修飾的莖-環寡核苷酸介導的反轉錄和鹼基間隔限制的定量pcr的製作方法

2023-10-10 14:53:09 3

專利名稱：：修飾的莖-環寡核苷酸介導的反轉錄和鹼基間隔限制的定量pcr的製作方法
技術領域：
：本發明涉及檢測樣品中的靶RNA，包括檢測樣品中的靶miRNA的方法。發明背景微小RNA(miRNA)是作為後生動物中基因表達的重要轉錄後調控因子發現(Bartel,2004)的小的非編碼RNA(通常約22個核苷酸的長度)。雖然在各種生理過程中miRNA的表達是關鍵的(Harfe，2005；Miska,2005；Carthew,2006;Lindsay，2008)，但是miRNA的調控異常參與許多人類疾病例如癌症(Visone&Croce，2009)、肌肉疾患(Chen等人,2009a)和神經變性(Hebert&DeStrooper,2009)的病理學。近來，發現成熟的miRNA在血液中是非常穩定的，且因此具有作為潛在的人類疾病的非侵入性生物標誌的廣闊前景(Chen等人，2008；Mitchell等人，2008)。迄今為止，已在許多物種中鑑定到數百種獨特的miRNA且這些miRNA中的每一種被預測為調控不同的革巴基因(Bartel,2009)。隨著通過計算機(insilico)預測和體內驗證持續發現了更多的miRNA(Mendes等人,2009),miRNA表達的表徵不僅仍是用於評估miRNA的分布和調控的必要工具而且也是用於鑑定新型生物標誌和潛在治療靶的重要工具。成熟miRNA可通過直接或間接方法檢測。雖然直接檢測方法(例如,螢光、比色和基於電學的方法)可將樣品測量期間引入的變化最小化，但是這些方法受到測定靈敏度低和miRNA同源物之間區分差的限制(Hunt等人，2009中綜述)。間接檢測方法主要包括RNA印跡、微陣列和反轉錄PCR(RT-PCR)。雖被廣泛使用，但是RNA印跡和微陣列都是半定量的且受差的靈敏度的限制並需要大量的起始RNA。雖然微陣列提供miRNA的高通量檢測和潛在的絕對定量的能力(Bissels等人，2009)，但是最近的研究表明，相比之下，實時PCR在靈敏度和特異性方面仍較為優越(Chen等人，2009b)。最近對用等溫法測量miRNA的嘗試已經取得了一些成功但卻工作強度大(Cheng等人，2009；Yao等人，2009)。迄今為止，實時RT-PCR仍是最靈敏和有效的定量RNA物質的方法。基於TaqMan探針的實時RT-PCR已被報導並廣泛用於有效且特異性地檢測miRNA。然而，由於額外的探針水解步驟，TaqMan測定與用於快速檢測miRNA的快速熱循環方案不相容。另外，隨著通過深度測序(Bar等人，2008;Goff等人，2009)越來越多地鑑定到數以百計的候選miRNA，針對每一種新型miRNA的TaqMan探針的設計不僅成本過高而且在技術上也有挑戰性並面臨實際困難(Varkony1-Gasic等人,2007)。已進行不依賴螢光探針而改善miRNA檢測的嘗試(Raymond等人，2005；Shi&Chiang,2005;Sharbat1-Tehrani等人,2008),然而,這些測定通常包括多個樣品處理步驟(Shi&Chiang，2005)並且受累於有限的動態檢測範圍(Raymond等人，2005)和/或針對同源miRNA的差的特異性(Raymond等人，2005；Shi&Chiang,2005;Sharbat1-Tehrani等人,2008)。這些測定和一些其他TaqMan測定(Varkony1-Gasic等人,2007；Yang等人，2009)的共同策略是使用通用的或共同的反向PCR引物和/或螢光探針以擴增和檢測多種miRNA。在這些測定中，實時PCR的特異性僅通過正向PCR引物實現，這不足以區分許多同源miRNA。此外，尚待確定這些測定是否能夠快速、多重且直接地檢測miRNA而不需RNA分離。雖然仍在確定多種基因組中微小RNA的數量，但是不同miRNA的數量被預期為多至幾千。因為2006年對RNA幹擾(A.Z.Fire&CraigC.Mello)授予了諾貝爾獎，所以對檢測miRNA的測定的需求穩步增加。因此，存在對檢測樣品中的靶RNA，包括miRNA的替代方法的需要。發明概述本發明提供了檢測樣品中靶RNA分子的方法。靶RNA分子可以是任何RNA分子，且在某些實施方式中可以是miRNA。本發明的方法使用反轉錄(RT)和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的組合以從包含靶RNA的樣品中特異性地鑑定該靶RNA。這些方法使用了修飾的莖-環RT寡核苷酸和半嵌套式PCR引物的組合以特異性地選擇靶RNA。RT寡核苷酸內的修飾的核苷酸的使用為DNA聚合酶提供了阻礙以防止擴增反應期間的錯誤引發。因此，可減少或甚至消除對於該擴增反應的RT寡核苷酸遺留，同時可甚至在樣品中存在miRNA同源物下增強針對靶miRNA的特異性。本發明的方法可提供對祀RNA物質，例如來自前體miRNA和來自同源家族成員的成熟miRNA的特異且快速的檢測。使用快速熱循環測量法(fastthermo-cyclingprofile)(每個循環10秒鐘)尚且保持特異性和靈敏性可能是可行的。這些方法還可以以多重形式使用，所述多重形式對於直接從細胞裂解物篩選和檢測miRNA而不需要費力的總RNA分離可能是有用的。本發明的方法可被調整為適合現有的實時PCR方法。實時PCR已成為用於基因表達測量的標準方法且已成為用於基因表徵(geneprofiling)和用於生物標誌發現的極為有用技術。這些方法可能是經濟、高性能、易於使用、快速和靈敏的。因此，一方面，本發明提供了用於檢測樣品中的靶RNA分子的方法，該方法包括:使用RT寡核苷酸反轉錄樣品中包含的靶RNA以產生包含RT寡核苷酸和3』延伸區域的反轉錄產物，所述RT寡核苷酸包含含有被修飾或可被修飾為阻礙DNA聚合酶延伸的一個或多個核苷酸的莖-環部分和與靶RNA的下遊部分互補的靶退火部分，所述靶退火部分位於莖-環部分的3』；使用下列引物擴增所述反轉錄產物以產生擴增產物:(i)第一擴增引物，其退火到所述反轉錄產物的3』延伸區域的下遊部分，和(ii)第二擴增引物，其退火到與所述反轉錄產物互補的DNA鏈的交界部分(interfaceportion),所述交界部分包含與RT寡核苷酸的3』部分和反轉錄產物中的3』延伸區域的5』部分互補的區域；以及檢測所述擴增產物；其中所述莖-環部分在用於所述反轉錄的條件下採取莖-環結構但在用於所述擴增的條件下不採取莖-環結構，且其中當所述莖-環部分包含可被修飾為阻礙DNA聚合酶延伸的一個或多個核苷酸時，該方法還包括在所述擴增之前修飾所述可被修飾的核苷酸。在某些實施方式中，被修飾或可被修飾為阻礙DNA聚合酶延伸的一個或多個核苷酸位於莖-環部分的環內。在某些實施方式中，莖-環部分包含被修飾為阻礙DNA聚合酶延伸的一個或多個核苷酸。例如，所述莖-環部分的環可包含用脂族碳鏈例如C6脂族鏈修飾的核苷酸。可選擇地，在某些實施方式中，莖-環部分包含可被修飾為阻礙DNA聚合酶延伸的一個或多個核苷酸且該方法還包括在擴增之前修飾該可被修飾的核苷酸。例如，該可被修飾的核苷酸可以是dU且所述修飾可包括用尿嘧啶-DNA糖基化酶處理。在另一個實例中，所述莖-環部分的環可包含一個或多個核糖核苷酸且所述修飾可包括用RNA酶處理。在某些實施方式中，靶RNA是miRNA。另一方面，本發明提供了用於檢測樣品中的靶miRNA分子的方法，該方法包括:使用RT寡核苷酸反轉錄樣品中包含的靶miRNA以產生包含RT寡核苷酸和3』延伸區域的反轉錄產物，所述RT寡核苷酸包含含有dU核苷酸的莖-環部分和與靶miRNA的下遊部分互補的靶退火部分，所述靶退火部分位於莖-環部分的3』；通過用尿嘧啶-DNA糖基化酶處理修飾該dU核苷酸；使用下列引物擴增所述反轉錄產物以產生擴增產物:(i)第一擴增引物，其退火到所述反轉錄產物的3』延伸區域的下遊部分，和(ii)第二擴增引物，其退火到與所述反轉錄產物互補的DNA鏈的交界部分，所述交界部分包含與RT寡核苷酸的3』部分和反轉錄產物中的3』延伸區域的5』部分互補的區域；以及檢測所述擴增產物；其中所述莖-環部分在用於所述反轉錄的條件下採取莖-環結構但在用於所述擴增的條件下不採取莖-環結構。在本發明的方法的某些實施方式中，擴增引物具有當與DNA雜交時顯示出熱穩定性的核苷酸作為3』末端核苷酸。例如，當與DNA雜交時顯示出熱穩定性的核苷酸可被鎖定在N-型呋喃糖構象中。在某些實施方式中，包括其中RNA是miRNA的實施方式中，當退火到反轉錄產物時第一擴增引物的3』端位置與當退火到DNA鏈時第二擴增引物的3』端位置之間在擴增產物的序列中的距離是-4至5個核苷酸。在某些實施方式中，RT寡核苷酸的靶退火部分為5至15個核苷酸的長度。在某些實施方式中，莖-環的莖部分是4至6個核苷酸的長度且莖-環的環部分是4至12個核苷酸的長度。在某些實施方式中，所述第二擴增引物退火到與RT寡核苷酸的莖-環部分的13至24個核苷酸、RT寡核苷酸的靶退火部分的5至15個核苷酸以及反轉錄產物的3』延伸區域的5』端處的I至5個核苷酸互補的序列。在某些實施方式中，第一擴增引物為12至27個核苷酸的長度。在某些實施方式中，所述檢測包括用螢光嵌入染料檢測。例如，所述螢光嵌入染料可以是SYBRGreen或EvaGreen。經結合附圖查閱本發明的具體實施方式的下列描述，本發明的其他方面和特徵將對於本領域普通技術人員變得明顯。附圖簡述僅通過舉例的方式闡述了本發明的實施方式的表格和附圖如下。表1.使用莖-環或線性實時RT-PCR區分成熟miRNA和前體miRNA。用莖-環或線性RT寡核苷酸反轉錄IO9拷貝的每種合成的成熟miRNA或體外轉錄的前-miRNA並使用相同的PCR引物定量。成熟miRNA和前體miRNA之間的區別被表示為ACt值(ACt=Ct前體成熟)。表2.用於miRNA前體的克隆和實時RT-PCR的引物序列。表3.用於檢測成熟miRNA的引物序列。表4.莖-環RT寡核苷酸和線性RT寡核苷酸的比較。採用最穩定的二級結構來計算線性RT寡核苷酸的AG0對於每種miRNA的莖-環RT寡核苷酸和線性RT寡核苷酸之間的序列差異被加下劃線。表5列出了表I至4和附圖中列出的各個序列，為每個序列指定了一個SEQIDNO。圖1是提供了本發明的方法的反轉錄階段概覽的圖解表示。圖2是提供了本發明的方法的擴增階段概覽的圖解表示。圖3.提供了本發明的方法的實施方式概覽的圖解示意圖。圖4.DNA阻礙物(dU)抑制DNA聚合酶的DNA延伸。圖5.用於設計半嵌套式實時RT-PCR測定的示意圖。Pf，正向引物；Pr，反向引物。圖6.第一擴增引物(Pf)和第二擴增引物(Pr)的布置，示出了空隙或重疊。圖7.環尺寸的比較。小環(4個鹼基)表現可與較大環(12個鹼基)相當。圖8.用於設計半嵌套式實時RT-PCR測定的流程圖和實例。圖9.miR-21半嵌套式實時RT-PCR測定的表現。(A、B)與標準循環方案相比在快速循環條件下通過實時PCR測定擴增miR-21cDNA(108至10拷貝)。用miR_21RT寡核苷酸反轉錄(C、D)合成的miR-2ImiRNA(IO9至IO2拷貝)的稀釋液，(E、F)來自A172細胞的總RNAdOOng至Ipg)的稀釋液，和(G、H)從U251細胞(100，000至10個細胞)的稀釋液分離的總RNA。通過實時PCR擴增cDNA樣品(10%v/v)連同無模板對照(NTC)。示出了該測定的擴增圖(A、C、E、G)和標準曲線(B、D、F、H)。標準曲線被繪製為Ct對Log(每個RT的起始材料)。圖10.對摻入U251總RNA的合成的let_7d和let_7emiRNA的稀釋液的定量。對合成的let-7d(A)或let-7e(B)的標準稀釋液(IO9UO8和IO7拷貝)摻混IOOng的從U251細胞分離的總RNA。用let-7d或let_7eRT引物反轉錄對照miRNA稀釋液或摻入了總RNA的miRNA稀釋液。通過實時PCR擴增cDNA樣品(10%v/v)。標準曲線被繪製為Ct對Log(每個PCR反應的輸入cDNA)。圖11.人let-7同源物的區分。A)八個let-7家族的miRNA的序列比對。B)特異性半嵌套式實時RT-PCR測定對每種let-7miRNA的相對檢測)。圖12.miR-24(A、B)、miR-92(C、D)和miR-218(E、F)實時RTPCR測定的動態範圍和效率。用miRNA特異性的RT寡核苷酸反轉錄合成的miR-24、miR-92和miR-218的標準稀釋液。通過實時PCR擴增cDNA樣品(10%V/V)連同無模板對照(NTC)。示出了該測定的擴增圖(A、C、E)和標準曲線(B、D、F)。標準曲線被繪製為Ct對Log(每個PCR反應的輸AcDNA)。圖13.使用併入dU的RT寡核苷酸的半嵌套式實時RT-PCR測定的特異性。A)dTRT寡核苷酸和dURT寡核苷酸的序列比較。dU殘基被加下劃線。B)let-7a測定對let-7fmiRNA的相對檢測。使用IOOnM或250nM的dT、dUl或dU2RT寡核苷酸反轉錄IO9拷貝的let_7a或let-7f。用或不用UDG處理cDNA樣品(10%v/v)並使用let_7a特異性PCR引物擴增。計算let-7fmiRNA的非特異性擴增並將其表示為相對檢測的％。誤差條表示一式四份的測量值的標準差。UDG處理的和未處理的樣品之間的相對檢測的顯著性差異通過Studentt-檢驗(Student，st-test)計算。**p<0.001。圖14.miRNA實時RT-PCR產物的凝膠電泳。用IO6拷貝的合成的miRNA(a)、IOngU251總RNA(b)或無模板對照(c)進行實時RT-PCR測定。從IOpg的U251總RNA擴增U6。通過4%瓊脂糖凝膠分辨擴增產物和25bp標準參照物(M)。產物大小:miR-7(37bp)、miR-21(38bp)、miR-218(36bp)、let-7f(45bp)、let_7g(42bp)、let_7i(38bp)和U6(94bp)。圖15.U251細胞中⑶NF調控的miRNA表達。通過半嵌套式實時RT-PCR對所選擇的成熟miRNA(A、B)的調控定量並表示為相對於未刺激的對照樣品的倍數變化。誤差條表示一式三份的測量值的標準差。處理的樣品和對照樣品之間的基因表達的顯著性差異通過Studentt_檢驗計算。*p<0.01;**p<0.001。圖16.併入dU的RT寡核苷酸的UDG處理阻止其用作RT之後的PCR引物。A)用於miR-21的標準(dT)和併入dU(dU)的RT寡核苷酸的序列。用dT(B)或dU(C)RT寡核苷酸反轉錄合成的miR-21(IO9拷貝)。然後用(紅色擴增曲線)或不用UDG(藍色擴增曲線)處理cDNA樣品(10%v/v)並用正向和反向引物(+Pr)或單獨的正向引物(-Pr)進行實時PCR0D)經或未經RNA酶處理的環中具有RNA序列的RT寡核苷酸。圖17.對六個⑶NF調控的miRNA的多重定量。