具有改變的電子傳遞途徑的修飾珠蛋白的製作方法

2023-10-10 09:13:39

專利名稱：：具有改變的電子傳遞途徑的修飾珠蛋白的製作方法
技術領域：
：本發明涉及修飾的載氧化合物(氧載化合物，oxygen-carryingcompound)例如血紅蛋白及它們的應用。
背景技術：
：用捐獻的血對患者輸血具有許多缺點。首先，可能缺少患者的血型。第二，存在捐獻的血可能被諸如肝炎病毒和HIV這樣的傳染原(病原體，infectiousagent)汙染的危險。第三，捐獻的血保存期限有限。另外，存在一些其中血液可能不容易獲得的情形，例如戰場上或國內緊急事件的情形。輸血的一種替代方案涉及使用血液代用品。血液代用品是一種也可提供對於保持血容量必要的滲透壓的載氧溶液。最近研究了兩種類型的代用品，即氟碳代血液(氟碳乳齊U，fluorocarbonemulsion)禾口血紅蛋白溶液。存在於紅細胞中的血紅蛋白由兩條a珠蛋白鏈和兩條13珠蛋白鏈構成，它們各自載有一個血紅素分子。一條a樣珠蛋白鏈和一條P樣珠蛋白鏈結合而形成非常穩定的二聚體(dimer)。a樣和|3樣珠蛋白基因屬於相關珠蛋白基因家族，其在不同發育階段被表達並受氧張力、pH和從胚胎到胎兒到新生兒的發育所調控。然後兩個二聚體以反平行方式排列而形成四聚體。二聚體結合而形成四聚體不如單體結合而締合成二聚體那麼強。因此，四聚體具有分解而形成二聚體的趨勢且在四聚體、二聚體和單體之間總是存在一個平衡。在高濃度珠蛋白下，主要形式是四聚體；通過稀釋，二聚體變成主要形式。由於結合力部分是靜電的，所以這種平衡也受溶劑、鹽、pH和其它因素影響。然而，使用天然的血紅蛋白作為血液代用品存在阻礙。首先，需要大劑量，需要大量生產蛋白，其通過重組方式或者來自捐獻的人血液或回收的非人血液。第二，獲得無傳染原和有毒物質的血紅蛋白很重要。第三，儘管血紅蛋白通常是68，000分子量的四聚體，但它可以分解而形成二聚體。該二聚體被腎快速清除，並且對於無細胞血紅蛋白來說停留時間太短而不能用作血液代用品。已經採取幾種方法以克服這些困難。這些方法包括通過重組DNA系統表達血紅蛋白、化學修飾血紅蛋白、以及生產血紅蛋白變體。血紅蛋白及其變體在包括大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞如CH0細胞的各種細胞體系中被表達。已知血紅蛋白的許多天然變體。這些變體包括自動聚合的變體、阻止四聚體分解的變體、以及在鹼中穩定的變體。還有超過30種具有降低的氧親和性的天然血紅蛋白變體。這樣的變體的若干實例在W088/091799中披露。改善血紅蛋白使用的另一種方法是通過加入其他聚合物而修飾該蛋白，從而改善血液中該蛋白的穩定性。例如US5，900，402描述了使用非抗原性聚合物，優選聚環氧烷(聚氧化烯烴或聚烷撐氧，polyalkyleneoxide)或聚乙二醇。因為血紅蛋白(和實際上的肌紅蛋白或其它載氧蛋白)涉及氧的運輸和儲存，由於具有這種功能(因為蛋白的卟啉環中存在的鐵離子的氧化還原性質)，它們負責生成反應活性氧物種。含氧衍生物(Fe(II))的自動氧化導致生成非功能性的三價鐵血紅素(ferrichaem)(Fe(III))和超氧化物離子(02—)，其隨後歧化而生成H202。這些物種最終能夠損害蛋白和/或血紅素基團。在導致這種破壞的途徑中的一個重要中間體是四價鐵血紅素(ferryhaem)(Fe(IV)=02—)本身，其是通過血紅素與H202和脂過氧化物的反應形成的。蛋白/卟啉基自由基陽離子(P+')伴隨從三價鐵血紅素和過氧化氫生成四價鐵血紅素，如化學方程式(1)中列出的P-Fe(III)+H202—P'+Fe(IV)=O2—+H20(1)儘管它們短暫存在，但是四價鐵血紅素和自由基也可能是有極大毒性的。這些氧化級聯可能是損害性的，因為(i)過氧化氫是一種已知產生細胞損傷的強氧化劑，(ii)四價鐵血紅素和蛋白質基自由基都可以通過奪取氫原子而引發脂質、核酸和胺基酸的氧化，以及(iii)血紅素修飾可以導致產生對蛋白交聯物種的高毒性血紅素以及導致血紅素損失和"游離"鐵的釋放。特別是當蛋白從紅細胞的保護性環境取出時，存在對於血紅蛋白介導的過氧化損傷的趨勢。這將會例如在自發性溶血或在溶血性貧血(例如鐮狀細胞貧血)期間發生。已經表明，正是通過這種過氧化機制，而不是如以前所認為的通過游離鐵催化的Fenton化學(Holtetal，(1999)Increasedlipidperoxidationinpatientswithrhabdomyolysis.Lancet353,1241;Moore，etal(1998)Acausativeroleforredoxcyclingofmyoglobinanditsinhibitionbyalkalinizationinthepathogenesisandtreatmentofrhabdomyolysis-inducedrenalfailure.J.Biol.Chem.273，31731-31737)在擠壓性損傷(橫紋肌溶解)後，肌紅蛋白誘導腎損傷。最近還表明，當在蛛網膜下腔出血中從紅細胞釋放時，血紅蛋白能夠在體內引起類似的損傷(Reeder，etal(2002)Toxicityofmyoglobinandhaemoglobin-oxidativestressinpatientswithrhabdomyolysisandsubarachnoidhaemorrhage.Biochem.Soc.Trans.30,745-748)。此外，不受控制的無細胞血紅蛋白(作為血液代用品開發)的血紅素介導的氧化反應已作為毒性重要的潛在途徑出現，或者直接地或者通過與細胞信號轉導途徑相互作用(Alayash，A.I.