中藥黃連解毒湯在製備防治類風溼關節炎的藥物中的應用的製作方法
2023-10-30 02:54:17 2
專利名稱：中藥黃連解毒湯在製備防治類風溼關節炎的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及中藥，具體涉及黃連解毒湯在製備防治類風溼關節炎的藥物中 的應用。
背景技術：
類風溼性關節炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一種病因尚未明了的慢性 全身性炎症性疾病，以慢性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外病變為主要臨床表 現，屬於自身免疫炎性疾病。該病好發於手、腕、足等小關節，反覆發作，呈對 稱分布。早期有關節紅腫熱痛和功能障礙，晚期關節可出現不同程度的僵硬畸形， 並伴有骨和骨骼肌的萎縮，極易致殘。從病理改變的角度來看，類風溼性關節炎 是一種主要累及關節滑膜(以後可波及到關節軟骨、骨組織、關節韌帶和肌鍵)， 其次為漿膜、心、肺及眼等結締組織的廣泛性炎症性疾病。類風溼性關節炎的全 身性表現除關節病變外，還有發熱、疲乏無力、心包炎、皮下結節、胸膜炎、動 脈炎、周圍神經病變等。但是，類風溼性關節炎至今尚無特效療法，仍處於對炎 症及後遺症的治療。黃連解毒湯首載於葛洪《肘後備急方》，王燾《外臺秘要》引崔氏方"前 軍督護劉車者，得時疾三日已汗解，因飲酒復劇，苦煩乾嘔，口燥呻吟，錯語不 得臥，餘思作此黃連解毒湯。此方由"黃連三兩(9g)，黃吝、黃柏各二兩(6g)， 梔子十四枚(9g)組成。上四味切，以水六升，煮取二升，分二服。此方淳火解 毒，主治三焦火毒熱盛證。凡大熱煩躁，口燥咽幹，錯語不眠；或熱病吐血，衄 血；或熱甚發斑，身熱下利，溼熱黃疸；外科癰瘍疔毒，小便黃赤，舌紅苔黃， 脈數有力皆可用之。"本方證乃火毒充斥三焦所致。火毒熾盛，內外皆熱，上擾神明，故煩熱錯語； 血為熱迫，隨火上逆，則為吐衄；熱傷絡脈，血溢肌膚，則為發斑；熱盛則津傷， 故口燥咽幹；熱壅肌肉，則為癰腫疔毒；舌紅苔黃，脈數有力，皆為火毒熾盛之200910195341.8 ，治宜瀉火解毒。方中以大苦大寒之黃連清瀉 心火為君，因心主神明，火主於心，瀉火必先瀉心，心火寧則諸經之火自降，且 兼瀉中焦之火。臣以黃芩清上焦之火。佐以黃柏瀉下焦之火。使以梔子通瀉三焦， 導熱下行，是火熱從下(小便)而去。四藥合用，苦寒直折，三焦之火邪去而熱 毒解，而諸證可愈。吳昆《醫方考》巻3曰"陽毒上竅出血者，此方主之。治 病必求其本，陽毒上竅出血，則熱為本，血為標，能去其熱則血不必治而歸經矣。 故用連、芩、桅、柏苦寒解熱之物以主之。然惟陽毒實火，用之為宜。若陰虛之 火則降多亡陰，苦從火化而出血益甚，是方在所禁矣。"《肘後備急方》巻2亦 載"煩嘔不得眠可用此方。"《成方便讀》載"可治一切火邪，表裡俱盛， 狂躁煩心，口燥咽幹，大熱乾嘔，錯語不眠，吐血，衄血，熱盛發斑等證。"現代藥理研究表明黃連解毒湯具有明顯的抗炎、鎮痛、抗菌、抗內毒素、 調節消化系統、解熱、降壓、等多方面作用。為尋求中醫藥治療類風溼性關節炎 的有效方劑，本發明人經大量試驗證實，黃連解毒湯有明顯的抗炎及免疫作用， 能較好的預防和治療類風溼性關節炎。發明內容本發明所要解決的技術問題在於研究設計黃連解毒湯在製藥中的應用。 本發明提供了中藥黃連解毒湯在製備防治類風溼性關節炎藥物中的應用。 所述中藥黃連解毒湯的中藥組成成分為黃連9g、黃芩6g、黃柏6g和梔子9g。本發明採用黃連解毒湯進行動物藥效試驗，結果顯示黃連解毒湯可抑制CIA (Collagen-Induced Arthritis,膠原誘導的關節炎)的臨床發病，明顯抑制了CIA的 發病嚴重程度和發病率，說明黃連解毒湯對CIA具有明顯的保護作用。