通過24種miRNA的多重實時RT-PCR測定對miR-7(A)、miR-21(B)、miR-218(C)、let-7f(D)、let-7g(E)和let_7i(F)的表達定量。將對這些miRNA的調控表示為相對於未刺激的對照樣品的倍數變化。誤差條表示一式三份的測量值的標準差。處理的樣品和對照樣品之間的基因表達的顯著性差異通過Studentt_檢驗計算。*p<0.01;**p<0.001。圖18.U251人成膠質細胞瘤細胞中⑶NF-引起的信號傳導的活化。用2%SDS裂解對照U251細胞和⑶NF刺激的U251細胞。使用microBCA蛋白質測定(Pierce，Rockford，IL,USA)對總蛋白質裂解物定量。通過SDS-PAGE分離總蛋白(10yg)並用針對磷酸ERK1/2的抗體(Cellphospho-SignalingTechnologies,Danvers,MA,USA)探測。在蛋白質印跡脫除緩衝液(WesternBlotStrippingBuffer)(Pierce)中脫除印跡並用總ERK1/2(CellSignalingTechnologies)重新探測以驗證等量上樣。對化學發光成像並通過ChemiDoc系統(Bio-Rad)分析。A)U251細胞中⑶NF(100ng/ml)活化ERK1/2MAPK的時間進程。B)MEK抑制劑U0126(5uM)預處理抑制⑶NF-引起的ERK1/2MAPK活化。圖19.對來自細胞裂解物的miRNA的直接和多重檢測。直接裂解以多種密度(每孔10、100、1000、10000和100000個細胞)培養在96-孔板中的U251細胞並在包含24種miRNART寡核苷酸的反應混合物中反轉錄。通過(A)miR-21和(B)miR_222實時PCR測定擴增從分離的RNA或細胞裂解物中產生的cDNA樣品(2.5%v/v)。對於分離的RNA的標準曲線被繪製為Ct對Log(每次RT的細胞數)。RI；RNA酶抑制劑。圖20.通過單重和多重實時RT-PCR對⑶NF-調控的miRNA定量。通過單一的miRNA-特異性的RT寡核苷酸(黑線)或24-重RT寡核苷酸(紅線)對總U251RNA樣品反轉錄。然後對cDNA樣品定量以表示為(A)miR218和(B)let7i。將對這些miRNA的調控表示為相對於未刺激的對照樣品的倍數變化。詳述目前提供了用於檢測樣品中的RNA的方法。該方法可用來檢測任何RNA物質，且可用於檢測成熟miRNA，包括從包含該miRNA的細胞直接檢測。該方法是一種RT-PCR(反轉錄-PCR)擴增方法，其將被設計成具有莖_環二級結構和被修飾為在擴增反應期間阻礙DNA聚合酶的核苷酸的RT寡核苷酸引物與擴增反應中的一對半嵌套擴增弓I物組合在一起。圖1和2提供了該方法概覽的圖解表示；指出了所示出的每個核酸分子的5』和3』端。圖1表示反轉錄反應且圖2表示擴增反應。在方法的反轉錄階段(圖1)，初始反應混合物100包含待被反轉錄的靶RNA102，和充當反轉錄反應的引物的反轉錄(RT)寡核苷酸104。RT寡核苷酸104具有莖-環部分106和靶退火部分108。在反轉錄反應所用的條件，例如約37°C的反應溫度下，莖-環部分106處於具有莖-環結構的退火構象中。莖-環部分106包含被修飾或可被修飾為阻礙DNA聚合酶延伸的一個或多個核苷酸110,如圖1所示。在反轉錄反應Al中，靶退火部分108退火到靶RNA102的下遊部分112並然後通過反轉錄酶延伸以產生包含RT寡核苷酸104和3』延伸區域116的反轉錄產物114。在方法的擴增階段(圖2)，初始反應混合物200包含反轉錄產物114，第一擴增引物202和第二擴增引物204。另外，初始反應混合物200還可包含從反轉錄反應遺留的某些RT寡核苷酸104，這些RT寡核苷酸104還因而可充當引物。在擴增反應所用的條件，例如約50°C或更高的反應溫度下，莖-環部分106處於不具有莖-環結構的解鏈構象，如圖2所示。在第一輪擴增BI中，反轉錄產物114充當模板且第一擴增引物202結合到反轉錄產物114的下遊部分206。DNA聚合酶延伸第一擴增引物202直到到達核苷酸110，阻礙進一步延伸，從而產生互補DNA鏈208，該互補DNA鏈208與反轉錄產物互補且具有在核苷酸110的互補位置附近的3』端。互補DNA鏈208具有交界部分210，交界部分210包含與在RT寡核苷酸104的3』端和3』延伸區域116的5』端之間的交界形成的反轉錄產物114中的交界互補的區域。在第二輪擴增B2中，第二擴增引物204退火到交界部分210處的互補DNA鏈208，且互補DNA鏈208充當DNA聚合酶延伸的模板以產生DNA鏈212。由於第二擴增引物204由此從互補鏈208的末端嵌入，DNA鏈212具有反轉錄產物114的一部分序列，但是比反轉錄產物114短。在隨後輪次的擴增B3中，第一擴增引物202和第二擴增引物204將退火到可獲得的DNA模板鏈。當第一擴增引物202退火到DNA鏈212時，所形成的互補DNA鏈208』比互補DNA鏈208短。因此DNA鏈212和互補DNA鏈208』形成擴增產物214。雖然一些更長的DNA鏈例如反轉錄產物114和互補DNA鏈208將用作模板而存在，但是隨著擴增反應通過多輪反應而推進，由於包括核苷酸110和由於第二擴增引物204的嵌套，產生更多的擴增產物214。圖3中提供了該方法的另一種圖解描繪。圖4描繪了阻礙DNA聚合酶的被修飾的核苷酸對擴增反應的特異性的影響。在一些之前的報導(Chen等人，2005；Raymond等人，2005；Shi&Chiang,2005；Duncan等人，2006;Varkonyi_Gasic等人，2007;Sharbat1-Tehrani等人，2008;Yang等人，2009)中，反向擴增產物被設計為直接退火到RT寡核苷酸中的序列。為實現這些方法中的特異性，需要獨特的miRNA-特異性的螢光探針來區分靶與非特異性擴增子(Chen等人，2005)。在某些基於TaqMan的測定的情形中，通過使用一種共同的檢測探針以獲得通量便利性而損害了這種特異性。相比之下，在如本文所述的方法中，增加的特異性可通過設計半嵌套式反向PCR引物實現，所述半嵌套式反向PCR引物被設計為退火到反轉錄寡核苷酸引物的一部分和反轉錄產物的3』延伸區域的一部分。與定量實時PCR方法相比，本文描述的方法不需要使用螢光探針，因為半嵌套式反向擴增引物增強了測定的特異性，且可允許在快速熱循環條件下使用螢光嵌入染料例如SYBRGreenI對少至亞介摩爾(subzeptomole)量的miRNA定量。因此，一方面提供了用於檢測樣品中的靶RNA的方法。該方法包括反轉錄反應。使用RT寡核苷酸作為反應引物對包含靶RNA的樣品進行反轉錄反應。如將應理解的，RT寡核苷酸因此充當反轉錄酶的引物，所述反轉錄酶使用靶RNA作為模板並延伸RT寡核苷酸以形成反轉錄產物，該反轉錄產物包含該反轉錄產物的5』端處的RT寡核苷酸和該反轉錄產物的3』端處的延伸區域。RT寡核苷酸包含莖-環部分和位於所述莖-環部分的3』的靶退火部分。因此，反轉錄反應中使用的RT寡核苷酸是被設計為具有包含莖-環結構的5』部分的DNA寡核苷酸。如將理解的，莖-環結構是具有一起配對以形成短的雙鏈體DNA莖的互補鹼基序列的自身退火結構。所述環由介於形成所述莖的兩個互補區域之間的核苷酸形成，且該環在莖的一端形成單鏈部分，連接形成雙鏈莖的兩個部分。莖-環部分被設計為在用於反轉錄反應的條件下，意思是在包括緩衝液、鹽和溫度條件及將影響DNA二級結構的任何其他參數的條件下採取莖-環結構，所述條件被選擇為允許反應中所用的反轉錄酶進行反轉錄。