(2004)0xygentherapeutics:canwetamehaemoglobinNat.Rev.DrugDiscovery3,152—159)。在嶽夫血/再灌注的內皮細胞培養模型系統[McLeod，L丄andAlayash，A.I.(1999)Detectionofaferryl-haemoglobinintermediateinanendothelialcellmodelafterhypoxia—reoxygenation.Am.J.Physiol.277，H92-H99]以及在缺少它們的抗氧化劑機制如穀胱甘肽的細胞(D'Agnillo&Alayash(2000)Interactionsofhaemoglobinwithhydrogenperoxidealtersthiollevelsandcourseofendothelialcelldeath.Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.279，H1880-H1889)中，已經證實四價鐵血紅蛋白的毒性。四價鐵血紅蛋白可能引起細胞損傷，包括細胞調亡和壞死的細胞死亡。已經表明，用化學修飾的血紅蛋白灌注大鼠腸，引起局部氧化性應激，導致放射性標記的白蛋白的腸繫膜洩漏(Baldwinetal(2002)Comparisonofeffectsoftwohaemoglobin-based02carriersonintestinalintegrityandmicrovascularleakage.Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.283，H1292-H1301)。重要地，這種血紅蛋白的氰根絡合物衍生物，其中用氰化物阻斷血紅素鐵且不能用來進入氧化還原反應，不產生細胞變化。US5，606，025描述了血紅蛋白結合到超氧化物歧化酶和/或過氧化氫酶，作為減少再灌注損傷和其它與血紅蛋白血液代用品相關的自由基介導過程的一種方法。
發明內容我們的研究進一步詳細考察了在血紅蛋白(Hb)和肌紅蛋白(Mb)中產生四價鐵(IV)物種的機制以及這種離子負責產生氧化性應激的機制。我們已經發現，來自某些物種(包括人)的肌紅蛋白和血紅蛋白表現出兩種截然不同的從外部還原劑到四價鐵血紅素鐵的電子傳遞途徑。低親和性途徑(通常>5慮)表示從還原劑到在蛋白的疏水性袋(pocket)中的四價鐵血紅素鐵的直接電子傳遞。第二種高親和性途徑(通常Phe突變體(▲)，顯示出雙直角雙曲線濃度依賴性。圖3:提出的用於還原具有高親和性通過蛋白的電子傳遞途徑的血紅素蛋白的兩個位點模型。還原劑(xH)以親和性KM和K^結合到以其四價鐵氧化態形式(P-[Fe(IV)=02—"+，其中P表示蛋白)的肌紅蛋白上的兩個可能的位點上。僅從這兩個位點可以發生從還原劑到四價鐵的電子傳遞。該高親和性結合位點位於或靠近酪氨酸103(PxH-[Fe(IV)=02—])，允許電子((kmax"0.01s—1)通過蛋白傳遞到四價鐵血紅素鐵而生成三價鐵蛋白(P-Fe(III))。低親和性位點位於該血紅素袋中，允許電子直接在還原劑和四價鐵血紅素(P-[Fe(IV)=02—]xH)之間傳遞。這個模型也允許兩個位點被還原劑(PxH-[Fe(IV)=02—]xH)填充。對於動力學模擬來說，假定在一個位點上的結合不影響結合到第二個位點的親和性。該模型也包括一個其中氧化的還原劑可以再生的步驟。圖4:殘基的位置，通過與已知來自結晶結構的馬肌紅蛋白(C)的電子通道殘基Tyrl03比較，該殘基可以在a人血紅蛋白(A)、P人血紅蛋白(B)中引入或消除通過蛋白的電子傳遞。馬肌紅蛋白的Tyrl03靠近血紅素且表面暴露，使它理想地用作從外部還原劑到四價鐵血紅素鐵的電子通道。人血紅蛋白a亞基在大致同樣的空間環境中具有酪氨酸(Tyr42)，然而，在人血紅蛋白P中這個殘基是氧化還原惰性的苯丙氨酸。圖5:通過抗壞血酸鹽的野生型四價鐵人血紅蛋白還原的濃度依賴性。四價鐵肌紅蛋白(lOyM)在pH7.4的磷酸鈉中與抗壞血酸鹽反應。通過擬合到雙指數函數中來計算對於a亞基(參)和13亞基(〇)的四價鐵還原速率常數。a亞基，但不是|3亞基，顯示出雙直角雙曲線濃度依賴性。圖6:通過抗壞血酸鹽的重組a-Tyr>Val四價鐵人血紅蛋白還原的濃度依賴性。四價鐵肌紅蛋白(lOiiM)在pH7.4的磷酸鈉中與抗壞血酸鹽反應。通過擬合到雙指數函數中來計算a亞基(參)和13亞基(〇)的四價鐵還原速率常數。a亞基和|3亞基都顯示出單一的直角雙曲線濃度依賴性。圖7:通過抗壞血酸鹽的重組a_Tyr42>Trp四價鐵人血紅蛋白還原的濃度依賴性。四價鐵肌紅蛋白(lOiiM)在pH7.4的磷酸鈉中與抗壞血酸鹽反應。通過擬合到雙指數函數中來計算a亞基(參)和13亞基(〇)的四價鐵還原速率常數。a亞基和|3亞基都顯示出單一的直角雙曲線濃度依賴性。具體實施例方式口卜啉基載氧蛋白(porphyrin-basedoxygen-carryingprotein)卟啉基載氧蛋白是指其中以其天然形式帶有卟啉分子並且其多肽單獨或以複合體攜帶並釋放結合於該卟啉分子的氧的任何多肽鏈。這樣的蛋白的變體例如野生型卟啉基載氧蛋白的天然或合成突變體也被本發明考慮。嚇啉基載氧蛋白在它天然狀態下將缺少在血紅蛋白a亞基，例如SEQIDNO:l的蛋白或它的哺乳動物同系物中存在的高親和性氧傳遞途徑。這種途徑經由包括在C螺旋的位置7處的酪氨酸殘基的電子傳遞途徑介導的(如本領域已知的，血紅蛋白亞基蛋白也參照單個的螺旋或交叉螺旋殘基的殘基進行編號，如下表l中列出的(基於US5，Q28，588，其內容結合於此作為參考)。