一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒的製作方法

2023-10-30 17:09:17 2

本發明屬於醫學檢驗
技術領域：
，具體涉及一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒。
背景技術：
：達比加群酯(dabigatranetexilate)是一種新型口服抗凝藥，通過直接抑制凝血酶(凝血因子fiia)發揮抗凝作用，可用於預防髓關節/膝關節置換術後靜脈血栓栓塞形成，或預防心房顫動導致腦卒中等。雖然抗凝作用的藥物有很多，例如華法林，但是達比加群酯具有明顯的優勢：起效快、抗凝療效可預期等，但是如同所有抗凝劑，達比加群酯會導致出血事件。目前還未開發出針對達比加群酯的特異性拮抗劑。而臨床上服用達比加群酯的患者一旦出現大出血，或者需要手術後者侵入性處理，一般會採取緊急逆轉抗凝活性的措施來應對。該方法不僅不利於提前預防出血症狀，還會給患者帶來生理和心理的雙重傷害，因此，嚴重影響了患者的健康和恢復。雖然達比加群酯較華法林和依諾肝素相比具有較高的安全性，但是該藥在被醫院和患者使用時，隨著使用人數的增加，人們發現對達比加群血液濃度的監測和調整劑量是必要的，對其密切監測可使嚴重出血風險大幅度降低,從而提高用藥的安全性。活化部分凝血活酶時間(aptt)是測定內源性凝血系統的篩選試驗,也可以作為內源性途徑凝血因子的定量試驗。此法可以用來檢測達比加群的血液含量；其原理為將待測血漿加入部分凝血活酶溶液，在鈣離子參與下纖維蛋白原轉變為不溶性纖維蛋白，測定凝固所需的時間，即為待測血漿活化部分凝血活酶時間；使用了達比加群的血漿活化部分凝血活酶時間會延長，此法可用來監測達比加群的血液含量。活化部分凝血活酶時間(aptt)是測定內源性凝血系統的篩選試驗，也可以作為內源性途徑凝血因子的定量試驗；凝血時間，即從加入部分凝血活酶溶液到血漿凝固的時間是整個實驗的基礎，因此凝血時間必須精確，否則實驗結果難以準確，在待測血漿加入部分凝血活酶溶液，激活了整條內源性凝血途徑，導致血漿凝固。整條內源性凝血途徑所牽涉的凝血因子眾多，所以此法受到的幹擾因素較多，達比加群的血液濃度和活化部分凝血活酶時間的相關係數不強，難以進行精確的量化。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於提供迅速準確，可以實現自動化測量的達比加群含量的試劑盒。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒，包括凝血酶、凝血酶發色底物、含有達比加群的人血漿標準品和稀釋液；凝血酶的工作濃度為0.1～2u/ml；凝血酶發色底物的工作濃度為0.05～1mmol/l。優選的，所述凝血酶的工作濃度為0.2～1u/ml。優選的，所述凝血酶發色底物的工作濃度為0.1～0.5mmol/l。優選的，所述凝血酶發色底物為h-d-chg-ala-arg-pna·2acoh、tos-gly-pro-arg-pna·acoh、h-d-chg-but-arg-pna·2acoh、h-d-chg-pro-arg-pna·2acoh、h-d-cha-ala-arg-pna·2acoh、h-d-cha-gly-arg-pna·2acoh、ch3oco-gly-pro-arg-pna·acoh、h-β-ala-gly-arg-pna·2acoh、h-d-phe-pip-arg-pna·2hcl、pyroglu-pro-arg-pna·hcl或h-d-ala-pro-arg-pna·2hcl。優選的，所述稀釋液的組分包括緩衝液、無機鹽、穩定劑、表面活性劑和防腐劑。優選的，所述緩衝液為三羥甲基氨基甲烷緩衝液或磷酸緩衝液；所述緩衝液的ph值為7.2～7.8。優選的，所述無機鹽為氯化鈉或氯化鉀；所述無機鹽的質量濃度優選為0.15～0.25mol/l；優選的，所述表面活性劑為聚乙二醇-8000或吐溫-20；所述表面活性劑的質量濃度為0.05％～0.15％。優選的，所述穩定劑為小牛血清或酪蛋白；所述穩定劑的質量濃度為0.08％～0.15％；優選的，所述防腐劑為proclin300或疊氮鈉；所述防腐劑的質量濃度優選為0.1～1mg/ml。本申請提供了一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒，包括凝血酶、凝血酶發色底物、含有達比加群的人血漿標準品和稀釋液；凝血酶的工作濃度為0.1～2u/ml；凝血酶發色底物的工作濃度為0.05～1mmol/l。所述試劑盒的檢測機理是凝血酶加入樣本血漿後會作用於發色底物，通過裂解其發色底物產生信號。