細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒的構建及應用的製作方法

2023-10-10 08:35:39 4

專利名稱：細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒的構建及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒的構建與應 用，屬於生物技術領域。
背景技術：
禽白血病病毒囊膜糖蛋白基因(ALV-env)編碼的囊膜糖蛋白(erw)包括囊膜表面 蛋白gp85和穿膜蛋白gp37，兩者在宿主細胞內先是形成gp85-gp37聚合前體蛋白，再經加 工剪切形成成熟的囊膜糖蛋白gp85和gp37。ALV-env基因編碼的囊膜蛋白是該類病毒的 主要表面蛋白。該囊膜蛋白與靶細胞表面特異性受體相互識別、結合，是病毒進入靶細胞進 行複製、增殖所必需的。pLenti7. 3質粒是Invitrogen公司利用HIV基因片段等構成的慢病毒病毒真核表 達質粒載體(Lentiviral vector)。pLenti7. 3質粒可將重組到其多克隆位點的目的基因 導入到被轉染的宿主細胞核並整合到宿主細胞染色體中。pLenti7. 3質粒可將其HIV長末 端雜交啟動子(RSV/5』 LTR)到SV40pA之間的DNA序列轉錄成一條長的mRNA，然後反轉錄 成cDNA。此部分DNA序列在整合到宿主細胞染色體中後，在CMV啟動子的作用下可在宿主 細胞核中轉錄插入的目的基因，在細胞漿中表達目的基因；同時表達pLenti7. 3攜帶的綠 色螢光蛋白(EmGFP)。

發明內容
本發明的第一個目的是將PCR擴增獲得的ALV-env基因與慢病毒表達載體重 組構建一種可在細胞膜上表達ALV-env蛋白的螢光真核轉基因表達質粒(pLenti7. 3/ ALV-env)，該質粒含有ALV-env基因。本發明的另一個目的是細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒在制 備禽白血病假病毒中的應用。本發明通過以下技術方案實現一種細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；其ALV-env蛋白胺基酸序列如SEQ ID NO 2所示。一種細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒是利用含啟動序列的 特異性引物上遊引物5，ATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCAC 3，；下遊引物 5，GACAGCTGCTCCCTAATTCTATG 3，，通過PCR方法從禽白血病病毒基因組(從雞胚成纖維 細胞培養物中提取)擴增env基因。禽白血病env基因與商品化pLenti7. 3表達質粒重 組，構成細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒(pLenti7. 3/ALV-env)。含 有pLenti7. 3/ALV-env質粒的大腸桿菌，已於2009年11月06日保藏在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO :3415，分類命名大腸埃希氏菌 Escherichia coli0
本發明還包括上述細胞膜表達ALV-env蛋白螢光表達轉基因質粒在禽白血病假 病毒上的應用。細胞膜表達ALV-env蛋白螢光表達轉基因質粒被轉染到宿主細胞(如HEK293細 胞)後，erw基因可表達禽白血病的囊膜蛋白，並定植到宿主細胞膜表面，同時在宿主細胞 漿中表達報告基因一綠色螢光蛋白。將ALV-env基因和綠色螢光蛋白基因(EmGFP)整合到 宿主細胞染色體中，並在宿主細胞膜表面表達出禽白血病的囊膜蛋白，同時在宿主細胞漿 中表達報告基因一綠色螢光蛋白。利用這種出現綠色螢光並在細胞膜上表達ALV-env蛋白 的HEK293細胞，藉助輔助質粒(pLPl、pLP2，Invitrogen公司)可製備禽白血病假病毒。製備出的假病毒可用於檢測禽白血病病毒(ALV-J亞型)的中和抗體當待測樣本 中具有足夠量的抗ALV-J亞型中和抗體時，可阻止該假病毒與宿主細胞結合，當樣本無抗 禽白血病病毒(ALV-J亞型)中和抗體或中和抗體較少時，該假病毒可與宿主細胞結合，24 小時後在螢光顯微鏡下檢測宿主細胞有無綠色螢光，如有可發出綠色螢光的宿主細胞則說 明樣本中沒有中和抗體，樣本檢測結果為陰性；如無可發出綠色螢光的宿主細胞(陰性對 照樣本細胞可發出螢光)細胞則說明樣本中有中和抗體，樣本檢測結果為陽性。本發明的有益效果是利用本發明構建的pLenti7. 3/ALV-env質粒與輔助質粒共 同轉染HEK293細胞，製備ALV-J假病毒，可代替利用活的ALV-J病毒進行中和試驗，避免了 活ALV病毒對環境的汙染。由於假病毒可自發發螢光，在中和實驗中可以省略螢光抗體染 色部分，減少非特異性螢光反應。


