以及在合適時在擴增期間抑制III型引導錯誤，混合物可以包括在引物退火期間為雙鏈但在引物延伸期間最低程度地抑制聚合酶活性的添加物。提供了直接與等溫DNA擴增反應或熱循環DNA擴增反應例如PCR反應中所用的 DNA聚合酶相互作用的寡核苷酸試劑。寡核苷酸試劑可在其中它們為雙鏈的所有步驟期間作用於擴增反應。它們可具有抑制引導錯誤和增加聚合酶選擇性的效果，包括相比於非完全互補的雜交鏈的3』凹端，DNA聚合酶優選延伸完全互補的雜交鏈的3』凹端。引導錯誤可根據不同類型來考慮。I型是每當反應混合物溫度低於引物退火溫度時就發生的引導錯誤。它發生於在擴增起始前反應混合物製備期間。如果溫度降低到引物退火溫度以下，它也可能發生於擴增期間。II型在擴增期間每當反應混合物溫度處於或高於引物退火溫度但低於存在的引物的解鏈溫度時發生的引導錯誤。III型是在已製備了高濃度擴增產物(擴增子)之後繼續的擴增期間發生的引導錯誤。引導錯誤的另一表現為引物二聚體形成，其中一個引物雜交到另一引物或雜交到其自身然後經歷延伸以生成短雙鏈擴增子，該短雙鏈擴增子然後可進一步擴增或甚至進一步多聚化並擴增。將擴增反應分為階段來考慮引導錯誤可能性是有用的。引導錯誤產生了可擴增產物，所以發生於擴增反應早期的引導錯誤事件將被擴增，幾乎就如其為靶分子一樣。隨後的一般性描述是針對PCR反應，但本領域技術人員將會理解其適用於其它擴增反應。PCR的該一般性說明是僅為了示例，而並非意圖限制可用擴增反應的類型。預備階段製備試劑並在25°C或更低溫度(例如，冰上)混合。引物濃度在預備階段期間為最高，該階段通常持續數分鐘。通常，靶標數目在預備階段期間低或非常低，並且這些靶標中一些或所有可以為單鏈，取決於樣品如何製備和其是否為cDNA。實際上，使用酶例如逆轉錄酶的cDNA合成也是預備階段的一部分，當用於cDNA合成的反應混合物也包含引物和DNA聚合酶時，因為反應混合物的這些成分可能在cDNA合成所需條件下錯誤引導，通常在40-60°C的溫度範圍內5-30分鐘。通過加熱到高溫(例如95°C)以使反應混合物中的所有雙鏈DNA變性來結束預備階段。如果DNA聚合酶以非活性形式(例如，抗體結合的DNA聚合酶)加入，則該加熱步驟激活該聚合酶，此過程稱為「熱啟動」。I型引導錯誤發生於預備階段期間。如果DNA聚合酶不是熱啟動酶並且如果反應混合物中未包括任何其它聚合酶活性抑制劑，則I型引導錯誤的機率增加。而且，如果聚合酶的熱啟動改性或用於阻斷聚合酶活性的所加入抑制劑未能進行完全抑制，則發生I型引導錯誤。引物二聚體形成和I型引導錯誤在預備階段期間優先發生，因為溫度較低。預備階段弓I導錯誤的產物將被擴增。早期階段反應的該階段通常為10-15個熱循環的PCR擴增。3步PCR的每個循環的熱曲線包括鏈-解鏈溫度、引物退火溫度和引物延伸溫度。對於2步PCR，引物退火和引物延伸是在相同溫度下進行。分配給熱循環中每個步驟的時間量通常為幾秒長。在第一和第二熱循環期間，引物第一次退火至其在全長靶標內的靶序列並且旨在僅當在完全互補靶序列上時選擇性延伸。引物退火至並且延伸於靶標的兩個鏈上，並且如果所有都完美進行，則生成並隨後指數擴增確定長度的兩個互補鏈。產物鏈相互雜交的趨勢低，因為其濃度低。如果引物延伸於其非完全互補的等位靶標上，則II型引導錯誤可在早期階段期間發生。對於引物來說，通常具有高於退火溫度若干度或甚至更多的Tm，這會招致II型引導錯誤。較短退火時間和較高退火溫度(相對於引物Tm)比較長退火時間和較低退火溫度更嚴格，因此降低了 II型引導錯誤並提高聚合酶選擇性。II型引導錯誤的產物可在剩餘擴增期間被擴增。在此未使用熱啟動聚合酶改性，因為首次加熱到高溫會不可逆地使熱啟動抗體或酶烷基化反應失活。熱穩定抑制劑，包括本文所述的那些，將在首次和後續的退火步驟期間起作用，因為它們未被高溫不可逆地變性。中期階段PCR反應的該階段通常包含10-25個熱循環並且包括解鏈、引物退火和引物延伸。在熱循環中分配給每個步驟的時間量通常為幾秒長。引物退火到和延伸於靶標的兩個鏈上，並在最佳條件下，生成和隨後指數擴增由引物對決定的確定長度的2個互補鏈。就實時對稱PCR測定而言，中期階段通常包括在反應的退火步驟或延伸步驟期間的產物檢測。就LATE-PCR反應而言，中期階段可以包括在低於退火溫度的溫度下的產物檢測，並且該檢測發生於延伸步驟之後。使用雜交探針的螢光信號通常在對稱PCR和 LATE-PCR的指數期晚期變得可檢測。在對稱PCR中期階段結束時，指數性蓄積的產物鏈的濃度增長到足夠高以在引物-退火步驟期間雜交產物鏈。指數擴增減慢並達到穩定，因為據信聚合酶結合到反應的雙鏈產物。就LATE-PCR而言，在產物鏈濃度變得足夠高以減慢反應之前，限制性引物耗盡並且終止反應指數期。在包括低溫檢測步驟的LATE-PCR擴增中，I型和II型引導錯誤可發生於中期階段，正如在早期階段中。這在實時LATE-PCR中的低溫檢測步驟期間尤其是個風險。當產物鏈濃度增加時，III型引導錯誤還可發生於中期階段。任何類型的引導錯誤，無論在預備階段、早期階段或中期階段期間，均導致重複反應間的發散，這在指數擴增減慢時尤其明顯。晚期階段擴增的晚期階段通常僅發現於LATE-PCR中，因為對稱PCR已達到穩定並且已通過此階段終止。LATE-PCR擴增的該階段通常包含10-25個熱循環，所述熱循環包括解鏈步驟、引物退火(僅過剩引物)、和引物延伸(僅過剩引物)。熱循環中分配給各步驟的時間量通常為幾秒長。每個過剩引物退火到並延伸於通過延伸其對應限制性引物(其限制性引物鏈)來製備的延伸產物上，並且如果所有都完美進行，則有效地生成過剩引物鏈， 其線性累計直到其開始超過該過剩引物自身。因而，LATE-PCR反應減慢，但沒有像對稱PCR 反應那樣達到穩定。就實時LATE-PCR測定而言，該階段可以包括在引物退火溫度或在低於退火溫度的溫度下的產物檢測，並且所述產物檢測發生於延伸期之後。使用雜交探針的螢光信號在該階段期間通常隨大約線性的動力學提高。III型引導錯誤可發生於在多個線性循環之後的晚期階段，因為過剩引物鏈的3』 端可沿著過剩引物鏈的另一分子的任何位置錯誤引導。因此，III型引導錯誤的概率隨以下情況增加1)單鏈產物濃度增加；2)多重反應中不同單鏈產物的數目增加；3)反應溫度降低；4)過剩引物鏈的3』端或靠近3』端的鹼基富含GC並且更容易雜交(錯誤引導)。III 型引導錯誤導致單鏈DNA轉化回雙鏈DNA，我們稱之為「產物進化」(雖然產物不完整或不正常)。產物進化表現為在使用檢測雙鏈產物的染料的螢光中突然的後期增加(平穩階段後的斜率增加)，或來自檢測單鏈DNA的探針的螢光突然降低。因此，III型引導錯誤類似於II型引導錯誤，原因在於錯誤可在退火溫度以上發生，但III型引導錯誤還類似於I型引導錯誤，原因在於錯誤可在退火溫度以下發生。當然，II型引導錯誤可發生於該階段，同樣，如果包括了低溫步驟，則I型引導錯誤也可發生於該階段。結束階段=LATE-PCR中的結束階段不涉及額外擴增，因為雙鏈產物不再解鏈分離。結束階段為擴增後階段，其中進行了一些操作。最普遍地，溫度降低至退火溫度以下以允許探針靶向雜交(信號產生=退火信號)，然後溫度隨時間升高以解鏈分離探針靶複合物(信號喪失=解鏈)。我們稱之為「探針退火-解鏈分析」。結束階段的探針退火-解鏈分析可在LATE-PCR擴增期間用或不用實時分析來進行。通常，在10-15個循環的晚期階段之後的探針退火-解鏈分析生成關於反應起始時存在的靶拷貝數的定量信息。通常，在結束階段不發生引導錯誤，或者如果發生，則其之後不發生使引導錯誤的產物可見所需的額外擴增。並且，如實施例10所示，可以使用「ColdStop(冷終ihl」方案來在晚期階段進行探針退火-解鏈分析，然後為額外循環重新起始擴增，直到達到結束階段， 此時可重複探針退火-解鏈分析。如實施例10所示，當在探針退火-解鏈分析之前未使用實時分析時，重複間發散較少，因為通過在每個熱循環中省略檢測步驟減少了 III型引導錯誤的頻率。雖然不願受任何理論束縛，但我們推論，修飾的雙鏈寡核苷酸(如本文所述)直接與DNA聚合酶相互作用，從而抑制所有類型的引導錯誤，即I型、II型、III型和引物二聚體。我們相信，當添加物為雙鏈時，優選結合到DNA聚合酶的的5』核酸外切酶域，但如果以足以超過飽和5』核酸外切酶域的濃度加入，則也結合到DNA聚合酶的聚合酶域。從經驗來看，25 μ L反應體積中每1. 25單位Taq DNA聚合酶300_600ηΜ濃度的添加物可足以飽和5， 核酸酶域和聚合酶域。