因此人血紅蛋白a鏈的Tyr42在本領域也鑑定為殘基C7。相應地，在其它血紅蛋白a鏈中的等效殘基也將是在C7位置。該途徑是一個經由一個或多個蛋白質胺基酸在還原劑和四價鐵血紅素鐵之間的電子傳遞。這種高親和性通過蛋白途徑存在於天然人肌紅蛋白和血紅蛋白a亞基中，但在人血紅蛋白13亞基中缺乏。待進行修飾的載氧蛋白包括哺乳動物血紅蛋白亞基，但可以包括其中蛋白被改變成攜帶氧的非哺乳動物血紅素蛋白和其它遺傳改造蛋白。這些蛋白將是重組的，具有改變的序列(胺基酸殘基的取代，但也可以包括殘基的插入)，以引入從在大量溶液中的還原劑到血紅素四價鐵的高親和性通過蛋白的電子途徑。可以預期，通過在諸如人血紅蛋白13亞基的蛋白中引入高親和性途徑，我們將能夠通過允許與血液代用品一起給予的還原劑如抗壞血酸鹽、尿酸鹽或去鐵酮更快地減少這些血紅素蛋白的高毒性四價鐵氧化態，並由此限制底物如脂質和DNA的氧化，而降低血液代用品的毒性。因此，本發明可用於在其天然狀態不具有高親和性途徑的任何血紅蛋白亞基。一方面，該蛋白是人血紅蛋白P鏈，其序列如以下SEQIDN0:2列出。可以使用的其它血紅蛋白亞基是那些在相當於殘基42/C7的位置上不具有酪氨酸殘基的脊椎動物或無脊椎動物血紅蛋白亞基。脊椎動物血紅蛋白包括哺乳動物血紅蛋白。哺乳動物血紅蛋白是特別高度保守的。人P鏈的類似物的實例包括13珠蛋白超家族的成員，例如分別在血紅蛋白F(HbF)或血紅蛋白A2(HbA2)中發現的Y或S血紅蛋白。這樣的類似物的這些或其它非限制性實例包括表2的哺乳動物物種類似物，它們也都具有Phe42殘基。可以從在線資料庫，包括通過ResearchCollaboratoryforStructuralBioinformatics的蛋白質資料庫(pdb)獲得這些序列。這些pdb參考提供了用於血紅蛋白e家族亞基蛋白以及在可應用的情況下的相應a亞基蛋白的序列。該|3家族亞基序列可以與其相應的a亞基使用或單獨使用，或與另一個P家族亞基蛋白聯合使用。表2tableseeoriginaldocumentpage7其它脊椎動物血紅蛋白a亞基類似物包括具有相當於Phe42的殘基的鳥類、爬行類和魚類血紅蛋白。這樣的亞基的非限制性實例包括表3中給出的那些，其在第3列中指出了類似於哺乳動物P鏈亞基的Phe42的胺基酸殘基的位置tableseeoriginaldocumentpage8在節肢動物或其它多細胞生物(例如軟體動物，線蟲蠕蟲和非線蟲蠕蟲)以及那些單細胞生物中，可以鑑定其它無脊椎真核生物P血紅蛋白類似物。載氧蛋白的修飾通過取代或插入可以修飾載氧蛋白以弓I入高親和性電子傳遞途徑。特別地且如圖5中所描述的，血紅蛋白13亞基的苯丙氨酸位於鄰近於血紅素且表面暴露，使它理想地充當從外源還原劑到四價鐵血紅素鐵(如果它是氧化還原活性基團)電子通道。因此本發明提供了一種插入或取代，從而在類似的位置提供氧化還原活性殘基。該氧化還原活性胺基酸可以例如是酪氨酸、色氨酸或組氨酸。特別地優選酪氨酸。因此一方面，本發明提供一種哺乳動物13珠蛋白亞基，其被修飾以在蛋白中定位(放置，locate)—個氧化還原活性殘基，以使蛋白表現出高親和性電子傳遞途徑。通過顯示該蛋白對還原劑具有雙直角雙曲線濃度依賴性，可以觀測到該途徑的存在。—方面，C7位置被取代從而引入氧化還原活性胺基酸，特別是上述提到的那些。可替換地，該e珠蛋白亞基可以包括一個插入以將該殘基引入到蛋白中，例如C螺旋中，例如在C6殘基和C7殘基之間，或在C7殘基和CD1殘基之間。這樣的插入可以進一步結合該蛋白的C螺旋的進一步修飾例如Cl-C6位置中的殘基的缺失或取代。可以使用分子模型化方法以鑑定哺乳動物血紅蛋白13鏈中的其他位置，其也位於四價鐵血紅素鐵附近且可以被取代以引入氧化還原活性胺基酸。其它修飾在一個實施方式中，除了野生型載氧蛋白的弱化修飾外，該蛋白可以包含一個或多個(例如l-5個，例如1或2個)另外的取代，或l-5個例如1、2或3個胺基酸(其可以是相鄰的或非相鄰的)的缺失或插入。這些可以是這樣的改變，其影響該蛋白的其他性能如它的氧親和性或協同性，穩定性和組裝速率的增強，血紅素流失速率或自動氧化速率的降低，或對蛋白水解降解和聚集的抗性，它與氧化氮的結合或它通過重組方式以可溶形式生產的能力。這樣的修飾在本領域本身是已知的且可以整合於本發明的蛋白中。在一個優選的方面，該修飾是降低氧化氮(N0)的結合的修飾。大量限制N0結合同時仍然允許氧傳輸的血紅蛋白變體是已知的。具有降低的與氧化氮反應的速率的許多血紅蛋白P鏈的變體在US6，455，676中披露，其內容結合於此作為參考。特別地，除了弱化修飾外，以下改變可以包括在載氧蛋白中B13(Leu>Phe或Trp);G12(Leu>Phe或Trp);B10(Leu>Phe)和E4(Val>Leu);B10(Leu>Trp)和E4(Val>Leu);B14(Leu>Phe或Trp);G8(Leu>Phe)和G12(Leu>Trp);Ell(Val>Leu)和G8(Leu>Trp);Ell(Val>Trp)和G8(Leu>Met);Ell(Val>Leu)和G8(Leu>Phe);Ell(Val>Leu)和G8(Leu>Met);Ell(Val>Phe)和G8(Leu>lie);Ell(Val>Phe)和G8(Leu>Phe);Ell(Val>Phe)和G8(Leu>Trp);Ell(Val>Phe)和G8(Leu>Met);Ell(Val>Met)和G8(Leu>Trp);Ell(Val>Met)和G8(Leu>Trp)禾PE7(His>Gin);Ell(Val>Trp)和G8(Leu>lie);E7(His>Gin)禾PEll(Val>Trp);E7(His>Gin)和Ell(Val>Leu);E7(His>Gin)和Ell(Val>Phe);E7(His>Gin)和Ell(Val>Phe)和G8(Leu>Phe或Trp);E7(His>Gin)和Ell(Val>Leu或Trp)和G8(Leu>Phe或Trp);E11(Val>Trp或Phe)和G12(Leu>Trp或Met);E11(Val>Trp或Phe)禾口B13(Leu>Trp或Met);BlO(Leu>Trp)禾口B13(Leu>Trp或Met);BIO(Leu>Phe)和B13(Leu>Trp);BIO(Leu>Trp或Phe)和G12(Leu>Trp);BIO(Leu>Phe)和G12(Leu>Met);G8(Leu>Trp)和G12(Leu>Trp或Met);或G8(Leu>Trp)和B13(Leu>Trp或Met)。