幹細胞生物活性組合物及其製備方法與應用與流程
2023-10-30 06:20:57
本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及生物活性物質，更具體地，本發明涉及幹細胞生物活性組合物及其製備方法與應用。
背景技術：
幹細胞(Stem Cell)是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞，它是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的「萬能細胞」。根據其發育階段可分為胚胎幹細胞與成體幹細胞。其中成體幹細胞(Adult stem cell，ASC)分布廣、增殖能力強、具有多向分化潛能且無倫理或宗教問題，可來源於骨髓、脂肪、皮膚、肌肉、角膜等各類組織，包括間充質幹細胞(Mesenchymal stem cell，MSC)、造血幹細胞、表皮幹細胞、內皮幹細胞、胃腸幹細胞、肝幹細胞、胰腺幹細胞、肌肉乾細胞、神經元幹細胞、臍帶血幹細胞等。
近年來，隨著對幹細胞研究的逐漸深入，發現其在增殖分化過程中產生或分泌了大量的生物活性物質，這是一種包含了生長因子、蛋白質、活性多肽、微量元素等多種促進細胞生長、活化與再生的物質，如表皮細胞生長因子(EGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經生長因子(NGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(PDGF)、角質細胞生長因子(KGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、白介素－6(IL-6)、白介素－7(IL-7)、天然免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD等。
然而，目前製備幹細胞生物活性物質的技術以及製備獲得的幹細胞生物活性物質的產量和質量仍有待改進。
技術實現要素：
目前實際中應用的幹細胞生物活性物質大多存在以下不足：1.直接從胎盤等組織中提取，致使所得到的幹細胞生物活性物質純度低；2.採用含有動物源成分(如胎牛血清)的培養液進行幹細胞的擴增培養，提取的物質中不可避免的含有動物來源的成分甚至含有存在於動物體內的病毒等，安全性低；3.幹細胞內含有豐富的生物活性物質，對幹細胞的增殖分化等非常重要，但這些物質並不分泌到細胞外，故常在提取過程中被遺漏；4.多採用單一的胚胎幹細胞或成體幹細胞進行培養而收集上清，未考慮到體內細胞複雜的生長環境與不同種類細胞之間的相互作用，導致提取的生物活性物質的產量不高。本發明旨在至少 在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。
根據本發明的一個方面，本發明提出一種具有高純度、高產量、高生物活性的幹細胞生物活性組合物，所述幹細胞生物活性組合物含有1.69-22.24pg/mL EGF、2443.17-4459.43pg/mL bFGF、1.44-134.36pg/mL beta-NGF、1.55-355.14pg/mL VEGF、11.87-159.70pg/mL PDGF-DD、135.79-688.13pg/mL KGF、1176.99-3825.79pg/mL TGF-β1，上述幹細胞生物活性組合物具有較高的生物活性，並且所述幹細胞生物活性組合物中各個生物活性因子具有較高含量。
根據本發明的一個實施例，所述幹細胞生物活性組合物含有18.47pg/mL EGF、4447.00pg/mL bFGF、32.66pg/mL beta-NGF、27.77pg/mL VEGF、77.04pg/mL PDGF-DD、688.13pg/mL KGF、3312.99pg/mL TGF-β1。所述幹細胞生物活性組合物具有較高的生物活性，並且所述幹細胞生物活性組合物中各個生物活性因子具有較高含量。