雖然不願受任何理論束縛，但我們推論，通過在低於引物退火溫度的溫度下飽和兩個域，通過質量作用和由於修飾基團引起的結合的組合而有效停止聚合酶，添加物(如本文所述)阻止I型引導錯誤。在高於引物退火溫度的溫度下，添加物可在不飽和5』核酸外切酶域和聚合酶域的濃度下使用。在這些溫度下，添加物優選結合到並且選擇性抑制5』 核酸外切酶域的活性，同時留給聚合酶域極大自由來進行正確雜交的引物的延伸。通過選擇性結合到5』核酸外切酶域，添加物通過變構效應增加聚合酶域的選擇性。雖然不願受任何理論束縛，我們推論，通過可用於針對特定目的來選擇一個或多個添加物的方式，修飾基團(例如Dabcyl基)有助於添加物的功能。甚至一個3』端修飾基團都可抑制潛在地由添加物自身導致的引導錯誤。然而，3』端修飾基團，無論一個還是兩個在雙鏈寡核苷酸上，不會提高聚合酶對在引物3』端的錯配的選擇性起作用。另一方面， 5』末端的修飾基團，特別是兩個5』修飾基團，可顯著提高該聚合酶選擇性。在雙鏈寡核苷酸兩個鏈的一個端上包括修飾物(即，一個5』修飾物和一個3』修飾物)可顯著提高選擇性，即使雙鏈寡核苷酸不是平端的。對於選擇性增強來說，在雙鏈寡核苷酸的兩個端上具有端上具有兩個修飾基團更好，但具有4個修飾基團的雙鏈寡核苷酸往往比具有一個、兩個或三個修飾基團的雙鏈寡核苷酸更能降低聚合反應的效率。我們推論，原因在於，具有四個修飾基團的添加物比具有較少修飾基團的添加物更有效地結合到聚合酶域。I型引導錯誤的抑制添加物包括雙鏈寡核苷酸，其位於或靠近鏈末端(即在鏈的末端區)通過加成1、 2、3或4個修飾基團(例如Dabcyl修飾基團)被修飾。在一些實施方案中，存在2_4個此類基團，而在一些實施方案中，這些基團共價連接到末端核苷酸。在實施例中，如本文所述的添加物，無論單一添加物還是混合物，由前綴「EP」指示以使其區別於用於比較而描述的其它添加物。實施例1表明添加物抑制I型引導錯誤而不導致額外的引導錯誤。在該實施例中，使用了產生錯誤產物(與引物對定義的產物不同的產物，如由解鏈分析所確定)的 LATE-PCR擴增。錯誤產物的產生指示I型引導錯誤。在此擴增中，嘗試將包含具有相同長度(16個核苷酸)但不同序列的未修飾雙鏈寡核苷酸的兩個不同添加物作為對照添加物。 一個添加物(16merA)以至少300nM的濃度加入使得反應產生正確產物(圖1)。另一個添加物(16merB)則不會(圖2)，甚至當以600nM或IOOOnM的濃度加入時也不會，並且實際上導致引導錯誤。此不一致性符合Kainz等人的教導雙鏈寡核苷酸可能抑制引導錯誤或可能導致引導錯誤。用添加物重複該測定，所述添加物為導致引導錯誤的寡核苷酸(IemerB) 的修飾，該修飾包括一個或兩個末端Dabcyl修飾物。相比於16merB (圖幻，包括600nM濃度的單一 Dabcyl修飾物、添加物EP048 (圖幻或添加物E0049抑制引導錯誤，包括由未修飾低聚物導致的引導錯誤。包括僅300nM濃度的兩個Dabcyl修飾物、添加物EP027時能抑制引導錯誤，並且當以僅IOOnM濃度加入時提供改善(圖4)。如包含不同濃度的添加物 EP027(圖5)的反應的動力學分析所示，300nM濃度的添加物EP027消除重複間發散，並且認為300nM為此測定中的最佳濃度。用長度12到30個核苷酸的若干其它未修飾雙鏈寡核苷酸來重複實施例1的測定。實施例1中所報導的結果證實就抑制或導致I型引導錯誤來說未修飾寡核苷酸是不一致的。如實施例1中所報導，還用許多雙鏈寡核苷酸重複該測定，所述雙鏈寡核苷酸具有8-22個核苷酸的長度範圍並且具有兩個Dabcyl修飾物、兩個地高辛配基修飾物、四個 Dabcyl修飾物、或四個地高辛配基修飾物。結果證實如本文所述的添加物抑制I型引導錯誤。這些結果還顯示出Tm對添加物的影響。(在本申請中，添加物的Tm是指未修飾雙鏈序列的計算Tm，如上所定義。修飾物往往會稍微提高實際Tm，也許提高1_2°C，讀者可納入考慮)。為抑制I型引導錯誤，優選的是，直至或近乎至引物退火溫度和引物Tm時維持雙鏈的添加物。在實施例1中，第一次10個循環的引物退火溫度為55°C。雖然在實施例1中，在 600nM濃度的所有情況下用Tm範圍為37°C到63°C的添加物獲得了良好結果，但其僅為添加物EP021，具有最低 ιι的添加物在300nM下也不提供良好結果。在IOOnM和50ηΜ濃度下表現最佳的添加物的Tm至少為60°C。為抑制PCR擴增反應中的I型引導錯誤，添加物的Tm 可至少為32°C，更通常為至少50°C，並且更優選為至少60°C。作為對本文所述添加物抑制I型引導錯誤的一致性的進一步檢查，我們使用不同引物進行不同靶序列的LATE-PCR測定。在此測定中，如實施例2中所報導，我們比較了 12個添加物與在實施例1的第一部分的測定中表現良好的未修飾雙鏈寡核苷酸(寡核苷酸22merA)。添加物均具有22個核苷酸的長度、若干不同序列、和兩個、三個或四個末端 Dabcyl修飾物的若干不同構型。所有這些在300nM濃度下在抑制引導錯誤方面至少與添加物22mer A 一樣好，並且在僅IOOnM的較低濃度下幾乎其中的一半也能達到相同效果。圖 6為添加物EP003和添加物22merA的解鏈曲線，表明只有IOOnM濃度的添加物抑制引導錯誤。實施例9示出定量LATE-PCR測定以在第一熱循環之前測量DNA聚合酶的聚合酶活性。相同的測定可用於定量和比較添加物的DNA聚合酶抑制能力，其可在寬範圍的濃度、 溫度和孵育時間上進行測定。初始反應混合物包括高濃度的兩個寡核苷酸(分別62個和 75個鹼基對)，該寡核苷酸能夠在其3』端處退火至彼此上以形成雜交物，該雜交物為27個鹼基對長並且具有60°C的計算Tm。它們在5』端上也具有引入部位。擴增引物未包括在初始反應混合物內。反應的熱曲線是以在50°C下等溫浸泡10分鐘起始。在此步驟期間，重疊的寡核苷酸可引入其自身，即，雜交並且通過活性DNA聚合酶延伸。如果這種情況發生，則將為引物產生雙鏈靶標的拷貝，其在熱循環之前加入反應混合物。在50°C長時間孵育期間聚合酶活性的活性抑制將減少該步驟期間形成的靶標拷貝數。在50°C長時間孵育之後，加入高Tm引物，並且進行2步LATE-PCR擴增以擴增已製備的任何靶標。用於擴增的引物退火溫度(72°C)遠高於重疊核苷酸的Tm，從而不產生額外雙鏈靶標。在此測定中，生成可探測水平產物所需的循環次數(以STOR Green或過剩引物鏈的探針來觀察)取決於在部分互補低聚物的初始等溫孵育期間產生了多少全長鏈。這又取決於在等溫孵育期間DNA聚合酶的活性，因為存在/不存在已知組合物和濃度的任何潛在酶抑制劑(此類抑制劑)，已在冰上並在重疊寡核苷酸加入之前首次組裝反應混合物時被加入反應混合物中。我們在此定量分析中測試了添加物，包括Tm處於或低於50°C孵育溫度的添加物 (EP020, Tm 500C ；EP022, Tm 45°C )和 Tm 顯著高於孵育溫度的添加物(EP046，Tm 67V )。 較低Tm的添加物在50°C孵育期間可能為基本上至少為單鏈，而高Tm添加物EP046可能為雙鏈。低Tm添加物摻入反應混合物未引起Ct延遲，但600nM濃度的EP046的摻入引起Ct 延遲，無論聚合酶為Taq還是Taq加抗體。添加物EP046的動力學曲線示於圖13中。圖 13表明，在不存在任何DNA聚合酶抑制劑的情況下，重疊寡核苷酸的3』端相互雜交並且延伸。加入具有用於熱啟動的聚合酶的抗體部分抑制I型引導錯誤達約1000倍，但進一步加入600nM EP046抑制I型引導錯誤額外10倍。實施例16報導用具有6個核苷酸長度的單鏈突出端和22個鹼基對的雙鏈區域的添加物的類似測試。添加物均含有相同的鏈序列，但不同的是修飾物(該實施例中為 Dabcyl基)的數目和位置。兩種個別鏈形成髮夾，如圖18C所示。測試方法包括在50°C下等溫浸泡1分鐘(而不是實施例9中的10分鐘)，然後在冰上孵育並隨後LATE-PCR擴增。 解鏈曲線分析表明具有兩個修飾物(圖19A)和三個修飾物(圖19B、圖19C)的添加物減少了不正確產物的產生，並且具有四個修飾物(圖19D)的添加物完全抑制其產生。實施例20報導根據實施例9的測試，其在預備階段期間更嚴格地隔離了 I型引導錯誤。通過使用在PCR退火/延伸溫度下變為單鏈的添加物，消除了可能的II型引導錯誤。 