對咪唑啉酮除莠劑具有抗性的甜菜植物的製作方法
2023-10-30 19:45:17 4
專利名稱：對咪唑啉酮除莠劑具有抗性的甜菜植物的製作方法
背景技術：
(1)發明概述本發明涉及一種方法，用於產生用於除草的咪唑啉酮除莠劑具有抗性的甜菜植物(Beta vulgaris L.)。具體地說，本發明涉及通過用培養基中的該除莠劑和細胞篩選編碼乙醯乳酸合酶(ALS)或亦稱為乙醯羥酸合酶(AHAS)的基因的突變而由敏感甜菜所產生的甜菜。
(2)相關技術的描述先有技術已描述了採用重組方法對乙醯乳酸合酶基因進行的遺傳改變，如Bedrook等人的美國專利5,013,659號、5,141,870號和5,378,824號所展示。這種類型的對甜菜植物的修飾已由′824號專利的實施例4展示。但在產生繁殖真正具有對除莠劑抗性的植物運一方面，這些結果不太令人滿意。
人們已經發展得到了各種抗性植物並將它們雜交育種。Saunders等人在Crop Science32:1357-1360(1992)中也描述了通過在含有磺醯脲類除莠劑的培養基中篩選突變細胞，從敏感自交能稔克隆(REL-1)產生對除莠劑具有抗性的甜菜植物(CRl-B)。Hart等人(Weed Sci.40:378-383(1992)和Weed Sci.41:317-324(1993))進一步記述了抗性系的特徵並確定這種抗性是來源於ALS活性的改變，對其它抑制ALS的除莠劑沒有顯示出交叉抗性，並且是由一個單一的半顯性基因編碼。
還沒有出版物描述通過修飾甜菜植物中的ALS或AHAS而獲得的對咪唑啉酮的抗性。已經發展得到具有該抗性的各種玉米系，如Newhouse等人在Theoretical and Applied Genetics83:65-70(1991)中所述。
進行作物保護的一種工業途徑是使用如歐洲專利375,875號所述的「安全劑」。這種方法在土壤中引入了另一種化學物質。優選的方法是研製對咪唑啉酮除莠劑具有抗性的甜菜植物。
目標因此，本發明的一個目標就是提供一種方法，通過篩選乙醯乳酸合酶基因的突變，這種突變編碼對咪唑啉酮除莠劑的抗性，從而賦予甜菜植物這種抗性。此外，本發明的目標就是提供對這種除莠劑具有抗性的甜菜植物。參閱下面的描述和附圖，這些目標和其它目標將會越來越明朗化。
附圖簡述
圖1是本發明方法的示意圖，該方法用來產生對咪唑啉酮除莠劑具有抗性的甜菜植物。R=抗性；IM=咪唑啉酮；S=敏感型；SU=磺醯脲類；Sur=SU-R、TP-R和IM-S的顯性ALS等位基因；SIR-13=SU-S、TP-S和IM-R的顯性ALS等位基因；TP=三唑並嘧啶。REL-1是獲得咪唑啉酮抗性的起始材料。
圖2是一個流程圖，展示了產生突變的甜菜植物的詳細步驟。
圖3圖顯示了萌發後向甜菜植物噴灑施用咪唑乙煙酸後的咪唑乙煙酸抗性。
圖4圖顯示了一個細胞培養物在ALS測定中對咪唑乙煙酸的抗性。
優選的實施方案的描述本發明涉及一種甜菜植物材料，這種材料由帶有突變的編碼乙醯乳酸合酶的該酶基因的突變細胞組成，其中所述突變細胞具有對咪唑啉酮除莠劑的抗性，並且這種抗性是可以通過由所述突變細胞產生的植物的傳統雜交傳遞的。
此外，本發明涉及一種在甜菜植物中產生一種除莠劑抗性的方法，包括將第一批甜菜細胞暴露於培養基中第一批細胞對之敏感的咪唑啉酮除莠劑；篩選對除莠劑有抗性的第二批細胞，其中所述抗性可以通過包含第二批細胞的植物的雜交育種來傳遞。
最後，本發明涉及一種在甜菜中賦予一種除莠劑抗性的方法，包括將第一批甜菜植物細胞暴露於培養基中第一批細胞對之敏感的咪唑啉酮除莠劑；篩選對除莠劑有抗性的第二批細胞；從第二批細胞生長出第一種植物，因此這株植物具有對該除莠劑的抗性；將第一種植物與第二種植物雜交育種，產生對該除莠劑具有抗性的雜交植物。
甜菜植物REL-1(再生型East Lansing-1)可得自在East Lansing,Michigan的美國農業部的遺傳學家Joseph Saunders博士，該品種是1987年公布的材料。這個品種可免費得到。REL-1對咪唑啉酮(IM-S)、磺醯脲類(SU-S)和三唑並吡啶氨磺醯除莠劑敏感(TP-S)，如圖1所示。
使用愈傷組織和懸浮培養發展了一個咪唑啉酮抗性(IM-R)雜合的細胞系。這個細胞系(種子)已經按照布達佩斯條約在美國典型培養物保藏中心於1996年5月6日以ATCC97534保藏，這裡稱為Sir-13。公眾通過名稱和保藏號申請可以獲得這個細胞系，然而，由於這樣的儲藏，不需要得到許可。通過與優良的甜菜植物品系、特別是Betavulgaris L.進行育種，可以產生在商業上特別有用的抗性甜菜植物。可以使用傳統的育種技術將咪唑啉酮抗性轉移給其它甜菜，如紅甜菜。
對咪唑啉酮除莠劑、具體為咪唑乙煙酸具有抗性的甜菜植物解決了在甜菜產區中由於使用該除莠劑而導致的土壤殘餘物問題。目前，在使用該除莠劑和該塊大田栽培甜菜植物的下一次使用之間有40個月的等待期。其次，高水平的咪唑啉酮抗性允許在甜菜中用咪唑啉酮進行除草。
下面的實施例1顯示了新型甜菜植物(Sir-13)的分離與培育。
實施例11．篩選對咪唑啉酮具有抗性的甜菜變異體(SIR-13)材料描述Rel-1 (再生型East Lansing-1)是一個高度可再生的雄性可育甜菜系，用於最初的選出針對咪唑啉酮的除莠劑抗性變異體的細胞篩選；在大多數實驗中用作敏感性對照。Sir-13 該甜菜分離物是通過將Rel-1的細胞平板接種在含咪唑乙煙酸的培養基上發展而來。這個變異體對咪唑啉酮有抗性，但對磺醯脲類並沒有交叉抗性。Sir-30 一個有代表性的傾向不育的選擇分離物。這是細胞培養程序得到的一個異常結果。
a．根據在高細胞分裂素濃度的條件下(在B1培養基中)產生愈傷組織以及從愈傷組織中再生出苗的能力，挑選植物用作體細胞克隆篩選的源材料。
B1培養基的配方30g L-1蔗糖100mg L-1肌醇1.65g L-1NH4NO31.90g L-1KNO30.44g L-1CaCl2·2H2O0.37g L-1MgSO4·7H2O0.17g L-1KH2PO46.2mg L-1H3BO316.8mg L-1MnSO4·H2O10.6mg L-1ZnSO4·7H2O0.88mg L-1KI0.25mg L-1Na2MoO4·2H2O
0.025mg L-1CuSO4·5H2O0.025mg L-1CoCl2·6H2O37.3mg L-1Na2EDTA27.8mg L-1FeSO4·7H2O1mg L-1硫胺素0.5mg L-1吡哆醇0.5mg L-1煙酸1mg L-1苄氨基嘌呤pH5.95將B1固體培養基與9g·L-1的植物培養瓊脂一起高壓滅菌，並用過濾除菌的除莠劑貯液按篩選計劃的需要進行調整。將瓊脂培養基倒入15×100mm的一次性塑料培養皿中。
將B1培養基以40ml的等份加入125ml錐形瓶中並高壓滅菌，用於液體懸浮培養。
篩選對咪唑啉酮有抗性的變異體Sir-13的源材料是Rel-1。
b．為篩選對咪唑啉酮有抗性的變異體，採用如圖2所示的程序。
葉圓盤外植體是由源植物快速展開的葉片製備。用15％商用漂白劑加0.025％Triton X-100(T-9284,Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)兩次、每次20分鐘連續衝洗葉片進行表面消毒(步驟1)。用無菌去離子水清洗葉片兩次。葉圓盤是用一個火焰滅菌的#3打孔器切下的。
無菌操作將葉圓盤置於固體B1培養基上(步驟2)。將葉圓盤在黑暗中30℃下培育4-8周，直到從葉圓盤上增生出脆弱、白色的愈傷組織。用鑷子將愈傷組織機械分離出來，並順序轉移到多個含有40ml液體B1培養基的125ml錐形瓶中(步驟3)。將這些瓶子放置於一個50Hz、低強度的日光燈照射下(30μE/m2s)的旋轉式搖床上。1周後將液體培養物用新鮮的B1培養基傳代培養。
在液體培養開始後兩周，用帶有60目篩網的細胞離散篩(SigmaCD-1)分離細胞塊。大約2/3體積的液體培養基在細胞沉澱之後被除去。在步驟4，將細胞重新懸浮於剩餘的培養基中，並且將1ml的等份均勻地鋪展在添加了50nM咪唑乙煙酸除莠劑(PURSUIT,AmericanCyanamid,Wayne,NJ)的固體B1培養基上。將平板疊起來，在微弱的日光燈照射下(5μE/m2s)培育8-12周。
c．在50nM咪唑乙煙酸的濃度下，所有的敏感細胞都死亡了。在運個濃度下存活並生長的細胞塊被檢定為可能的抗性變異體。在步驟5，將這些細胞塊(直徑約1-3mm)轉移到新鮮的不含除莠劑的B1固體培養基上，並讓其在低光照條件下(10-20μE/m2s)生長。分別鑑定並保持每一個假定的抗性變異體。
d．在步驟6，每隔4-6周就將白色、脆弱的愈傷組織再分到新鮮的B1固體培養基上，直到從愈傷組織中生長出單獨的苗。將這些苗轉移到如下的苗維持培養基(M20)中M20培養基的配方30g L-1蔗糖100mg L-1肌醇1.65g L-1NH4NO31.90g L-1KNO30.44g L-1CaCl2·2H2O0.37g L-1MgSO4·7H2O0.17g L-1KH2PO46.2mg L-1H3BO316.8mg L-1MnSO4·H2O10.6mg L-1ZnSO4·7H2O0.88mg L-1KI
0.25mg L-1Na2MoO4·2H2O0.025mg L-1CuSO4·5H2O0.025mg L-1CoCl2·6H2O37.3mg L-1Na2EDTA27.8mg L-1FeSO4·7H2O1mg L-1硫胺素0.5mg L-1吡哆醇0.5mg L-1煙酸0.25mg L-1苄氨基嘌呤pH5.95將M20固體培養基與9g·L-1的植物培養瓊脂一起高壓滅菌，並用過濾除菌的除莠劑貯液按篩選計劃的需要進行調整。將瓊脂培養基倒入20×100mm的一次性塑料培養皿中。
在10-20μE/m2s的日光燈照射下保持苗培養物，並用解剖刀片解剖苗培養物進行繁殖。繁殖候選的苗培養物，並按下面介紹的方法評估抗性的水平。2．苗培養物的咪唑啉酮抗性的水平在步驟7，如下評估苗培養物對除莠劑的抗性將3個一致大小的小苗切塊分別置於含M20培養基的平板上，其中M20培養基添加了濃度按對數遞增、範圍為1nM到0.1nM的咪唑啉酮除莠劑。將Sir-13培養物的反應與敏感性對照(Rel-1)的苗培養物的反應進行對比。將苗培養物在光強度20μE/m2s、溫度25℃的條件下保持3周。通過評估苗培養物轉移到選擇培養基上3周後所受的損傷及其鮮重來確定苗培養物的反應。除莠劑抗性的大小通過抗性I50值(導致50％損傷的除莠劑濃度)與敏感性對照的I50值的比值確定。
採用上面的方法，但替換培養基中使用的除莠劑，確定每種變異體的交叉抗性特徵。Sir-13的苗培養物顯示了對咪唑乙煙酸具有220倍水平的抗性，對磺醯脲類除莠劑氯磺隆或三唑並嘧啶磺醯苯胺除莠劑唑嘧磺草胺沒有表現出交叉抗性，如表1所示。
表1苗培養物和ALS抗性和交叉抗性的大小