而血漿中的達比加群會抑制凝血酶，達比加群含量越高,對凝血酶的抑制越強,得到的吸光度信號越弱。所以在一定的範圍之內,達比加群的含量和吸光度的信號是負相關關係,可以根據標準曲線達到定量檢測的目的。本發明所述試劑盒基於凝血酶發色底物法實現監測血漿中達比加群含量變化，所述試劑盒實現快速準確檢測達比加群含量，研究發現，達比加群濃度在0～500ng/ml時，r≥0.99，線性關係較好，同時所述試劑盒相對偏差小於1％，準確性較好。同時，本發明提供的試劑盒經過多次測量時，cv值小於2％，重複性較好。所述試劑盒可以檢測到低至15ng/ml的達比加群。附圖說明圖1為實施例3中繪製的標準曲線圖。具體實施方式本發明提供了一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒，包括凝血酶、凝血酶發色底物、含有達比加群的人血漿標準品和稀釋液；凝血酶的工作濃度為0.1～2u/ml；凝血酶發色底物的工作濃度為0.05～1mmol/l。本發明提供了一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒，研究發現，達比加群濃度在0～500ng/ml時，r≥0.99，線性關係較好，同時所述試劑盒相對偏差小於1％，準確性較好。本發明提供的一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒包括凝血酶。所述凝血酶的工作濃度為0.1～2u/ml，優選為0.2～1u/ml，更優選為0.5u/ml。所述凝血酶的來源沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的凝血酶即可。本發明中，所述凝血酶購自西格馬(sigma)。本發明提供的一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒包括凝血酶發色底物。所述凝血酶發色底物的工作濃度為0.05～1mmol/l，優選為0.1～0.5mmol/l，更優選為0.3mmol/l。所述凝血酶發色底物為h-d-chg-ala-arg-pna·2acoh、tos-gly-pro-arg-pna·acoh、h-d-chg-but-arg-pna·2acoh、h-d-chg-pro-arg-pna·2acoh、h-d-cha-ala-arg-pna·2acoh、h-d-cha-gly-arg-pna·2acoh、ch3oco-gly-pro-arg-pna·acoh、h-β-ala-gly-arg-pna·2acoh、h-d-phe-pip-arg-pna·2hcl、pyroglu-pro-arg-pna·hcl和h-d-ala-pro-arg-pna·2hcl中的一種或幾種。所述凝血酶發色底物的來源沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的凝血酶發色底物即可。本發明提供的一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒包括稀釋液。所述稀釋液的作用是對凝血酶和凝血酶發色底物進行稀釋，得到凝血酶和凝血酶發色底物溶液。本發明中，所述稀釋液的組分包括緩衝液、無機鹽、穩定劑、表面活性劑和防腐劑。所述緩衝液優選為三羥甲基氨基甲烷緩衝液或磷酸緩衝液，更優選為三羥甲基氨基甲烷緩衝液；所述緩衝液的ph值為7.2～7.8，更優選為7.5。所述無機鹽優選為氯化鈉或氯化鉀，更優選為氯化鈉；所述無機鹽的質量濃度優選為0.15～0.25mol/l，更優選為0.2mol/l；所述表面活性劑優選為聚乙二醇-8000或吐溫-20，更優選為聚乙二醇-8000；所述表面活性劑的質量濃度優選為0.05％～0.15％，更優選為0.1％。所述穩定劑優選為小牛血清或酪蛋白，更優選為小牛血清；所述穩定劑的質量濃度優選為0.08％～0.15％，更優選為0.1％；所述防腐劑優選為proclin300或疊氮鈉；所述防腐劑的質量濃度優選為0.1～1mg/ml，更優選為0.5mg/ml。本發明中，一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒在檢測達比加群含量中的應用，包括以下步驟：1)用稀釋液將凝血酶和凝血酶發色底物稀釋，得到凝血酶和凝血酶發色底物的溶液；2)將待測樣品與凝血酶溶液混合、孵育，得到孵育後的混合液；3)將孵育後的混合液與凝血酶發色底物的溶液混合、孵育後，讀取待測樣品中發色底物的信號強度；4)將得到的計算信號強度與已知濃度標準品的標準曲線比對，得到血液中達比加群含量。本發明中，所述步驟2)中待測樣品與凝血酶溶液的體積比為1～2:1，更優選為1:1。