上面使用的編號是基於螺旋鏈編號，其可以參照對人13鏈的表1的一級序列編號。在其它載氧蛋白中在相當的位置也可以做這些修飾。蛋白多聚體在一個實施方式中，載氧蛋白以多聚體的形式存在。這樣的形式可以延長血液循環中蛋白的壽命，改善載氧能力或降低副作用。在血紅蛋白|3亞基蛋白的情況下，這樣的形式包括四聚體血紅蛋白。在這種形式下，兩個P鏈可以與兩個a鏈形成四聚體。可選地，兩個或多個亞基可以例如通過化學交聯或作為重組表達的結果而彼此共價連接。該a鏈可以是野生型a鏈，即SEQIDNO:1的人a鏈或同源脊椎動物或無脊椎動物a鏈。脊椎動物a鏈包括哺乳動物、鳥類、爬行類和魚類a鏈。這樣的a鏈包括發現的與上述表2-4中提及的13鏈結合的那些，且它們的序列可以從pdb登錄(pdbentry)獲得。a鏈可以包含一個或多個(例如1-5個，例如1或2個)另外的取代，或l-5個例如1，2或3個胺基酸(可以是相鄰的或不相鄰的)的缺失或插入。這些可以是影響該蛋白的其他性能的改變，例如與其他蛋白的相互作用、與氧化氮的結合或易於通過重組方式生產。在一方面，該a鏈可以被修飾以例如通過缺失或通過用氧化還原惰性殘基取代而在去除位置42的酪氨酸殘基。這裡作為氧化還原惰性殘基考慮的胺基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸。對a鏈考慮的修飾與氧化氮結合的特別改變包括Ell(Val>Leu)和E7(His>Gin);Ell(Val>Phe或Trp)禾PE7(His>Gin);Ell(Val>Phe或Trp或Leu)禾PE7(His>Gin)和G8(Leu>Phe或Trp);BIO(Leu>Phe)和E4(Val>Leu);BIO(Leu>Trp)和E4(Val>Leu);BIO(Leu>Trp)和E7(His〉Gln);BIO(Leu>Trp)禾PEll(Val>Phe);BIO(Leu>Trp)和El1(Val>Trp);BIO(Leu>Trp)和El1(Val>Leu)和G8(Leu>Trp);BIO(Leu>Trp)禾PEll(Val>Leu)和G8(Leu>Phe);BIO(Leu>Trp)禾PEll(Val>Phe)和G8(Leu〉Trp);BIO(Leu>Trp)禾PEll(Val>Phe)和G8(Leu>lie);BIO(Leu>Trp)和E7(His>Gin)和Ell(Val>Leu)和G8(Leu>Trp);BlO(Leu>Trp)和Ell(Val>Trp)和G8(Leu>Trp);Ell(Val>Leu)和G8(Leu>Phe);Ell(Val>Leu)和G8(Leu>Trp);B13(Met>Phe或Trp);G12(Leu>Phe或Trp);或B14(Phe>Trp))。上面使用的編號是基於螺旋鏈標號，其可以參照對於人a鏈的表1的一級序列編號。在其他載氧蛋白中的相應位置也可作這樣的修飾。也可以提供彼此和/或與其他載氧蛋白共價或非共價結合的其他更高級形式。例如，聚合的血紅蛋白亞基鏈或交聯的鏈在本領域本身是已知的並且這些方法可以應用於本發明。保護基團在另一方面，本發明的載氧蛋白，無論是單體形式或多聚體形式，都可以軛合(結合)於一個保護基團。各種類型的保護基團在本領域同樣是已知的且可以在本發明中使用。在保護基團是一種蛋白的情況下，該保護基團可以作為一種融合體產生，例如在該載氧蛋白的N-端或C-端。可替換地，該蛋白可以與載氧蛋白共表達或分別表達，並且這兩個蛋白利用交聯劑通過化學方式結合。例如，一類保護基團是酶促抗氧化蛋白。這些包括過氧化氫酶和超氧化物歧化酶(SOD)。可以使用任何適宜的過氧化氫酶或SOD，儘管優選地這些是人類酶。這些酶可以重組地或通過本領域常用的任何其他方式生產。US5，606，025，其內容整合於此作為參考，描述了這樣的酶與血紅蛋白的軛合併且這樣的方法可以用於本發明。因此可以使用以前報導的任何適宜的惰性交聯試劑，其適用於製備用作載氧復甦液(oxygen-carryingresuscitativefluid)的交聯血紅蛋白，例如為戊二醛，琥珀醯水楊酸衍生物(diasprinderivative)，包括來源於寡糖的氧化性開環的聚醛，二磷酸酯，三磷酸酯等。感興趣的酶具有類似於在血紅蛋白的珠蛋白鏈上的那些化學基團，以便當它通過與交聯劑的反應使它們發生交聯時，它們將適當地化學結合到血紅蛋白上。載氧蛋白和酶促抗氧化蛋白的相對量可以在寬範圍內變化，其中載氧蛋白佔據主要成分。基於載氧蛋白的重量，酶的總重量適宜在O.1-10%的大致範圍，且優選地在0.5-2.5%大致範圍。如在一個實施方式中，當SOD和過氧化氫酶都化學結合到聚血紅蛋白時，soD對過氧化氫酶的重量比率適宜為約i:1-5:1，且優選地為約i.5:1-2.5:i。也可以用作上述酶促基團或在可替代方案中的另一類保護基團是無抗原性的聚合物基團，例如聚環氧烷保護基團。