圖1通過PCR擴增的ALV-env基因電泳結果1是env擴增片段；M是DNA分子量 標記 2K DNA Marker。圖2ALV-erw基因與Peasy-Tl克隆載體構建的T-env酶切鑑定結果1是T-env克 隆單酶切；2是T-env雙酶切；3是DNA分子量標記2K plus DNA Marker。圖3ALV-env基因pLenti7. 3載體構建的pLenti7. 3/ALV-env酶切鑑定結果1是 ALV-env/ALV-env表達載體雙酶切產物；M是DNA分子量標記15K DNA Marker。圖4細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒結構圖ALV-enV是插入 的外源基因，其餘部分為pLenti7. 3載體。pLenti7. 3/ALV-env表達質粒的結構特徵如下HIV 長末端雜交啟動子(RSV/5，LTR hybrid promoter) :1_410RSV promoter :bases 1 229HIV-I 5，LTR :bases 230 410HIV 包裝信號(HIV-1 psi ( Ψ)packaging signal) :521 565HIV 反轉錄元件(HIV-1 Rev response element (RRE)) 1075 1308Cppt :bases 1801-1923CMV 啟動子(CMV promoter) 1935 2519禽白血病膜蛋白基因(ALV-env) :2570 4327V5 標籤(V5 印itope) 4345 4386WPRE :bases 4405—5002
SV40 啟動子(SV40 promoter) 5013 5321綠色螢光蛋白基因(EmEMGFP) :5380 6099HIV 長末端重複序列(AU3/3，LTR) 6170 6404AU3 :bases 6170 62233' LTR :bases 6224 6404SV40 ^^ A(SV40 polyadenylation signal) 6476 6607S (Ampicillin(bla)resistance gene) 7565 ~ 8425質粒骨架(pUCorigin) 8570 92439243 9650 原商品化載體中未註明部分。其中禽白血病膜蛋白基因(ALV-env)是本發明製備的基因，其餘部分來自商品化 質粒 pLenti7. 3。圖5表達載體轉染後48小時螢光檢測結果發出螢光的細胞為已轉染 pLenti7. 3/ALV-env將要釋放假病毒的HEK293細胞。圖6中和試驗結果觀察為假病毒與宿主細胞結合後培養24小時，在螢光顯微鏡 下觀察到的可發出綠色螢光的細胞，此時樣本為陰性。
具體實施例方式一、ALV-env基因的獲取利用含啟動序列的ALV-env特異性引物，通過PCR方法，自禽白血病病毒細胞培養 物中擴增禽白血病ALV-env基因。1、DNA摸板的提取將ALV-J病毒毒株接種於IOOmL細胞培養瓶中長成70% _80%的雞胚成纖維細胞 (CEF)單層。接種後細胞維持7-10天，收集接種病毒培養的細胞，按照以下程序提取組織 DNA 1)收集接種病毒的細胞瓶中細胞，細胞經Hanks液輕輕吹打洗滌數次，然後每瓶 加入0. 25%胰酶0. 5 1. 0ml，37°C溫箱中放置5 lOmin，將細胞消化吹打後收集於5ml
離心管。2) IXPBS液洗滌，2000rpm離心沉澱轉移到1. 5ml離心管中，然後加入300 μ 1抽 提液(lOOmmol/LNaCl，10mmol/L Tris. Cl PH 8. 0,25mmol/L EDTA pH 8· 0，0· 5% SDS)懸浮 後，加入蛋白酶Κ(100 μ g/ml)，55°C水浴中消化過夜。3)加入等體積的苯酚/氯仿溶液(苯酚氯仿異戊醇=25 24 1)約400μ 1 抽提一次，將上層液體轉移到另一 1. 5ml離心管中，加入1/10體積3mol/L的醋酸鈉和2倍 體積無水乙醇後，置於_20°C冷卻2h或者更長時間。4)取出後12000rpm離心IOmin沉澱DNA，以70%乙醇懸浮DNA沉澱後，12000rpm 離心5 lOmin，棄去上清。5)經乙醇沉澱後的DNA，空氣中室溫自然乾燥後，溶解於50 μ 1體積的TE Buffer(IOmmol Tris-Cl, lmmol EDTA, pH 8. 0)中，核酸定量約為 50 IOOng/μ 1，即為 模板DNA，以用於擴增整合進細胞基因組的ALV-J的前病毒DNA模板。2、ALV-env 基因擴增
5
ALV-env基因特異性引物上遊引物5，ATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCAC3下遊引物5，GACAGCTGCTCCCTAATTCTATG3，PCR反應體系如下ddH2015. 8μ L
15. 8μ L 2. 5μ L 2. 0μ L 2. Ομ L l.OyL l.OyL 0. 2μ L 1 μ LIOXBufferMgCl24dNTP上遊引物(20ρΜ)下遊引物(20ρΜ)Taq enzymeModel DNAPCR反應程序如下94°C IOmini94°C Imin57 °C Imin72 °C 2min72 °C IOmin4°C 保存反應結束後，進行瓊脂糖電泳，目的基因長度為1710bp，見附圖1。3、PCR 產物與 Peasy-Tl 克隆將擴增的PCR產物與與Peasy-Tl克隆載體連接，獲得T-env克隆載體。其構建過 程是建立5微升連接體系PCR 產物0. 5 μ LPeasy-Tl4. 5 μ L連接體系室溫反應10-15分鐘感受態細胞的轉化取5 μ L連接產物轉化Τ0Ρ10感受態細胞。挑取單陽性菌落，接種到含5mL LB (含100 μ g/mL)培養基的試管中，37°C震蕩培 養過夜。提取質粒，利用限制性內切酶BamHl、Xhol酶切，利用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，見 到1710bp和3928bp兩條DNA片段，見附圖2。二、ALV-env 與 pLenti7. 3 連接利用限制性內切酶BamHl、Xhol酶切T-env克隆載體。利用瓊脂糖凝膠進行 電泳，從膠上回收帶有粘性末端的ALV-env片斷。利用限制性內切酶BamHl、Xhol酶切質粒pLenti7. 3，將線形化的載體與從回收 的DNA片斷用T4DNA連接酶連接，得到細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒 pLenti7. 3/Alv-env 質粒。其構建過程是