根據本發明的一個實施例，所述幹細胞生物活性組合物是通過將間充質幹細胞和脂肪基質細胞進行非接觸式共培養獲得的。相關研究表明，幹細胞體外培養時在不同程度上需要依賴另外一些細胞對它們的滋養、支持作用。基質細胞是一類能夠對幹細胞起滋養作用的滋養細胞，多種基質細胞系已經被用來支持幹細胞的體外培養。它們的存在可以更好地模擬體內環境，而且它們可以分泌多種已知的、未知的生長因子來支持幹細胞的生長。脂肪組織提供了多能基質細胞的來源。研究發現，脂肪組織位於可以較易獲得的結締組織中，其中存在著抽脂術細胞，其克隆細胞株被稱為脂肪基質細胞(Adipose tissue-derived stromal cell，ADSC)，這些細胞體內分布廣、取材創傷小、細胞獲得量大(每克脂肪組織存在高達8.6×104個基質細胞)，可補充、增殖穩定、具有美容效果等，是合適的基質細胞。當然，具有與脂肪基質細胞相似特點的細胞還可來自於其它組織，這些組織包括但不限於骨、骨髓、軟骨、結締組織、韌帶組織或腱、骨骼肌、平滑肌、皮膚、外周血、臍帶血、胎盤。雖然這些基質細胞並不相同，但它們所擁有的共性使它們可在體外行使相似的功能，尤其是可作為飼養層支持胚胎幹細胞或成體幹細胞的增殖並維持在未分化狀態。進一步地，非接觸式共培養在同一體系中實現兩種細胞共培養，避免了直接接觸式共培養中所存在的幹細胞分離純化困難、免疫安全性差、容易引起病毒傳播等問題，解決了不同細胞的分離問題，便於培養結束後獲得高純度的幹細胞；此外當培養模型中細胞間相互作用需要通過建立細胞間緊密連接和/或需要採用旁分泌的作用方式時，非接觸式共培養不會引起幹細胞的變化。
根據本發明的再一個方面，本發明提出一種製備所述幹細胞活性組合物的方法，包括以下步驟：(1)利用培養基，對間充質幹細胞和脂肪基質細胞進行非接觸式共培養；(2)收集含有間充質幹細胞的培養液；以及(3)將所述含有間充質幹細胞的培養液中的間充質 幹細胞進行裂解後進行離心，並收集上清液，所述上清液構成所述幹細胞活性組合物。利用該方法製備獲得具有高純度、高產量、高生物活性的幹細胞生物活性組合物。需要說明的是，所述含有間充質幹細胞的培養液中包含有間充質幹細胞和培養基。
根據本發明的一個實施例，所述非接觸式共培養採用非接觸培養裝置，所述非接觸培養裝置包括：培養皿，所述培養皿中限定出下室，所述脂肪基質細胞接種於所述下室；Transwell，所述Transwell中限定出上室，所述Transwell具有PET膜，所述PET膜使所述上室和所述下室呈流體連通，所述間充質幹細胞接種於所述上室。本發明所述方法採用Transwell培養板建立非接觸式的幹細胞和基質細胞體外共培養體系，培養結束後便於幹細胞與基質細胞的分離，以便獲得高純度的幹細胞生物活性物質。
根據本發明的一個實施例，所述方法步驟(3)中進一步包括：(3-1)將所述含有間充質幹細胞的培養液放入-20℃冷凍後，放入5℃中進行解凍，以便獲得凍融後的含有間充質幹細胞的培養液；(3-2)在振幅50％的情況下，對所述凍融後的含有間充質幹細胞的培養液進行超聲0-90min，收集並混合超聲後的液體，以便獲得超聲後的含有間充質幹細胞的培養液；(3-3)將所述超聲後的含有間充質幹細胞的培養液在10000rpm下離心30min後，於0.22μm微孔濾膜進行過濾，並收集上清液，所述上清液構成所述幹細胞活性組合物。本發明所述方法採用超聲破碎、低溫凍融與高速離心等方法提取、分離、純化細胞培養上清及幹細胞內產生的生物活性物質，從而獲得高純度、高產量和高活性的幹細胞生物活性物質。
根據本發明的一個實施例，所述方法步驟(3-2)在振幅50％的情況下，對所述凍融後的含有間充質幹細胞的培養液進行超聲50min，收集並混合超聲後的液體，以便獲得超聲後的含有間充質幹細胞的培養液。由此，利用本發明所述方法，可以獲得高純度、高產量和高活性的幹細胞生物活性物質。