如下文討論的，莖-環部分還被設計為在用於擴增反應的條件下解鏈，或不採取莖-環結構。因此，莖部分的序列可被選擇為在包括將相關的緩衝條件考慮在內的用於反轉錄的溫度下退火，但不在再次包括將相關的緩衝條件考慮在內的用於擴增反應的溫度下退火。例如，莖-環部分在37°C或更低的溫度下可能採取莖-環結構，但在約50°C或更高的溫度下可能不退火形成莖-環結構。RT寡核苷酸的莖-環部分包括DNA聚合酶阻礙位置。DNA聚合酶阻礙位置是莖-環區域中當線性化和不採取莖-環結構時充當延伸DNA聚合酶(elongatingDNApolymerase)的阻礙物的位置,所述DNA聚合酶使用反轉錄產物作為模板在擴增反應中延伸擴增引物。DNA阻礙位置可置於RT寡核苷酸的莖-環部分內的任何地方。在一個實施方式中，DNA阻礙位置置於莖-環部分的環內。DNA阻礙位置可以是阻礙延伸DNA聚合酶延伸引物的對莖-環區域的任何修飾。例如，DNA阻礙位置可以是不能被DNA聚合酶讀碼的修飾的核苷酸，例如，使用DNA核苷酸或具有附加的化學基團的修飾的DNA核苷酸的衍生物。所述修飾可以是修飾的核苷酸的核酸鹼基的結構改變；也就是說其可以是DNA聚合酶不能用作模板或經過其延伸的A、G、C或T的類似物。所述修飾可以是為DNA阻礙位置處的核苷酸上的取代基的基團，包括非核苷酸基團，且可以是側基或可被連接到兩個核苷酸使得該基團形成寡核苷酸骨架的一部分。例如，DNA阻礙位置可位於環區域且可包括連接兩個核苷酸的脂族碳鏈，例如C6脂族鏈。因此，修飾可包括併入非核苷酸基團，包括併入到骨架中，以阻礙DNA聚合酶的延伸。在某些實施方式中，DNA阻礙位置可能已被修飾以當向轉錄反應中添加RT寡核苷酸時阻礙DNA聚合酶。例如，可使用修飾的核苷酸2-氨基-5-(2』-脫氧-b-D-呋喃核糖基)吡啶_5，-三磷酸(d*CTP)或5-(2，-脫氧-b-D-呋喃核糖基)-3-甲基-2-吡啶酮-5』-三磷酸(d*TTP)。已表明這兩種修飾的核苷酸在由Taq聚合酶催化的PCR中顯示出強烈抑制(Guo等人，1998)。在其他實施方式中，DNA阻礙位置可以是經處理可被修飾以阻礙DNA聚合酶的核苷酸或基團。也就是說，可被修飾的核苷酸或基團當被加入到RT反應時被進一步處理以在DNA阻礙位置形成修飾的核苷酸。例如，在一個實施方式中，可被修飾的核苷酸是dU核苷酸，用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)對其進行處理。在另一個實施方式中，可被修飾的核苷酸可以是核糖核苷酸，用RNA酶對其進行處理。在兩種情況下，修飾處理產生修飾的核苷酸，包括RT寡核苷酸的裂解，從而有效地阻止DNA聚合酶延伸。在擴增反應之前對可被修飾的核苷酸進行修飾，且可在RT反應之後進行。莖-環部分可具有任何合適的長度以在反轉錄期間提供莖-環結構並在擴增反應期間解鏈。例如，整個莖環結構可以是12至24個核苷酸的長度。在某些實施方式中，莖-環的莖部分可以是4或6個核苷酸的長度。在某些實施方式中，莖-環的環部分可以是4至12個核苷酸的長度。對形成莖環結構的寡核苷酸的設計是已知的，且將計算給定序列的退火溫度或將設計用於特定退火條件的莖-環結構的電腦程式是可獲得的，例如MFOLD軟體。如以上陳述的，莖部分的序列可被設計為在用於反轉錄反應的溫度下退火，而在用於擴增反應的溫度下解鏈。如以上陳述的，RT寡核苷酸包含靶退火部分。靶退火部分位於莖-環部分的3』並被設計為與靶RNA的下遊部分互補。在某些實施方式中，RT寡核苷酸的靶退火部分為5至15個核苷酸的長度。因此，在反轉錄反應之後，產生反轉錄產物，所述反轉錄產物包含該RT產物的5』端處的RT寡核苷酸，和RT寡核苷酸的3』處的與靶RNA的下遊部分互補的延伸區域，該延伸區域位於與RT寡核苷酸的靶退火部分互補的區域的下遊(或位於其3』)。對被反轉錄的樣品進行擴增反應。所使用的PCR方法可包括如本領域已知的實時PCR方法。這些方法包括在產生擴增產物時使用螢光探針檢測該產物。如將應理解的，擴增反應使用一對擴增引物，正向引物和反向引物進行。第一擴增引物(即，正向引物)被設計為退火到RT產物的3』延伸區域的下遊部分。該引物可以是適合退火到RT產物的3』延伸區域的期望部分的任何合適的長度。引物長度可部分地由所選擇的退火溫度和條件決定。對待退火到模板核酸內的期望序列的擴增引物的設計是已知的。在某些實施方式中，第一擴增引物為12至27個核苷酸的長度。第二擴增引物(即，反向引物)被設計為退火到與RT產物互補的DNA鏈的交界部分。互補DNA鏈的交界部分包括與RT產物從RT寡核苷酸過渡到3』延伸區域的點互補的區域。因此，所述交界部分包含與RT寡核苷酸的3』部分和RT產物中的3』延伸區域的5』部分互補的區域。在某些實施方式中，第二擴增引物被設計為退火到與RT寡核苷酸的莖-環部分的13至24個核苷酸、RT寡核苷酸的靶退火部分的5至15個核苷酸以及反轉錄產物中的3』延伸區域的5』端處的I至5個核苷酸互補的序列。在某些實施方式中，第二擴增引物為13至24個核苷酸的長度。在某些實施方式中，包括其中RNA為miRNA的實施方式中，當退火到反轉錄產物時第一擴增引物的3』端位置和當退火到DNA鏈時第二擴增引物的3』端位置之間在擴增產物的序列中的距離為-4至5個核苷酸，意思是在第一擴增引物的3』端退火到RT產物的地方和第二擴增引物的3』端退火到與RT產物互補的DNA鏈的地方之間可能存在I至4個核苷酸的重疊，或可能存在I至5個核苷酸的空隙，或當退火到各自的模板核酸上時在擴增引物的3』端之間可能存在對準。擴增引物中的任何一個或兩者都可具有當與DNA雜交時顯示出熱穩定性的核苷酸作為3』末端核苷酸。與不包括該熱穩定性核苷酸的DNA相比，包括該核苷酸允許使用增加的解鏈溫度，促使擴增引物優先退火到DNA。例如，當與DNA雜交時顯示出熱穩定性的核苷酸可被鎖定在N-型呋喃糖構象中。選行擴增反應並產生擴增產物。一旦擴增產生，則其被檢測到。檢測擴增產物可包括任何檢測方法，包括例如將擴增產物與具有固定的互補序列的微陣列雜交，使用例如凝膠電泳的技術的尺寸分離或使用實時PCR方法以當擴增產物被產生時檢測所述擴增產物。檢測可包括用螢光嵌入染料檢測擴增產物。例如，所述螢光嵌入染料可以是SYBRGreen或EvaGreen。在該方法的一個示例性實施方式中，提供了用於檢測樣品中的靶miRNA分子的方法，該方法包括:使用RT寡核苷酸反轉錄包含該靶miRNA的樣品以產生包含RT寡核苷酸和3』延伸區域的反轉錄產物，所述RT寡核苷酸包含含有dU核苷酸的莖-環部分和與靶miRNA的下遊部分互補的靶退火部分，所述靶退火部分位於莖-環部分的3』；通過用尿嘧啶-DNA糖基化酶處理修飾該dU核苷酸；使用下列引物擴增包含所述反轉錄產物的樣品以產生擴增產物:(i)第一擴增引物，其退火到所述反轉錄產物的3』延伸區域的下遊部分，和(ii)第二擴增引物，其退火到與所述反轉錄產物互補的DNA鏈的交界部分，所述交界部分包含與RT寡核苷酸的3』部分和反轉錄產物中的3』延伸區域的5』部分互補的區域；以及檢測擴增產物；其中所述莖-環部分在用於反轉錄的條件下採取莖-環結構但在用於擴增的條件下不採取莖-環結構。通過下列非限制性實施例進一步例示了這些方法。實施例實施例1使用併入脫氧尿苷的寡核苷酸和半嵌套引物通過實時RT-PCR對成熟微小RNA的高性能定量材料和方法成熟miRNA和前體miRNA模板和序列分析。