一種家蠶肽聚糖識別蛋白的表達和純化方法與流程
2023-10-18 10:09:29
本發明屬於昆蟲免疫領域，特別涉及一種家蠶肽聚糖識別蛋白（pgrp-s1）的原核表達。
背景技術：
家蠶是一種重要的經濟昆蟲，蠶絲用來製作絲綢，銷售於海內外，帶動了相關企業的發展，極大的促進了我國的經濟發展。蠶蛹中含有豐富的蛋白質，可食用。蠶沙和蠶蛻的皮可入藥，具有重要的藥用價值。所以為了提高家蠶成活率，增強家蠶對病原微生物的抵禦能力，研究家蠶免疫是必不可少的。而且關於蠶對微生物病原體免疫的文獻已經有越來越多被報導。
家蠶屬於鱗翅目昆蟲，既是重要的經濟昆蟲，又是重要的模式生物。家蠶缺乏後天免疫，在與微生物的長期進化過程中形成了一套比較完善的免疫機制即先天免疫，用來抵禦病原微生物的入侵。家蠶先天免疫主要依靠模式識別受體識別病原體相關分子模式進而激活先天免疫通路，從而殺死微生物。這些病原體相關分子模式只存在病原微生物而不存在宿主中，如脂多糖、肽聚糖等，這些病原體相關分子模式被相應的模式識別受體識別，從而激活下遊的信號通路。肽聚糖識別蛋白（pgrp）家族是家蠶最重要的模式識別受體，它可以識別病原微生物的肽聚糖，進而觸發家蠶的免疫通路，從而激活或抑制抗菌肽的表達。有研究表明，家蠶感染革蘭氏陰性菌激活imd通路得到免疫應答，革蘭氏陽性菌激活imd通路得到免疫應答，但也有證據報導表明這兩種途徑之間相互聯繫。
家蠶的基因組中已鑑定出12個肽聚糖識別蛋白基因，這些肽聚糖識別蛋白具有一個pgrp結構域，用來結合病原微生物的肽聚糖，進而啟動或抑制抗菌肽的合成。已有證據表明一些肽聚糖識別蛋白也可以觸發酚氧化酶通路的激活，促進黑化作用。一些肽聚糖識別蛋白也可以直接作為殺菌劑殺死細菌。
技術實現要素：
本發明提供了一種家蠶肽聚糖識別蛋白s1的原核表達載體的構建。
本發明是通過下列技術方案實現的：
家蠶肽聚糖識別蛋白s1原核表達的方法，從家蠶脂肪體組織中提取總rna，通過逆轉錄合成cdna，以此為模板，通過設計引物從家蠶脂肪體組織中擴增得到家蠶肽聚糖識別蛋白s1基因。
家蠶肽聚糖識別蛋白s1原核表達的方法，
設計引物的上遊引物是5'-cgcaggatccgacatggcccgcctcc-3'（bamh1）,（seqidno.1）；
下遊引物是5'-attagcggccgctcttgatggagtccacgttct-3'(not1)（seqidno.2）。設計的引物中插入酶切位點，以便於用分子克隆的方法將家蠶肽聚糖識別蛋白s1基因克隆到原核表達載體pet-30a中，將構建好的原核表達載體轉化dh5α，將菌液pcr和酶切驗證的陽性克隆測序，將測序正確的陽性克隆提取質粒轉化bl21（de3）。
家蠶肽聚糖識別蛋白s1原核表達的方法，將測序正確的bl21（de3）過夜培養，然後以1:100用新鮮培養基稀釋，繼續培養至od值大約在0.5左右，加入終濃度為0.8mm的iptg和質量濃度為20%的葡萄糖誘導，誘導時間為5h。由於表達的蛋白帶有his標籤，可以用鎳離子螯合磁珠進行純化。
鎳離子螯合磁珠進行純化包涵體蛋白的方法，按照下述步驟進行：
（1）將誘導的菌液離心，收集沉澱，將沉澱用1×pbs洗滌兩次，離心棄上清，沉澱加入適量的1×pbs並懸浮，冰上超聲（功率：25%，運行3秒、間歇8秒，25次）裂解，離心，分別取上清和沉澱進行12%sds-page，以確定目的蛋白的可溶性。
（2）樣品處理：沉澱用適量的包涵體洗滌液（1m鹽酸胍、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=7.8）重懸，離心棄上清。沉澱用適量的包涵體裂解液（6m鹽酸胍、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=7.8）重懸，離心得到上清。
（3）磁珠預處理：用buffera（8m尿素、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=7.8）平衡鎳離子螯合磁珠磁珠與目的蛋白結合：磁珠中加入樣品處理步驟中離心得到的上清液，使目的蛋白與磁珠結合。