並能下 調脾細胞上清液中TNF-a (腫瘤壞死因子a) 、 IL-17 (白介素17) 、 IFN-y (幹擾 素y),抑制促炎細胞因子TNF-a、 IFN-y和IL-17的分泌，從而對CIA疾病具有保 護作用。TNF-a和IFN-Y在RA發病機制中起著重要作用。TNF-a可直接誘導蛋白 水解酶的合成，造成基質結構的破壞。實驗結果也表明，黃連解毒湯可較大程度 降低脾臟細胞分泌TNF-a。用抗TNF-a療法在治療RA上取得了良好的效果，不但 阻止了骨組織破壞而且也抑制了IL-I7的產生。黃連解毒湯對炎症的控制及對關 節組織的保護可能與其降低TNF-a含量有關。 IFN-Y主要由浸潤在病灶局部的CD4+T細胞分泌，它可以激活巨噬細胞，活化MIP-la、MIP-ip和IP-10的表達，這些趨化因子參與淋巴細胞向病灶遷移的過程。 本發明的實驗中，黃連解毒湯在體內明顯降低了IFN-Y的水平，有可能與阻斷了 淋巴細胞的後繼遷移有關。有研究報導，TNF-a與IFN-Y在體外共同刺激纖維原 細胞和人微血管內皮細胞可協同誘導趨化因子CXCLIO的產生，RA病人滑液中 大量CXCLIO的表達導致活化Thl細胞及自然殺傷細胞的浸潤，對組織造成損 傷。在類風溼關節炎的模型中升高的IL-15可通過誘導IL-17而發揮其促炎症細胞 因子的特性，IL-15可能通過環孢菌素A和類固醇敏感的途徑，導致關節中的IL-17 過度分泌。IL-17除了可刺激滑膜細胞釋放各種炎症介質外，還可通過刺激 RANKL與RANK結合，刺激骨吸收，是目前認識到的在類風溼性關節炎骨破壞 病理中最重要的細胞因子之一。本發明中，黃連解毒湯可顯著抑制IL-17的生成， 黃連解毒湯對CIA有明顯的療效，可明顯抑制CIA臨床發病，降低炎性細胞因 子TNF-a及IFN-Y的分泌，這是黃連解毒湯治療類風溼關節炎的機制。本發明通過藥理學研究實驗，明確所述中藥黃連解毒湯可用於製備防治類風溼 性關節炎藥物，為臨床治療類風溼性關節炎提供了新的中藥，可以克服化學藥的 毒付作用，給患者帶來治療的信心，有較大的臨床應用價值。
具體實施方式
一、實驗材料 藥物與試劑雞II型膠原(CII): Chondrex， Redmond, WA 98052， USA;不完全弗氏完全 佐劑(IFA) Difco Laboratories, Detroit, MI;磷酸緩衝鹽溶液(PBS):由本 實驗室自行配製，在800ml蒸餾水中溶解8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44gNa2HP04和 0.24gKH2PO4。用鹽酸調PH至7.4，加水定容至l L，過濾除菌後使用；DMSO二 甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide, DMSO):為sigma公司產品；1640培養基吉諾生 物醫藥技術有限公司；小牛血清民海生物有限公司；96孔平底板，CORNING 公司；70pm細胞研磨濾網，BD Falcon公司；15ml、 50ml離心管，BD Falcon公 司；0.22pm濾器，Millipore公司；1ml旋口注射器，BD公司；貝朗三通，德 國貝朗公司；甲氨喋呤片上海醫藥(集團)有限公司信誼製藥總廠(080605);黃連解毒湯實驗室自製，其製備方法為取黃連9克，黃芩6克，黃柏6克，梔子9克，混合後用300ml的水泡半小時，加熱煮沸，保持沸騰煮至l小時，煎煮液 過濾，濾液備用。濾渣再用240ml的水加熱煮沸，保持沸騰煮至l小時，煎煮液過 濾，合併兩次濾液，濃縮至lg/ml即可。 動物DBI/I型小鼠，雄性，6-8周，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可 證號SCXK(滬)2007-0005，飼養於第二軍醫大學實驗動物中心清潔級環境中。 儀器與設備高速臺式離心機，Eppendorf;高速臺式低溫離心機，HITACHI公司；倒置顯 微鏡，Nikon公司；超淨臺，蘇淨集團安泰公司製造；電熱恆溫鼓風乾燥箱，上 海精宏實驗設備有限公司；溼度C02培養箱，Heraus公司；恆溫水浴鍋，上海 國華電器有限公司。二、 實驗方法 模型的建立 實驗準備完全弗氏佐劑(CFA)的製備在不完全弗氏佐劑中加入熱滅活的結核分支杆 菌至終濃度4mg/ml，使用之前充分混勻。 0.01M冰乙酸製備11.43pl冰乙酸溶於20ml去離子水中，過濾，4"C備用。 CII製備將CII溶解於0.01M冰乙酸至終濃度4mg/ml， 4 。C保存。 抗原的乳化用三通管連接兩支玻璃針管，將PBS、完全弗氏佐劑和抗原CII 分別加入一支針管中(每100pl乳化液含200嗎CII和5(Hi1完全弗氏佐劑)，排 除針管內氣泡後，來回推動針管約500次，將針管內各成分充分混勻成乳化狀態。 CIA模型的誘導第0天，小鼠尾根部2-3釐米處給予10(Hi1 /只乳化好的CII抗原皮下注射免 疫；第21天，加強免疫50plCl1和150plPBS充分混勻，150ul/只腹腔注射；正常組用生理鹽水同法注射。三、 實驗分組和給藥方案大鼠隨機分為6組，每組12隻，分別為正常組、CIA模型組、陽性對照組(甲 氨喋呤2mg/kg)、黃連解毒湯組分為高、中、低三個劑量組，其給藥量分別為500mg/kg、 250mg/kg、 125 mg/kg。於二次免疫前一天(第20天)至第34天黃連 解毒湯組分別按500mg/kg、 250mg/kg、 125mg/kg連續灌胃給藥，甲氨喋呤組每 兩天按2mg/kg給藥，正常組和模型組按10ml/kg給予飲用水。1、 多發性關節炎指數(arthritis index, AI)評分二次免疫後，定期記錄小鼠全身關節病變情況，按3級評分法評價，計算發病 率及平均發病指數。具體評分標準為O分-關節正常；l分-關節輕微紅腫；2分-關節紅腫嚴重，累及整個關節，活動受限；3分-爪子或關節功能障礙，關節僵硬。 四肢的總和為小鼠的評分，最高為12分。2、 淋巴及脾臟單個核細胞(MNC)懸液的製備小鼠處死，固定，剪開腹部皮膚，取兩側腹股溝淋巴結；後打開腹腔，取出脾 髒，立即放入裝有1640的15ml離心管中，置於冰上；將脾臟倒入70pm的細胞 研磨濾網中，用lml注射器針芯充分研磨，使之成細胞懸液；收集細胞懸液，4'C ， 1000卬m，離心8min，離心後棄去上清；打散細胞，加入0.83%氯化銨水(約1.0ml/ 脾臟)，裂解5min;加入3倍體積的PBS終止裂解反應，並用玻璃吸管去除細胞 懸液中的絮狀物；4'C， 1000rpm，離心8min，離心後棄去上清；打散細胞，加 入lml 1640 (含小牛血清)，混勻後計數，以1640完全培養基(含小牛血清)在 96孔板中培養，5xlO"ml每孔100ul，貼壁2小時。3、 脾細胞NO測定在96孔平圓底板中每孔加入5xl06/ml脾臟MNC100ul，每組4復孔；貼壁2小 時後，換液DMEM培養基，每孔加LPS (終濃度lug/ml)，將細胞置於37'C， 5 %C02培養箱中培養18小時後取出上清液檢測NO。4、 脾、淋巴細胞增值測定在96孔平圓底板中分別加入5xlO"ml脾臟及淋巴MNC100ul，每組4復孔；貼 壁2小時後，加CII (100ug/ml)，將細胞置於37'C， 5%C02培養箱中培養72小 時後取出加MTS測增值。5、 脾細胞細胞因子測定在96孔平圓底板中加入5xlO"ml脾臟MNC100ul，每組4復孔；貼壁2小時後， 加CII (100ug/ml)，將細胞置於37。