1-咪唑啉酮(American Cyanamid,Wayne,NJ)2-磺醯脲類-Glean(Dopont,Wilmington,DE)3-三唑並嘧啶磺醯苯胺(BROADSTRIKE,Dow Elanco,Indianapolis,IN)4-R/S=對於測試的特定除莠劑來說抗性I50值與敏感對照I50值的比值。5-I50是對苗培養物造成50％損傷所需的除莠劑濃度。3．植物再生與培育在步驟8，使用相似的方法將Sir-13的苗培養物再生為整棵植株。在先前的苗傳代培養兩周之後，將Sir-13苗轉移到含40ml N3生根培養基的125ml錐形瓶中。
N3培養基的配方30g L-1蔗糖100mg L-1肌醇1.65g L-1NH4NO31.90g L-1KNO30.44g L-1CaCl2·2H2O0.37g L-1MgSO4·7H2O0.17g L-1KH2PO46.2mg L-1H3BO316.8mg L-1MnSO4·H2O10.6mg L-1ZnSO4·7H2O0.88mg L-1KI0.25mg L-1Na2MoO4·2H2O0.025mg L-1CuSO4·5H2O0.025mg L-1CoCl2·6H2O37.3mg L-1Na2EDTA27.8mg L-1FeSO4·7H2O1mg L-1硫胺素0.5mg L-1吡哆醇0.5mg L-1煙酸3mg L-1萘乙酸pH5.95將N3培養基以40ml的等份加入125ml的錐形瓶中，每個瓶中加入9g L-1瓊脂(0.45g)，高壓滅菌，準備用於苗培養物的生根。然後將培養物轉移到25℃每天24小時中等光強度(40-60μE/m2s)光照下。4-6周後根逐漸形成。
在步驟9，將生根的苗(R0代)然後轉移到溫室中的Baccto(Michigan Peat Co.Houston,TX)盆栽混合物中。在步驟10，將Sir-13的R0植物與一種名為293的光滑根的甜菜雜交。這些雜交得到的F1代種子進行自交，產生F2種子。假定咪唑啉酮抗性是顯性或半顯性的單基因性狀。F2代植物的咪唑啉酮抗性應按1純合抗性2雜合抗性1純合敏感性的比例分離。Sir-13作為單基因顯性性狀的遺傳對每一株F2植株進行子代測試，檢測該比例。將Sir-13的F2植株自交，並從每一植株上分別收集種子。將這些子代種植在溫室中，並在2-4葉期噴灑1/4倍田間施用比的咪唑乙煙酸(PURSUIT)除莠劑(0.0625 1b ai/A+1qt/A SunIt-Ⅱ(AGSCO Fargo)+1qt/A28％UAN(尿素硝酸銨)。這個比例使得將具有1或2個拷貝Sir-13等位基因的植株與敏感性植株鑑別開來。
根據子代測試的分離結果，將每一個Sir-13家族歸類為純合抗性、雜合抗性或純合敏感性。結果清楚地顯示Sir-13 F2分離的各個類別符合1∶2∶1的比例，如表2所示。
表2
這些結果表明Sir-13是一個單基因顯性性狀。目前還未確定顯性或半顯性的程度。4．整株植物對咪唑啉酮的抗性將純合的(不分離)Sir-13 F2植株自交，產生純合的Sir-13 F3種子。讓Rel-1克隆自交，產生敏感性S1種子。將種子種植到溫室中的Baccto盆栽混合物中，並在種植後14天進行間苗，使得每盆一個植株。在4-6葉期向植株噴灑0、0.26、1.1、4.4、17.5、70或280g活性組分/ha的咪唑乙煙酸(PURSUIT)或AC299,263(RAPTOR)。所有處理都以239L/ha的體積施用並包括以下噴灑添加劑1％(體積)的SunIt-Ⅱ和1％(體積)的28％UAN。每種處理平行測定4次。處理後20天測定苗的鮮重。Sir-13和敏感性甜菜的反應如圖3所示。Sir-13純合體對咪唑乙煙酸和AC299,263分別表現出120倍和90倍的抗性。5．