基於實施例20報導的結果，我們斷定a)熱啟動抗體不完全抑制DNA合成並且在抗體存在下生成的大多數產物是I型引導錯誤所引起；b)在冰上孵育期間合成的產物大部分為I型引導錯誤的結果；c)添加物EP010用於提高產物冰上延伸的特異性，並且因為大多數冰上產生的產物是I型引導錯誤的結果，所以EP010抑制了大部分冰上引物延伸事件。因為含添加物EP010的擴增產物的解鏈曲線(圖23E)表明，雙鏈形式在72°C下不再存在，該溫度為在擴增時引物退火和延伸進行的溫度，實施例20中所觀察的EP010的效果完全是由於起始擴增前在50°C和冰上孵育時EP010活性所致。實施例9中所用添加物的相同分析表明， 它們具有高於EP010的解鏈峰(未示出)，因此實施例9中添加物的效果並不僅嚴格歸因於擴增前步驟，而且還歸因於擴增期間的步驟。抑制II型引導錯誤禾Π 曾力D PCR /i應的擇十牛添加物可抑制II型引導錯誤和提高DNA聚合酶對引物的雜交3』端核苷酸的選擇性。為測定在LATE-PCR測定中在擴增期間在限制性引物的3』端核苷酸上錯配的選擇性， 我們擴增完全互補於兩種引物的靶標(匹配靶標)，並且我們分別擴增完全互補於過剩引物但包含對限制性引物的3』端核苷酸的單一錯配的靶標。或者，如下文所述並且在實施例 19中所顯示，3』端錯配可通過使用阻斷物寡核苷酸來產生。我們通過DNA染料檢測雙鏈產物。「選擇性」為介於來自錯配靶標的擴增信號的Ct與來自匹配靶標的擴增信號的Ct差異 (ACt)。當在不含添加物的樣品上進行時，該測定可顯示聚合酶對引物/匹配靶標的基本選擇性超過引物/錯配靶，以及引物/匹配靶的擴增的基本效率。對於Taq DNA聚合酶，ACt 可能少於兩個擴增循環。添加物引起的選擇性提高為由擴增反應混合物中包括添加物所引起的ACt的增益。我們在該選擇性測定中測試了未修飾雙鏈寡核苷酸和多個添加物。在實施例3中報導了一式三份的運行的測定結果。基於三次重複的平均，所報導的Ct差異(ACt)為選擇性的提高。未修飾的雙鏈寡核苷酸22merA，儘管Tm稍微高於測定的引物退火溫度，但通過小於兩個Ct單位在多達300nM的濃度下也提高了 Taq DNA聚合酶其自身的基本選擇性。我們測試了具有相同長度(22個核苷酸)和具有兩個、三個、或四個Dabcyl修飾物的不同構型的許多添加物。如在實施例3中所報導，兩個、三個、或四個Dabcyl修飾物的大多數構型顯著提高聚合酶的選擇性，從而減低了其II型引導錯誤的傾向。如在實施例3中進一步報導，我們還測試了用於添加物和螢光素(FAM)而不在添加物中用作修飾基團的三個其它修飾物。在至少一些雙鏈寡核苷酸中，相比於添加物22merA和相比於22個核苷酸長的具有四個FAM修飾物的寡核苷酸，修飾物地高辛配基、香豆素和淬滅劑QSY21中的每一個均顯著提高選擇性。如實施例17中所報導，我們相似地用不同量的3個添加物測試了擴增，所述添加物具有22個鹼基對的雙鏈區域和6個核苷酸長的單鏈突出端。添加物的序列在實施例16 中給出。添加物包含兩個形成髮夾的鏈，如圖18C中所示。具有兩個和三個Dabcyl基作為修飾物的此類添加物示出大於3個Ct單位的選擇性(ACt)的適當提高。選擇性的最大增益是用具有4個Dabcyl基作為修飾物的添加物來實現的，即大於6個Ct單位。添加物還可在常規的對稱PCR擴增中抑制II型引導錯誤和提高聚合酶選擇性。實施例11報導用於兩個靶序列的對稱PCR測定，一個完全互補於兩個引物，一個完全互補於一個引物但含有相對另一引物3』端核苷酸的錯配。該測定既在反應混合物中無添加物時進行，也在反應混合物中具有兩個添加物的組合時進行。該組合(命名為ΕΡ04!3)包括組合濃度為300ηΜ的具有Dabcyl修飾物的兩個雙鏈寡核苷酸。在實施例11的測定中，PlatinumTaq DNA聚合酶、熱啟動DNA聚合酶和高度辨別等位基因-特異性引物對的組合相對於錯配靶標優選以7. 84CT值擴增匹配靶標。該檢測特異性可能等同於在兩個DNA靶標的理論混合群體中在超過2 個錯配靶標中檢測1個匹配靶標(即0.43%預期靶標)。與之相比，將添加物EP043加入相同的對稱PCR測定提高了有利於匹配靶標的特異性由另外4. 75CT值到12. 59CT值，這可能等同於在超過6，615個錯配靶標中檢測1個匹配靶標(即0. 02% )， 對應於在檢測特異性中提高26. 7倍。在實施例5中報導的實驗中，我們通過不用添加物、用低Tm添加物(EP020 (Tm 5ΓΟ)和用高Tm添加物(EP013(Tm 62°C))進行了一系列LATE-PCR擴增。該實驗包括在高度嚴格條件(高退火溫度)、中等嚴格條件和相當不嚴格條件(相對於引物Tm的低退火溫度)下使用不同引物退火溫度來測試擴增反應。當嚴格性降低時，引導錯誤問題通常惡化。測定為用於兩個靶序列的雙重測定，每個序列均具有其自身的引物對和其自身的檢測探針。探針為在雜交到正確擴增子後發螢光的分子信標探針。圖9A-9F中報導了在首先的50個循環上的探針螢光的動力學曲線。圖9A示出，在該擴增反應中，Platinum Taq DNA聚合酶(一種熱啟動聚合酶)未能抑制I型和II型引導錯誤，即便是在嚴格條件下對於所有循環65°C退火溫度。相比之下， 兩個添加物在所用濃度下能夠抑制(圖9B和9D)。在首次20個循環(退火溫度60. 7°C ) 期間低嚴格性情況下，在退火溫度下不為雙鏈的低Tm添加物EP020在擴增期間(圖9C)未抑制II型引導錯誤，但較高Tm添加物EP013能抑制(圖9F)。這表明，為抑制在特定溫度發生的引導錯誤類型，添加物應在該溫度下為雙鏈。對圖9D-9F的比較表明，用添加物EP013， 對首次20個循環使用嚴格退火條件(66.5°C )實現了最少的重複間發散，並且在最不嚴格條件(60. 7°C )下比在中等嚴格性(64. 2V )下的發散更少。後一種結果的解釋在於，事實上，雙鏈的濃度(添加物的作用濃度)在較低退火溫度下較高，說明了添加物濃度和引物退火溫度間的相互關係。從圖9D-9F中可知，用添加物EP013，一個靶序列在反應中擴增顯著不如另一產物序列有效。我們發現，通過將用於效率較低的擴增的限制性引物濃度從50nM 增加到ΙΟΟηΜ，可大大減小差異。III型引導錯誤的抑制添加物可抑制III型引導錯誤。實施例13報導一種實驗，其中LATE-PCR反應進行到65個循環，足以發生III型引導錯誤並且產生由另一擴增子鏈引導一個擴增子鏈而形成的長雙鏈產物。我們測試了 不用添加物的擴增；用Tm十分接近於58°C引物退火溫度(添加物EP047，Tm 59. 1°C )的添加物的擴增；和用添加物混合物的擴增，在混合物中，將少量 (僅約十分之一)的添加物EP047替換為在高於退火溫度的溫度下為雙鏈的添加物。在該實施例中，我們使用了較高Tm的添加物，其Tm(67. 4 °C )基本上高於退火溫度。不用添加物的三次重複擴增的解鏈曲線表明，在65個擴增循環之後，所檢測產物的Tm高於預期產物， 說明發生了產物進化。動力學曲線表明在穩定期中SYBR信號發生增加，也說明發生了產物進化。當限制性引物的5』端通過加入一對A-核苷酸來修飾時，結果仍然相同解鏈曲線示出與所需擴增子相比產物具有更高的Tm。包括600nM濃度的EP047及未修飾限制性引物有少許幫助其將產物進化延遲了若干循環，並且在三次重複的兩次中的某些所檢測產物具有正確Tm。包括600nM的EP047和使用修飾的限制性引物顯著減少了產物進化並且在3次重複中的一次中完全阻止了產物進化。當使用未修飾限制性引物時，包括600nM總濃度的添加物混合物EP043顯著降低了產物進化並且在3次重複中的一次中完全阻止了產物進化。包括600nM的EP043和使用修飾的的限制性引物顯著減少了產物進化並且在3次重複中的兩次中完全阻止了產物進化。因此，經設計具有高於引物退火溫度的Tm的低濃度添加物可抑制III型引導錯誤。另外，效果可被增強，如果使擴增子鏈的3』端富含AT-核苷酸， 這可(必要時)通過修飾限制性引物的5』端來實現。實施例15包括針對示出嚴重III型引導錯誤的RNA靶序列的無添加物對照擴增測定。還表明，包括添加物(雙鏈寡核苷酸及雙鏈寡核苷酸的四鏈混合物)可抑制對照中所見的III型引導錯誤。實施例15顯示添加物、反應混合物和方法未抑制用於將RNA靶標轉變成cDNA靶標的逆轉錄酶。多重反應添加物可以使多種引物對與多種靶序列高度多重反應。實施例8報導12重反應， 即在單一反應混合物中使用12個引物對12個靶序列的重複擴增。該擴增反應為65個循環的LATE-PCR擴增。所述靶序列被包括作為人類線粒體基因組DNA，其以1000個、100個和10個啟動拷貝數包括在反應混合物內。除了不用添加物的對照擴增以外，在反應混合物中還包括濃度為300nM和600nM的添加物EP011。在擴增之後，反應混合物經受電泳分離以確定是否製備了 12個預期產物。另外，進行雙脫氧法測序以評價擴增子。電泳凝膠圖像 (圖1 示出，以1000個拷貝起始但不用添加物的擴增不能產生12個產物的預期組，但用 1000個拷貝加上濃度為300nM和600nM的添加物EPOll起始的擴增產生了 12個產物。凝膠顯示，在該反應中300nM濃度的EPOll不能完全抑制引導錯誤，如通過輕量級產物帶所證實。當添加物EPOll以600nM濃度包括於反應混合物中時，引導錯誤產物未見於該凝膠中。 作為對此終產物的進一步分析，對其測序。測序結果表明，已產生了足夠量的12個擴增子中的每一個以允許通過簡化的Dilute』 N』 Go方案進行雙脫氧法測序。當靶標的起始數目減少到100個和10個拷貝時，發現情況並非如此。1000個拷貝的線粒體DNA的結果表明， 在擴增前和在擴增期間，弓I導錯誤均被成功抑制。添加物混合物添加物的混合物(添加物混合物ΕΡ04!3)在上文結合實施例13作了討論。使用混合物的原因可(例如)通過參考實施例1來理解。結果表明，I型引導錯誤的抑制通常需要適當高濃度的添加物。然而，圖5中的動力學曲線表明，隨著Tm顯著高於引物退火溫度的添加物的濃度提高時，聚合反應的效率傾向於降低。實施例13也表明，可能需要高Tm添加物來抑制III型引導錯誤。添加物的混合物可被設計成抑制兩種類型的引導錯誤，而使擴增效率的減低減小化。在一個實施方案中，使用了包括Tm接近退火溫度的較高濃度(300ηΜ 到IOOOnM)的添加物和在高於退火溫度的溫度時為雙鏈的較低濃度(25nM到300nM)的添加物的混合物，具體而言，Tm高於退火溫度若干度的添加物(或較高退火溫度，如果在反應中使用了兩種添加物)可用於抑制兩種類型的引導錯誤。添加物的混合物可以包含4個不同鏈，即未共有共同鏈的2個雙鏈添加物。可選地，添加物的混合物可以包含3個鏈，即共有共同鏈的2個雙鏈添加物。後一種方法減少了擴增混合物中所包括的不同鏈的數目。我們在實施例3所述的聚合酶選擇性測定中測試了添加物的混合物(未修飾的雙鏈寡核苷酸的混合物和添加物的混合物)。實驗結果實施例4中有所報導。所測試混合物均為3鏈混合物，其中兩個添加物共有共同鏈。混合物均包括高Tm添加物，其Tm為67. 4°C， 高於引物退火溫度(在本實驗中為62°C)若干度；和低Tm添加物，其Tm在57. 4-59. 1°C的範圍內，即稍微低於退火溫度。兩種混合物，添加物041和添加物042，含有未修飾的雙鏈寡核苷酸。當針對較高Tm雜交物以75nM濃度加入和針對較低Tm雜交物以325nM加入時，具有未修飾的寡核苷酸的兩種混合物均僅相對輕微地提高聚合酶的選擇性(小於兩個擴增循環)。我們還測試了添加物的4種混合物。在兩個添加物(EP041，EP04》中，兩個雙鏈寡核苷酸均含有3個Dabcyl修飾物，在一個添加物(EP043)中，較高Tm的寡核苷酸含有3 個Dabcyl，而較低Tm的聚核苷酸含有4個Dabcyl ；並且在一個添加物(EP045)中，兩個寡核苷酸均含有4個Dabcyl。所有4個混合物均比添加物041和042提高更多選擇性。圖 7A-7D和圖8A-8D分別為在600nM的相同總濃度下但較高iTm雜交物量從25nM到IOOnM變化的情況下混合物EP043和EP045的動力學曲線。這些曲線顯示添加物和重複間發散所引起的抑制作用。ACt結果和動力學曲線一起表明，對於每個混合物而言，可能存在混合物中的較高Tm雜交物的最佳量。對於混合物EP043，(a)即便最低濃度05nM)的高Tm組分也提高聚合酶選擇性，(b)通過增加高達IOOnM的高Tm組分的比例並未更多地提高聚合酶選擇性，和(C)製劑中的任何一種均未顯著抑制引物到其匹配靶標的擴增效率。對於混合物 EP045來說，(a)即便最低濃度05nM)的高Tm組分也比ΕΡ043在更大程度上提高聚合酶選擇性，(b)聚合酶選擇性提高高Tm組分濃度的比例，(c)所有劑型均不顯著地抑制其匹配靶標的引物的擴增效率，並且⑷抑制程度隨高Tm組分比例而增加。我們判斷混合物EP043 的最佳劑型為75/600/525nM，並且我們判斷混合物EP045的最佳劑型為50/600/550nM，當這些劑型具有重複間的低發散。 在實施例19中，我們還在測定中測試了添加物混合物ΕΡ043，其中通過使用阻斷物寡核苷酸產生了 3』端錯配。該測定的方案一般性示於圖21Α和圖21Β中。圖21Α、21Β示出了兩個雙鏈靶231、232，它們在限制性引物的結合位點(箭頭23 近下遊存在一個鹼基對的差異(過剩引物鏈中的G或A)。過剩引物的結合位點(箭頭234)也在兩個靶標間被轉變。寡核苷酸阻斷物235為互補於，並且結合到靶標231 (圖21A)，其為待選擇的「錯配」 靶標。阻斷物235為等位基因辨別的，並且錯配於靶232(圖21B)並且未結合至該靶232。 因此，引物233完全結合至靶232並且被延伸，但引物233的3』端不能結合到靶標231，從而防止延伸。在圖21A中，虛線242為由引物233延伸產生的限制性引物鏈。在圖21B中， 虛線243為通過延伸引物233產生的限制性引物鏈。阻斷物235與末端螢光團236和末端淬滅劑237 —同示出，但所有所需的是阻斷物235具有阻斷的3』端核苷酸，以便在擴增期間不可通過DNA聚合酶延伸。在圖21A、21B中所示的具體實施方案中，靶標231、232經示出區別為來自阻斷物235下遊和來自過剩引物234下遊的另一鹼基對(圖21A中的過剩引物鏈241中的G或圖21B中過剩引物鏈244中的C)。螢光團239和淬滅劑240標記的序列特異性探針238結合到靶標231( 「錯配」靶標)的擴增產物，但未結合到靶標232的擴增產物，並在雜交後產生信號。探針238在不用於提高聚合酶選擇性的意義上為任選的。例如，其可用於擴增產物的解鏈分析。實施例19表明，就誘導的II型引導錯誤而言，當添加物降低擴增效率時，以熱循環依賴方式延遲了擴增，並且當由於存在添加物所致選擇性增強的量度也為熱循環依賴性時，選擇性的明顯增強需要針對效率的熱循環依賴性降低來矯正。實施例19中示出了一種方法，用於在存在阻斷物的情況下並且存在/不存在添加物的情況下使用一系列靶標稀釋反應進行矯正。我們在上述實施例8的12重反應中使用了添加物混合物EP043，以觀察是否能產生足量的所有12個產物用於測序。對於這些實驗，我們通過加入富含AT的尾部修飾了限制性引物，並且我們將擴增反應從65個循環擴展到80-90個循環。通過這些修飾，當包括鏈濃度為50/600/550nM的添加物混合物EP043並且基因組線粒體DNA的起始量為僅100 個拷貝或10個拷貝時，以測序所需量成功製備了所有12個預期產物。這些結果表明，在擴增之前和擴增期間成功阻止了引導錯誤，儘管實際上擴增的延伸長度對III型引導錯誤的抑制構成嚴格測試。在實施例12中，我們在限制性引物的3』端上有所不同的LATE-PCR擴增反應中， 測試了總濃度為600nM的混合物EP043。一個反應包括具有富含GC的3，端(GGC)的限制性引物。其它反應包括具有富含AT的3』端(AAG)的限制性引物。相比無添加物的對照，在擴增中包括添加物EP013 (3個Dabcyl修飾物，Tm 60°C )及富含GC3，端的引物導致聚合化 G個循環的Ct延遲)效率相對很小的降低。然而，相比無添加物的對照，包括相同濃度的相同添加物及具有富含AT 3』端的引物導致效率顯著更大的降低(11個循環的Ct延遲)。 在繼續進行70個循環的兩個反應中，相比無添加物對照，添加物EP013顯著降低4個重複中的發散。7推 IhTf^P^弓I雑胃通過在用於實時檢測的PCR循環中包括低溫檢測步驟，增加了 II型引導錯誤的可能性。通過延長LATE-PCR擴增以生成單鏈產物增加了 III型引導錯誤。我們已測試了我們稱為「冷終止」的方案，其中，作為對實時、低溫檢測的替換，在一個或若干個中間點中斷擴增反應以便進行可以包括低溫步驟的操作。實施例10示出「冷終止」方案，其中操作為解鏈分析。實施例10中的擴增為使用螢光檢測的雜交探針進行的70個循環的2步LATE-PCR 擴增。以600nM濃度測試添加物EP010。為了比較，用實時檢測進行了擴增。對於實時檢測，在擴增循環的每個退火/延伸步驟後加入低溫檢測步驟(60°C)。作為熱循環函數的探針螢光示於圖14A中，該圖示出用1000個、100個和10個靶序列拷貝起始的擴增的重複間的適度發散。