C， 5%C02培養箱中培養48小時後取上清液 檢測細胞因子。四、結果1、黃連解毒湯可抑制CIA的臨床發病在此CIA的實驗中，用CII誘導CIA模型，初次免疫為第0天，第21天加 強免疫後小鼠隨機分為6組對照組和三組黃連解毒湯組。於第20天開始給，陽 性對照組每兩天給予甲氨喋呤藥2mg/kg，黃連解毒湯高劑量組給予500 mg/kg， 中劑量組為250mg/kg，低劑量組為125mg/kg，連續給藥14天，直到實驗結束。 每天觀察小鼠並依據評分標準給每隻小鼠評分。CII誘導CIA，加強免疫後小鼠陸續出現發病，對照組與用藥組在發病時間上 沒有明顯差異。發病後，模型組組小鼠疾病嚴重程度加重較快，在免疫後第37天 達到高峰，而給藥組小鼠發病後疾病發展較對照組小鼠緩和(圖l)。從發病率 來看，模型組為92%，對照組為75%，黃連解毒湯高、中、低三個劑量組分別為 72%， 70%和75%。由此可見，黃連解毒湯對CIA發病時間沒有明顯影響，但明 顯抑制了CIA的發病嚴重程度和發病率，說明黃連解毒湯對CIA具有明顯的保 護作用。2、黃連解毒湯能下調脾細胞上清液中TNF-a、 IL-17、 IFN-y在體內給予藥物治療CIA的實驗中，疾病達到平臺期後處死小鼠，取出脾臟細 胞，製成單細胞懸液，每孔1.5"06個細胞鋪板，在體外用20pg/ml的抗原ClI刺 激，培養48小時後收集上清，用ELISA方法測量細胞因子TNF-a、 IFN々的濃度。如圖2所示，CII刺激後，模型組細胞上清中TNF-a、 IFN-y及IL-17均高於各 個藥物處理組，與陽性對照組及黃連解毒湯組相比，存在統計學差異(p<0.05)。 說明體內給予藥物治療後，能夠抑制促炎細胞因子TNF-a、 IFN-y和IL-17的分泌， 並能從而對CIA疾病具有保護作用。
圖l黃連解毒湯臨床評分中+模型組+對照組+黃連解毒湯 500mg/kg +黃連解毒湯250111§/1^ +黃連解毒湯12511^/1^圖2脾細胞上清細胞因子結果中(1) TNF-a檢測結果(2) IL-17檢測 結果(3) IFN-y檢測結果；。空白組國模型組國甲氨喋呤組s黃連解毒湯 500mg/kg ia黃連解毒湯250mg/kg S黃連解毒湯125mg/kg; *P<0.05 ** PO.01 。
權利要求
1、中藥黃連解毒湯在製備防治類風溼性關節炎藥物中的應用。
2、 根據權利要求l所述的應用，其特徵在於所述中藥黃連解毒湯的中藥組成成 分為黃連9g、黃芩6g、黃柏6g和梔子9g。
全文摘要
本發明提供了中藥黃連解毒湯(中藥組成成分為黃連9g、黃芩6g、黃柏6g和梔子9g)在製備防治類風溼性關節炎藥物中的應用。本發明採用黃連解毒湯進行動物藥效試驗，結果顯示黃連解毒湯可抑制CIA(Collagen-Induced Arthritis，膠原誘導的關節炎)的臨床發病，明顯抑制了CIA的發病嚴重程度和發病率，說明黃連解毒湯對CIA具有明顯的保護作用。並能下調脾細胞上清液中TNF-α、IL-17、IFN-γ，抑制促炎細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17的分泌，從而對CIA疾病具有保護作用。為臨床治療類風溼性關節炎提供了新的中藥，可以克服化學藥的毒副作用，給患者帶來治療的信心，有較大的臨床應用價值。
文檔編號A61K36/756GK101653502SQ20091019534
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月8日 優先權日2009年9月8日
發明者劉心如, 劉曉華, 磊 單, 張衛東, 徐希科, 李慧梁, 柳潤輝, 沈雲亨, 竇聖姍, 娟 蘇 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學