一種從桃兒七中製備高純度鬼臼毒素的方法
2023-10-18 11:29:19 1
專利名稱：一種從桃兒七中製備高純度鬼臼毒素的方法
技術領域：
本發明涉及從植物中提取鬼臼毒素的方法，特別是一種從桃兒七中製備高 純度鬼臼毒素的方法。
鬼臼毒素(podophyllotoxin)又叫鬼臼素、鬼臼毒、鬼臼脂素，是一種 具抗腫瘤活性的天然產物，屬木脂素類化合物中的環木脂內酯。其化學名為 [5R- (5 a ， 5 a 0 ， 8a a ， 9 a ) ]， 5， 8， 8 a ， 9-四氫-9-羥-5- (3， 4， 5-三甲氧苯基) 呋喃(3'，4': 6,7)萘並-[2，3-d]-l,3-間二氧雜環烯-6(5a H)-酮。分子式 C22H2208， 分子量414.41，結構式為通式I :
鬼臼毒素可用於治療尖銳溼疣、抑制皰疹病毒。同時自50年代鬼臼毒素 被證實對腫瘤細胞有治療效果以後，人們加強了對鬼臼毒素的研究併合成了 大量的鬼臼毒素衍生物，篩選出了SP-G (鬼臼毒素葡萄糖與苯甲醛的縮合產 物)、SP-1 (鬼臼酸乙基醯肼)、依託泊甙(VP-16)和替尼泊甙(VM-26)等幾 種高活性抗腫瘤藥物。
目前，鬼臼毒素主要從小檗科的八角蓮屬、桃兒七屬和山荷葉屬等屬植 物中分離得到。杉UL七(Podophyllum emodi Wall. var. chi膽se Sprague) 又名大黃鬼臼、華鬼臼、桃耳七、小葉蓮，為小檗科植物，生長於山中林下陰 溼的地方，在我國資源十分豐富，主要分布在甘肅、陝西、西藏、青海等省。
背景技術：
3地下部分或果實入藥，其性溫味苦，有和血、止血、除風溼、解毒、消腫之功 效。
目前從桃兒七中提取純化鬼臼毒素的生產方法大致可分為化學溶劑提取 分離法和常壓柱層析分離法兩類，傳統的化學溶劑提取分離方法具有操作簡 單，產量大的優點，但提取純化過程中都需要用到苯或甲苯等毒性較大的溶劑， 給操作者造成危害較大，對環境汙染嚴重，且所得產品純度低。常壓柱層析分 離法雖然能得到高純度的產品，但操作繁瑣，且產量低，分離效率差，生產周 期長，需消耗大量的洗脫劑，矽膠利用率低。
中國專利CN1253456C公告的一種從桃兒七中製備鬼臼毒素的方法，其是 將桃兒七根莖粉碎後，加入90%乙醇溶液，在70。C回流提取3次，合併提取液， 減壓濃縮，得棕紅色漿狀物；在棕紅色漿狀物，加入石油醚，攪拌使其充分萃 取，靜置分層，棄去下層棕紅色液體，將上層淡黃色液體靜置結晶，離心過濾， 得白色至淡黃色針狀晶體，此即為鬼臼毒素粗品，繼而用柱層析分離與純化， 得到鬼臼毒素精品。
在柱層析分離與純化時，先用氯仿溶解鬼臼毒素粗品，再流過裝有矽膠 的減壓層析柱；用醇類或酮類與氯仿的混合液進行洗脫，收集部分洗脫液，減 壓濃縮至幹，得白色提取物，即為純度91.1-98.75%的鬼臼毒素精品。
但是上述方法得到的鬼臼毒素精品純度略低且不太穩定。
發明內容
為了避免以往工藝的缺點，節約資源，簡化工序，縮短生產周期，直接 分離得到高純度的鬼臼毒素，並減少對操作者的危害，本發明提供了一種新的 從桃兒七中製備高純度鬼臼毒素的方法，該方法得到的鬼臼毒素純度大於99%。 對於保護日趨減少的鬼臼毒素資源，降低生產成本，促進鬼臼毒素應用，具有 極為重要的意義。
為了實現本發明的目的，本發明所採用的技術方案是
一種從桃兒七中製備高純度鬼臼毒素的方法，分為原料用醇類提取得浸 膏再經萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高壓柱層析兩部分組成，具體步驟
為將桃兒七根莖經超微粉碎後，在超聲波條件下用醇類溶劑加熱50-6CTC提 取三次，合併三次提取液，合併提取液濃縮醇類溶劑，得到比重為1.0-1.2的紅褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏體積量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇 水相用等體積的二氯甲垸萃取三次，合併三次的二氯甲垸相，濃縮得到純度為 40%-50%的淡黃色鬼臼毒素粗品；淡黃色鬼臼毒素粗品用二氯甲垸溶解，上樣 至矽膠為300-400目的高壓柱，用丙酮+二氯甲烷溶劑的混合洗脫液洗脫，收集 產品段洗脫液，過濾濃縮後，烘乾即得到純度大於99%的鬼臼毒素精品。
為了使植物細胞中有效組分全部釋放出來，將桃兒七根莖經超微粉碎至 粒徑IO y m以下，使其小於植物細胞的平均直徑15-25 ix m。
所用超聲波的功率為1000-10000W。
在本發明中，所述二氯甲垸相用無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮幹，6(TC幹
燥，得到純度為40%-50%的淡黃色鬼臼毒素粗品。
在本發明中，所述醇類溶劑為甲醇或乙醇，優選為甲醇。 所述高壓柱的柱壓為2. 5 3. 5MPa。內徑為100-250mm，層析柱層徑高比為
1 : 10-20。
所述洗脫液中丙酮與氯仿的體積比為i: 20。
在本發明中，洗脫液過濾濃縮後，採用6(TC進行鼓風乾燥。 本發明的方法克服了以前工藝的提取效率低，所用溶劑毒性大，產品顏 色差，純度低的缺點，具有如下優點
1、 不採用傳統的加熱浸泡並濃縮幹的方法，而是原料經超微粉碎，在超 聲波條件下加熱浸泡，濃縮後到一定比重再萃取浸膏的醇水相，操作簡便，提 取完全徹底，提取效率高，直接得到的產品純度高。
2、 去除了過去用苯等毒性較大的溶劑化學結晶的方法，而採用毒性相對 低的丙酮和二氯甲垸溶劑進行柱層析，對人體危害更小，對環境汙染低。
3、 使用特製高壓柱進行層析，上樣量大，周期短，分離度好，產品純度 高，矽膠可重複利用。
4、 避免了過去高溫加熱高溫烘乾工序，而採用6(TC進行鼓風乾燥，產品 質量好。
本發明得到的鬼臼毒素純度大於99% 。
具體實施例方式
本發明內容通過以下的實施例作進一步的闡述，但並不限制本發明的範圍。
實施例1
5 kg超微粉碎粒徑10"m以下的桃兒七根莖用30 L甲醇50'C浸泡，用功 率為1000W超聲波提取3次，3小時每次，合併3次提取液濃縮得到4.8 L比重為 l.l的紅褐色浸膏，轉入萃取罐並加入9.6L 7jC，共用15L二氯甲垸分3次萃取， 合併3次二氯甲烷相，用無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮幹，並採用6(TC烘乾得640 g淡黃色鬼臼毒素粗品粉末。淡黃色鬼臼毒素粗品粉末3L二氯甲烷溶解，溼法 上樣至填料為300-400目矽膠高壓柱，其中高壓柱的柱壓為2. 5 3.5MPa，高壓 柱內徑為100咖，層析柱層徑高比為1 : 12，用比例為l: 20的丙酮和二氯甲烷的
混合洗脫液洗脫，收集鬼臼毒素產品部分，濃縮至大量產品析出，過濾，採用 6(TC鼓風乾燥得到鬼臼毒素精品白色粉末150 g， HPLC檢測純度為99. 22%。
實施例2
50 kg超微粉碎粒徑10ixm以下的桃兒七根莖用300 L甲醇50'C浸泡，用 功率為5000W超聲波提取3次，3小時每次，合併3次提取液濃縮得到48. 6 L比重 為l.l的紅褐色浸膏，轉入萃取罐並加入IOO L水，共用150 L二氯甲垸分3次 萃取，合併3次二氯甲垸相，無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮幹，並採用6(TC烘乾 得6240 g淡黃色鬼臼毒素粗品粉末。淡黃色鬼臼毒素粗品粉末20 L二氯甲烷溶 解，溼法上樣至填料為300-400目矽膠高壓柱，其中高壓柱的柱壓為2.5 3.5MPa，高壓柱內徑為200mm，層析柱層徑高比為l : 12.5,用比例為l: 20的丙 酮和二氯甲垸混合液洗脫，收集鬼臼毒素產品部分，濃縮至大量產品析出，過 濾，採用60。C鼓風乾燥烘乾得到白色粉末1534 g， HPLC檢測純度為99. 37%。
實施例3
5 kg超微粉碎粒徑10um以下的桃兒七根莖用30 L乙醇6(TC浸泡，用功 率為1000W超聲波提取3次，3小時每次，合併3次提取液濃縮得到4. 82 L比重為 1.08的紅褐色浸膏，轉入萃取罐並加入10L水，共用15L二氯甲垸分3次萃取， 合併3次二氯甲烷相，無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮幹，並採用60'C烘乾得624g 淡黃色鬼臼毒素粗品粉末。淡黃色鬼臼毒素粗品粉末3L二氯甲烷溶解，溼法上 樣至填料為300-400目矽膠高壓柱，其中高壓柱的柱壓為壓力2. 5 3. 5MPa,高
6壓柱內徑為100mm，層析柱層徑高比為l : 12，用比例為h 20的丙酮和二氯甲烷 混合液洗脫，收集鬼臼毒素產品部分，濃縮至大量產品析出，過濾，採用60 。C鼓風乾燥烘乾得到白色粉末148 g， HPLC檢測純度為99. 47%。
實施例4
50 kg超微粉碎粒徑10um以下的桃兒七根莖用300 L乙醇60。C浸泡，用 功率為5000W超聲波提取3次，3小時每次，合併3次提取液濃縮得到47. 7 L比重 為1.12的紅褐色浸膏，轉入萃取罐並加入IOO L水，共用150 L二氯甲烷分3 次萃取，合併3次二氯甲烷相，無水硫酸鈉乾燥過濾後濃縮幹，並採用6(TC烘 幹得6212 g淡黃色鬼臼毒素粗品粉末。淡黃色鬼臼毒素粗品粉末20 L二氯甲烷 溶解，溼法上樣至填料為300-400目矽膠高壓柱，其中高壓柱的柱壓為2.5 3.5MPa，高壓柱內徑為200隱,層析柱層徑高比為1 : 12.5，用比例為l: 20的丙 酮和二氯甲垸混合液洗脫，收集鬼臼毒素產品部分，濃縮至大量產品析出，過 濾，採用60。C鼓風乾燥烘乾得到白色粉末1516 g， HPLC檢測純度為99. 48%。
權利要求
1. 一種從桃兒七中製備高純度鬼臼毒素的方法，分為原料用醇類提取得浸膏再經萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高壓柱層析兩部分組成，具體步驟為將桃兒七根莖經超微粉碎後，在超聲波條件下用醇類溶劑加熱50-60℃提取三次，合併三次提取液，合併提取液濃縮醇類溶劑，得到比重為1.0-1.2的紅褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏體積量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇水相用等體積的二氯甲烷萃取三次，合併三次的二氯甲烷相，濃縮得到純度為40％-50％的淡黃色鬼臼毒素粗品；淡黃色鬼臼毒素粗品用二氯甲烷溶解，上樣至矽膠為300-400目的高壓柱，用丙酮+二氯甲烷溶劑的混合洗脫液洗脫，收集產品段洗脫液，過濾濃縮後，烘乾即得到純度大於99％的鬼臼毒素精品。
2. 如權利要求l所述的方法，其中將桃兒七根莖經超微粉碎至粒徑10um 以下。
3. 如權利要求l所述的方法，其中所用超聲波的功率為1000-10000W。
4. 如權利要求l所述的方法，其中所述二氯甲垸相用無水硫酸鈉乾燥過 濾後濃縮幹，6(TC乾燥，得到純度為40%-50%的淡黃色鬼臼毒素粗品。
5. 如權利要求l所述的方法，其中所述醇類溶劑為甲醇或乙醇。
6. 如權利要求l所述的方法，其中所述高壓柱的柱壓為2. 5 3. 5MPa。
7. 如權利要求6所述的方法，其中所述高壓柱內徑為100-250mm,層析柱 層徑高比為l : 10-20。
8. 如權利要求l所述的方法，其中所述洗脫液中丙酮與氯仿的體積比為i: 20。
9. 如權利要求l所述的方法，其中洗脫液濃縮過濾後，採用60'C進行鼓 風千燥。
全文摘要
一種從桃兒七中製備高純度鬼臼毒素的方法，分為原料用醇類提取得浸膏再經萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高壓柱層析兩部分組成，具體步驟為將桃兒七根莖經超微粉碎後，在超聲波條件下用醇類溶劑加熱提取三次，合併三次提取液，合併提取液濃縮醇類溶劑，得到比重為1.0-1.2的紅褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏體積量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇水相用等體積的二氯甲烷萃取三次，合併三次的二氯甲烷相，濃縮得到純度為40％-50％的淡黃色鬼臼毒素粗品；淡黃色鬼臼毒素粗品用溶解，上樣至矽膠為300-400目的高壓柱，用丙酮+二氯甲烷溶劑的混合洗脫液洗脫，收集產品段洗脫液，濃縮過濾後，烘乾即得到純度大於99％的鬼臼毒素精品。
文檔編號A61P35/00GK101503410SQ20091004769
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月17日 優先權日2009年3月17日
發明者仝澤彬, 張偉中, 張愛平, 王權勇, 蔡志香, 卅 高 申請人:上海金和生物技術有限公司