脊椎動物用飼料組合物的製作方法

2023-10-18 07:15:04 1

專利名稱：脊椎動物用飼料組合物的製作方法
脊椎動物用飼料組合物
技術領域：
本發明涉及一種養殖方法，具體而言，涉及ー種脊椎動物用飼料組合物。
現有技術隨著世界人ロ快速成長，以及可耕地面積的減少，可利用的糧食資源漸趨短缺，提升單一面積生產量以及增加附加營養價值是世界糧食生產的趨勢。針對漁業而言，因海上捕撈所得的漁獲量已幾近飽和，且動物蛋白市場對漁類產品的需求日益成長，由水產養殖業以彌補捕撈漁業產品供應量的不足已是勢在必行。石斑魚(Epinephelus spp.)物種分類屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、魚盧行目(Perciforms)、鯧科(Serranidae)、石斑亞科(Epinephelinae)、石斑屬(Epinephelus),為暖水性魚類，廣布全世界熱帶與亞熱帶海域，為養殖界公認亞太地區最重要的經濟魚種。臺 灣主要養殖瑪拉巴石斑、點帶石斑、龍膽石斑和青點石斑。一般石斑魚養殖至少需八至十二個月才達上市體型，但最後的收成率都不高。除了早期稚魚易遭受病毒及細菌感染而死亡夕卜，養殖期間的天候因素、水質汙染問題、餌料生物的選擇與管理方面都會增加業者的風險。因此如何提高養殖魚類的養成速度，縮短上市的時間，降低飼料轉換率(飼料投餵重量/魚只體重増加重量)及養殖期間可能發生的風險，是值得努力研究的方向。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic andrich incysteine, SPARC),又稱骨結合素(osteonectin)、BM40,其蛋白大小約35_45kDa,主要分布於細胞外基質(extracellular matrix, ECM)之中，是一種細胞基質蛋白(matricelluarprotein),亦為ー種具有與細胞外基質結合亦可與細胞結合特性的具有多功能的糖蛋白(glycoprotein)。雖然SPARC主要分布於細胞外基質之中，但其功用卻不同於一般基質中的結構性蛋白所負責的細胞結構組成、支持作用；相反的，SPARC專司細胞與細胞外基質之間的溝通橋梁，屬於調控性的蛋白質，能調節數種細胞基質蛋白的產生及儲存堆積(Bradshaw及Sage,2001,J Clin Invest 107 ; 1049-1054 ;Lane 及 Sage，1994，FASEB J 8;163_173)。而SPARC主要表現於胚胎發育過程，對細胞分化、組織的鈣化生成、骨骼發育、型態及器官發育有極大影響，當於生物成體時此蛋白的表現量有降低的趨勢，主要是當皮膚或是組織受傷時的修復及重組過程會有較明顯的表現(Lane及Sage, 1994)。SPARC主要可以分成三個功能區(Hohenester等人，I"7，EMBO J 16 ；3778-3786) :1、酸性區(Acidic domain):位於蛋白質N端，此區可與5 8個I丐離子形成弱親和カ的結合，具有抑制細胞延展及調控細胞外基質生產的功能；2、類卵泡抑制素區(Follistatin like domain):此區包含多個半胱氨酸,且有類似卵泡抑制素的功能,能夠抑制細胞增生，此區還包含另ー個特別的序列-銅離子結合序列(K) GHK (Iruela-Arispe等人，1995，Mol Biol Cell 6 ;327_343)，具有促進血管的增生的功能；3、細胞外鈣離子結合區(ECdomain):為SPARC的C端，具有兩個EF-手型結構域(EF-handmotif)可與I丐離子形成高親和カ的結合，能與細胞或某些膠原蛋白結合，亦具有抑制細胞增生及延展的效果(Maurer 等人，1995，J Mol Biol 253 ;347_357)。目前對SPARC生物功能性的研究探討已有ー些發現，於活體外的老鼠內皮細胞培養觀察中可以發現到幾個特性(一)SPARC的表現可以抑制細胞型態的延展，使細胞趨於圓形(Murphy-Ullrich 等人，1991，J Cell Biol 115 ;1127_1136);調控細胞外基質的組成及其中某些細胞外基質蛋白質的表現，進而調節細胞與外基質之間的結合狀況從而改變細胞型態及遷徙的能力(Hasselaar 等人，1991，J Biol Chem 266 ;13178_13184 ;Tremble 等人，1993，J Cell Biol 121 ； 1433-1444) ; (ニ)抑制細胞周期的進行，主要使周期停於中Gl期，故有抑制細胞生長的功能(Yan 及 Sage，1999，JHistochem Cytochem 47 ; 1495-1506)；(三)於血管細胞培養的研究發現其具有促進血管增生的性質(Funk及Sage，1991，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88 ;2648_2652);而在活體內發現，去除SPARC基因的老鼠在出生不久後即有白內障的現象，推測SPARC對於眼睛晶狀體的發育為必需的蛋白(Yan及Sage，1999);而研究中也發現在spare基因敲除的老鼠中，可以觀察到皮膚組成發生異常改變，脂肪層有增厚的現象，且其脂肪細胞有體積變大及數目增多的現象，血液中由脂肪細胞所分泌的瘦蛋白濃度也有上升的情形，因此推測SPARC蛋白可能和體內調控脂肪量變化有相關關係(Bradshaw 等人，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 ;6045_6050)。 肌肉倍增基因(myostatin),亦稱為第八號生長分化因子(growth anddifferentiation factor-8,⑶F_8),為轉化生長因子TGF-0家族中的成員。肌肉倍增基因可負向調控肌肉的生長分化。在牛及人體的研究中皆可發現當肌肉倍増基因失去功能吋，因無法執行負向調控肌肉之生長分化，造成肌肉倍増的表現型出現(McPherron及 Lee,1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,12457-12461 ；Schuelke 等人，2004, TheNewEngland Journal of Medicine 350,2682-2688)。在哺乳動物研究方面，將小鼠的肌肉倍增基因敲除(McPherron 及 Lee，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 ; 12457-12461)、在小鼠肌肉中大量表現肌肉倍増抑制蛋白(如Follistatin)或是讓其訊息傳遞所需的受體蛋白ActRIIB 失去功能(Lee 及 McPherron，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 ;9306_9311)，都會導致肌肉倍増的結果出現。而在硬骨魚類研究方面，使用反義嗎啉敲除(Antisensemorpholinoknock-down)技術抑制斑馬魚胚胎中的肌肉倍增蛋白-I的mRNA,可使胚胎生長速度變快(Amali 等人,2004, Developmental Dynamics 229 ;847_856);或利用 RNAi 技術使斑馬魚肌肉倍增基因-I默化，出現巨大斑馬魚的特徵(Acosta等人，2005，Journal ofBiotechnology 119 ;324_331),進ー步以組織切片去探討研究這些肌肉細胞,發現肌肉細胞體積變大(Hypertrophy)及肌肉細胞數目增生(Hyperplasia),可能是導致肌肉倍增的原因。另ー方面，體外細胞株研究結果指出，若在C2C12肌肉母細胞株內大量表現肌肉倍増蛋白質，可抑制肌肉母細胞的增生，使細胞停留在細胞周期當中的Gl至S期(Thomas等人，2000, The Journal of Biological Chemistry 275 ;40235_40243)。另一方面，若在肌肉星狀細胞內大量表現肌肉倍増蛋白質，發現其可抑制肌肉星狀細胞活化及自我更新(self-renewal) (McCroskery, 2003, The Journal of CellBiology 162 ;1135_1147),亦證明肌肉倍増蛋白質在肌肉發育過程當中，的確扮演負向調控的角色。除了其本身會在肌肉細胞內進行調控之外，其它文獻指出其有抑制脂肪新生的功能存在(Rebbapragada等人，2003，Molecular and CellularBiology 23 ;7230_7242)，也有研究指出其有抑制肌肉母細胞調亡的功倉泛(Rios等人,2001,Biochemical and BiophysicalResearch Communications280 ；561-566)。然而關於肌肉倍增蛋白質及SPARC的研究中，並無關於飼料轉換率(飼料投餵重量/體重增加重量)的報導，於養殖業中，除了肌肉增加外，飼料轉換率亦是成本控制之重要關鍵，再者，現今針對免疫抑制脊椎動物的方法為採用注射抗原性片段，耗時耗力，且易造成脊椎動物受傷，業界仍需要開發可降低飼料轉換率的飼料組合物，以提高養殖的養成速度。

發明內容本發明涉及一種脊椎動物用飼料組合物，其可提高養殖的養成速度，縮短上市的時間，降低飼料轉換率及養殖期間可能發生的風險。本發明提供一種脊椎動物用飼料組合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體。
