一種利用組培技術快速培育細胞質不育系統中保持系的方法
2023-10-10 06:30:54
專利名稱：一種利用組培技術快速培育細胞質不育系統中保持系的方法
技術領域：
本發明屬於作物遺傳育種技術領域，特別是一種利用組培技術快速培育細胞質不育系統中保持系的方法。
背景技術：
作物不育系的利用為雜種優勢的推廣做出了巨大的貢獻。雜種優勢利用的方法主要有細胞質雄性不育系、細胞核雄性不育系、自交不親和系、基因工程雄性不育系和化學殺雄等方法。其中細胞質雄性不育也被稱為是細胞質和細胞核互作雄性不育系，以下簡稱為細胞質雄性不育。有一種類型的細胞質雄性不育係為隱性細胞質雄性不育系，即幾乎所有的材料都為其恢復系。育種家要想獲得保持系，傳統方法是採用洋蔥公式人工合成。具體步驟為通常得到的不育系材料基因型為s (rfrf)，自然界中恢復系基因型為N(RfRf)或s (RfRf )，兩者之間雜交Fl代基因型s (Rfrf)。取Fl花粉與恢復系回交後自交，將出現兩種情況(1) 若後代出現不育單株，則對應的恢復系的細胞質為不育的，這種情況被淘汰。(2)若後代沒有不育單株出現，則對應的恢復系的細胞質為可育，並且反交得到N(Rfrf)和N(RfRf)兩種基因型。N(Rfrf)自交出現N(RfRf) N(Rfrf) N(rfrf) =1:2:1的分離比，另一種基因型 N(RfRf)自交仍然為N(RfRf)。然後將自交後代的株系與不育系s (rfrf)測交，若出現表型為不育單株，其對應的父本基因型應該為N(rfrf)，這就是我們所需要的保持系。這種方法稱為洋蔥公式人工合成法。在此過程中需要多代測交、雜交和自交，配製多個測交組合，並且需要大面積種植和多年測定，外加一定的機遇才能成功選育出保持系。在作物不育系統中，有一種不育類型為微量花粉性雄性不育，如甘藍型油菜中的 Polima雄性不育系和Shan 2A雄性不育系，但在選育過程中會出現微量花粉的程度與保持系的核基因遺傳背景有較大關係。在選育保持系時，不育系s (rfrf)要與保持系N(rfrf) 進行多年回交。較為徹底的不育系在與保持系回交時通常會出現較多的微量花粉而被淘汰掉。回交次數越多、組合越多越容易出現微量花粉。從數百個測交組合中能夠篩選出的優良保持系寥寥無幾。多年的測交和回交工作量大，種植面積廣，費時費力和過程繁瑣。在傳統育種過程中，育種家通常從由不育系配製的優良的雜交組合中分離出優良單株作為育種材料。雜交組合Fl代材料基因型為s (Rfrf)，將基因型s (Rfrf)自交，F2代會產生s (RfRf) s (Rfrf) s (rfrf) =1 2 1分離，如果出現優良不育單株也望洋興嘆，只能在可育株及後代中繼續選擇，直至找到優良性狀可育單株，但篩選出的可育單株一定具有 Rf基因，所以只能做恢復系，而不育株s(rfrf)會被篩選掉。但並不是每個材料都適合做恢復系，所以此方法育種造成育種材料較大浪費。嫁接作為一種營養繁殖為眾人所知，但作為一種基因轉移方法卻很少被應用。植物細胞與細胞之間的通道胞間連絲，有助於植物每個細胞與鄰近細胞之間進行有利的分子交換(Liu，2010)，研究證明植株在幼嫩未成熟組織的狀態下，大分子交換的通道就更雜亂
3無章，植株越嫩，胞間連絲越大，發生大分子轉移的可能性就越大(Rusk，2009) .Stegemann and Bock (science, 2009)研究表明細胞質遺傳物質如質體DNA編碼轉基因可以在嫁接結合處相互轉移，並且證明轉移後的細胞中兩種標記基因都會表達而且是可遺傳的。嫁接轉移質體基因74株嫁接小苗中有94次質體轉移事件。通過嫁接轉移線粒體研究在育種中較少利用。
發明內容
本發明的目的在於提供一種利用組培技術快速培育細胞質不育系統中保持系的方法，該方法利用組織培養技術將不育系和具有正常細胞質的可育系材料進行嫁接，兩者的愈傷組織細胞中的線粒體相互轉移，使具有正常細胞質的可育系的線粒體轉移到不育系的細胞質中，然後組培分化長根成苗，通過分子鑑定和表型確認，得到既有不育系細胞核遺傳物質又有可育系的正常細胞質材料，此材料即可作為保持系，為育種提供保持系材料。本發明依次通過下列步驟實現
1)將細胞質雄性不育系和具有正常細胞質的可育系種子浸泡24h後，依次經清水衝洗 2次、質量比濃度為95%的乙醇處理Imin、無菌水清洗2_3次、質量比濃度為0. 1%升汞漂洗 15min，其間不時搖動、無菌水清洗4次後，接種於MS培養基，取培養8-lOd的幼苗備用；
MS培養基配方MS粉4. 4g /L+糖20g/L +冷凝膠2. 6g/L
2)待種子發芽下胚軸伸長到大約IOcm左右時，將不育系下胚軸切成5mm切段，具有正常細胞質的可育系切成IOmm切段，然後將兩種切段切口處接觸放於誘導脫分化培養基；
