一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法
2023-10-10 11:32:49 1
一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法
【專利摘要】本發明提供一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法，通過生物信息學分析獲得轉基因植物中外源基因與秀麗隱杆線蟲基因組中相同短片段，通過將短片段克隆和轉化來飼餵秀麗隱杆線蟲，根據秀麗隱杆線蟲的表型差異來檢測外源基因對線蟲的安全性。以往轉基因作物的安全性評價集中在取食外源蛋白對非靶標生物影響，本發明用於檢測外源基因對線蟲這類重要土壤生態系統組成者的安全性問題，填補了這一轉基因作物安全評價領域的空白。本發明是利用飼餵的方法來進行RNAi，不需要特殊的試劑和儀器，線蟲飼養容易，方法簡單易行。
【專利說明】一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法
【技術領域】[0001]本發明涉及分子生物學領域，具體地說，涉及一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法。
【背景技術】
[0002]從1996年轉基因作物開始大規模的種植到現在，已經有16年的歷史，轉基因作物在環境中的大規模釋放，使得轉基因作物的安全性越來越成為人們關注的焦點，並引發了不少的爭論。轉基因作物的風險評估一直是伴隨著轉基因作物的研究而開展的，並且也一直是轉基因作物獲得許可的一個重要環節。根據2001年歐洲議會發布的2001/18/EC指令，轉基因作物風險評估的目的是在個案分析的原則上確定和評估轉基因作物可能對人類健康和環境造成的直接或間接、短期或長期的負面影響(Craig et al.2008)。轉基因作物的風險評估的一項重要內容就是轉基因作物的環境安全，包括對非靶標生物以及生物多樣性的影響、基因漂移以及重組的風險和靶標生物的抗性演化風險等。轉基因作物中轉入的外源蛋白和外源基因可以通過花粉、根際分泌物以及作物殘體等形式在環境中進行擴散，這可能對轉基因的非靶標生物產生影響。
[0003]所有的轉基因作物都有一些非靶標的物種存在，這些物種大致可以分為以下幾類:a.農業害蟲的天敵(比如瓢蟲)和傳粉者(比如蜜蜂)；b.非靶標的食草動物；c.土壤生物；d.保護物種(比如黑脈金斑蝶)；e.對地方生物多樣性有貢獻的物種(Snow etal.2005 ；Andow and Hilbeck2004)。由於外源蛋白和外源基因可以通過根際分泌物以及作物殘體等形式在土壤中殘留，轉基因作物對土壤生物的非靶標效應也成為研究者關注的一個重點。已經有不少研究者開始研究轉基因作物對彈尾目昆蟲(Folsomia Candida)、蟎類(Scheloribates praeincisus)、蟲丘蝴(Enchytraeus albidus)以及甲蟲(Poeciluschalcites)等土壤生物的影響(袁一楊和戈峰2010)。
[0004]土壤中的線蟲無論是在在自然生態系統和農業生態系統中佔據著重要位置。土壤中自由生活的線蟲的取食範圍包括細菌、真菌、藻類、原生動物以及腐殖質等，而寄生性線蟲則在動物和植物中均有發現。土壤線蟲作為分解者參與環境中的氮循環和碳循環，是土壤食物鏈的一個關鍵環節。這使得線蟲越來越多的被應用為土壤生態系統的指示生物。土壤線蟲中屬於線蟲動物門胞管腎綱小杆目小杆科隱杆線蟲屬的秀麗隱杆線蟲(Caenorhabditis elegans)作為一種重要的模式生物,不僅在分子生物學以及發育生物學方面取得了很多重要的研究成果，也越來越多的應用於環境毒理學方面的研究，在環境評估中發揮著越來越重要的作用。在早期的研究中，常使用致死率作為評估的標準，而在後來的研究中，有更多反映亞致死情況的指標被應用到對環境的風險評估中來，比如生長和繁殖，取食和用計算機追蹤的方法來反映運動機能等(Sochovd et al.2006 ；Leung etal.2008 ；Hoss et al.2009)。
[0005]在目前研究轉基因作物對土壤生物的非靶標效應中，一般考察殘留在土壤中的外源蛋白(如Bt蛋白)對土壤生物的毒副作用，而不考慮外源基因的影響。對於一般的生物來說，除了基因漂移和重組以外，外源基因難以對其產生影響。但是，通過對模式生物秀麗隱杆線蟲的研究，發現線蟲是一種可以通過注射、浸泡和取食雙鏈RNA等方式來影響自身基因表達,產生RNAi效應的生物。這種外源基因對土壤線蟲的非靶標效應是之前研究中沒有得到監測的缺失環節。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法。
[0007]為了實現本發明目的，本發明的一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法，通過生物信息學分析獲得轉基因植物中外源基因與秀麗隱杆線蟲基因組中相同短片段，通過將短片段克隆和轉化來飼餵秀麗隱杆線蟲，根據秀麗隱杆線蟲的表型差異來檢測外源基因對線蟲的安全性。
[0008]通過構建含有外源基因與秀麗隱杆線蟲相同短片段的表達雙鏈RNA的載體，轉入大腸桿菌中飼餵秀麗隱杆線蟲，利用RNAi的方法，檢測轉基因作物中的外源基因是否對秀麗隱杆線蟲造成影響。
[0009]具體地，所述方法包括以下步驟:
[0010]I)序列的生物信息學分析