這樣的基團也可以用在單體載氧蛋白上或用於為二聚體或更高形式的這些蛋白上。例如US5，900，402，其內容整合於此作為參考，描述了聚環氧烷，最優選地聚乙二醇(PEG)與載氧蛋白的軛合。該軛合優選地通過聚環氧烷的羥基末端與載氧蛋白的賴氨酸殘基的自由氨基基團的共價鍵接而形成。例如參見美國專利5，234，903，其披露了mPEG-琥珀醯亞胺基碳酸酯_Hb軛合物。用於軛合聚合物與載氧蛋白的其他方法在本領域同樣也是已知的，如通過經由醯胺或酯鍵接，也適用於本發明。雖然優選血紅蛋白賴氨酸的e氨基基團修飾，但也考慮其他軛合方法。可以通過血紅蛋白和聚合物之間的任何原子的共價鍵接。此外，也考慮例如親脂性或親水性相互作用的非共價軛合。另外的適用於共價軛合載氧蛋白的活化聚合物的實例在美國專利5，349，001、5，321，095、5，324，844和5，605，976以及PCT公開W095/11924和W096/00080中描述，將各自的披露內容結合於此作參考。軛合物優選包括聚乙二醇(PEG)作為聚環氧烷。該聚環氧烷包括單甲氧基-聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物等。聚合物也可以用C2—4烷基代替單甲氧基基團在遠端進行帽化。為了適用於本文，聚環氧烷必須在室溫下可溶於水。可以使用(數均)分子量為約200-約100，OOODa的聚環氧烷鏈。例如優選的PAO具有約1，000-約30，000的分子量，而更優選具有約2，000-約25，000分子量的PAO。一些特別優選的本發明的軛合物包括具有約5，OOODa分子量的聚環氧烷鏈。無抗原性聚合物基團的鏈的數目對載氧蛋白的比率可以為約l:1_約20:l，優選地約5:1-15:i，例如約io:i。這些鏈可以是上文限定的尺寸範圍。總之，軛合之前載氧蛋白單體的分子量是約17，000Da。在這樣的蛋白軛合至如上所述的無抗原性聚合物基團的情況下，軛合物為蛋白(即，載氧蛋白或該蛋白和酶促基團的軛合物)重量的約30%_60%，例如約45%_55%，其餘是無抗原性的聚合物基團。因此，本發明的一個示例性實施方式是本發明載氧蛋白與45%_55%重量的分子量約2，000-約25，000的聚環氧烷的軛合物。在該實施方式的一方面，載氧蛋白可以是其中修飾在Phe41處的血紅蛋白13鏈。在該實施方式的另一方面，聚環氧烷是PEG。在進一步的方面，載氧蛋白是其中減弱修飾在Phe41處的血紅蛋白a鏈且聚環氧烷是PEG。在上述實施方式中，載氧蛋白可以是單體形式或兩個或多個單元的聚合物的形式。組合物本發明的載氧蛋白理想地配製成一種組合物，其包含生理學可接受的載體，適合給予哺乳動物，特別是人。一般地，這樣的載體是一種無菌溶液，其包含在儲存期間用於保持溶液的生理pH和穩定性的緩衝劑和防腐劑。這些載體可以是例如漢克溶液(Hank'ssolution)或林格溶液(Ringer'ssolution)、生理鹽水、由鹽水和葡萄糖構成的混合物、以及肝素化的檸檬酸鈉_檸檬酸_葡聚糖溶液等的生理學相容性緩衝液。本發明的載氧蛋白可以與膠體狀血漿代用品和血漿擴容劑如線性多糖(例如，葡聚糖)、羥乙基澱粉、平衡的流體凝膠以及其他血漿蛋白進行混合。另外地，載氧蛋白可以與水溶性、生理學可接受的聚合物血漿代用品混合，其實例包括聚乙烯醇、聚環氧乙烷、聚乙稀吡咯烷酮、和環氧乙烷-聚丙二醇縮聚物。本發明的組合物可以進一步包括一種或多種具有抗氧化性能的化合物。這些化合物可以包括抗壞血酸鹽和尿酸鹽。抗氧化劑可以包括在任何合適濃度的，其可以根據目標用途和抗氧化劑的性質而改變。例如，尿酸鹽的適宜濃度可以在50-400yM的範圍內，且對於抗壞血酸鹽為50-200iiM，儘管根據需要可以使用更低或更高的量。組合物還可以包括鐵螯合劑，其在螯合通過載氧蛋白分解釋放的鐵方面起作用。這樣的鐵螯合劑的實例包括去鐵胺(desferrioxamine)和去鐵酮。鐵螯合劑或其混合物可以以例如10-5000uM的濃度存在。載氧蛋白的給予本發明的蛋白可以用作血液代用品。存在許多其中需要對氧水平的恢復、保持或替換有用的疾病。這些疾病包括創傷；缺血(例如心臟病發作、中風或腦血管損傷引發的缺血)；其中需要血液代用品來替代手術前去除的血液的血稀釋；感染性休克；癌症(例如，將氧遞送到含氧量低的腫瘤塊內核)；慢性貧血；鐮狀細胞貧血；心臟停搏；和缺氧症。因此本發明的載氧蛋白及其組合物可以用於治療上述疾病的方法中。本發明的載氧蛋白及其組合物也可離體用於器官灌注中。血液代用品在器官灌注中特別地有用，在需要在移植前在離體的器官中維持氧含量從而保持在可接受狀態。器官包括心臟、肝、肺、腎。考慮到患者疾病的特性和治療方案，在上述任一種方法中使用的本發明載氧蛋白的濃度和量要根據醫生的意見。一般地，載氧蛋白可以0.l-6g/dl，例如0.l-4g/dl的濃度使用。載氧蛋白通常靜脈內給予。也考慮共同給予無毒試劑以增強氧化氮產生(例如，精氨酸)。核酸本發明也提供編碼本發明的修飾載氧蛋白的核酸。該核酸可以是DNA或RNA。DNA可以是單鏈或雙鏈的。本發明的核酸可以是分離和/或純化的形式，或者沒有或基本上沒有與它天然相關的物質，例如除了可能的一個或多個用於表達的調控序列外，沒有或基本上沒有側掛人類基因組中的基因的核酸。—般地，本發明的核酸通過修飾編碼載氧蛋白的野生型序列而可以獲得。野生型血紅蛋白和其他載氧蛋白的核酸序列在本領域是已知的且可以廣泛地得到。一般地，例如定點突變這樣的重組技術可以用於修飾已知的野生型序列，以使該序列編碼本發明的修飾載氧蛋白。哺乳動物核酸的野生型序列也可以被修飾以優化在異源體系中，例如在細菌或酵母細胞中的表達的密碼子用途。本發明的核酸可以整合入重組可複製載體中。