一種知母多糖提取物及其製備方法和醫藥用途的製作方法

2023-10-10 17:25:59

專利名稱：一種知母多糖提取物及其製備方法和醫藥用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種知母多糖提取物和其製備方法，及將該知母多糖提取物用作免疫抑制活性，用於治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病的醫藥用途。
背景技術：
知母為百合科知母屬植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的根莖，性味苦、甘、寒，歸肺、胃、腎經。具有清熱瀉火、滋陰潤燥功能，用於外感熱病，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內熱消渴，腸燥便秘。現代研究發現知母中的化學成分以留體皂苷、雙苯吡酮類為主，尚有木脂素類、黃酮類、有機酸類等，是現代醫藥研究中的熱點藥物之一，近年來的研究進展迅速，但大都集中於知母皂苷類、雙苯吡酮類成分上，認為知母皂苷為知母的重要藥效物質基礎，對知母多糖研究較少，尚未見其具有免疫抑制活性的報導。本發明通過深入的化學、藥理學、藥效學研究，發明了一種製備知母多糖的新方法，該方法操作簡單，經濟節能，並且能得到較高純度和較大含量的多糖組分；同時首次發現知母多糖具有免疫抑制活性，可用於治療與免疫炎性損傷相關的各種疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病。這與知母以往研究中皂苷類、雙苯吡酮類藥效物質基礎的研究是完全不同的。