通過Proligo(Sigma,StLouis,MO,USA)或IntegratedDNATechnologies(Coralville,IA,USA)合成成熟的miRNA。使用帶T7啟動子測序標籤的PCR引物(T7promotersequencedtaggedPCRprimer)克隆前體miRNA(表2)。通過測序驗證純化的PCR產物並根據廠家說明使其經受用於前體miRNA的體外轉錄的MEGAscript17轉錄試劑盒(Ambion,Austin,TX,USA)的處理。通過分光光度法對成熟miRNA和前體miRNA定量並將其稀釋成期望的濃度以用作標準品。使用版本8.0的VectorNTI軟體(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進行miRNA同源物的序列比對和系統發生分析。細胞培養和總RNA分離。將人成膠質細胞瘤細胞系A172和U251培養在37°C下的5%C02加溼的培養箱中的補充有10%胎牛血清(FBS，Sigma)和抗生素(100U/ml青黴素和IOOiig/ml鏈黴素)的DMEM中。將U251細胞以每孔200，000個細胞接種在六孔板中，持續24小時並用無FBS的DMEM培養基孵育12_16h。然後在DMEM中用100ng/ml的GDNF刺激細胞，持續確定的時間段。對於MEK抑制劑的研究，在GDNF刺激之前在DMEM中用5uMU0126(Promega,Madison,WI,USA)預孵育細胞45min。根據廠家說明使用TRIzol試劑(Invitrogen)在20iig/ml的直鏈丙烯醯胺(Ambion)的存在下從未處理的或⑶NF處理的成膠質細胞瘤細胞中分離總RNA。然後使用分光光度法對所提取的RNA樣品定量並通過變性RNA凝膠電泳檢查完整性。反轉錄(RT)。用無RNA酶的DNA酶I(Promega)在37°C下處理總RNA樣品30min。在80°C下持續5min使DNA酶失活。對於初級miRNA和前體miRNA的RT，首先在80°C下在150nM的基因特異性反向引物的存在下加熱IOOng的DNA酶I處理的總RNA或體外轉錄的前體miRNA標準品的稀釋液5min,在冰上速冷並如廠家(Invitrogen)詳細說明的進行反轉錄[Ix緩衝液、dNTP(IOmM)、二硫蘇糖醇(DTT)、RNA酶抑制劑、Thermoscript(15U)]。在60°C下進行反轉錄45min並通過在85°C下進一步孵育5min終止。對於前體的檢測，用預先驗證的基因特異性引物如之前報導的(Jiang等人，2005)進行RT和實時PCR。對於成熟miRNA的RT,在10UI的總體積中使用IOOU的ImpromII(Promega)和IOOnM的莖-環或線性RT寡核苷酸在42°C下對IOOng的DNA酶I處理的總RNA或合成的人成熟miRNA標準品的稀釋液進行反轉錄,持續30min。通過在70°C下加熱5min終止反應。對於24種成熟miRNA的多重RT，在40UI的總體積中使用400U的ImpromII和IOOnM的每種RT寡核苷酸(總共2.4iiM)在42°C下對IOOng的DNA酶I處理的總RNA樣品進行反轉錄，持續30min。然後將cDNA樣品用於使用miRNA-特異性引物的實時PCR。表3中列出了用於RT和實時PCR的引物。表4中列出了線性RT寡核苷酸。尿卩密唳-DNA糖基化酶(UDG)處理。通過IntegratedDNATechnologies合成具有脫氧尿苷(dU)併入的RT寡核苷酸。如上所述地進行反轉錄。然後用5UUDG(NewEnglandBiolabs,Beverley,MA,USA)在37°C下處理cDNA樣品lOmin。在95°C下持續IOmin使反應失活並進行實時PCR。不經RNA分離檢測miRNA。用PBS洗滌96-孔板中各種細胞密度(每孔10至IO5細胞)的U251細胞一次，裂解並在存在或不存在RNA酶抑制劑SUPERase-1n(lU/iil，Ambion)下在42°C下在具有40iiI的包含0.5%TritonX-100(ThermoFisherScientific,MA,USA)、400UImpromII(Promega)和IOOnM的每種RT寡核昔酸(總共2.4uM)的RT混合物的孔中直接反轉錄30min。為了比較，從相同密度的細胞中分離總RNA並在相同的RT混合物中反轉錄。然後將cDNA樣品用於實時PCR。實時PCR。使用SYBRGreenI在CFX96系統(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)上進行實時PCR。根據之前的報導(Schmittgen等人，2004Jiang等人，2005)對前體miRNA和U6snRNA進行實時PCR。在95°C下最初預變性IOmin後，接下來對miRNAcDNA進行快速熱循環:50循環的95°C下變性5s以及在60°C下退火/延伸5s。在包含2.5mMMgCl2,IOOnM的每一種引物和1.25UKlearTaqDNA聚合酶(KBiosciences,Hoddesdon,UK)的lXXtensaMix-SG(BioffORKS,Singapore)中以25yI的總體積對IUI的每一種cDNA樣品進行實時PCR。使用CFX管理軟體(Bio-Rad)自動計算循環閾值(Ct)。若可應用的話，將所有miRNA表達水平標準化成U6snRNA表達。實時RT-PCR測定效率和特異性的計算。如之前所述(Too，2003)地確定實時RT-PCR的效率和特異性。簡單地講，對miRNA的10倍稀釋液進行實時RT-PCR。通過繪製合成的miRNA稀釋液的Ct對Log(拷貝數)的曲線獲得miRNA的標準曲線。通過(10"s-1)X100%計算測定效率，其中S為標準曲線的斜率。對於特異性的計算，通過實時RT-PCR對相同量(每RTlO9拷貝)的完全匹配的miRNA和錯配的miRNA定量。然後將ACt計算為Ct完全匹配_麗懸。然後通過10AGt/sX100%計算錯配的miRNA的相對檢測。結果半嵌套式實時RT-PCR測定的概括。在本研究中，我們已設計了用於通過半嵌套式實時RT-PCR特異性檢測成熟miRNA的簡單方法(圖5)。起初，我們注意到在一些之前的報導(Chen等人，2005；Raymond等人，2005；Shi&Chiang,2005；Duncan等人，2006；Varkony1-Gasic等人，2007;Sharbat1-Tehrani等人，2008;Yang等人，2009)中，反向PCR引物被設計為直接退火到RT寡核苷酸中的序列。為實現特異性，需要獨特的miRNA-特異性的螢光探針來區分靶與非特異性擴增子(Chen等人，2005)。在某些基於TaqMan的測定的情形中，通過使用一種共同的檢測探針以獲得通量便利性而損害了這種特異性。我們假設可通過設計半嵌套式反向PCR引物代替使用共同的或通用的反向PCR引物實現增加的特異性。圖6展示了該方法中在雙鏈模板上的每條引物的3』端之間具有不同距離的正向和反向引物的設計。圖7表明較小的4個核苷酸的環與較大的12個核苷酸的環一樣有效。為檢驗該假設，先通過在RT期間採取穩定的莖-環二級結構的RT寡核苷酸在42°C下對成熟miRNA進行反轉錄。然後使用帶標籤的正向引物(Pf)和半嵌套式反向引物(Pr)擴增cDNA樣品，其中3-5個核苷酸延伸在RT寡核苷酸之外。使用SYBRGreenI在實時PCR中監測cDNA樣品的擴增。