所述步驟2)中孵育的溫度優選為37℃。所述孵育的時間優選為2分鐘。本發明中，所述孵育後混合液與凝血酶發色底物的溶液的體積比為1～2:1，更優選為1:1。本發明中，所述步驟3)中信號強度的檢測波長為405nm。本發明除了可以檢測達比加群含量，還可以檢測其他直接凝血酶抑制劑。本發明中，所述檢測其他凝血酶抑制劑的方法同檢測達比加群的方法。下面結合實施例對本發明提供的一種基於凝血酶發色底物法檢測達比加群含量的試劑盒進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。實施例1濃度為20mmol/l的tris緩衝液，再加入鹽酸調節ph值至7.5；再加入氯化鈉，聚乙二醇-8000小牛血清和疊氮鈉，攪拌後得到終濃度分別為氯化鈉0.2mol/l，聚乙二醇-80000.1％，小牛血清0.1％，疊氮鈉0.5mg/ml的稀釋液。取凝血酶溶於稀釋液中，形成工作濃度為0.1u/ml、0.2u/ml、0.5u/ml、1u/ml和2u/ml的凝血酶溶液。取凝血酶的發色底物h-d-phe-pip-arg-pna·2hcl溶於稀釋液中，形成工作濃度為0.05mmol/l、0.1mmol/l、0.3mmol/l、0.5mmol/l和1mmol/l的凝血酶的發色底物溶液。實施例2樣品檢測：取100μl樣本與100μl凝血酶溶液混合均勻，37℃孵育2分鐘，然後加入200μl凝血酶的發色底物溶液，37℃反應在405nm波長測量吸光度5分鐘。凝血酶溶液和凝血酶的發色底物溶液的工作濃度選擇如表2所示。記錄試驗結果，計算信號強度，和標準曲線比對得到達比加群含量。表1檢測達比加群測定的結果由表1可以看出，上述方案均能準確地測定達比加群的含量變化，其中凝血酶工作濃度為0.5u/ml與凝血酶的發色底物的工作濃度為0.3mmol/l的方案檢測效果最佳。實施例3達比加群標準品的製備：配製多個不同濃度的已知達比加群濃度的人血漿標準品，其濃度分別為0ng/ml，15ng/ml，30ng/ml，60ng/ml，120ng/ml，250ng/ml，500ng/ml。標準曲線製作：(1)取100μl標準液與100μl凝血酶溶液混合均勻，並孵育2分鐘，孵育和反應的溫度均為37℃。(2)然後加入200μl凝血酶的發色底物溶液，混合均勻，在405nm波長測量吸光度5分鐘。(3)根據達比加群標準液梯度濃度與所對應吸光值，採用線性方程繪製標準曲線，請見圖1，其標準曲線公式為y＝-0.7441x+0.2067(r2＝0.9927)。表2檢測達比加群測定試劑盒線性範圍達比加群濃度(ng/ml)0153060120250500達比加群濃度(ng/l)00.0150.030.060.120.250.5405nm吸光度1.6791.5881.5071.4321.2911.0140.699由表2可知，達比加群濃度在0～500ng/ml範圍內容，具有較好的線性關係，在此範圍內能夠準確檢測血漿中達比加群的含量。實施例4按照實施例3中的檢測方法，凝血酶工作濃度為0.3u/ml與凝血酶的發色底物的工作濃度為0.5mmol/l的方案對不同梯度達比加群濃度進行檢測，得到吸光度值，計算後得到本試劑盒的檢測靈敏度。根據國家標準，靈敏度為標準曲線的斜率，即用已知濃度或活性的樣品測試試劑盒，記錄在試劑盒規定參數下產生的吸光度改變，其中標準曲線的斜率為-0.7441log(吸光度)/(ng/l)。表3檢測達比加群測定試劑盒靈敏度達比加群濃度(ng/ml)0153060120250500405nm吸光度1.6791.5881.5071.4321.2911.0140.699由表3所示，本發明提供的試劑盒可以檢測到低至15ng/ml的達比加群。實施例5按照實施例3的檢測方法將達比加群標準品的濃度為30ng/ml和250ng/ml多次檢測吸光度值，結果見表4。表4檢測達比加群測定試劑盒重複性由表4可知，本發明提供的試劑盒經過多次檢測時，cv值小於2％，重複性非常好。實施例6按照實施例3中的檢測方法，蛇靜脈酶工作濃度為0.2u/ml與凝血酶的發色底物的工作濃度為1mmol/l的方案對不同稀釋液進行檢測，得到利用不同稀釋液的標準曲線。表5檢測不同稀釋液對試劑盒的影響由表5可以看出，不同稀釋液種類對試劑盒的標準曲線的有不同的程度的影響，其中碳酸鹽緩衝液的標準曲線r2值為0.9727，硼酸鹽緩衝液的標準曲線的r2值為0.9759，而三羥甲基氨基甲烷緩衝液和磷酸鹽緩衝液的標準曲線r2值均大於0.99，因此，三羥甲基氨基甲烷緩衝液或磷酸緩衝液有利於提高試劑盒的檢測準確性和精確度。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁12