一種特異性指示禽糞便汙染的基因檢測方法
2023-10-18 14:19:34
專利名稱：一種特異性指示禽糞便汙染的基因檢測方法
技術領域：
本發明屬於環境生物技術領域，具體涉及一種特異性指示禽糞便汙染的基因檢測方法。
背景技術：
隨著沿海養殖業的發展，農業非點源汙染——畜禽排洩物汙染已成為影響近海海域及養殖水體環境質量的重要汙染源。畜禽養殖排洩物多以非點源的方式進入水體環境， 其隨機性、散在性、廣泛性和多樣性給管理和控制造成了巨大困難。動物糞便帶來的大量致病微生物，諸如霍亂弧菌、傷寒沙門氏菌、腸蘭伯氏鞭毛蟲、A型肝炎病毒、貝類Norwalk病毒等可以隨著汙染的水體到處傳播。部分細菌或病毒能夠直接作用於海洋動植物，導致魚類或貝類等水產養殖品大量死亡；部分致病菌還可以存活於貝類或魚類體內，通過食物鏈進入人體，造成流行病傳染病的暴發。由此可見，糞便汙染不僅給水產養殖業和海洋生態環境帶來危害，而且還威脅著人類的健康生活。治病要去根，治汙當溯源。建立監測、溯源和示蹤為一體的近岸海域及養殖水環境非點源汙染示蹤監測體系勢在必行。為了解決農業糞便汙染對水環境帶來的汙染問題，以美國為代表的先進國家開始了一種新型識別糞便汙染源技術——微生物源示蹤(Microbial Source Tracking, MST) 的研究。MST是指利用微生物為汙染源的示蹤指示物，識別汙染環境中汙染物(特別是糞便) 來源的生物技術。MST監測的優勢主要體現在1)準確識別環境水域中非點源汙染，特別是糞便汙染的來源；2)正確評估非點源汙染水體的汙染貢獻率；3)明確各已知汙染源與病原微生物和汙染危害之間的相關性；4)用於預測各已知汙染源汙染物的遷移化規律和擴散途徑。微生物源示蹤的具體方法可分為依賴資料庫型(library-d印endent methods, LDMs)和非依賴資料庫型(library-ind印endent methods, LIMs)兩大類。LDMs方法是利用不同宿主來源指示微生物(如五cWi)表型或基因型的差異建立相應資料庫，並參照資料庫信息判別未知宿主來源的指示菌，從而追溯糞便汙染的來源；包括抗生素耐藥法、脂肪酸分析法、核糖體法、脈衝場電泳法、rep-PCR指紋分析法等。LIMs方法主要依賴於宿主特異性分子標記的檢測，關鍵在於篩選針對不同動物宿主的特異性標記。目前研究較為成熟且應用廣泛的是LDMs，然而此類方法需要大量菌株的分離純化及相關特性資料庫的建立，耗時耗力且具有區域局限性；因此，基於宿主特異性標記檢測的LIMs方法越來越受到關注。近年來研究發現，宿主特異性擬桿菌屬(ifecteroiW^) 16S rRNA基因標記的檢測可有效用於指示人源和動物源糞便汙染，是一種理想的LIMs方法。已有研究篩選得到特異性指示人、狗、牛和豬糞便汙染的fecteroii/a^^s 16S rRNA基因標記(Kildare et al.， 2007，Water Res. 41:3701 - 3715; Layton et al., 2006, App1. Environ. Microbiol. 72:4214 - 4224; Mieszkin et al. , 2009, App1. Environ. Microbiol. 75:3045 -30 ),而特異性指示禽糞便汙染的fecteroii/a^^ 16S rRNA基因標記未見報導。
發明內容
本發明的目的在於通過系統進化分析禽糞便擬桿菌屬(Macteroidales) 16S rRNA 序列，獲得一種特異性指示禽糞便汙染的基因標記Av-Bac，最終將該基因標記應用於水體中禽源糞便汙染的溯源。一種特異性指示禽糞便汙染的基因檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟
a)從水域中提取待測水樣DNA;
b)用螢光定量PCR擴增樣品DNA;其中，引物核苷酸序列為 正向引物 Av-BacF: 5』- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3』
反向引物 Av-BacR 5 』 -CGCCCATTGACCAATA-3 』
探針序列為FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA ；
c)將上述擴增產物核苷酸序列與下述核苷酸序列進行比對