對咪唑乙煙酸的ALS靶酶反應使用標準程序從溫室中生長的甜菜植物快速展開的葉片上部分純化ALS(Hart等人，Weed Science40:378-383(1992))。在咪唑乙煙酸的濃度按對數遞增的條件下，評估純合Sir-13 F3植株和Rel-1 S1種子的提取物中ALS的活性。測定REL-1和Sir-13甜菜系的葉片提取物的ALS活性。如上所述將植株種植於溫室中直到4-6葉期。在咪唑乙煙酸的濃度按對數遞增的條件下，測定新鮮提取物中ALS的活性。採用的方法和程序修改自Ray(Plant Physiol.75:827-831(1984))和Shaner等人(Plant Physiol.76:545-546(1984))簡要介紹的方法和程序。在40ml冷勻漿緩衝液(0.1M K2HPO4,pH7.5、1mM丙酮酸鈉、0.5mMMgCl2、0.5mM焦磷酸硫胺素、10μM黃素腺嘌呤二核苷酸、10％(體積)甘油)加2.5g聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpolypyrolidone)中勻漿10g甜菜葉片。將勻漿液用8層紗布過濾並以27,000g離心20分鐘。取出上清液並用(NH4)2SO4處理至50％飽和度。將此溶液在0℃保持1小時，然後以18,000g離心15分鐘，將沉澱再溶解於1ml重懸浮緩中液(0.1MK2HPO4,pH7.5、20mM丙酮酸鈉、0.5mM MgCl2)，並在Sephadex G-25PD-10柱(Pharmacia,Inc.,Piscataway,NJ)上脫鹽。立即評估酶提取物。
通過將0.2ml酶製備物(以重懸浮液按3∶1的比例稀釋)加入1.3ml反應緩衝液(25mM K2HPO4,pH7.0、0.625mM MgCl2、25mM丙酮酸鈉、0.625mM焦磷酸硫胺素、1.25μM黃素腺嘌呤二核苷酸)中並於35℃溫育1小時，測定ALS活性。反應混合物包含終濃度為0、4、40、400、4000、40000、400000或4000000nM的咪唑乙煙酸或終濃度為0、0.9、9、90、900、9000、90000nM的氯磺隆。加入50μl 6N H2SO4並於60℃溫育15分鐘，終止反應。這個如Westerfield(J.Biol.Chem.16:495-502(1945))所述的程序也將ALS酶的產物乙醯乳酸脫羧，形成3-羥基丁酮。通過加入1ml含2.5％(重量)α-萘酚和0.25％(重量)肌酸的2.5N NaOH並於60℃溫育15分鐘，形成有色的3-羥基丁酮複合物。
將購得的3-羥基丁酮用作比色反應的標準品。在530nm處測定反應溶液的吸光度，以確定3-羥基丁酮的濃度。重複每種除莠劑的實驗，每次3個平行測定。用Bradford的方法(Anal.Biochem.72:248-254(1976))測定提取物中蛋白的濃度，使用牛血清白蛋白製作標準曲線。
所有實驗都進行兩次，每種處理平行測定3次。圖4顯示了Sir-13純合體和敏感性Rel-1的ALS提取物的反應。Sir-13在酶水平上顯示對咪唑乙煙酸具有150倍的抗性(通過抗性系和敏感系的I50值的比例確定)。圖3顯示前文所討論的整株植物表現出44倍的抗性。6．ALS基因拷貝數進行DNA印跡分析，以確定在敏感系甜菜中存在的ALS基因拷貝數。從原代Sir-13突變體的敏感性F3植株中分離基因組DNA，並用普通實用技術(Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiely andSons，紐約(1991))進行分析。同樣分析一個市售甜菜變種的基因組DNA。在兩個甜菜品系中，檢測到ALS基因的單一拷貝。