可向RT寡核苷酸併入脫氧尿苷(dU)殘基並隨後在擴增前在37°C下用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)處理所產生的cDNA。為輔助用戶確定任何實時RT-PCR測定的設計，使用hsa-miR-21(下文的miR-21)作為例子呈現了流程圖(圖8)。半嵌套式實時RT-PCR測定的性能。首先使用miR-21cDNA稀釋液在快速(每個循環10s)和標準(每個循環75s，15s變性和60s退火/延伸)的熱循環測量法下評價半嵌套式實時RT-PCR測定的性能。該測定在兩種循環測量法下都顯示出極佳的動態範圍(dynamicrange)和線性度(linearity)(圖9A、B),表明該測定對於快速檢測miRNA的穩健性。為評價RT和PCR的性能，對合成的miR-21稀釋7個數量級(每RTlO9至100拷貝)並通過半嵌套式實時RT-PCR定量。標準曲線的極佳線性度表明miR-21測定具有至少71og的寬的動態範圍且能夠檢測每RT反應少至100拷貝(亞介摩爾)(圖9C、D)。接下來我們檢查了該測定在檢測來自總RNA樣品的miRNA方面的性能。使用miR-21半嵌套式實時RT-PCR測定對IOOng至Ipg的總RNA稀釋液(圖9E、F)和從100，000至10個細胞中分離的總RNA(圖9G、H)定量。標準曲線再次表現出極佳的線性度(圖9F、表明該測定能夠可靠地檢測來自微量(IPg)總RNA或來自少至10個細胞的miRNA。總RNA摻入實驗進一步支持了該測定對不經RNA分級的來自總RNA的成熟miRNA定量的能力。此處，用不同量的合成let-7d或let-7emiRNA摻混來自U251細胞的不包含let_7d和let-7e的IOOng總RNA(數據未示出)。總RNA的存在不影響成熟let-7d/let_7emiRNA的定量(圖10)。還評價了用於三種其他miRNA(miR-24、miR-92和miR-218)的半嵌套式實時RT-PCR測定(圖12)。所有三種測定都表現出極佳的動態範圍(至少71og)、靈敏度(每RTlO3-1O4拷貝)和RT-PCR效率(88%-100%)0此外，這些測定顯示了來自合成的標準品和總RNA樣品的靶miRNA的特異性擴增。通過凝膠電泳驗證擴增子的大小(圖14)。成熟miRNA相對於前體miRNA的特異性檢測。使用9種成熟miRNA及其對應的前體(miR-21、miR-7-l、miR-7-2、miR-218-l、miR-218-2、let_7f_l、let_7f_2、let_7g、let_7i)研究了半嵌套式實時RT-PCR測定在區分成熟miRNA與前體miRNA方面的能力。為了對比，我們還評價了RT期間不形成有利的二級莖-環結構的線性RT寡核苷酸(AG>0.5kcal/mol)。為了更好地比較，將這些莖-環RT寡核苷酸及其對應的線性RT寡核苷酸設計為I)僅5』端處的4-5個鹼基不同；2)具有相同的GC含量和相似的Tm(<1°C差異)以及3)具有相同的3』序列使得可在PCR中使用相同的引物。使用莖-環或線性RT和半嵌套式實時PCR單獨對相同量(每RTlO9拷貝)的成熟miRNA和前-miRNA定量。取決於所測試的9種前-miRNA，使用莖-環RT寡核苷酸早於前-miRNA3-14個循環檢測到成熟miRNA(平均ACt為8.7個循環)。相比之下，使用線性RT寡核苷酸的測定的區分力較差(平均ACt為4.8個循環)且不能區分某些成熟的miRNA與其前體例如前-miR-21、前-let-7f-l和前-let_7i(表I)。人let_7miRNA同源物的區分。多個miRNA家族(例如，hsa-let-7、hsa-miR-30)由僅單個核苷酸或幾個核苷酸不同的高度同源的miRNA組成。八個let-7家族的miRNA共享最多63.6%的整體序列同一性，其中let_7a和let_7c、let_7a和let_7f、let_7b和let-7f僅單個核苷酸不同(圖11A)。在該研究中，設計了用於每種let-7miRNA的半嵌套式實時RT-PCR測定。使用每種測定擴增所有八種合成的let-7miRNA並比較相對檢測。簡單地講，先使用靶向不太同源的3』區域的莖-環RT寡核苷酸實現每種let-7miRNA(每RTlO9拷貝)的特異性反轉錄。miRNA-特異性正向PCR引物和優選地具有miRNA-特異性3』末端序列的半嵌套式反向弓I物進一步改善了對多種let-7miRNA的區分。除了相對於let_7c具有1.778%的相對檢測的let-7a測定以外，所有八種let-7測定表現出極佳的對同源miRNA的區分，非特異性檢測小於1%(圖11B)。對於2個或更多個核苷酸不同的let-7miRNA，這些測定能夠特異性地檢測靶miRNA，交叉靶擴增小於0.3%。該結果表明通過不昂貴的SYBRGreenI檢測化學，半嵌套式實時RT-PCR測定能夠在可與基於螢光探針的實時RT-PCR測定(Chen等人，2005)相當的水平上區分高度同源的miRNA。通過併入dU的RT寡核苷酸和UDG處理提高測定的性能。可使用包括尿嘧啶-DNA糖基化酶(M)G)處理的新型策略進一步改善對某些高度同源的miRNA的區分。在該研究中，我們觀察到遺留的RT寡核苷酸的量能夠用作PCR期間的擴增引物，但是具有較差的效率(圖16)。有趣的是，UDG處理之後，併入dU的RT(dU-RT)寡核苷酸而不是標準RT(dT-RT)寡核苷酸不能用作反向PCR引物(圖16B、C)。然後我們假設let-7miRNA同源物之間的區分可通過相似的策略進一步改善。實際上，雖然用於let_7a的標準(dT)RT寡核苷酸相對於let-7fmiRNA表現出0.03%的相對檢測，但是在UDG處理後在環(dUl)或莖(dU2)區域具有dU併入的let_7aRT寡核苷酸明顯不太能夠交叉擴增let_7f(圖13)。let_7adT和dURT寡核苷酸都能夠同樣好地引發let_7a的反轉錄(數據未示出)。應用多重測定鑑定U251細胞中⑶NF-引起的miRNA的表達。為評價該miRNA檢測方法的穩健性，設計並應用半嵌套式實時RT-PCR測定來鑑定U251細胞中GDNF-調控的miRNA。測試了總共26種miRNA，包括被報導為在人成膠質細胞瘤中調控異常的18種miRNA(miR-7、miR-10b、miR-15b、miR-21、miR-124、miR-128、miR-137、miR-139、miR-146b、miR-181a、miR_181b、miR_181c、miR-218、miR-221、miR-222、miR-425、miR-451、miR-486)(Pang等人，2009)和8種let_7家族miRNA。發現U251細胞中表達二十種miRNA(除了miR-137、miR-146b、miR_181c、miR-451、let_7d和let_7e以外)(數據未示出)。通過⑶NF引起的對ERK1/2MAPK的時間依賴性激活刺激細胞，通過MEK抑制劑U0126預處理抑制ERK1/2MAPK(圖18)。然後我們量化了U251細胞中由⑶NF這20種miRNA的表達的瞬時調控。有趣的是，⑶NF刺激引起對miR-7、miR-21、miR-218(圖15A)和let_7f、let_7g、let-7i(圖15B)的時間依賴性上調。未觀察到對其他miRNA的明顯調控。然後我們研發了用於同時對26種miRNA(對應24種RT寡核苷酸)反轉錄並隨後通過半嵌套式實時PCR檢測單獨的miRNA的多重測定。