脫分化培養基配方MS&4.41g/L+2，4-D lmg/L+6-BA lmg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠 2. 6g/L
3)傷口處出現愈傷組織的分化後，將其轉移至分化培養基上；
分化培養基配方MS 鹽 4. 41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+ 蔗糖 30g/L + 冷凝膠2. 6g/L
4)傷口處產生綠色和白色緻密的愈傷組織後，再轉移到分化芽培養基上，此時兩種切段的愈傷組織結合在一起生長；
分化芽培養基配方MS鹽4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠 2. 6g/L
5)培養基兩周更換一次，組織分化出的類似嫩葉的組織達Icm左右高時轉移至分化莖
培養基中；
分化莖培養基配方MS鹽4.41g/L +6-BA 0. 005mg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠2. 6g/L
6)分化莖培養基上外植體逐漸生長長成完整的小植株，待其長出4-5片葉、3-4條鬚根時，打開培養罐，使小植株慢慢適應外界環境，2-3天後，移出植株，清水將根部培養基洗淨，移栽至盛有營養土的盆缽中常規培養；
7)取植株葉片提取細胞核DNA並用蔗糖沉澱差速離心法提取線粒體DNA，進行分子鑑定，具有不育系細胞核遺傳物質又有可育系的正常細胞質材料即為保持系；
8)分子鑑定完成後進行田間性狀觀察進一步確認，可育且農藝性狀與不育系相似的材料即為選育出的保持系；
上述方法步驟1-6都在組培條件下進行，外植體光照16h黑暗8h培養，培養基兩周換
4一次。
圖1為在細胞質雄性不育系統中利用傳統的洋蔥公式合成法合成人工保持系流程圖2為本發明方法一種利用組培技術快速培育細胞質不育系統中保持系的方法流程圖，細胞質不育系材料與細胞質可育的可育系材料嫁接過程中，對接處形成愈傷，細胞質交流，交流的細胞質分化成苗。本發明可以應用於以下三個方面
(1)可以替代洋蔥公式人工合成法培育優良的保持系。有些作物的不育系材料基因型為s(rfrf)，自然界中恢復系基因型為N(RfRf)或S (RfRf)。通過本發明可以將不育系 s(rfrf)與恢復系N(RfRf)的細胞質遺傳物質進行交換，後代出現具有N (rfrf)基因型的材料。具有不育系核遺傳物質和恢復系的細胞質遺傳物質的優良保持系，免去大面積種植、 多年連續測交和回交篩選優良保持系過程。(2)在含有微量花粉細胞質雄性不育系統中，保持系培育需要大量測交和回交， 並且在逐步回交過程中經常因為微量花粉問題而被淘汰掉。在回交過程中，若出現優良的不育系時，採用此發明將不育系與正常細胞質的可育系嫁接，可以直接得到具有不育系核遺傳物質和恢復系的細胞質遺傳物質的優良保持系，而不需要再次回交。減少育種年限，並且可以獲得優良保持系。(3)傳統育種過程中，育種家從由細胞質雄性不育系統中配製的雜交種中分離出的可育材料都只能做恢復系，而不育系被淘汰掉。利用本發明可以將優良不育系與正常細胞質的可育系嫁接，可以直接得到具有不育系核遺傳物質和恢復系的細胞質遺傳物質的優良保持系。可節約育種資源，大大提高育種效率。本發明具有以下優點
(1)洋蔥公式合成法合成保持系最少需要5代(3-5年)，並且需要大面積種植和測交。 本發明人工合成保持系只需要1年，主要在實驗室完成，不需要大面積種植和測交，可大大節約成本和勞力。(2)含有微量花粉細胞質不育系測交篩選保持系時，利用本發明可以獲得更多的含微量花粉較少的不育系及對應的保持系，可大大提高成功選擇保持系的概率。(3)在從含有細胞質雄性不育系配製的雜交種Fl中，可以獲得優良的不育系及相對應的保持系。
具體實施例方式以油菜作物舉例說明
1)將不育系和具有正常細胞質的可育系的種子浸泡24h，並從中踢出黃種皮的和腐爛的種子一清水清洗2次(H2O) — 95%乙醇Imin —無菌水清洗2_3次一0. 1%升汞漂洗 15min (其間不時搖動)一無菌水清洗4次一接種一培養(MSg培養基)取培養8_10d的幼苗備用；
MS培養基配方MS粉4. 4g /L+糖20g/L +冷凝膠2. 6g/L
52)待種子發芽下胚軸伸長到大約IOcm左右，將不育系下胚軸切成5mm切段，具有正常細胞質的可育系切成IOmm切段，然後將兩種切段切口處接觸放於誘導脫分化培養基；
誘導脫分化培養基配方MS鹽4. 41g/L+2，4-D lmg/L+6-BA lmg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠2. 6g/L
3)大約兩個星期後，通過誘導分化及培養，傷口處會有愈傷組織的分化，將其轉移至分化培養基上；