由此可知，本發明中由所述方法製備獲得的細胞生物活性組合物具有以下優勢：1.克服了現有技術直接從臍帶或胎盤等組織中提取的生物活性物質純度、產量與活性不高的缺點。本發明採用Transwell培養板建立幹細胞和基質細胞體外非接觸共培養體系，採用超聲破碎、低溫凍融與高速離心等方法提取、分離、純化細胞培養上清及幹細胞內產生的生物活性物質，從而獲得高純度、高產量和高活性的幹細胞生物活性物質；2.克服了現有技術中應用含動物源成分培養基的不足，本發明中的共培養體系均採用無血清培養基，未使用任何含動物源成分的培養基，避免了動物源成分造成的安全隱患；3.克服了現有技術中未提取幹細胞自身產生的生物活性物質的缺陷，本發明通過超聲破碎等方法，在提取幹細胞分泌的生物活性物質的同時，也提取了幹細胞內的生物活性物質；4.克服了現有技術中多採用單一的胚胎幹細胞或成體幹細胞進行培養從而提取的生物活性物質的產量不高的缺陷，本發明採用幹細胞和基質細胞體外共培養體系，通過基質細胞的滋養作用促進幹細胞 的生長及未分化狀態的維持，且進一步模擬了體內組織細胞和幹細胞之間的相互作用，所得生物活性物質產量較高；5.克服了現有共培養技術中幹細胞與基質細胞接觸式共培養的不足，本發明採用Transwell培養板建立非接觸式的幹細胞和基質細胞體外共培養體系，培養結束後便於幹細胞與基質細胞的分離，以便獲得高純度的幹細胞內生物活性物質。
本發明中的幹細胞生物活性組合物可有效調控機體細胞信號傳導、活化人體幹細胞，進而修復或替代機體損傷、病變及衰老的細胞。因此，本發明中的幹細胞生物活性組合物在美容產品、保健品、組織工程領域具有廣泛的應用前景。
根據本發明的第三方面，本發明提出了一種化妝品，包含上述幹細胞生物活性組合物或利用上述方法製備獲得的幹細胞生物活性組合物，所述化妝品具有抗衰老，增強皮膚彈性的功能，對損傷的皮膚能自動地進行護理、調養與修復，使皮膚變得更柔嫩、更富有彈性。
根據本發明的第四方面，本發明提出了一種保健品，包含上述幹細胞生物活性組合物或利用上述方法製備獲得的幹細胞生物活性組合物，所述保健品具有抗衰老、增強機體免疫力、促進損傷或衰老組織再生以及改善組織器官功能的作用。
根據本發明的第五方面，本發明提出一種促進幹細胞/祖細胞增殖和/或分化功能的方法，在存在上述幹細胞生物活性組合物或上述方法製備獲得的幹細胞生物活性組合物的條件下，培養所述幹細胞/祖細胞，利用該方法能夠促進細胞增殖與分化的功能。
附圖說明
圖1是根據本發明的一個實施例，間充質幹細胞和脂肪基質細胞進行非接觸式共培養裝置的示意圖。
具體實施方式
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
實施例
實施例1、脂肪基質細胞的分離純化
患者知情並同意後，經吸脂術獲取脂肪組織。患者年齡在37-54歲之間，身體質量指數(kg/m2)在28-35之間，除肥胖外，身體健康狀況良好，無糖尿病或其它併發症。吸脂後，將脂肪組織置於生理鹽水中於術後2h內送至實驗室，2倍體積的Krebs-Ringer Bicarbonate 緩衝液洗滌3-4次去除血汙，再用1倍體積的Ⅰ型膠原酶(1g/L of KRB，1％BSA)在間歇攪拌下37℃消化60min。消化完成後，300g離心5min以去除漂浮的脂肪細胞。將得到的基質細胞接種到細胞培養瓶中置37℃，5％CO2培養箱中進行培養，細胞的初始密度為3.5×103個/cm2，培養4-5天後細胞約長到80％。用0.5mM EDTA/0.05％胰蛋白酶消化細胞，1200rpm離心5min，再將細胞用Dulbecco’s modified Eagle’s–Ham’s F-10medium(V/V＝1:1)(含10％胎牛血清，15mM HEPES(pH 7.4)，100U/mL青黴素，100mg/mL鏈黴素，0.25mg/mL兩性黴素B)重懸，調整細胞密度為1×104個/cm2，37℃，5％CO2培養箱中進行培養。待長到80％時按上述方法傳代，得到第2代脂肪基質細胞。
實施例2、胎盤間充質幹細胞的分離純化
取足月順產或剖腹產的胎盤組織，剝除母體側蛻膜，剪取小塊胎兒蛻膜側胎盤組織，PBS衝洗，去除血跡。將胎盤組織剪成碎片，加入0.1％Ⅳ型膠原酶，37℃消化30min，過100目篩網，收集細胞懸液，加入配好的培養基(含DMEM，10％FBS，5ng/mL bFGF，100U/mL青黴素，100μg/mL鏈黴素，25mmol/L穀氨醯胺)，調整培養細胞密度為1×105個/mL，置於37℃，5％CO2的培養箱培養，每3-4d進行換液，胎兒蛻膜側胎盤組織消化後獲得細胞中僅有少量的貼壁細胞，經2周後逐漸形成扁平單層細胞，細胞按常規方法傳代、凍存、復甦。最多傳代至第5代，收集5代以內的細胞。此時收集的幹細胞生物學性狀穩定，增殖能力強。
實施例3、脂肪基質細胞與間充質幹細胞共培養體系的建立