使用該24-重測定，我們發現通過用U0126預處理細胞有效地抑制了⑶NF`對6種m`iRNA的上調，表明MEK-ERK1/2信號傳導通路是⑶NF-引起的miRNA表達所需要的(圖17)。使用miR-218和let_7i作為實例通過標準單重測定獲得了相似的結果(圖20)。對細胞裂解物中miRNA的直接和多重檢測。對來自細胞裂解物的miRNA的直接檢測可避免費時的多步驟RNA分離過程並急劇增加測定的通量。然後我們還研究了半嵌套式實時RT-PCR測定在直接和多重定量來自在96-孔中的10至100，000個培養的U251細胞的miRNA方面的能力。從這些細胞分離的總RNA用作定量對照。與圖9H相似，分離的RNA對照的miR-21和miR-222標準曲線的極佳的線性度表明來自從少至10個細胞提取的總RNA的miRNA可被可靠地定量(圖19)。重要的是，與分離的RNA對照相比，使用該多重測定可一樣好地檢測來自10-1000個細胞的裂解物的miR-21和miR-222。然而，值得注意的是用接近匯合(IO4細胞/孔)或過度匯合(IO5細胞/孔)的細胞密度的裂解物損害了miRNA的直接定量。有趣的是，在含有或不含RNA酶抑制劑下檢測來自細胞裂解物的miRNA時未觀察到顯著差異，表明成熟miRNA的極大的穩定性。討論現在已知miRNA在調節基因表達方面起重要作用且已表明多至60%的人基因被miRNA靶向(Friedman等人，2009)。隨著對miRNA的表達特徵的興趣增加，用於檢測成熟miRNA的快速、穩健且有成本效益的方法是極為期望的。本文所述的半嵌套式實時RT-PCR測定設計起來簡單且表現出極佳的性能並為未來可被鑑定的任何miRNA的設計提供靈活性。關於合成的miRNA靶，半嵌套式實時RT-PCR測定表現出至少71og的寬的動態範圍，少至每RT100個分子(亞介摩爾)的高靈敏度和大於90%的高的RT-PCR效率。除了miRNA表達的相對定量之外，合成的miRNA標準品也可允許對來自總RNA樣品的miRNA表達絕對定量。與之前報導的在每個循環45至75s的標準熱循環設定下進行的miRNA實時PCR測定(Chen等人,2005；Raymond等人,2005；Shi&Chiang,2005;Sharbat1-Tehrani等人，2008;Yang等人，2009)相比，我們的測定能夠快速熱循環(每個循環IOs)而不改變反應混合物。該測定的快速循環能力可部分地歸因於通過半嵌套引物產生的短的擴增子(<50bp)和SYBRGreenI的快速螢光獲取而不需要探針水解。特異且靈敏地對來自總RNA樣品的成熟miRNA定量通常分別需要大小分級和預擴增。已報導除了另外的樣品處理步驟之外，大小分級可導致miRNA的一致性損失(Wang等人，2007)且預擴增效率極大地受miRNA中A鹼基數量的影響(Mestdagh等人，2008)。通過我們的miRNA定量分析，可有效地檢測少量的總RNA(Ipg至IOOng)和從少至10個細胞分離的總RNA而不需要分級或預擴增。之前，用於同時反轉錄220至450種miRNA的MegaplexmiRNA測定已被應用於量化來自微量的總RNA或單細胞的miRNA表達(Tang等人，2006；Mestdagh等人，2008)。因為對於每種miRNA使用了低得多的RT寡核苷酸濃度，所以尤其當起始總RNA小於350ng時在實時PCR之前需要預擴增。在該研究中，我們已表明對24種miRNA的多重測定產生與單重測定相當的結論，而未減少RT寡核苷酸的濃度或不需要預擴增。因此，我們提出用該方法對相對少量的miRNA多重檢測可減少樣品和試劑需求且仍允許對miRNA的可靠定量。這些多重測定還可用於對來自培養在96-孔的細胞的miRNA直接定量。因此，本文報導的方法不僅能夠對來自微量的分離的RNA而且能夠直接對來自裂解的細胞的miRNA表達可靠、快速且高通量地定量檢測，而不需要費力、費時的RNA分離方法。在該研究中，對來自前體的成熟miRNA的特異性檢測通過具有莖-環二級結構的RT寡核苷酸實現。雖然前體miRNA的表達水平通常與成熟miRNA相關(Calin等人，2004；Schmittgen等人,2004),但是常見的是，miRNA的成熟可被調控,從而前體miRNA被表達，但是所述前體miRNA的成熟形式不能被檢測到(Ambros等人,2003；Michael等人,2003；Wulczyn等人,2007;Schmittgen等人,2008)。為了區分對miRNA加工和成熟的調控,用於成熟miRNA和前體miRNA的特異性測定是極為期望的。我們發現莖-環RT寡核苷酸而不是線性RT寡核苷酸優先反轉錄成熟miRNA而不是前體miRNA。莖-環策略之前已被成功地應用於特異性反轉錄正在複製的逆轉錄病毒的有義鏈(Anwar等人，2006)。已提出線性RT寡核苷酸應包含至少7個核苷酸的miRNA-特異性序列以有效地反轉錄成熟miRNA(Raymond等人，2005)。該研究中使用的線性RT寡核苷酸(具有6個miRNA-特異性核苷酸)對成熟miRNA與前-miRNA的差的區分可能是由於對成熟miRNA的無效反轉錄，這與之前的發現(Chen等人，2005)—致。這些結果表明反轉錄期間莖_環二級結構可以穩定RT寡核苷酸和成熟的miRNA之間的短的鹼基配對。基於作為靶識別的關鍵性決定因素的跨越miRNA的5』處的2-7個核苷酸的相同的種子序列，miRNA被分為幾個家族(例如let-7家族)(Lewis等人，2005)。雖然同一家族的miRNA可能共有一些共同的靶和功能，但是該家族的具體成員可能參與某些生理過程和疾病狀態。例如，發現let-7b隨年齡被特異性上調並造成衰退的幹細胞自我更新(Nishino等人，2008)。let-7d的低表達被建議作為頭部和頸部鱗狀細胞癌的預後標誌(Childs等人，2009)，且let-7i被鑑定為人上皮性卵巢癌的新型生物標誌(Yang等人，2008)。這樣一來，對於開發生物標誌和對於miRNA的生物起源的研究需要對這些miRNA的特異性且定量的檢測。之前，let-7同源物的區分通過TaqMan實時RT-PCR測定實現，其中在miRNA-特異性RT之後，共同的反向引物被用於PCR且miRNA-特異性TaqMan探針是區分所需要的(Chen等人，2005)。具有相似策略但是未使用螢光探針的測定受累於顯著更差的對let-7同源物的區分(Raymond等人，2005；Shi&Chiang,2005;Sharbat1-Tehrani等人，2008)。我們假設且表明了半嵌套式miRNA-特異性反向PCR引物急劇地增強了測定的特異性且不需要使用螢光探針。使用該方法，可使用不昂貴的SYBRGreenI來特異性地檢測所有let_7miRNA，具有與TaqMan實時RTPCR(Chen等人，2005)相當且在某些情況下優於TaqMan實時RTPCR的極佳的區分。過多的RT寡核苷酸的存在可在PCR期間用作將促使非特異性擴增的反向引物。尤其當PCR中的正向引物也可與共有序列(例如，來自同源miRNA的cDNA)雜交時，這是成問題的。緩和該問題的常見做法是通過在RT後稀釋cDNA樣品減少RT寡核苷酸的遺留。然而，尤其是對於低豐度的靶miRNA，該方法將總是降低測定的靈敏度。對於低豐度的miRNA，通過在實時PCR之前用脫氧尿苷殘基修飾RT寡核苷酸並用UDG處理cDNA進一步改進該測定。