（4）磁珠洗滌：用bufferb（8m尿素、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=6.0）和bufferc（8m尿素、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=5.3）對磁珠進行洗滌，以除去雜蛋白。
（5）目的蛋白洗脫：用bufferd（8m尿素、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=4.0）洗脫目的蛋白。
（6）目的蛋白復性：採用透析法對包涵體進行復性。
本發明的優勢之處：免除了從家蠶組織中提取蛋白的繁瑣步驟，極大的節約實驗成本和時間。
附圖說明
圖1為pcr擴增家蠶肽聚糖識別蛋白s1基因的結果，圖中：1-6:以脂肪體為模板，梯度pcr擴增s1基因；
圖2為菌液pcr結果，圖中：1：dl5000dnamarker；2-3：一個菌落的菌液pcr產物；3-4：另一個菌落的菌液pcr產物；
圖3為重組質粒的雙酶切結果，圖中：1：dl5000dnamarker；2-3：重組質粒的雙酶切產物；
圖4為iptg誘導目的蛋白表達的結果，圖中：1：蛋白marker；2：未誘導菌液；3：iptg誘導的菌液；
圖5為確定目的蛋白是否存在於沉澱中，圖中：1：未誘導菌液；2：iptg誘導的菌液；3：超聲處理後取總菌液；4：超聲處理後取上清液；5：超聲處理後取沉澱；
圖6為純化的目的蛋白sds-page結果，圖中：1：蛋白marker；2：未誘導菌液；3：純化前的蛋白；4：純化的蛋白；
圖7為純化的目的蛋白westernblot結果圖，中：1：未誘導菌液；2：純化前的蛋白；3：純化的蛋白。
具體實施方式
為了更好地了解本發明的目的和優勢，結合實施例對本發明做進一步的解釋。所舉實施例只用來解釋本發明，但並不限定本發明。
實施例1：獲得家蠶肽聚糖識別蛋白s1基因
用於pcr擴增基因所用的高保真酶購自takara公司，引物是由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
首先，根據genbank公布的核苷酸序列（nm_001043371）設計引物，上遊引物為5'-cgcaggatccgacatggcccgcctcc-3'（bamh1）,下遊引物為5'-attagcggccgctc
ttgatggagtccacgttct-3'(not1)。其次，從家蠶中分離脂肪體提取mrna，逆轉錄為cdna。以cdna為模板，通過所設計的引物進行pcr，擴增出家蠶肽聚糖識別蛋白s1基因。用1%瓊脂糖凝膠檢測（參見圖1）。
實施例2：家蠶肽聚糖識別蛋白s1基因表達菌的構建
用於構建的宿主菌dh5α和bl21（de3），pet-30a質粒由本實驗室保存，dh5α和bl21（de3）製成感受態細菌。bamh1和not1，連接酶均購自takara公司。質粒提取試劑盒購自omaga公司。
對擴增的肽聚糖識別蛋白s1基因和pet-30a進行雙酶切，使用快速連接酶將雙酶切肽聚糖識別蛋白s1基因連接到同樣雙酶切的pet-30a上，於16℃水浴2h，並轉化dh5α感受態細菌。將轉化的dh5α塗布於含卡那黴素（30μg/ml）的lb固體培養基上，37℃倒置培養過夜。將平板上的菌落進行菌液pcr驗證，使用兩對引物進行驗證（參見圖2）。將菌液pcr驗證正確的菌落過夜培養，用質粒提取試劑盒提取質粒用於雙酶切驗證（參見圖3），將驗證正確的目的克隆測序。測序成功的目的克隆質粒轉化bl21（de3），篩選出含有目的基因的菌落。
實施例3：誘導目的蛋白的表達
將含有目的基因的bl21（de3）挑菌落於含卡那黴素（30μg/ml）的lb液體培養基中，37℃培養過夜，然後按1:100稀釋接種於新的含卡那黴素（30μg/ml）的lb液體培養基中37℃培養至od值大約在0.5左右，加入終濃度為0.8mm的iptg和20%的葡萄糖誘導，誘導時間為5h，4℃4500rpm離心25min，收集菌體，進行12%sds-page驗證是否表達（參見圖4）。
實施例4：純化目的蛋白
鎳離子螯合磁珠購自海狸納米科技（蘇州）有限公司。