分化培養基配方MS 鹽 4. 41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+蔗糖 30g/L + 冷凝膠2. 6g/L
4)大約兩個星期，開始分化且傷口處產生綠色和白色緻密的愈傷組織後，再轉移到分化芽培養基，此時兩種切段的愈傷組織結合在一起生長；
分化芽培養基配方MS鹽4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠 2. 6g/L
5)培養基兩周更換一次，在分化芽培養基培養時進行觀察，組織會分化出類似嫩葉的組織，如果嫩葉沒有長出則繼續在分化芽培養基上培養，出現Icm左右高的嫩葉組織時將組織轉移至分化莖培養基中；
分化莖培養基配方MS鹽4. 41g/L +6-BA 0. 005mg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠2. 6g/L
6)分化莖培養基上外植體逐漸生長長成完整的小植株，待其長出4-5片葉、3-4條鬚根時，打開培養罐，使小植株慢慢適應外界環境，2-3天後，移出植株，清水將根部培養基洗淨， 移栽至盛有營養土的盆缽中自然生長，給予充足陽光，定期施肥；
7)取植株葉片提取細胞核DNA並用蔗糖沉澱差速離心法提取線粒體DNA，進行可育基因檢測等分子鑑定，若具有不育系細胞核遺傳物質又有可育系的正常細胞質材料即為保持系；
8)分子鑑定完成後進行田間性狀觀察進一步確認，可育且農藝性狀同不育系相似的材料即為選育出的保持系。 上述方法步驟1-6都在組培條件下進行，外植體光照16h黑暗8h培養，培養基兩周換一次，防止有毒物質積累。
權利要求
1. 一種利用組培技術快速培育細胞質不育系統中保持系的方法，其特徵在於，依次通過下列步驟實現1)將細胞質雄性不育系和具有正常細胞質的可育系種子浸泡24h後，依次經清水衝洗 2次、質量比濃度為95%的乙醇處理Imin、無菌水清洗2_3次、質量比濃度為0. 1%升汞漂洗 15min，其間不時搖動、無菌水清洗4次後，接種於MS培養基，取培養8-lOd的幼苗備用；MS培養基配方MS粉4. 4g /L+糖20g/L +冷凝膠2. 6g/L2)待種子發芽下胚軸伸長到大約IOcm左右時，將不育系下胚軸切成5mm切段，具有正常細胞質的可育系切成IOmm切段，然後將兩種切段切口處接觸放於誘導脫分化培養基；脫分化培養基配方MS&4.41g/L+2，4-D lmg/L+6-BA lmg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠 2. 6g/L3)傷口處出現愈傷組織的分化後，將其轉移至分化培養基上；分化培養基配方MS 鹽 4. 41g/L +6-BA4mg/L+ZT 2mg/L+AgN03 5mg/L+ 蔗糖 30g/L + 冷凝膠2. 6g/L4)傷口處產生綠色和白色緻密的愈傷組織後，再轉移到分化芽培養基上，此時兩種切段的愈傷組織結合在一起生長；分化芽培養基配方MS鹽4.41g/L +6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠 2. 6g/L5)培養基兩周更換一次，組織分化出的類似嫩葉的組織達Icm左右高時轉移至分化莖培養基中；分化莖培養基配方MS鹽4.41g/L +6-BA 0. 005mg/L +蔗糖30g/L +冷凝膠2. 6g/L6)分化莖培養基上外植體逐漸生長長成完整的小植株，待其長出4-5片葉、3-4條鬚根時，打開培養罐，使小植株慢慢適應外界環境，2-3天後，移出植株，清水將根部培養基洗淨，移栽至盛有營養土的盆缽中常規培養；7)取植株葉片提取細胞核DNA並用蔗糖沉澱差速離心法提取線粒體DNA，進行分子鑑定，具有不育系細胞核遺傳物質又有可育系的正常細胞質材料即為保持系；8)分子鑑定完成後進行田間性狀觀察進一步確認，可育且農藝性狀與不育系相似的材料即為選育出的保持系；上述方法步驟1-6都在組培條件下進行，外植體光照16h黑暗8h培養，培養基兩周換一次。
全文摘要
本發明利用組織培養技術將不育系和具有正常細胞質的可育系材料進行嫁接，兩者的愈傷組織細胞中的線粒體相互轉移，得到既有不育系細胞核遺傳物質又有可育系的正常細胞質材料，即為保持系。本發明可以應用在隱性細胞質雄性不育的人工保持系的合成上、具有微量花粉不育系的保持系的選育中和在含有細胞質雄性不育系的雜交中分離出新的不育系和保持系等方面，可大大豐富保持系選育的途徑，提高育種效率。
文檔編號C12Q1/68GK102217535SQ20111009902
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月20日 優先權日2011年4月20日
發明者付東輝, 李加納, 申敏, 肖美麗 申請人:西南大學