採用具有PET膜的Transwell懸掛式培養小室結合6孔板進行脂肪基質細胞與間充質幹細胞的非接觸式共培養。取對數生長期的細胞，用0.05％/0.25％胰蛋白酶消化製成單細胞懸液，計數、調整細胞密度後接種，培養基採用MSC無血清培養基。實驗組將脂肪基質細胞接種於Transwell培養小室的下室，然後將Transwell懸掛式培養小室的上室置於孔中，在Transwell懸掛式培養小室內接種MSC，讓上下室的培養液相互通融，從而建立起脂肪基質細胞與間充質幹細胞的共培養體系；對照組則將MSC單獨接種於Transwell小室內，下層為基礎培養液。將共培養體系在37℃，5％CO2條件下進行培養。
實施例4、脂肪基質細胞與間充質幹細胞共培養體系生物活性物質的提取
從培養箱中取出培養48h後的按實施例3處理的實驗組或對照組的細胞培養體系。1200rpm離心5min，取細胞培養上清與MSC，混合均勻，放入－20℃冰箱中過夜，第二天拿出放入5℃冰箱中至完全溶解，如此反覆凍融3次。凍融結束後用超聲破碎儀在振幅 50％的情況下分別超聲0、10、20、30、40、50、60、90min，再分別將超聲後的液體在10000rpm下離心30min，0.22μm微孔濾膜過濾，獲得不同超聲時間的幹細胞生物活性物質混合液。
實施例5、脂肪基質細胞與間充質幹細胞共培養體系生物活性因子的含量測定
取實施例4獲得的實驗組或對照組的幹細胞生物活性物質混合液，分別用R&D的酶聯免疫吸附試驗盒(ELISA)測定幹細胞生物活性物質混合液中表皮細胞生長因子(EGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經生長因子(beta-NGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、血小板衍生因子-DD(PDGF-DD)、角質細胞生長因子(KGF)、轉化生長因子β1(TGF-β1)的含量。方法參照試劑盒說明。如鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)含量的測定：取已包被抗人bFGF的96孔酶標板，往每孔中加入100μL測試稀釋液，再分別加入100μL標準品、樣品或空白對照，充分混勻，室溫孵育2h，常規洗板，每孔加入200μL人bFGF特異性的已連接酶的單克隆抗體，室溫孵育2h，洗板後加入200μL酶底物室溫反應30min，加入50μL終止液終止反應，在450nm處測吸光度，並用540nm處的吸光度扣背景。根據標準曲線計算細胞因子含量。結果表明，共培養體系中EGF含量為1.69-22.24pg/mL、bFGF含量為2443.17-4459.43pg/mL、beta-NGF含量為1.44-134.36pg/mL、VEGF含量為1.55-355.14pg/mL、PDGF-DD含量為11.87-159.70pg/mL、KGF含量為135.79-688.13pg/mL、TGF-β1含量為1176.99-3825.79pg/mL；對照組中EGF含量為1.50-17.98pg/mL、bFGF含量為1334.43-3079.65pg/mL、beta-NGF含量為1.14-95.41pg/mL、VEGF含量為1.45-235.43pg/mL、PDGF-DD含量為10.99-100.47pg/mL、KGF含量為120.12-503.23pg/mL、TGF-β1含量為787.69-2585.47pg/mL。由結果可知，脂肪基質細胞與間充質幹細胞共培養體系中細胞因子的分泌量均在一定程度上高於間充質幹細胞單獨培養時的細胞因子分泌量，說明通過基質細胞的滋養作用可促進幹細胞的生長與生物活性因子的分泌。
實施例6、脂肪基質細胞與間充質幹細胞共培養體系生物活性物質的提取
從培養箱中取出培養48h後的按實施例3處理的實驗組或對照組的細胞培養體系。1200rpm離心5min，取細胞培養上清與MSC，混合均勻，放入－20℃冰箱中過夜，第二天拿出放入5℃冰箱中至完全溶解，如此反覆凍融3次。凍融結束後用超聲破碎儀在振幅50％的情況下超聲50min，再將超聲後的液體在10000rpm下離心30min，0.22μm微孔濾膜過濾，得幹細胞生物活性物質混合液。