圖14A也示出循環70附近開始會聚的初始靶的三個量的曲線。包括實時、低溫檢測增加了 II型引導錯誤的機會。我們重複用無實時低溫檢測但具有40個循環後的中斷的所有三個起始拷貝數的擴增以在45°C下進行解鏈起始。然後，我們重新起始擴增以在 70個循環後結束，此時進行第二次解鏈。第一次解鏈的解鏈曲線示於圖14B中。三個不同起始量的靶的重複有明顯區別並且示出很小發散。第二次解鏈的解鏈曲線示於圖14C中。 在循環70附近，初始靶量的三個水平的曲線已會聚，並且檢測到很小的發散。為解釋圖14B和圖14C中所示結果，描述以下內容。如果引導錯誤由於低溫中斷而發生，則單鏈DNA將轉變為雙鏈DNA，並且單鏈產物的量將在循環40和循環70之間下降。 此狀況並未發生。如果引導錯誤在40個循環後的中斷期間發生，重複間的發散將在循環40 和循環70之間增加。此狀況並未發生。如果引導錯誤在中斷期間發生，由不同量的初始靶標產生的單鏈產物量在70個循環之後將不能達到平衡。此狀況並未發生。圖14A、圖14B 和圖14C的比較表明，添加物EP046在此「冷終止」擴增中完全抑制所有類型的引導錯誤。 具有單個中斷的「冷終止」方案消除在循環40前和在循環41後的任何低溫步驟。這降低了在除循環41之外的所有循環期間II型和III型引導錯誤的機會。該第一解鏈包括在低於引物退火溫度的溫度下的較長時間(在該實施例中，約15分鐘)，從而增加了在解鏈(其可能包括錯誤引導的3』端的一個延伸)期間引導錯誤的可能性，作為交換在其它循環中消除低溫步驟。該折衷選擇可以幫助減少重複間發散。應了解，「冷終止」方案可用於篩選針對其對引導錯誤的效果來添加物組合物和濃度。DNA聚合酶的5』核酸外切酶活件的抑制作用添加物可有效抑制具有5』核酸外切酶活性的DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶和 Tfi (+) DNA聚合酶)的該活性。(此效果不適用於不具有該活性的DNA聚合酶，例如Klenow 片段，其不具有5』核酸外切酶域，和Tfi (-)DNA聚合酶，其包含修飾的而使其失活的5』核酸外切酶域)。我們發展了實施例6中所報導的測定，作為不依賴引物的方式用於測量添加物對DNA聚合酶的5』核酸外切酶活性的抑制效果。在該測定中，螢光團和淬滅劑雙標記的不可延伸探針被雜交到不具有反應混合物中所包括的引物的靶標。然後，反應混合物經受熱振蕩，其中溫度在45°C與60°C之間循環45次，在此期間，實時檢測探針螢光。探針裂解導致指示聚合酶的5』核酸外切酶活性的螢光增加。若干添加物以300nM的濃度在此測定中進行了測試，並且與包括探針但沒有靶標的對照測定進行了對比。在對照測定中，無雜交物形成，並且探針未裂解。在包含探針和靶而無添加物的測定中，螢光發生較大增長。在包含探針、靶和添加物的測定中，相比於具有靶標而無添加物的測定，螢光增長明顯減少，表明顯著抑制了 5』核酸酶活性。分別具有3個和4個共價連接的Dabcyl基的添加物EP004 和EP001，完全抑制了對探針的不依賴引物的5』核酸外切酶裂解。添加物EP008(在其各 5』核苷酸上具有共價連接的Dabcyl基)也完全抑制此測定中的引物獨不依賴5』核酸外切酶活性。相比之下，添加物EP009(在其每個3』核苷酸上具有共價連接的Dabcyl基)僅部分抑制此測定中的不依賴引物的5』核酸外切酶活性。結果表明雙鏈寡核苷酸上的Dabcyl 修飾物基團可增強以位置依賴性方式抑制5』核酸外切酶活性。優選在添加物的兩個5』端上的Dabcyl基，與兩個Dabcyl基相比，優選的是三個和四個Dabcyl基。加成實驗顯示針對Tfi (+)DNA聚合酶的一致結果。如實施例18中報導，我們以不同量的三個添加物進行實施例6的溫度-振蕩測定，所述添加物具有22個鹼基對的單鏈區域和6個核苷酸長的單鏈突出端。添加物的序列在實施例16中給出。添加物包含兩個形成髮夾的鏈，如圖18C中所示。此類添加物包括兩個、三個、或四個Dabcyl基作為修飾物。如圖20所示，具有兩個Dabcyl修飾物的添加物以濃度依賴性方式抑制了 iTaq DNA聚合酶的不依賴引物的5』核酸外切酶活性，200nM和400nM 的濃度較大地抑制活性並且600nM的濃度幾乎完全抑制活性。具有三個和四個修飾物的所測試添加物還以濃度依賴性方式抑制了聚合酶的不依賴引物的5』核酸外切酶活性，但程度不及圖20中所示的結果。為量度在PCR擴增期間對5』核酸酶活性的抑制作用，我們使由實施例5中所述 LATE-PCR擴增產生的探針和擴增子經受雜交條件，然後解鏈分析。探針的反應混合物單獨地也經受解鏈分析。實施例7中報導了該實驗，並且解鏈曲線示於圖IlA和圖IlB中。在圖IlA中比較單獨來自探針和來自無添加物的擴增的螢光表明某些探針分子被裂解解鏈完成後來自擴增反應的螢光沒有下跌到探針螢光的水平。圖IlB表明當包括600nM濃度的添加物EP013的擴增反應混合物時，由於聚合酶(在這種情況下為Taq DNA聚合酶)的5』 核酸酶活性導致的探針裂解被抑制解鏈完成後來自擴增反應的螢光下跌到探針螢光的水平。作為PCR引物的添加物實施例14示出PCR引物形式的添加物。為將用於LATE-PCR擴增的典型過剩引物轉變成抑制I型引導錯誤的添加物，進行了兩個操作首先，修飾基團(在這種情況下為 Dabcyl基)被添加到引物5』端；其次，部分互補於過剩引物且具有5』端Dabcyl基和3』 端Dabcyl基的反向互補鏈以100、200或300nM的濃度被包括於反應混合物。通過將若干錯配引入反向互補鏈(可選地，可降低反向互補鏈的長度)，相對於由過剩引物和靶序列形成的雜交物的Tm，過剩引物和反向互補鏈形成的雜交物的Tm降低。由過剩引物和反向互補鏈形成的雜交物包括三個修飾基團。雙鏈擴增產物的解鏈分析表明，在反應混合物中包括200nM或300nM濃度的反向互補序列產生具有極少到沒有其它產物的期望的擴增子，並且解鏈曲線顯示極少的重複間發散。相比之下，反應混合物中無反向互補序列的擴增產生預期擴增子和較低Tm產物的混合物，並且解鏈曲線顯示出重複間發散。上述實施例試圖示例添加物、反應混合物和方法的某些優選實施方案並且不應被解釋為窮舉性的或限制性的。許多變化是可能的並且將對所屬領域的技術人員顯而易見。 例如，可使用除PCR以外的擴增方法，並且添加物可以為除雙鏈DNA分子之外的分子的修飾版本。其它變化將對所屬領域的技術人員顯而易見。
實施例實施例1. I型引導錯誤的抑制使用單個引物對和單個靶標進行LATE-PCR測定以生成雙鏈和單鏈擴增子。通過在擴增末端的解鏈分析來表徵雙鏈產物。除雙鏈寡核苷酸之外的反應成分，以及反應條件如下。限制性引物 5' CCTGGATTATGCCTGGCACCAT (SEQ ID No. 1)過剩引物5 『 CCTTGATGACGCTTCTGTATCTA (SEQ ID No. 2)靶標5 『 CCTGGATTATGCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCATCAAAG(SEQ ID No. 3)在由以下組成的25 μ 1體積中進行LATE-PCR擴增1X PCR緩衝液(Invitrogen， Carlsbad, CA) ,3mM MgCl2、250nM dNTP、50nM 限制性引物、IOOOnM 過剩引物、0. MX SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA) >1. 25Taq DNA M^n^ (Invitrogen, Carlsbad, CA)及人類基因組DNA的大約1000個基因組(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。使用濃度為50、100、300、600、和IOOOnM的添加物，對每個添加物進行一式三份的擴增反應，以及無添加物反應。這些反應的熱曲線條件如下95°C /10s-55°C /30s-70°C /30s，10個循環，然後 95°C /10s-50°C /30s-70°C /30s,40個循環，然後，在55°C開始解鏈，間隔30秒遞增1°C直到 97 °C。使用雙鏈DNA產物的STOR Green螢光(_dF/dT，SYBR)的第一衍生物，通過解鏈曲線分析在50個循環結束時分析反應。另外，針對某些反應，分析產生雙鏈產物的動力學