該載體可以用於在相容宿主細胞中複製核酸。因此進一步的實施方式中，本發明提供了一種製備本發明的核酸的方法，其通過向可複製載體中引入本發明的核酸；向相容宿主細胞中引入該載體；以及在可以導致載體複製的條件下生長該宿主細胞。優選地，載體中本發明的核酸可操作地連接一個控制序列，其能夠提供用於通過宿主細胞表達編碼序列，即該載體是表達載體。術語"可操作地連接"指其中所述組分以允許它們以其期望方式發揮作用的關係連接(結合，juxt即osition)。控制序列"可操作地連接"到編碼序列是以該編碼序列的表達在與控制序列相容的條件下實現的方式連接。可以選擇或構建合適的載體，含有適當的調控序列，包括啟動子序列、終止子片段、多腺苷酸化序列、增強子序列，標記基因和其它適當的序列。載體可以是適當的質粒、病毒如噬菌體噬粒或杆狀病毒、粘粒、YAC、BAC或PAC。載體包括基因治療載體例如基於腺病毒的、腺相關病毒、逆轉錄病毒(例如HIV或MLV)或a病毒載體的載體。載體可以提供有複製起點，可選地用於表達載氧蛋白的啟動子和可選地該啟動子的調控子。載體可以含有一個或多個可選擇的標記基因，例如在細菌質粒情況下的氨苄西林抗藥性基因或對於哺乳動物載體的新黴素抗藥性基因。載體可以體外使用，例如用於生產RNA或用於轉染或轉化宿主細胞。用來在各種各樣的不同宿主細胞中克隆和表達多肽的系統是熟知的。適宜的宿主細胞包括細菌、真核細胞例如哺乳動物和酵母、以及杆狀病毒系統。本領域可獲得的用於表達異源性多肽的哺乳動物細胞系包括中華倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、COS細胞和許多其它的細胞。可以選擇啟動子和其它表達調控信號以與表達載體設計的宿主細胞相容。例如，酵母啟動子包括釀酒酵母(S.cerevisiae)GAL4和ADH啟動子、裂殖酵母(S.pombe)nmtl和adh啟動子。哺乳動物啟動子包括可以引入對重金屬例如鎘響應的金屬硫蛋白啟動子。也可以使用例如SV40巨大T抗原啟動子或腺病毒啟動子等的病毒啟動子。所有的這些啟動子在本領域中很容易得到。載體可以包括其它序列例如啟動子或增強子以驅動插入的核酸、核酸序列的表達，從而作為融合體和/或編碼分泌信號的產生載氧蛋白，以使在宿主細胞中產生的多肽從細胞分泌出來。用於生產用於基因治療的本發明多肽的載體包括帶有本發明微小基因序列的載體。宿主細胞以及載氧蛋白的生產根據本發明的宿主細胞例如以上提及的那些，可以在導致載氧蛋白表達的條件下進行培養，隨後通過回收蛋白從而提供為基本上分離形式的蛋白。為了提供功能性載氧蛋白，在回收期間或回收之後，蛋白可以用血紅素源產生，或蛋白可以與適宜的血紅素源例如二價鐵-原卟啉或三價鐵原卟啉(高鐵血紅素)混合。例如US5，801，019，其內容結合於此作為參考，描述了在酵母細胞中各種修飾血紅蛋白，包括血紅蛋白亞基的多聚體的表達和回收。這樣的方法可以用於本發明產生載氧蛋白。在載氧蛋白是血紅蛋白13鏈亞基的情況下，它可以與互補亞基例如a鏈亞基共表達。共表達蛋白可以是單獨蛋白的形式或是與13鏈亞基的融合體。在表達之後，利用包括但不限於層析(例如離子交換、親和性和分篩柱層析)、離心、差異溶解度的標準方法，或用於純化蛋白的任何其它標準技術來回收蛋白。實施例進一步通過下面的實施例來描述本發明實施例1:通過四價鐵還原動力學測定，來自馬但不是海兔的肌紅蛋白具有高親和性通過蛋白(throug-protein)的電子傳遞途徑。在本實施例中，動力學檢測來自不同物種的肌紅蛋白的四價鐵血紅素還原到三價鐵血紅素蛋白的動力學，以確定存在或不存在高親和性通過蛋白途徑。依照該工藝步驟，來自Sigma-Aldrich(Poole，Dorset,區，通過凝較過濾進一步純化)的三價鐵馬肌紅蛋白，或在5mM磷酸鈉pH7.4中的重組三價鐵海兔肌紅蛋白Mb(20iiM)在25。C下與H202(20yM)反應15min。這時，通過加入硫化鈉(ImM)測定，三價鐵肌紅蛋白到四價鐵肌紅蛋白的轉化率超過95%。加入過氧化氫酶(10nM)以除去未反應的！1202並且繼續反應另外的lmin。在使用的pH下，四價鐵血紅素蛋白在幾小時內是穩定的。然後以1:l體積比將還原劑加入到0.1M磷酸鈉pH7.4中，以使四價鐵肌紅蛋白的最終濃度為10M。在使用其他強緩衝液(例如O.1M醋酸鈉，pH5)四價鐵血紅素不穩定的情況下，pH可以"跳到"其他值。光譜跟蹤直到反應完成。利用最小二乘法，將時間過程(425nm-408nm)擬合到單指數函數。然後這些速率常數作為還原劑濃度的函數繪圖，且將該分布擬合(最小二乘法)到雙直角雙曲線(圖1):其中ka和kb是每一個雙曲線的最大速率，而KD1和KD2是解離常數，S是還原劑濃度，而AK是四價鐵自動還原的速率常數。還原劑濃度對來自馬的四價鐵肌紅蛋白還原觀察到的速率常數變化的依賴性顯示出雙直角雙曲線依賴性，這在海兔肌紅蛋白中沒有觀測到。來自馬的肌紅蛋白在位置103和146處具有兩個酪氨酸殘基，而海兔肌紅蛋白沒有酪氨酸殘基。實施例2:靠近血紅素的酪氨酸殘基對於高親和性通過蛋白電子傳遞途徑是關鍵。野生型和重組抹香鯨肌紅蛋白以及重組Tyrl03>Phe抹香鯨肌紅蛋白與過氧化氫反應，並且如實施例1中所述測定通過去鐵酮的四價鐵血紅素還原的動力學。通過蛋白電子傳遞途徑(在野生型抹香鯨肌紅蛋白中很明顯)在Tyrl03〉Phe突變體中沒有觀測到(圖2)。這表明存在連接血紅素和外部環境的氧化還原活性酪氨酸對於高親和性途徑是關鍵成分。圖1和圖2的數據可以用一種雙位點模型合理地說明，其中還原劑(xH)以親和性KM和U結合至以其四價鐵氧化態(P-[Fe(IV)=02—r，其中P表示蛋白，圖3)的肌紅蛋白上的兩個可能位點。