M)G最先從大腸桿菌(E.Coli)中純化出來且發現其能夠裂解來自包含尿嘧啶的DNA的尿嘧啶(Lindahl等人，1977)。尿嘧啶殘基的釋放在DNA上產生可阻礙PCR期間DNA聚合酶複製的無嘧啶位點(Longo等人，1990)。可能UDG處理使得未使用的dURT寡核苷酸不能用作PCR引物。在其中最大特異性是期望的或在RT期間難以實現區分(例如let-7a和let-7f共有相同的用於RT引發的3』序列)的情形中這是一種簡單且有吸引力的方法。已知miRNA以與正常的腦相比不同的方式在成膠質細胞瘤中表達，且這些異常調節的miRNA中的許多參與成膠質細胞瘤生長、侵入和化學抗性(Lawler&Chiocca,2009；Li等人，2009)。對所選擇的miRNA使用半嵌套式實時RT-PCR測定，發現⑶NF通過MEK-ERK1/2MAPK信號傳導通路調控miR-7、miR-21、miR-218、let_7f、let_7g和let_7i的表達。這些GDNF-引起的miRNA的功能意義仍有待研究。使用本文研發的快速且高通量的方法，現在通過表徵miRNA表達中的變化來篩選藥物是可行的。目前公知領域中miRNA的數量超過17，000種(Kozomara&Griffiths-Jones,2011)並被預期隨生物信息學預測和體內驗證例如深度測序增加。由於對miRNA表達分析的持續需求，本研究中呈現的半嵌套式實時RT-PCR測定為快速且可靠地檢測功能性的成熟miRNA提供了高性能的方法。如同每一份單獨的出版物或專利申請被明確且單獨地指明被通過弓I用併入一樣，本說明書中提到的所有出版物和專利申請被通過引用併入本文。對任何出版物的提及是為其在申請日之前的公開內容且不應解釋為承認本發明無權由於在先發明而早於該出版物。如在本說明書和所附權利要求中使用的，除非上下文明確地另外指明，否則單數形式「一個(a)」、「一個(an)」和「該(the)」包括複數的所指對象。如在本說明書和所附權利要求中使用的，術語「包含(comprise)」、「包含(comprising)」、「包含(comprises)」和其他形式的這些術語意在為非限制性包括的含義，也就是說，包括特定的所提及的元素或組分而不排除任何其他元素或組分。如在本說明書和所附權利要求中使用的，所提供的所有範圍或列表意在表達限制於其中的任何中間值或範圍或任何子列表。除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有如本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。雖然為了清楚理解的目的已通過闡述和舉例以某些細節描述了前述發明，但是根據本發明的教導對本領域普通技術人員易於明顯的是可對其進行某些改變和修改而不偏離所附權利要求的精神和範圍。參考文獻AmbrosV，LeeRC,LavanwayA，WilliamsPT，JewellD.2003.MicroRNAsandothertinyendogenousRNAsinC.elegans.CurrBiol13:807-818.AnwarA，AugustJT,TooHP.2006.Astem-loop-mediatedreversetranscriptionrealtimePCRfortheselectivedetectionandquantificationofthereplicativestrandofanRNAvirus.AnalBiochem352:120-128.BarM，WymanSK,FritzBR，QiJ,GargKS,ParkinRK，KrohEM,BendoraiteA，MitchellPS，NelsonAM,RuzzoWL,WareC，RadichJP，GentlemanR,Ruohola-BakerH，TewariM.2008.MicroRNAdiscoveryandprofilinginhumanembryonicstemcellsbydeepsequencingofsmall·RNAlibraries.StemCells26:2496-2505.BartelDP.2004.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，andfunction.Cellll6:281-297.BartelDP.2009.MicroRNAs:targetrecognitionandregulatoryfunctions.Celll36:215-233.BisselsU，WildS，TomiukS，HolsteA，HafnerM，TuschlT，BosioA.2009.AbsolutequantificationofmicroRNAsbyusingauniversalreference.RNA.CalinGA，LiuCG,SevignaniC，FerracinM，FelliN，DumitruCD,ShimizuM，CimminoA，ZupoS，DonoM,Dell1AquilaML，AlderH，RassentiL，KippsTJ，BullrichF，NegriniM，CroceCM.2004.MicroRNAprofilingrevealsdistinctsignaturesinBcellchroniclymphocyticleukemias.ProcNatlAcadSciUSAlOl:11755-11760.CarthewRW.2006.GeneregulationbymicroRNAs.CurrOpinGenetDevl6:203-208.ChenC，RidzonDA,BroomerAJ，ZhouZ，LeeDH,NguyenJT,BarbisinM，XuNL,MahuvakarVR,AndersenMR，LaoKQ,LivakKJ,GueglerKJ.2005.RealtimequantificationofmicroRNAsbystem-loopRT-PCR.NucleicAcidsRes33:el79ChenJF，CallisTE,WangDZ.2009a.microRNAsandmuscledisorders.JCellScil22:13-20.ChenX，BaY,MaL,CaiX，YinY,WangK，GuoJ，ZhangY,ChenJ，GuoX，LiQ，LiX，WangW,WangJ，JiangX，XiangY,XuC，ZhengP，ZhangJ，LiR,ZhangH，ShangX，GongT，NingG，ZenK，ZhangCY.2008.CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellResl8:997-1006.ChenY，GelfondJA,McManusLM,ShiremanPK.2009b.ReproducibilityofquantitativeRT-PCRarrayinmiRNAexpressionprofilingandcomparisonwithmicroarrayanalysis.BMCGenomicslO:407.ChengY，ZhangX，LiZ，JiaoX，WangY，ZhangY.2009.HighlysensitivedeterminationofmicroRNAusingtarget-primedandbranchedrol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