29(作為熱循環的函數的STOR強度讀數)。A. 16mer16個核苷酸長的以下添加物中的每一個均包括在起始反應混合物中(末端阻斷物C3為3碳連接鏈):16merA. 5' CACGACCTCGCCGACC (C3)(C3)GTGCTGGAGCGGCTGG 5' (SEQ ID No. 4)16merB. 5' CACGACCTCGCTGACC (C3)(C3)GTGCTGGAGCGACTGG 5' (SEQ ID No. 5)EP048 在頂鏈的 3，端具有一個 Dabcyl 的 16merB(SEQ. ID No. 6)EP049 在底鏈的 3，端具有一個 Dabcyl 的 16merB(SEQ ID No. 7)EP027 具有兩個 Dabcyl ( 一個在每個鏈的 3，端)的 16merB(SEQ ID No. 8)無添加物下，擴增產生除「正確」產物以外的產物，S卩，除了引物定義的雙鏈產物 (擴增子)以外的產物。包含300nM濃度的添加物16merA的三次重複擴增反應的解鏈曲線示於圖1中，指向下方的箭頭標識了預期產物。圓圈11為三次重複的曲線。判斷該擴增十分良好，因為(1)製備了正確產物而普遍排除不正確產物，並且( 三次重複十分一致(重疊曲線)。較高濃度的16merA獲得了相同結果。在較低濃度(50nM，IOOnM)下，發現了大量不正確產物，並且三次重複不一致。300nM濃度的添加物16merB的解鏈曲線示於圖2中。圓圈21為三次重複的曲線。判斷該擴增十分不可接受，因為發現大量不正確產物，並且三次重複不一致。在任何所用濃度下，均未發現擴增生成正確產物而普遍排除不正確產物，並且在任何濃度下重複均未高度一致。所述不正確產物顯著不同於無添加物情況下獲得的不正確產物，指示添加物 16merB導致引導錯誤。600nM濃度的添加物EP049的解鏈曲線示於圖3中，通過指向下方的箭頭標識預期產物。圓圈31為三次重複的曲線。判斷該擴增十分良好，因為(1)製備了正確產物而普遍排除不正確產物，並且(2)三次重複十分一致(重疊曲線)。用較高濃度獲得了相同結果， 但較低濃度在重複間不一致並且提供了不正確產物。添加物EP048示出IOOnM和600nM濃度的更一致產物，指示出兩個鏈均能夠引導錯誤。IOOnM濃度的添加物EP027的解鏈曲線示於圖4中，通過指向下方的箭頭標識預期產物。圓圈41為三次重複的曲線。判斷該擴增為良好而非十分良好，因為(1)製備了正確產物而普遍排除不正確產物，並且(2)三次重複相當地一致，曲線間振蕩較小。在該添加物的較高濃度下，判斷結果為十分良好，因為三次重複十分一致。然而，在50nM下，製備了大量的不正確產物，並且重複並不一致。EP027的擴增動力學分析示於圖5中。圓圈51為IOOnM濃度的三次重複；圓圈52 為300nM濃度的三次重複；圓圈53為600nM濃度的三次重複；並且圓圈M為IOOOnM濃度的三次重複。在IOOnM濃度下，穩定區域中的三次重複間存在發散。包含300nM的三次反應具有完全重疊的動力學並且比包含600或IOOOnM的反應具有更高的效率。因此，300nM 的EP027在此測定中為最佳量。B.其它添加物由未添加修飾物的長度為12個、18個、20個、22個和M個核苷酸的雙鏈寡核苷酸組成的若干添加物以50nM、100nM、300nM、600nM和IOOOnM的濃度在該實施例的測定中進行試驗。如在A部分中討論的16mers，結果是不一致的。例如，在試驗的三個不同12mer中， 一個在所有濃度下未能產生正確產物，一個僅在IOOOnM濃度下產生正確產物，並且一個在 600nM和更高濃度下產生正確產物。在試驗的八個較長寡核苷酸中，甚至在600和IOOOnM 的最高濃度下，一半產生了大量的不正確產物。在300nM濃度下，僅三個產生了正確產物而普遍排除不正確產物，並且沒有一個在更低濃度下做到如此。我們判斷添加物22merA在此測定中為最佳(末端阻斷物P為磷酸酯)22merA. 5『 GGAGCAAAATAGCAATGAGGTAppCCTCGTTTTATCGTTACTCCAT 5' (SEQ ID No. 9)還測試了由包括兩個或四個末端修飾物並且長度為8個、11個和22個核苷酸的雙鏈寡核苷酸組成的若干添加物。修飾物為Dabcyl或地高辛配基(DIG)添加物EP010. 5' DabcylGGTCAGATGAAAATGATACGTGDabcylDabcyl CCAGTCTACTTTTACTATGCAC Dabcyl 5'(SEQ ID No. 10)添加物EPO18. 5' GGTCAGATGAAAATGATACGTGDabcylDabcyl CCAGTCTACTTTTACTATGCAC 5'(SEQ ID No. 11)添加物EP020. 5' Dabcyl GAAATAAAATAAAAATAAAATADabcylDabcyl CTTTATTTTATTTTTATTTTAT Dabcyl 5'(SEQ ID No. 12)添加物EP021.5' DabcylCAGCCGGCDabcylDabcyl GTCGGCCG Dabcyl 5' (SEQ ID No. 13)添加物EP022. 5' Dabcyl CCGCCGGC DabcylDabcyl GGCGGCCG Dabcyl 5' (SEQ ID No. 14)添加物EP023. 5' DabcylGCGTACGCAGGDabcylDabcyl CGCATGCGTCC Dabcyl 5' (SEQ ID No. 15)添加物EP024. 5' DabcylGCGTACGAAGGDabcylDabcyl CGCATGCTTCC Dabcyl 5' (SEQ ID No. 16)添加物EP026. 5' DIG GGAGCAAAATAGCAATGAGGTA DIGDIG CCTCGTTTTATCGTTACTCCAT DIG 5'(SEQ ID No. 17)添加物EP028. 5' DabcylTGAGAGATGAAAATGATCGAGTDabcylDabcyl ACTCTCTACTTTTACTAGCTCA Dabcyl 5'(SEQ ID No. 18)添加物EP029. 5' GGTCAGATGAAAATGATACGTG DIGDIG CCAGTCTACTTTTACTATGCAC 5'(SEQ ID No. 19)所有這組添加物在等於或小於600nM的濃度下產生了正確產物而普遍排除了其
它產物。除了一個(EP021)以外，所有均在300nM或更小濃度下做到如此。添加物EP028在IOOnM濃度下做到如此，並且添加物EP010在50nM濃度下做到如此。實施例2. I型引導錯誤的抑制在針對具有不同引物的不同靶標的測定使用未修飾的雙鏈寡核苷酸22merA(判斷為實施例1中的最佳未修飾添加物)以及若干Dabcyl-修飾的寡核苷酸。在擴增起始之前以100和300nM的濃度將各添加物分別加入LATE-PCR擴增反應混合物。使用雙鏈DNA 產物的STOR Green螢光(_dF/dT，Sybr)的第一衍生物，通過解鏈曲線分析在50個循環結束時分析反應。另外，針對某些反應分析產生雙鏈產物的動力學(Sybr強度讀數作為熱循環的函數)。除雙鏈寡核苷酸之外的反應成分以及反應條件如下。限制性引物 5' AAATTGCGTCATTGTTTCACAGGGCCA(SEQ ID No. 20)過剩引物5 『 AATCTGGGTGGTGGTCATAC (SEQ ID No. 21)靶標5' AATCTGGGTGGTGGTCATACAGGTCATCACTGTAAAATTCTTTGAACTTTTCTGTATATATCTTTGAAAATTTTGGAAAAAAAATGTTGGAAAACTTAAAAGGCTGTTGCTTTGCTCATATTGGCGGTACATATACAAAAGTGGAAAGGATGAGATTGATTGGCATGGCCCTGTGAAACAATGACGCAATTT(SEQ ID No. 22)在由以下組成的25 μ 1體積中進行LATE-PCR擴增IX InvitrogenPCR緩衝液 (Invitrogen, Carlsbad, CA)、3mM MgCl2、250nM dNTP、50nM 限制性引物、IOOOnM 過剩引物、0.24X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA)及人類基因組 DNA 的大約 1000 個基因組(Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)。