電子從還原劑到四價鐵的電子傳遞僅從這兩個位點發生。高親和性結合位點位於或靠近Tyrl03(PxH-[Fe(IV)=02—])，允許電子通過蛋白傳遞(kmax"0.01s—1)到四價鐵血紅素鐵，從而產生三價鐵蛋白(P-Fe(III))。低親和性位點位於允許電子在還原劑和四價鐵血紅素(P-[Fe(IV)=02—]xH)之間直接傳遞的血紅素袋中。該模型也允許兩個位點被還原劑(PxH-[Fe(IV)=02—]xH)填充。為了動力學模擬，假設在一個位點是的結合將不影響與第二個位點結合的親和性。該模型包括其中被氧化的還原劑可以再生的一個步驟。該模型也允許預測其它基於晶體結構的血紅蛋白。與肌紅蛋白相比，人血紅蛋白a亞基的結構在類似空間位置(Tyr42)顯示一個鄰近血紅素的酪氨酸，且它表面暴露，使其理想地充當從外部還原劑到四價鐵血紅素鐵的電子途徑(圖4)。人血紅蛋白13中對應的殘基是氧化還原惰性的苯丙氨酸。因此該模型預測，人血紅蛋白a亞基但不是|3亞基將具有高親和性通過蛋白的電子傳遞途徑。實施例3:人血紅蛋白的異源亞基表現出不同的四價鐵還原機制。重組人血紅蛋白與過氧化氫反應且如實施例1中所述測定被抗壞血酸鹽的四價鐵血紅素還原的動力學。四價鐵血紅素還原的時間過程不是如肌紅蛋白觀測的單指數，但可以利用產生兩個速率常數的雙指數函數描述，一個速率常數代表觀察到的a亞基的四價鐵還原的速率常數，而另一個代表觀察到的13亞基的四價鐵還原的速率常數。四價鐵還原的動力學(圖5)顯示，這些亞基對還原劑與僅具有一個血紅蛋白亞基(指定為a亞基)行為極不相同，表現出具有高親和性電子傳遞途徑。實施例4:a-Tyr42的定點突變消除高親和性通過蛋白的電子傳遞途徑，降低了四價鐵血紅素還原速率。利用定點突變生成a基因的突變體。在表5(見下)中可以找到引物序列。在PCR反應中根據供應商的說明書使用高精確度酶Phusion(Fi皿zymes)或者PfuUltraTM(Stratagene)，使用如下PCR程序95。C2min;95。C30s;55。Clmin;72。C5min;16個循環；72t:10min。然後利用Dpnl(Fermentas)消化模板DNA並利用標準工藝步驟將突變的質粒轉化到大腸桿菌BL21DE3中。所得的克隆體用BigDyeterminatorv.3.0(A卯liedBiosystems)測序以確證正確的序列。含有編碼修飾a鏈的質粒的大腸桿菌進行生長培養並利用標準方法回收修飾的a鏈，基本上如以下實施例5中所述。表4用於定點突變的引物序列tableseeoriginaldocumentpage15具有a-Tyr42>Val(圖6)或a-Tyr42>Trp(圖7)突變的重組人血紅蛋白與過氧化氫反應，並且如實施例1中所述測定通過抗壞血酸鹽的四價鐵血紅素還原的動力學。在兩種突變體中，在失去高親和性通過蛋白途徑的情況下，對a亞基四價鐵還原速率影響是顯著的，如通過沒有第一個雙曲線所證實的。因此a-Tyr42突變為部分氧化還原活性的色氨酸在10iiM抗壞血酸鹽濃度下降低了a亞基四價鐵還原速率2倍，且a-Tyr42突變為氧化還原惰性的纈氨酸在10yM抗壞血酸鹽濃度下降低a亞基四價鐵還原速率12倍。實施例5:HbP鏈的定點突變。使用上面實施例4中所述的方法，利用如下引物對來形成對人血紅蛋白|3鏈的|3鏈突變，以引入P_Phe41>Tyr突變。名稱序列(5'-3')bF41Y正向CCGTGGACCCAGCGTTACTTTGAATCCTTCGGTG(SEQIDN0:7)bF41Y反向CACCGAAGGATTCAAAGTAACGCTGGGTCCACGG(SEQIDNO:8)人血紅蛋白a和|3鏈的基因被優化以在大腸桿菌中表達並克隆入載體pETDuet中，導致生成HbpETDuet。如上所述，利用定點突變生成a和P基因的突變體。在PCR反應中根據供應商的說明書，使用高精確度酶Phusion(Finnzymes)或者PfuUltra(Stratagene)，其中使用如下的PCR程序95°C2min;95°C30s;55°Clmin;72°C5min;16個循環；72。C10min。然後模板DNA用Dpnl(Fermentas)消化且用標準的工藝步驟將突變的質粒轉化到大腸桿菌BL21DE3種。所得的克隆體用BigDyeterminatorv.3.O(AppliedBiosystems)測序以確認正確的序列。帶有質粒HbpETDuet的大腸桿菌BL21DE3在含有1LTB培養基和100yg/ml羧卞西林的2L燒瓶中，在37。C和120rpm下生長培養直到0D咖>1。然後通過加入0.ImMIPTG誘導血紅蛋白的表達。而且加入0.3mMS-氨基乙醯丙酸和CO氣體以提高蛋白產率。誘導後將培養條件變為22t:和60rpm。收穫細胞並在超聲處理之前，在10mMNaP的緩衝液p朋.0中再懸浮。利用具有CM瓊脂FF(GEHealthcare)的離子交換層析純化血紅蛋白。樣品上柱後，用lOmMNaP緩衝液p朋.0清洗直到吸收率返回到基線。用70mMNaP緩衝液pH7.2洗脫血紅蛋白並用VivaSpin柱(Vivascience)濃縮。然後濃縮的樣品用洗脫緩衝液施加到S印hacrylS-200凝較過濾柱(GEHealthcare)。如上濃縮含血紅蛋白的餾分並在_80°C儲存直至使用。測試包含突變的a和|3鏈的重組血紅蛋白，以證明高親和性電子傳遞途徑從a鏈轉移到P鏈。表l人血紅蛋白A。