將收集的細菌用20ml1×pbs清洗兩次，4℃4500rpm離心25min，收集菌體。用10ml1×pbs重懸菌體，冰上超聲（功率：25%，運行3秒、間歇8秒，25次）裂解，4℃12000rpm離心10min，分別取上清和沉澱進行12%sds-page，以確定目的蛋白的可溶性（參見圖5）。
樣品處理：沉澱用10ml包涵體洗滌液（1m鹽酸胍、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=7.8）重懸，離心棄上清，重複一次。沉澱用10ml包涵體裂解液（6m鹽酸胍、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=7.8）重懸，離心得到上清。
磁珠預處理：將磁珠充分混勻，吸取1ml磁珠懸液於離心管中，將離心管置於磁性分離器上，待溶液澄清後移去保存液。從磁性分離器取下離心管。加入10mlbuffera（8m尿素、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=7.8）使磁珠重新懸浮，將離心管置於磁性分離器上，磁性分離，移去上清液，重複洗滌2次以平衡鎳離子螯合磁珠。
磁珠與目的蛋白結合：磁珠中加入樣品處理步驟中離心得到的上清液，將離心管置於旋轉混合儀上旋轉20min，使目的蛋白與磁珠結合。之後將離心管置於磁性分離器上，磁性分離，移去上清液。
磁珠洗滌：依次加入10mlbufferb（8m尿素、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=6.0）和bufferc（8m尿素、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=5.3）對磁珠進行洗滌，以除去雜蛋白。最後加入10mlbufferc使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉移到新的離心管中，以防止雜蛋白的汙染。
目的蛋白洗脫：用5mlbufferd（8m尿素、20mm磷酸鈉、500mmnacl,ph=4.0）洗脫目的蛋白。
目的蛋白復性：採用透析法對包涵體進行復性，透析外液分別為a(20mm磷酸鈉、500mmnacl、4m尿素，ph4.0)、b(20mm磷酸鈉、500mmnacl、2m尿素，ph4.0)、c(20mm磷酸鈉、500mmnacl、1m尿素，ph4.0)、d(20mm磷酸鈉、500mmnacl、0m尿素，ph4.0)，每次透析時間為4小時。
實施例5：12%sds-page分析和westernblot驗證
一抗（anti-his）二抗（羊抗鼠igg）購自南京諾唯贊生物科技有限公司
12%sds-page分析：取100μl純化的目的蛋白加入20μl5×sdsloadingbuffer煮沸5min,12000rpm離心5min，取20μl上樣。進行12%sds-page，用考馬斯亮藍染色液染色2h,用考馬斯亮藍脫色液脫色過夜（參見圖6）。
westernblot驗證：將純化的蛋白到pdvf膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，用tbst洗滌4次，加入一抗（anti-his1:1000稀釋），4℃過夜，pdvf膜用tbst洗滌4次，加入二抗（羊抗鼠igg1:5000稀釋）1h，tbst洗滌4次，加入顯色液，ecl顯色（參見圖7）。
上述實施例為本發明較為優化的條件，由圖6和圖7可證明，純化出的蛋白較好。本發明的實驗方法並不受上述實施例的限制，在本發明實驗原理的前提下，所做的修飾和改進都屬於本發明的保護範圍之內。
sequencelisting
江蘇大學
一種家蠶肽聚糖識別蛋白的表達和純化方法
2
patentinversion3.3
seqidno.1
26
dna
人工序列
（1）..（26）
1
cgcaggatccgacatggcccgcctcc26
江蘇大學
seqidno.2
33
dna
人工序列
（1）..（33）
2
attagcggccgctcttgatggagtccacgttct33