實施例7、脂肪基質細胞與間充質幹細胞共培養體系生物活性因子的含量測定
取實施例6獲得的實驗組或對照組的幹細胞生物活性物質混合液，分別用R&D的酶聯免疫吸附試驗盒(ELISA)測定幹細胞生物活性物質混合液中表皮細胞生長因子(EGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經生長因子(beta-NGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、血小板衍生因子-DD(PDGF-DD)、角質細胞生長因子(KGF)、轉化生長因子β1(TGF-β1)的含量。方法參照試劑盒說明。如鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)含量的測定：取已包被抗人bFGF的96孔酶標板，往每孔中加入100μL測試稀釋液，再分別加入100μL標準品、樣品或空白對照，充分混勻，室溫孵育2h，常規洗板，每孔加入200μL人bFGF特異性的已連接酶的單克隆抗體，室溫孵育2h，洗板後加入200μL酶底物室溫反應30min，加入50μL終止液終止反應，在450nm處測吸光度，並用540nm處的吸光度扣背景。根據標準曲線計算細胞因子含量。結果表明，共培養體系中EGF含量為18.47pg/mL、bFGF含量為4447.00pg/mL、beta-NGF含量為32.66pg/mL、VEGF含量為27.77pg/mL、PDGF-DD含量為77.04pg/mL、KGF含量為688.13pg/mL、TGF-β1含量為3312.99pg/mL；
對照組中EGF含量為12.13pg/mL、bFGF含量為2870.75pg/mL、beta-NGF含量為20.33pg/mL、VEGF含量為26.89pg/mL、PDGF-DD含量為58.90pg/mL、KGF含量為495.78pg/mL、TGF-β1含量為1997.53pg/mL。由結果可知，脂肪基質細胞與間充質幹細胞共培養體系中細胞因子的分泌量均在一定程度上高於間充質幹細胞單獨培養時的細胞因子分泌量，說明通過基質細胞的滋養作用可促進幹細胞的生長與生物活性因子的分泌。
實施例8、幹細胞生物活性物質生物活性測定
將人幹細胞生物活性物質按120μg/孔/天加入小鼠骨髓細胞中37℃培養，第2天計細胞數，並鏡下觀察細胞形態變化，與對照組相比給幹細胞生物活性物質組能夠促進細胞的貼壁並刺激小鼠骨髓細胞的增殖。
實施例9、幹細胞生物活性物質在美容產品中的應用
將幹細胞生物活性物質以10-100μg/ml的比例加入到化妝品的配方中，均質處理後製成化妝品。含有幹細胞生物活性物質的化妝品具有抗衰老，增強皮膚彈性的功能，對損傷的皮膚能自動地進行護理、調養與修復，使皮膚變得更柔嫩、更富有彈性。
如將細胞因子加入含有聚乙烯醇、甘油、咪唑烷基脲、乙醇、月桂醇聚氧乙烯醚、水等成分的面膜液中，混勻，製備成面膜，長期面部應用可以起到皮膚美白、修復、抗衰老的作用。
實施例10、幹細胞生物活性物質在保健品中的應用
將幹細胞生物活性物質按1:1000-1:8000比例加入特定食品中製成保健品。含有二者的保健品具有抗衰老、增強機體免疫力、促進損傷或衰老組織再生以及改善組織器官功能的作用。
實施例11、幹細胞生物活性物質在組織工程中的應用
將幹細胞生物活性物質以10-200μg/ml的比例加入體外幹/祖細胞培養體系中，發現其具有促進細胞增殖與分化的功能。
取培養至5代的胎盤間充質幹細胞，用0.25％胰蛋白酶消化製成單細胞懸液、計數，以5×103個/孔種入96孔板，分為兩組，一組加入100μLα-MEM培養基，另一組加入100μL含有10μg幹細胞生物活性物質的α-MEM培養基，CO2培養箱培養48h。每孔加入10μL CCK-8試劑，CO2培養箱中37℃孵育2h，用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度(OD)值。結果表明加入幹細胞生物活性物質組的細胞增殖率是未加幹細胞生物活性物質組的123.07％±2.13％。
在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。