發明內容
本發明目的之一是提供一種具有免疫抑制活性的知母多糖提取物。本發明目的之二是提供一種上述知母多糖提取物的製備方法，知母多糖的含量佔提取物重量百分比的60 %以上。本發明目的之三是將上述知母多糖提取物製成各種劑型的免疫抑制劑，用於治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病的醫藥用途。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的—種知母多糖提取物的製備方法，其特徵在於知母原料藥材脫脂後，再經過水提取、醇沉澱得到粗多糖，粗多糖經過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分子化學成分，製成較高純度的知母多糖提取物。一種製備上述知母多糖提取物的方法，其包括以下具體步驟(1)將知母用高濃度乙醇回流除去脂溶性雜質；(2)殘渣加水回流提取，濾液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉澱；C3)沉澱依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌；(4)洗滌後的沉澱用蒸餾水復溶，透析；( 透析液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得多糖沉澱；(6)多糖沉澱依次用無水乙醇，丙酮分別洗滌；(7)洗滌後的沉澱用蒸餾水復溶，採用弱酸弱鹼型陰、陽離子交換樹脂串聯法脫去多糖中的色素和蛋白質，即得知母多糖提取物。為了達到更好的提取效果，優選的，步驟(1)中將知母用6 12倍重量的80 95%乙醇回流脫脂2 3次，每次回流2 池；步驟O)中將殘渣加6 12倍重量的蒸餾水回流提取2 3次，每次回流提取2 3h，將濾液濃縮至藥材0. 2 1. 0體積，加入80 95%乙醇醇沉，離心得沉澱；步驟C3)、(6)中將沉澱依次用2 4倍重量的無水乙醇，丙酮分別洗滌；步驟中的沉澱以0. 5 2. 0倍重量的蒸餾水復溶，以分子量大小為 3. OXlO3-L 2X IO4的透析袋透析24 72h。將從知母中分離出的多糖依次採用DEAE-kpharose F. F和DEAE-52離子交換色譜柱(洗脫相為0. 1-lmol/L的NaCl溶液)，收集液可以選擇但不限於如下瓊脂糖凝膠柱色譜做進一步純化分離S印hadex G50、S印hacryl S100、S印hacryl 200、S印hacryl S300 和kphacryl S400(洗脫相為0. 1-lmol/L NaCl溶液)。本發明知母多糖提取物中總多糖的含量佔提取物重量百分比的60%以上，進一步純化甚至可以得到知母多糖單體。所述的知母多糖提取物，具有免疫抑制活性對小鼠單核巨噬細胞吞噬功能呈抑制作用，提示具有非特異性免疫抑制功能；降低綿羊紅細胞所致實驗大鼠溶血素生成的含量，表示具有體液免疫抑制功能。知母多糖提取物通過免疫抑制機制，可用於治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病。本發明知母多糖提取物可以加入製備不同劑型時所需的各種輔料和藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑後，以常規的中藥製劑方法製備成任何一種適宜的臨床製劑，例如可以是注射劑(粉針、凍乾粉針、水針、輸液等)、口服製劑(片劑、口服液、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊或滴丸)等。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例1取知母藥材約2. ^ig，用90%乙醇回流提取3次，每次池，過濾，將濾渣晾乾，殘渣加蒸餾水10倍量，回流提取3次，每次池，過濾，合併濾液，減壓回收溶劑至藥材1倍體積， 用95%乙醇調至含醇量為80%，靜置過夜，2000rpm/min離心，沉澱依次用4倍量無水乙醇、 丙酮洗滌，得總多糖。取總多糖加水溶解，上清液裝入透析袋中流水透析48h，蒸餾水透析 Mh，透析液減壓濃縮至藥材1體積，加入95%乙醇調含醇量為85%，靜置過夜，2000rpm/ min離心，沉澱用4倍量無水乙醇、丙酮依次洗滌，蒸餾水復溶，經過弱酸弱鹼型陰、陽離子交換樹脂(Amberlite FPA90C1+Amberlite IRC84)脫去總多糖中色素和蛋白質冷凍乾燥， 得精製知母多糖。用苯酚-硫酸法，在500nm處，紫外分光光度法測定總多糖含量，以葡萄糖 C6H12O6 計為 65%。實施例2取知母藥材約3kg，用80 %乙醇回流提取2次，每次3h，過濾，將濾渣晾乾，殘渣加蒸餾水8倍量，回流提取2次，每次3h，過濾，合併濾液，減壓回收溶劑至藥材1倍體積， 用95%乙醇調至含醇量為80%，靜置過夜，2000rpm/min離心，沉澱依次用3倍量無水乙醇、丙酮洗滌，得總多糖。取總多糖加水溶解，上清液流水透析48h，蒸餾水透析Mh，透析液減壓濃縮至藥材1體積，加入95%乙醇調含醇量為80%，靜置過夜，2000rpm/min離心，沉澱用3倍重量無水乙醇、丙酮依次洗滌，蒸餾水復溶，經過弱酸弱鹼型陰、陽離子交換樹脂(Amberlite FPA90C1+Amberlite IRC84)脫去總多糖中色素和蛋白質冷凍乾燥，得精製知母多糖。用苯酚-硫酸法，在500nm處，紫外分光光度法測定總多糖含量，以葡萄糖C6H12O6 計為60%。實施例3製成輸液劑將知母總多糖經過瓊脂糖凝膠柱kphacryl S300,Sephadex G50色譜做進一步純化分離得到98%純度以上的知母多糖提取物，加入適量增溶劑，研磨，再加入少量注射用水進行稀釋，混勻，然後加入氯化鈉適量，溶解後再加注射用水至規定量，濾過，灌封，滅菌， 即得。實施例4製成片劑取之母多糖提取物適量，加入稀釋劑、崩解劑等輔料適量，混勻，製成顆粒，乾燥， 壓製成片，包衣或噴薄膜衣即得。實驗例1知母多糖抗炎實驗研究取ICR雄性小鼠，隨即分成知母高劑量G40mg/kg)、知母低劑量(110mg/kg)、陽性對照地塞米松(3. 6mg/kg)及空白對照組。秤取各組小鼠體重，計算均值標準差確定無組間差異，連續灌胃給藥三天，第三天於末次給藥後50min，每鼠右耳塗致炎劑(二甲苯20μ 1)， 左耳作為空白對照，3小時後將小鼠處死，剪下兩耳並打下圓耳片，分析天平稱重，計算小鼠耳腫脹度。比較4組腫脹度的差異性。實驗結果見表1。表1 知母多糖抗炎實驗結果(X ±S，n=10)
權利要求
1.一種知母多糖提取物，其特徵在於所述知母多糖提取物中總多糖的含量佔提取物重量百分比的60%以上。
2.一種知母多糖提取物的製備方法，其特徵在於知母藥材脫脂後，經過水提取、醇沉澱得到粗多糖，粗多糖再經過透析、離子交換柱層析脫去蛋白、色素，再除去小分子化學成分，製成較高純度的知母多糖提取物。
3.—種權利要求1、2所述的知母多糖提取物的製備方法，包括以下步驟(1)將知母用高濃度乙醇回流除去脂溶性雜質；(2)殘渣加水回流提取，濾液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得沉澱；(3)沉澱分別用無水乙醇，丙酮依次洗滌；(4)洗滌後的沉澱用蒸餾水復溶，進行透析；(5)透析液濃縮，加入乙醇醇沉，離心得多糖沉澱；(6)多糖沉澱分別用無水乙醇，丙酮依次洗滌；(7)洗滌後的多糖沉澱用蒸餾水復溶，採用弱酸弱鹼型陰、陽離子交換樹脂串聯法脫去多糖中的色素和蛋白質，製成知母多糖提取物。
4.按照權利要求2、3所述的知母多糖提取物的製備方法，其特徵在於步驟(1)中將知母用6 12倍重量的80 95%乙醇回流脫脂2 3次，每次回流2 池；步驟O)中將殘渣加6 12倍重量的蒸餾水回流提取2 3次，每次回流提取2 池，將濾液濃縮至藥材0. 2 1. 0體積，加入80 95%乙醇醇沉，離心得沉澱；步驟C3)、(6)中將沉澱依次用2 4倍重量的無水乙醇，丙酮分別洗滌；步驟(4)中的沉澱以0. 5 2. 0倍重量的蒸餾水復溶，以分子量大小為3. OX IO3-L 2 X IO4的透析袋透析24 72h。
5.按照權利要求1、2、3所述的知母多糖，其特徵在於知母多糖具有免疫抑制活性，可以用作製備各種劑型的免疫抑制劑或作為製備其他免疫抑制藥物的原料藥，用於治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病的醫藥用途。
全文摘要
本發明涉及一種知母多糖提取物及製備方法和醫藥用途。製備方法包括原料脫脂後，再經過水提取、醇沉澱得到粗多糖，粗多糖經過透析、離子交換層析脫去蛋白、色素，除去小分子化學成分，製成較高純度的知母多糖提取物。本發明提取物中知母多糖的含量以葡萄糖計，所述多糖的含量佔知母提取物重量百分比60％以上。本發明通過大量的藥理學實驗發現，知母多糖提取物具有免疫抑制活性，用於治療免疫炎性損傷性疾病腎炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎、扁桃體炎及糖尿病的醫藥用途。
文檔編號A61P11/00GK102166294SQ20111008770
公開日2011年8月31日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日
發明者匡海學, 夏永剛, 王知斌, 王秋紅, 穆光銳, 薛娟 申請人:匡海學