[0011]將轉基因作物外源基因的核苷酸序列與秀麗隱杆線蟲的全基因組序列進行比對分析，找出完全匹配且長度≥17bp的目的基因片段，再將這些目的片段在Wormbase資料庫中進行檢索，找出與秀麗隱杆線蟲基因組中外顯子反相互補的目的基因片段；
[0012]2)重複片段表達載體的構建及宿主菌的轉化
[0013]1.將找到的與秀麗隱杆線蟲基因組中外顯子反相互補的目的基因片段分別以5和10的倍數進行拷貝，兩端加上限制性內切酶位點和保護鹼基，合成5個和10個拷貝的重複目的基因片段；
[0014]i1.將目的基因片段與含有兩個相反方向的T7啟動子的表達載體L4440分別用相同的限制性內切酶反應，切割後的目的片段和表達載體以3:1的比例進行連接，使目的片段連入表達載體的兩個T7啟動子之間；
[0015]ii1.將連接產物轉化到大腸桿菌Transl09的感受態細胞中，將菌液塗布於LB培養基上，挑取陽性克隆，提取質粒，轉化到大腸桿菌HT115的感受態細胞中，將菌液塗布於LB培養基上，37°C培養過夜；
[0016]3)對照組的選擇和表達載體的構建
[0017]根據Wormbase資料庫中秀麗隱杆線蟲的基因信息,選擇3個基因rpl_2, fem-1和hrp-1作為陽性對照；分別在這3個基因上選擇長度為700bp、200bp和IOObp的片段，設計引物，兩端加上相應的酶切位點，按步驟2)中目的基因片段的克隆方法，連接到表達載體L4440 中；
[0018]4)飼餵秀麗隱杆線蟲
[0019]iv.將E.coli 0P50塗布於NGM培養基上，室溫培養過夜；挑取秀麗隱杆線蟲於含有E.coli 0P50的NGM培養基上，20°C培養；
[0020]V.將步驟2)中含有目的基因片段克隆表達載體的大腸桿菌HT115接種於含lmmol/L IPTG的NGM培養基上，室溫培養過夜以誘導dsRNA的產生；將處於L3生長期的線蟲放到該培養基上飼養至產卵,待線蟲大量產卵後,移除成蟲；
[0021]v1.每個處理組及對照組設置5個平板，每個平板中接入20條Fl代線蟲；在？1代線蟲產卵期間，每天更換一次平板；待產卵期結束後，每兩天更換一次平板；統計Fl代線蟲的產卵數量及存活時間，進而檢測外源基因對土壤線蟲的安全性。
[0022]步驟3)中分別針對3個基因rpl-2，fem-1和hrp_l的長度為700bp、200bp和IOObp的片段，設計的引物如下:
[0023]
【權利要求】
1.一種檢測轉基因作物外源基因對土壤線蟲安全性的方法，其特徵在於，通過生物信息學分析獲得轉基因植物中外源基因與秀麗隱杆線蟲基因組中相同短片段，通過將短片段克隆和轉化來飼餵秀麗隱杆線蟲，根據秀麗隱杆線蟲的表型差異來檢測外源基因對線蟲的安全性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)序列的生物信息學分析 將轉基因作物外源基因的核苷酸序列與秀麗隱杆線蟲的全基因組序列進行比對分析，找出完全匹配且長度≥17bp的目的基因片段，再將這些目的片段在Wormbase資料庫中進行檢索，找出與秀麗隱杆線蟲基因組中外顯子反相互補的目的基因片段； 2)重複片段表達載體的構建及宿主菌的轉化 1.將找到的與秀麗隱杆線蟲基因組中外顯子反相互補的目的基因片段分別以5和10的倍數進行拷貝，兩端加上限制性內切酶位點和保護鹼基，合成5個和10個拷貝的重複目的基因片段； ?.將目的基因片段與含有兩個相反方向的T7啟動子的表達載體L4440分別用相同的限制性內切酶反應，切割後的目的片段和表達載體以3:1的比例進行連接，使目的片段連入表達載體的兩個T7啟動子之間； ii1.將連接產物轉化到大腸桿菌Transl09的感受態細胞中，將菌液塗布於LB培養基上，挑取陽性克隆，提取質粒，轉化到大腸桿菌HT115的感受態細胞中，將菌液塗布於LB培養基上，37 °C培養 過夜； 3)對照組的選擇和表達載體的構建 根據Wormbase資料庫中秀麗隱杆線蟲的基因信息，選擇3個基因rpl_2, fem-1和hrp-1作為陽性對照；分別在這3個基因上選擇長度為700bp、200bp和IOObp的片段，設計引物，兩端加上相應的酶切位點，按步驟2)中目的基因片段的克隆方法，連接到表達載體L4440 中； 4)飼餵秀麗隱杆線蟲 iv.將E.coli 0P50塗布於NGM培養基上，室溫培養過夜；挑取秀麗隱杆線蟲於含有E.coli 0P50的NGM培養基上，20°C培養； V.將步驟2)中含有目的基因片段克隆表達載體的大腸桿菌HT115接種於含lmmol/LIPTG的NGM培養基上，室溫培養過夜以誘導dsRNA的產生；將處於L3生長期的線蟲放到該培養基上飼養至產卵,待線蟲大量產卵後,移除成蟲； v1.每個處理組及對照組設置5個平板，每個平板中接入20條Fl代線蟲；在Fl代線蟲產卵期間，每天更換一次平板；待產卵期結束後，每兩天更換一次平板；統計Fl代線蟲的產卵數量及存活時間，進而檢測外源基因對土壤線蟲的安全性。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟3)中分別針對3個基因rpl-2，fem-1和hrp-1的長度為700bp、200bp和IOObp的片段，設計的引物如下:
【文檔編號】C12R1/19GK103695541SQ201310682486
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】許崇任, 王戎疆, 李家練, 李茹 申請人:北京大學