Av-Bac 5'-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GMGG TCCCC CACAT TGGM CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，
若二者核苷酸序列相同，且該序列平均濃度為每毫升樣品中含2. 5士0. 3 Iogltl拷貝，則該水域判斷為受禽糞便汙染的水域。進一步地，步驟b中，螢光定量PCR反應的引物濃度為300 nmol，探針濃度為200 nmol ο步驟b 中，螢光定量 PCR 反應程序為95 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45個循環，在每個循環退火、延伸階段收集螢光信號。本發明還提供了一種用於上述基因檢測方法的引物，其特徵在於，該引物序列為正向引物 Av-BacF: 5，- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3，；反向引物 Av-BacR: 5』 -CGCCCATTGACCAATA-3』。本發明中的基因標記Av-Bac是通過系統進化分析得到，具體方法如下 (一)擬桿菌屬UacteroiWe1S) 16S rRNA基因序列系統進化分析
採集我國東海近岸部分海域周圍主要養殖禽類和海鳥糞便樣品，並提取糞樣DNA ； 利用引物Bac32F/Bac708R選擇性擴增Bacteroichles 16S rRNA基因，獲得禽源 Bacteroidales 16S rRNA基因文庫；將23個代表性序列與GenBank中16S rRNA序列同源性比對，構建系統進化樹(圖1)，並獲得1個禽類特異性序列聚類簇Cluster A。(二)特異性指示禽糞便汙染基因標記(Av-Bac)的引物與序列特徵
根據上述Cluster A中的序列比對，設計用於螢光定量PCR檢測的引物和探針， Av-BacF: 5』 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3』 Av-BacR: 5' -CGCCCATTGACCAATA-3『 Av-BacProbe FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA
上述引物擴增片段長度為103 bp，即為特異性指示禽糞便汙染基因標記Av-Bac，其核苷酸序列為
5』-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3， (三)應用Av-Bac螢光定量PCR檢測樣品的特異性評價
將Av-Bac標記用於螢光定量PCR檢測58個已知來源的糞樣(包括豬、牛、羊、狗、雞、鴨、鵝、海鳥來源)，real-time PCR反應時Av-BacF/ Av-BacR最佳濃度為300 nmol， Av-BacProbe 最佳濃度為 200 nmol。最佳反應程序為95 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45個循環，在每個循環退火、延伸階段收集螢光信號。結果顯示，禽類樣品中均能特異性擴增103 bp大小的條帶，Av-Bac標記的平均濃度為每克糞樣中含6. 8士0. 4 Iogltl拷貝；而在其他動物糞便中無特異性條帶。利用此基因標記進行水體的禽源糞便汙染溯源可保證100%的準確率。本發明具有以下優點
(1)將基因標記Av-Bac用於水體中禽源糞便汙染(非點源汙染)的溯源，具有顯著的宿主特異性，正確判別率可達100%。(2)用基因標記Av-Bac可定量檢測禽糞便汙染情況，從而能正確評估其汙染貢獻率。(3)採用Av-Bac基因標記檢測水體的糞便汙染屬於微生物源示蹤(MST)方法中的非依賴資料庫型(LIMs)，無需菌株的分離培養及特徵資料庫的建立，操作簡單、省時省力， 且不受地域限制。
圖1是基於禽源擬桿菌屬16 S rRNA基因構建的系統發育樹(雞源FcB，鴨源 FdB，鵝源FgB，海鳥源SgB)。圖2是禽源Av-Bac標記的real-time PCR擴增曲線。圖3是Real-time PCR檢測部分已知來源的糞樣Av-Bac基因標記的電泳圖。其中，泳道1、4和8為雞源，泳道9和10為鴨源，泳道14為鵝源，泳道17為海鳥源)。
具體實施例方式1.樣品採集及DNA提取
採集我國東海近岸部分海域(寧波、舟山、象山港、杭州灣)周圍主要養殖禽類(雞、鴨、 鵝)和海鳥糞便樣品，每種禽糞30份。取無菌採便棒插入新鮮糞便中，確保採便棒兩側小孔滯納一定量糞便，將採便棒放入無菌試管內並做好記錄，用冰盒帶回實驗室並在M h內進行處理。樣品命名為雞源FcBl-30，鴨源FdBl-30，鵝源FgBl-30，海鳥源SgBl-30。每個樣品取 250 mg (溼重)採用 FastDNA spin kit for soil (MP Biomedical)試劑盒提取 DNA。2. ^MBacteroidales 16S rRNA 基因文庫構建
禾丨J 用引物 Bac32F: 5' -AACGCTAGCTACAGGCTT-3 『 /Bac708R: 5' -CAA TCGGAGTTCTTCGTG-3，從提取的DNA樣品中選擇性擴增fecieroiWes 16S rRNA基因。PCR 反應條件為94 ° C 5 min, 94 ° C 30 sec, 61 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec，30個循環； 72 ° C 延伸 7 min。PCR 產物經 QiaQuick gel purification (Qiagen)試劑盒純化後，克隆至pCR2. 1載體，轉化大腸桿菌T0P10F，。藍白斑篩選獲得69個陽性克隆，挑陽性菌落於 37 ° C、130 rpm下振蕩培養M h後離心收集，保存於-20 ° C待測序。3. Bacteroidales 16S rRNA 序列進化分析
序列測定由上海英俊(Invitrogen)生物技術有限公司測序部完成。用^^仙此！！吐v. 4. 8軟體編輯原始16S rRNA基因克隆序列，然後利用DOTUR軟體分析克隆序列。具有洲的序列差別者定義為分類操作單元(即Operational taxonomic unit，簡稱OUT)。在選取 OTU的同時，對文庫進行飽和曲線分析。每個OTU中選取1個克隆序列(如果該OTU含有的克隆序列多於1個)做為代表序列，共獲23個代表性序列。將其與NCBI網絡資料庫中的同源序列進行比對。根據比對結果，選取相似度最高的同源序列作為參照序列。將選取的同源參照序列和本研究所得OTU代表序列結合在一起。然後通過Bioedit軟體包中的 ClustalW將序列對齊，並將對齊後的序列文件轉為MEGA 4. O軟體的文件輸入格式。最後用 MEGA 4. O軟體做系統進化分析。構建系統進化樹時，迭代運算1000次。系統進化分析顯示有1個禽類特異性序列聚類簇Cluster A (圖1)。該聚類簇包含了本研究獲得的11個OTU序列，其中FdB22、FgBM和SgB15與GenBank中已知的雞特異性標記同源性達95%以上；FcB18、SgBlO和FdB23與已知的鵝特異性標記同源性達99%以上；FdB7和FdB13與已知的鴨特異性標記同源性達93%以上；SgB21與已知的海鳥特異性標記同源性達99%。因此，根據Cluster A設計禽類相關特異性基因標記。4.特異性指示禽糞便汙染基因標記(Av-Bac)的獲得
將Cluster A中飽Bacteroidales 16S rRNA部分序列(OTU)進行比對，以同源的片段設計PCR擴增的引物和探針。用於real-time PCR檢測的引物和探針，核苷酸序列為 Av-BacF: 5』 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3』
Av-BacR: 5' -CGCCCATTGACCAATA-3『 Av-BacProbe FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA。上述引物擴增片段長度為103 bp，即為特異性指示禽糞便汙染基因標記Av-Bac， 其核苷酸序列為
5』-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，。實施例1 已知來源糞樣real-time PCR檢測Αν-Bac標記的特異性