這些反應的熱曲線條件如下25°C下30分鐘，然後 950C /10s-62°C /20s-70°C /20s, 50個循環，然後以55°C /30s開始解鏈並且42個循環的 1°C遞增。(縮寫「S」，如20s，表示「秒」。)使用雙鏈DNA產物的STOR Green螢光(解鏈曲線分析)的第一衍生物在50個循環結束時分析所有反應。測試了以下添加物添加物2^erA. 5 『 GGAGCAAAATAGCAATGAGGTAppCCTCGTTTTATCGTTACTCCAT5『(SEQ ID No. 9)添加物EP001.5' DabcylGGAGCAAAATAGCAATGAGGTADabcylDabcyl CCTCGTTTTATCGTTACTCCAT Dabcyl 5'(SEQ ID NO. 23)添加物EP002.5' DabcylGGAGCAAAATAGCAATGAGGTADabcylpCCTCGTTTTATCGTTACTCCAT Dabcyl 5'(SEQ ID No. 24)添加物EP003. 5' GGAGCAAAATAGCAATGAGGTADabcylDabcyl CCTCGTTTTATCGTTACTCCAT Dabcyl 5'(SEQ ID No. 25)添加物EP004.5' Dabcyl GGAGCAAAATAGCAATGAGGTApDabcyl CCTCGTTTTATCGTTACTCCAT Dabcyl 5'(SEQ ID No. 26)
32
添加物EP005.5' DabcylGGAGCAAAATAGCAATGAGGTADabcylDabcyl CCTCGTTTTATCGTTACTCCAT 5'(SEQ ID No. 27)添加物EP006. 5' DabcylGGAGCAAAATAGCAATGAGGTApDabcyl CCTCGTTTTATCGTTACTCCAT 5'(SEQ ID No. 28)添加物EP007. 5' GGAGCAAAATAGCAATGAGGTADabcylpCCTCGTTTTATCGTTACTCCAT Dabcyl 5'(SEQ ID No. 29)添加物EP008. 5' DabcylGGAGCAAAATAGCAATGAGGTAppCCTCGTTTTATCGTTACTCCAT Dabcyl 5'(SEQ ID No. 30)添加物EP009. 5' GGAGCAAAATAGCAATGAGGTADabcylDabcyl CCTCGTTTTATCGTTACTCCAT 5'(SEQ ID No. 31)添加物EP020.5' DabcylGAAATAAAATAAAAATAAAATADabcylDabcyl CTTTATTTTATTTTTATTTTAT Dabcyl 5'(SEQ ID No. 12)添加物EP052. 5' DabcylGGAGCAAAATAGCAATGAGGTADabcylpCCTCGTTTTATCGTTACTCCAT5'(SEQ ID No. 32)添加物EP053. 5' GGAGCAAAATAGCAATGAGGTApDabcyl CCTCGTTTTATCGTTACTCCAT Dabcyl 5'(SEQ ID No. 33)判斷300nM濃度的雙鏈寡核苷酸22merA為十分良好，因為(1)產生了正確產物
而普遍排除不正確產物，和(2)三次重複十分一致(重疊曲線)。然而，IOOnM濃度22merA 卻並非如此，因為其中一個重複並未普遍排除不正確產物。同樣，判斷所有含Dabcyl添加物在300nM下十分良好。還判斷它們中的五個(EP00U EP002、EP003、EP004和EP005)在 IOOnM濃度下為十分良好。圖6示出用添加物EP003和用添加物22merA在IOOnM濃度下的三個重複反應的解鏈曲線。圓圈61為添加物22merA的三次重複。圓圈62為添加物EP003 的三次重複。實施例3. II型引導錯誤和聚合酶選擇性我們進行了 LATE-PCR測定，其中我們擴增了互補於兩個引物(匹配靶標)的靶標，並且其中我們分別擴增了互補於過剩引物但含有對限制性引物的3』端核苷酸的單一錯配的靶標。我們實時檢測了雙鏈產物，即，在每個PCR循環的引物退火部分期間，通過DNA 染料(在這種情況下為STOR Green)。在存在任何濃度添加物的情況下對3』端錯配的選擇性為在來自錯配靶標擴增的信號的閾值循環(Ct)與來自匹配靶標擴增的信號的Ct之間的差值(ACT)。一式三份地進行擴增反應。Ct差值使用三次重複的平均值來計算。用於提高 DNA聚合酶的選擇性的添加物的效果為具有添加物的Ct差值減去無任何添加物的Ct差值。在這個和隨後實施例中的標題「選擇性」下，我們以Ct單位(S卩，作為ACt)報導了由添加
物的使用產生的Ct差值的提高。 引物和單鏈靶的序列如下 限制性引物 5 『 CGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAGT(SEQ ID NO. 34)過剩引物5' GCCCAAGTTTTATCGTTCTTCTCA(SEQ ID NO. 35)匹配靶標(A).5 『 CGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAG A AGGTTCTAAGTGCCATGATACAAGCTTCCCAATTACTAAGTATGCTGAGAA GAACGATAAAACTTGGG(SEQ ID No. 36)錯配靶標⑴.5 『 CGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAG T AGGTTCTAAGTGCCATGATACAAGCTTCCCAATTACTAAGTATGCTGAGAAGAACGATAAAACTTGGGCAA(SEQ IDNo. 37)劃線和加粗的核苷酸為其過剩引物鏈中的互補物將匹配或錯配限制性引物的3』 端核苷酸的核苷酸。在由以下組成的25μ1體積中一式三份地(三次重複測定)進行LATE-PCR擴增:ix Invitrogen PCR 緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3mM MgCl2、250nM dNTP、50nM 限制性引物、IOOOnM 過剩引物、0. 24X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA)、1. 25 單位 Platinum Taq DNA聚合酶 Qnvitrogen,Carlsbad，CA)及大約 1000個單鏈靶A(匹配的)或 T(錯配的)。這些反應的熱曲線條件為95°C 3分鐘，然後95°C /5s-62°C /20s-72°C /30s, 60個循環。對於包含兩個靶標的這個和其它測定，我們進行了對照擴增，使用過剩引物(其完全互補於兩個靶標)和對照限制性引物(其也完全互補於兩個靶標)以確保兩個靶標的起始拷貝數相同，在此情況下，兩個靶標的(^相同。(如果對照擴增顯示起始拷貝數不相同， 則有兩個選擇重新配製，或者，如果Ct差值輕微-如在本文報導的實施例中那樣的情況， 則矯正所觀察到的Ct值以針對差值來調整。)在報導Tm時，其為無修飾物的雙鏈添加物的計算解鏈溫度。本說明書中所述雙鏈添加物的Tm是根據以下文獻計算Markhan和ZukerOOi^)DINAMELT web server for nucleic acid melting prediction, Nucleic Acids Res 33 :W577_W581,以及 Markham 禾口 Zuker(2008)UNAF0LD :software for nucleic acid folding and hybridization。 ^t Keith, J. M. He, BI0INF0RMATICS,Structure, Functions and Applications, No. 453 於 Methods in Molecular Biology, Ch. 1,第 3-31 頁(Humana Press, Totowa, New Jersey. ISBN 978-1-60327-428-9。A.無添加物該測定在沒有添加物的情況下進行。實時檢測STOR Green信號，S卩，在所有PCR 循環的引物退火部分期間。作為擴增循環次數的函數的螢光強度讀數表明該酶對匹配靶標具有合適的固有選擇性。當在測定中測試添加物時，也包括了無添加物對照，並且從針對添加物的匹配和錯配靶序列之間的Ct差值上減去針對無添加物對照的匹配和錯配靶序列間的Ct差值以達到所呈現的選擇性提高數目(Δ Ct)。