這個數據表明一個純合突變型甜菜中所有的ALS酶活性都由抗性酶的形式構成。7.ALS基因突變為確定ALS酶抗性的分子基礎，用標準技術測定ALS基因上所有以前報導的除莠劑抗性突變發生的兩個區域的序列(Current Protocolsin Molecular Biology,J.Wiely and Sons，紐約(1991))。甜菜ALS基因以前曾被測序(美國專利5,378,824號)，並設計了聚合酶鏈式反應(PCR)引物，以擴增負責以前報導的植物除莠劑抗性的基因的兩個區域。從抗性甜菜(Sir-13)和敏感性甜菜(Rel-1)得到的序列數據的對比表明，核苷酸序列上337位的一個單核苷酸從鳥嘌呤變為腺嘌呤，導致甜菜ALS胺基酸序列上113位發生了由蘇氨酸到丙氨酸的取代。已經將該位點與蒼耳的咪唑啉酮抗性(Bernasconi等人，J.Biol.Chem.270:17381-17385(1995))和酵母的磺醯脲類抗性(美國專利5,378,824號)相聯繫。在檢查過的ALS基因上這兩個區域中並未發現其它與野生型核苷酸序列不同的鹼基改變。
以上敘述將只是本發明的說明，而本發明僅受下文所附的權利要求書限制。
權利要求
1．一種由突變細胞組成的甜菜植物材料，所述的突變細胞帶有編碼乙醯乳酸合酶的突變基因，其中所述突變細胞具有對一種咪唑啉酮除莠劑的抗性，並且這種抗性可以通過由所述細胞產生的植物的傳統雜交育種來傳遞。
2．權利要求1的材料，所述材料得自對所述除莠劑沒有抗性、名為REL-1的親代甜菜植物的敏感性細胞，採用的方法是將所述敏感性細胞於含所述除莠劑的培養基上培養以篩選突變的細胞。
3．以名為ATCC97534(Sir-13)的種子保藏的權利要求1的材料。
4．權利要求1的作為種子或種子繁殖體的植物材料。
5．在甜菜植物中產生除莠劑抗性的方法，所述方法包括(a)將甜菜植物的第一批細胞暴露於培養基中的一種第一批細胞對之敏感的咪唑啉酮除莠劑；然後(b)篩選具有所述除莠劑抗性的第二批細胞，其中所述抗性可以通過包含第二批細胞的植物的雜交育種來傳遞。
6．權利要求5的方法，其中所述第二批細胞得自名為REL-1的甜菜植物的第一批細胞。
7．權利要求5的方法，其中所述第二批細胞以名為ATCC97534(SIR-13)的種子保藏。
8．在甜菜植物中賦予除莠劑抗性的方法，所述方法包括(a)將甜菜植物的第一批細胞暴露於培養基中的一種第一批細胞對之敏感的咪唑啉酮除莠劑；(b)篩選具有所述除莠劑抗性的第二批細胞；(c)從第二批細胞生長出第一種植物，使得所述植物具有所述除莠劑抗性；然後(d)將第一種植物與第二種植物進行雜交育種，產生對所述除莠劑具有抗性的雜交植物。
9．將對除莠劑的抗性賦予其它甜菜的方法，所述方法包括(a)將甜菜植物的第一批細胞暴露於培養基中的一種第一批細胞對之敏感的咪唑啉酮除莠劑；(b)篩選具有所述除莠劑抗性的第二批細胞；(c)從第二批細胞生長出第一種植物，使得所述植物具有所述除莠劑抗性；然後(d)將第一種植物與第二種植物進行雜交育種，產生對所述除莠劑具有抗性的雜交植物。
10．權利要求8的方法，其中步驟(a)的第一批細胞來自名為REL-1的甜菜。
11．權利要求8的方法，其中所述第二批細胞以名為ATCC97534(SIR-13)的種子保藏。
全文摘要
描述了對咪唑啉酮除莠劑具抗性的甜菜植物。所述甜菜植物通過用該除莠劑篩選突變咪唑啉酮抗性細胞而得自敏感細胞。得自所述細胞的抗性植物可以在已經用咪唑啉酮除草的大田中生長。
文檔編號C12N5/10GK1230218SQ97197848
公開日1999年9月29日 申請日期1997年7月8日 優先權日1996年7月17日
發明者D·彭納, T·R·賴特 申請人:密執安州大學