將Av-Bac標記用於螢光定量PCR檢測58個已知來源的糞樣(包括豬、牛、羊、狗、 雞、鴨、鵝、海鳥來源)，real-time PCR反應時Av-BacF/ Av-BacR最佳濃度為300 nmol， Av-BacProbe 最佳濃度為 200 nmol。最佳反應程序為95 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45個循環，在每個循環退火、延伸階段收集螢光信號。結果顯示，禽類樣品中均能特異性擴增103 bp大小的條帶，Av-Bac標記的平均濃度為每克糞樣中含6. 8士0. 4 Iogltl拷貝；而在其他動物糞便中無特異性條帶(圖3)。利用此基因標記進行水體的禽源糞便汙染溯源可保證100%的準確率。實施例2 =Av-Bac標記溯源檢測水環境中糞便汙染的來源
於東海近岸部分海域(寧波、舟山、象山港、杭州灣)採集水樣共141份，採用FastDNA spin kit for soiKMP Biomedical)試劑盒提取樣品DNA。用螢光定量PCR擴增樣品DNA ； 其中，引物核苷酸序列為正向引物Av-BacF 5』 - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3』；反向引物 Av-BacR: 5』 -CGCCCATTGACCAATA-3』 ；探針序列為FAM-GAACTGAGACACGGTCC_TAMRA。將上述擴增產物核苷酸序列與Av-Bac標記核苷酸序列進行比對
Av-Bac 5'-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GMGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，。
結果顯示，共有27份樣品中可特異性檢測到103 bp大小的條帶，說明禽類糞便汙染水樣的檢出率為19. 1%，即東海近岸部分海域存在禽糞便汙染。Av-Bac標記的平均濃度為每毫升水樣中含2. 5±0. 3 Iog1。拷貝。
權利要求
1.一種特異性指示禽糞便汙染的基因檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟a)從水域中提取待測水樣DNA;b)用螢光定量PCR擴增樣品DNA;其中，引物核苷酸序列為正向引物 Av-BacF: 5』- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3』反向引物 Av-BacR 5 』 -CGCCCATTGACCAATA-3 』探針序列為FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA ；c)將上述擴增產物核苷酸序列與下述核苷酸序列進行比對Av-Bac 5'-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GMGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，若二者核苷酸序列相同，且該序列平均濃度為每毫升樣品中含2. 5士0. 3 Iogltl拷貝，則該水域判斷為受禽糞便汙染的水域。
2.如權利要求1所述的基因檢測方法，其特徵在於，步驟b中，螢光定量PCR反應的引物濃度為300 nmol，探針濃度為200 nmol。
3.如權利要求1所述的基因檢測方法，其特徵在於，步驟b中，螢光定量PCR反應程序為95 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45個循環，在每個循環退火、延伸階段收集螢光信號。
4.一種用於權利要求1-3任一權利要求所述基因檢測方法的引物，其特徵在於，該引物序列為正向引物 Av-BacF 5，- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3，；反向引物 Av-BacR 5， -CGCCCATTGACCAATA-3，。
全文摘要
本發明公開了一種特異性指示禽糞便汙染的基因檢測方法，包括從水域中提取待測水樣DNA；用特異性引物螢光定量PCR選擇性擴增樣品DNA；將擴增產物核苷酸序列與基因標記Av-Bac核苷酸序列進行比對的步驟。本發明將基因標記Av-Bac用於水體中禽源糞便汙染(非點源汙染)的溯源，具有顯著的宿主特異性，正確判別率可達100%。並可定量檢測禽糞便汙染情況，從而能正確評估其汙染貢獻率。
文檔編號C12Q1/68GK102260744SQ20111020271
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者傅玲琳, 王彥波 申請人:浙江工商大學