B.無修飾物的雙鏈添加物以下22個核苷酸長的雙鏈寡核苷酸(命名為「22merA」，其中各鏈的3'端用磷酸酯(P)加帽以阻止通過DNA聚合酶延伸)以三個不同濃度用作添加物22mer A. 5『 GGAGCAAAATAGCAATGAGGTAppCCTCGTTTTATCGTTACTCCAT 5 『 (SEQ ID NO. 9)選擇性的結果(錯配靶Ct減去匹配靶Ct)示於表1中。表 權利要求
1.一種用於引物依賴性DNA擴增反應的反應混合物，所述擴增反應包括通過用於擴增至少一個DNA靶序列的DNA聚合酶來引物延伸，所述反應混合物包括至少一個引物對、DNA 聚合酶和dNTP，改良處包括在擴增起始前將至少一個雙鏈寡核苷酸添加物包括在反應混合物內，該雙鏈寡核苷酸添加物具有6-50個核苷酸長的雜交物長度，在32°C下至少50%為雙鏈，在其每條鏈上具有末端區並且包括1-4個修飾基團，每個修飾基團均共價連接到不同末端區，所述修飾基團為不具有非平面大體積部分的多環部分，其中所包括的所述至少一個雙鏈寡核苷酸添加物的濃度與所述DNA聚合酶濃度有關並且對於以下功能的至少一個是有效的抑制引導錯誤、提高聚合酶對具有未完全互補的3』凹端序列的雜交物的選擇性、提高聚合酶對具有富含AT的3』凹端序列的雜交物的選擇性、減少重複反應間的發散、 抑制聚合酶5』核酸外切酶活性、以及抑制聚合酶活性；條件是，如果添加物為任何靶序列的引物或檢測探針，則其包括至少三個修飾基團。
2.根據權利要求1所述的擴增反應混合物，其中所述至少一個修飾基團為2-4個修飾基團。
3.根據權利要求2所述的擴增反應混合物，其中所述2-4個修飾基團為3個修飾基團。
4.根據權利要求3所述的擴增反應混合物，其中所述添加物包括第一鏈，其為所述至少一個靶序列的引物或探針；和反向互補鏈，其部分互補於所述第一鏈。
5.根據權利要求2所述的擴增反應混合物，其中所述2-4個修飾基團為4個修飾基團。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的擴增反應混合物，其中所述修飾基團共價連接到所述至少一個雙鏈寡核苷酸添加物的末端核苷酸。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的擴增反應混合物，其中所述修飾基團為Dabcyl。
8.根據權利要求2所述的擴增反應混合物，其中所述至少一個添加物為兩種添加物的混合物。
9.根據權利要求8所述的擴增反應混合物，其中所述混合物由三個鏈組成。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的擴增反應混合物，其中所述至少一個雙鏈寡核苷酸添加物由天然核苷酸組成。
11.根據權利要求1-9中任一項所述的擴增反應混合物，其中所述至少一個雙鏈寡核苷酸添加物為DNA。
12.根據權利要求1-3和5-11中任一項所述的擴增反應混合物，其中所述至少一個添加物不是所述至少一個靶序列的弓I物或探針。
13.根據權利要求1-12中任一項所述的擴增反應混合物，其中所述至少一個雙鏈寡核苷酸添加物的濃度超過ΙΟΟΟηΜ。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的擴增反應混合物，還包括逆轉錄酶。
15.根據權利要求1所述的擴增反應混合物，其中所述至少一個雙鏈添加物包括1至4 個單鏈突出端。
16.根據權利要求15所述的擴增反應混合物，其中所述至少一個雙鏈添加物包含至少一個鏈，所述鏈在未雜交時，形成莖-環結構。
17.一種用於擴增至少一個DNA靶序列的方法，所述方法包括使所述至少一個DNA靶序列與根據權利要求1所述的擴增反應混合物接觸；和使所述反應混合物經歷具有引物退火溫度和引物延伸溫度的引物依賴性DNA擴增反應。
18.根據權利要求17所述的方法，其中使所述至少一個DNA靶序列與所述反應混合物接觸是由加入所述至少一個單鏈形式的DNA靶序列到所述反應混合物中所組成。
19.根據權利要求17所述的方法，其包括逆轉錄RNA以獲得至少一個DNA靶序列。
20.根據權利要求17所述的方法，其中所述至少一個修飾物為2-4個修飾物。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述雙鏈寡核苷酸具有在引物退火溫度到引物退火溫度以下不超過5°C的範圍內的解鏈溫度Tm。
22.根據權利要求20所述的方法，其中所述雙鏈寡核苷酸具有高於所述引物退火溫度的解鏈溫度Tm。
23.根據權利要求17所述的方法，其中所述添加物具有三個修飾基團並且包括第一鏈，其為所述至少一個靶序列的引物或探針；和反向互補鏈，其部分互補於所述第一鏈。
24.根據權利要求20所述的方法，其中所述至少一個添加物為兩種添加物的混合物。
25.根據權利要求22所述的方法，其中所述混合物包括第一添加物，其具有Tm在所述引物退火溫度到所述引物退火溫度以下不超過5°C的範圍內的雙鏈寡核苷酸；和第二添加物，具有Tm高於所述引物退火溫度的雙鏈寡核苷酸。
26.根據權利要求25所述的方法，其中每個添加物包括3-4個修飾基團。
27.根據權利要求17-26中任一項所述的方法，其中所述引物依賴性擴增反應為聚合酶鏈反應(PCR)擴增反應。
28.根據權利要求17-26中任一項所述的方法，其中所述引物依賴性擴增為LATE-PCR 擴增反應。
29.根據權利要求17- 中任一項所述的方法，其中所述至少一個DNA靶序列逆轉錄自 RNA靶序列。
30.一種擴增測定方法，其包括根據權利要求17-29中任一項所述的擴增和在擴增期間實時或在擴增後端點對反應的單鏈產物、反應的雙鏈產物、或兩者進行螢光檢測，其中所述反應的雙鏈產物用螢光DNA染料檢測，所述反應的單鏈產物用至少一個螢光標記的雜交探針檢測，或兩者均有。
31.一種擴增至少一個DNA靶序列的試劑盒，所述試劑盒包括所述用於根據權利要求 1-16中任一項所述的反應混合物的試劑。
32.根據權利要求31所述的試劑盒，還包括逆轉錄酶。
33.根據權利要求31或32所述的試劑盒，還包括DNA染料。
34.根據權利要求31-33中任一項所述的試劑盒，還包括用於所述至少一個靶序列的螢光標記的檢測探針。
35.一種修飾的雙鏈寡核苷酸，所述修飾的雙鏈寡核苷酸在其各鏈上具有末端區，具有 6-50個核苷酸長的雜交物長度，在32°C下至少50%為雙鏈，並且包括2-4個修飾基團，所述修飾基團各自共價連接到不同末端區，所述修飾基團為不具有非平面大體積部分的多環部分，所述修飾寡核苷酸能夠抑制DNA聚合酶的所述5』核酸外切酶域。
36.根據權利要求35所述的修飾的寡核苷酸，其中所述雙鏈寡核苷酸為DNA。
37.根據權利要求35或36所述的修飾的寡核苷酸，其中所述修飾基團連接到末端核苷酸。
38.一種根據權利要求35-37中任一項所述的兩個修飾的雙鏈寡核苷酸的混合物。
39.根據權利要求38所述的混合物，其中所述兩個雙鏈寡核苷酸包含三個鏈。
40.根據權利要求1所述的擴增反應混合物，其中所述DNA聚合酶為熱穩定的。
全文摘要
本發明涉及修飾的雙鏈寡核苷酸，其在每個鏈上具有末端區，具有6-50個核苷酸長的雜交物長度，具有至少32℃的解鏈溫度Tm，並且包括2-4個修飾基團，每個修飾基團共價連接到不同末端區，優選連接到末端核苷酸，所述修飾基團為不具有非平面大體積部分的多環取代基，所述修飾的寡核苷酸能夠結合到DNA聚合酶的5』核酸外切酶域，並且當以通常不高於2000nM的濃度包括在PCR或其它引物依賴性DNA擴增反應中時，該濃度對於以下功能的至少一個是有效的抑制引導錯誤、增加聚合酶對3』端錯配的選擇性、增加聚合酶對富含AT 3』端的選擇性、減少重複間發散、抑制聚合酶5』核酸外切酶活性和抑制聚合酶活性；以及包含此類修飾的雙鏈寡核苷酸的擴增反應混合物，和包括此類修飾的雙鏈寡核苷酸的擴增反應、擴增測定和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102421918SQ201080020170
公開日2012年4月18日 申請日期2010年3月11日 優先權日2009年3月12日
發明者J·賴斯, L·J·萬, N·賴斯, 賈豔偉 申請人:布蘭代斯大學