T-env載體與pLenti7. 3表達載體雙酶切建立50微升酶切反應體系BamHl2 μ LXhol2μ LIOXK Buffer5μ LPlasmid30 μ LddH20IlyL37°C水浴4h。電泳切膠回收。ALV-env片段與pLenti7. 3表達載體連接回收表達載體與ALV-env片段，建立連接反應體系PCR 產物2 μ 1pLenti7. 38μ 1Solution I10 μ 116 °C連接過夜。5、轉化和增菌轉化Stbl3感受態，挑取單菌落，接種到含IOmL LB (含100 μ g/mL)培養基的試管 中，37°C震蕩培養過夜，提取質粒後利用限制性內切酶BamHl、Xhol酶切，利用瓊脂糖凝 膠進行電泳，見到1710bp和7935bp兩條DNA片段，見圖3。DNA序列測定，確認ALV-env已 與pLenti7. 3表達載體重組，閱讀框架正確，獲得pLenti7. 3/ALV-env表達載體質粒。6、增菌並提取質粒大量培養，利用QIAGEN DNA質粒純化試劑盒，提取質粒，電泳鑑定。具體過程如 下(1)將篩選克隆重新劃板，挑取單菌落，接種到含IOmL LB培養基的試管中，37°C 震蕩培養過夜，取1培養物mL接種到含IOOmL LB (含100 μ g/mL)培養基的試管中，37°C震 蕩培養過夜，。(2)利用QIAGEN DNA質粒純化試劑盒提取質粒1)取30mL細菌培養物於50mL離心管中，離心使細菌沉澱。2)加ImL裂解液I，劇烈振蕩，懸浮菌體。3)加ImL裂解液11，輕輕混勻，冰浴不超過5分鐘。4)加ImL裂解液III，上下振蕩，冰浴10分鐘。5) 12000rpm 離心 lOmin，取上清夜。6)將上清裝入層析柱中，垂直靜置，待上清夜完全通過層析柱。7)加2mL洗脫，垂直靜置，待洗脫液完全通過層析柱。8)收集洗脫液，檢測DNA濃度，-20°C冰箱保存備用。三、製備細胞膜表達ALV-env蛋白、細胞漿表達綠色螢光蛋白HEK293細胞將HEK293細胞接種24孔板，每孔Iml MEM+10% FBS (胎牛血清)，培養至70% 80%細胞融合。每孔加入脂質體-DNA轉染液(pLenti7. 3/ALV-env 0.8μβ;，輔助質粒 PLpl，PLp20. 8 μ g ；脂質體2 μ g)表達質粒混合溶液，稍稍震蕩混勻，於37°C、C025%的培養 箱裡培養6小時，棄轉染液，每孔加入含10% FBS的DMEM Iml,60 72小時觀察可在宿主細胞漿中出現綠色螢光(激發光波長488nm，發射光波長567nm)，見圖5。收集上清液，滴定 禽白血病假病毒滴度(ID5tl)。-20°C冰箱保存。該禽白血病假病毒可用於檢測禽白血病病 毒中和抗體的病毒效價。四、禽白血病假病毒的應用連續稀釋測待檢血清樣本，用50 100*ID5Q禽白血病假病毒與等量的已稀釋的待 檢樣本混合，37°C孵育30分鐘，接種雞胚成纖維細胞，37°C孵育24 48小時。如果樣品中 含有足夠量的抗ALV-J亞型中和抗體時，可阻止該假病毒與雞胚成纖維細胞結合；當樣本 無抗禽白血病病毒中和抗體或中和抗體較少時，該假病毒可與雞胚成纖維細胞結合。24小 時後在螢光顯微鏡下檢測雞胚成纖維細胞是否可發出綠色螢光，如觀察到可發出綠色螢光 的雞胚成纖維細胞則說明樣本中沒有足夠的中和抗體(如圖6)，樣本為陰性；如無可發出 綠色螢光的細胞(陰性對照樣本細胞可發出螢光)則說明樣本中有中和抗體，樣本為陽性。利用本發明構建的pLenti7. 3/ALV-env質粒與輔助質粒共同轉染HEK293細胞，制 備ALV-J假病毒，可代替利用活的ALV-J病毒進行中和試驗，避免了活ALV病毒對環境的汙 染。由於假病毒可自發螢光，在中和實驗中可以省略螢光抗體染色部分，減少非特異性螢光 反應，並可節約時間和試劑。山東農業大學細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒的構建及應用212932DNA 質粒(Plasmid)CDS(1175).. (2932)1
0128]ttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaat600129]acactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattgga1200130]attagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatat1800131]￡1￡1￡1￡Ι ￡Ι 0ataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtact2400132]ttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctccc3000133]aaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacag3600134]agacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaa4200135]aggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacat4800136]Q.CQ.Q.Q.CX^Q.Q.0·gaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgataagcttgg5400137]gagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccc6000138]cgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccat6600139]tgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtat7200140]catatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat780
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380385 390
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AlaArgliePheAlaSerPhePheAla Pro Gly Val Ala Ala Ala Gln
395400 405
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410415420
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AsnLeuThrSerLeulieLeuAsnAla lie Leu Glu Asp Thr Asn Ser
425430435
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440445450 455
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460465 470
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475480 485
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490495500
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505510515
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520525530 535
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540545 550
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555560 565
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GlnLeuSerArgAlalieLeuGlnlie Ser lie Thr Leu Ala Ala Ala
570575580
Arg Tyr His Arg lie Arg Glu Gln Leu Ser Arg Ala lie Leu Gln Ile565570575Ser lie Thr Leu Ala Ala Ala Arg Val58058權利要求
一種細胞膜表達ALV env蛋白螢光真核轉基因表達質粒，其特徵在於核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；其ALV env蛋白胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.根據權利要求1所述的細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒，其特徵 在於該質粒含有ALV-env基因。
3.一種細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒的應用，其特徵在於該質粒 可用於製備禽白血病假病毒，按照本發明製備的禽白血病假病毒可用於禽白血病病毒中和 抗體的製備。
全文摘要
本發明涉及一種細胞膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒的構建及應用，是將PCR擴增獲得的ALV-env基因與慢病毒表達載體重組構建的一種可在細胞膜上表達ALV-env蛋白的螢光真核轉基因表達質粒，該質粒含有ALV-env基因。該質粒被轉染到宿主細胞後，可將ALV-env基因和綠色螢光蛋白基因(EmGFP)基因整合到宿主細胞染色體中，並在宿主細胞膜表面表達出禽白血病的囊膜蛋白，同時在宿主細胞漿中表達報告基因-綠色螢光蛋白。該膜表達ALV-env蛋白螢光真核轉基因表達質粒可用於製備禽白血病假病毒，製備的禽白血病假病毒可用於檢測J-亞型禽白血病中和抗體。
文檔編號C07K16/10GK101935675SQ201010011630
公開日2011年1月5日 申請日期2010年1月14日 優先權日2010年1月14日
發明者崔治中, 常維山, 張振傑 申請人:山東農業大學