的胺基酸序列和螺旋殘基標誌螺旋a螺旋P螺旋a螺旋NAl1ValNAl1ValE1768AsnE1773Asp--NA22HisE1869AlaE1874GlyNA22LeuNA33LeuE1970ValE1975LeuAl3SerAl4ThrE2071AlaE2076AlaA24ProA25ProEF172HisEF177HisA35AlaA36GluEF273ValEF278LeuA46AspA47GluEF374AspEF379AspA5"7I_ysA58LysEF475AspEF480AsnA68ThrA69SerEF576MetEF581LeuA79AsnA710AlaEF677ProEF682LysA810ValA811ValEF778AsnEF7S3GlyA911LysA912ThrEF879AlaEF884ThrA1012AlaA1013AlaFl80LeuFl85PheAll13AlaAll14LeuF281SerF286AlaA1214TrpA1215TrpF382AlaF387ThrA1315GlyA1316GlyF483LeuF488LeuA1416LysA1417LysF584Serr589SerA1517ValA1518ValF685AspF6卯GluA16ISGly-F786LeuF791LeuAB119Ala--F887HisF892HisBl20HisBl19AsnF988AlaF993CysB221AlaB220ValFG189HisFG194AspB322GlyB321AspFG290LysFG295LysB423GluB422GluFG391LeuFG396LeuB524TyrB523ValFG492ArgFG497HisB625GlyB624GlyFG593ValFG598ValB726AlaB725GlyGl94AspGl99AspB827GluB826GluG295ProG2100ProB928AlaB927AlaG396ValG3101GluBIO29LeuB1028LeuG497AsnG4102AsnBll30GluBll29GlyG598PheG5103PheB1231ArgB1230ArgG699LysG6104ArgB1332MetB1331LeuG7100LeuG7105LeuB1433PheB1432LeuG8101LeuG8賜LeuB1534LeuB1533ValG9102SerG9107GlyB1635SerB1634ValG10103HisG10108AsnCI36PheCI35TyrGil104CysGil109ValC237ProC236ProG12105LeuG12110LeuC338ThrC337TrpG13106LeuG13111ValC439ThrC438ThrG14107ValG14112Cys17tableseeoriginaldocumentpage181vhltpeeksavtalwgkvnvdevggealgrllvvypwtqrffesfgdlstpdavmgnpkv61kahgkkvlgafsdglahldnlkgtfatlselhcdklhvdpenfrllgnvlvcvlahhfgk121eftppvq朋yqkvragranalahkyh。權利要求一種修飾的卟啉基載氧蛋白，所述蛋白在其未修飾狀態下包含一個電子傳遞的低親和性位點以及一個經由一個或多個蛋白質胺基酸在還原劑和四價鐵血紅素鐵之間的高親和性電子傳遞，其中所述蛋白包含一個對所述鐵離子增強或引入高親和性電子傳遞途徑的修飾。2.根據權利要求1所述的蛋白，其是哺乳動物血紅蛋白鏈亞基。3.根據權利要求1或2所述的蛋白，其是13鏈亞基或所述13鏈超家族的成員。4.根據權利要求3所述的蛋白，其是人13、Y或S鏈。5.根據權利要求1-4中任一項所述的蛋白，其通過取代Phe41進行修飾。6.根據權利要求5所述的蛋白，其中所述修飾是Phe41>Tyr。7.根據權利要求1-4中任一項所述的蛋白，其通過插入一個胺基酸進行修飾。8.根據權利要求7所述的蛋白，其中所述插入是將氧化還原活性胺基酸插入到血紅蛋白的c-螺旋中。9.根據前述權利要求中任一項所述的蛋白，其包含降低NO結合的非野生型殘基。10.—種蛋白，包含權利要求1-9中任一項所述的蛋白的二聚體、四聚體或多聚體。11.根據權利要求10所述的蛋白，其中所述二聚體、四聚體或多聚體是交聯的。12.—種蛋白，包含兩個a珠蛋白亞基和權利要求l-ll中任一項所述的蛋白的兩個亞基。13.根據前述權利要求任一項所述的蛋白，軛合至一個保護基團。14.根據權利要求13所述的蛋白，其中所述保護基團是抗氧化酶。15.根據權利要求13所述的蛋白，其中所述保護基團是聚環氧烷。16.—種組合物，包含在生理學可接受載體中的根據前述權利要求中任一項所述的蛋白。17.—種治療人對象的方法，包括向需要治療的對象給予有效量的根據權利要求16所述的組合物。18.—種編碼根據權利要求1-14中任一項所述的蛋白的核酸。19.一種表達載體，包含可操作地連接到一個啟動子的根據權利要求18所述的核酸。20.—種宿主細胞，包含根據權利要求19所述的表達載體。21.—種製備根據權利要求1-15中任一項所述的蛋白的方法，包括在根據權利要求20所述的宿主細胞中表達一種蛋白從而回收根據權利要求1-14中任一項所述的蛋白，以及可選地修飾所述蛋白從而提供一種根據權利要求10-15中任一項所限定的蛋白。全文摘要本發明涉及一種修飾的卟啉基載氧蛋白如血紅蛋白，發現在其未修飾狀態下具有一個電子傳遞的低親和性位點以及一個經由一個或多個蛋白質胺基酸在還原劑和四價鐵血紅素鐵之間的高親和性電子傳遞。本發明提供這樣的包含增強這種途徑的修飾的蛋白。文檔編號A61K9/00GK101711255SQ200880021531公開日2010年5月19日申請日期2008年6月26日優先權日2007年6月29日發明者克裡斯託夫·埃裡克·庫珀,布蘭東·喬恩·裡德,米歇爾·託馬斯·威爾遜申請人:威文和科技有限公司