優選地，根據本發明的飼料組合物進一步包含肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質的片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段的抗體。

圖I為石斑魚經免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的血清抗體效價圖。圖2為石斑魚經免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的體重變化圖。圖3為石斑魚經免疫抑制肌肉倍增蛋白質的血清抗體效價圖。
具體實施方式本發明提供一種脊椎動物用飼料組合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體。根據本發明的飼料組合物通過抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的功能，可在脊椎動物體中降低飼料轉換率，其中飼料轉換率被定義為(飼料投餵重量)/(體重增加重量)。優選地，根據本發明的飼料組合物進一步包含肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質的片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段的抗體。根據本發明的飼料組合物可適用於各種脊椎動物體中；優選地，根據本發明的飼料組合物適用於魚體；更優選地，該魚體為硬骨魚綱(Osteichthyes),目前已選殖出包括斑馬魚、大西洋鮭魚、莫三比克吳郭魚、條紋鱸魚、金頭鯛魚、虹鱒、河鱒、河鯰、點帶石斑魚及日本真鱸的肌肉倍增基因，且其胺基酸序列具有高度保守性，推測應具有相同的功能；尤其優選地，該魚體為硬骨魚綱鱸行目(Perciforms);尤其優選地，該魚體為硬骨魚綱S盧行目鯧科(Serranidae);尤其優選地,該魚體為硬骨魚綱S盧行目鯧科石斑亞科(Epinephelinae);尤其優選地，該魚體為硬骨魚綱硬骨魚綱鱸行目鯧科石斑亞科石斑屬(Epinephelus);最佳地,該魚體為點帶石斑魚(Epinephelus coioides)。根據本發明的飼料組合物利用抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質的功能以提高脊椎動物的飼料轉換率，其可針對基因、轉錄反應、翻譯反應、蛋白質活性及信號轉導路徑等各階段以抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質的功能，本發明所屬技術領域中具通常知識者可選擇適當的操作以抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質的功能，例如利用基因敲除方法去除基因體中的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増基因、抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質本身的活性或是抑制受體蛋白的作用。優選地，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質的功能是通過免疫抑制法而抑制，其利用抑制蛋白質活性的方式抑制其功能，可對脊椎動物產生較小的系統性副作用。在本發明的一個優選的具體實施例中，免疫抑制法為給予脊椎動物富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質或其片段的抗體。優選地，該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質的片段為抗原性片段。本發明所屬技術領域中具通常知識者可克隆得編碼富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質的基因，表達該蛋白或其抗原性片段，並將其免疫至動物體內，而得到該抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質的抗體或其抗原性片段的抗體。根據本發明的抗體可通過將富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質或其抗原性片段 免疫其它動物，並純化出抗體而得，或是直接將富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白質或其抗原性片段免疫脊椎動物體，使該脊椎動物體本身產生抗體。根據本發明的抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體，優選地，該抗體為多克隆抗體。本發明所述的「抗原性片段」是指蛋白質抗原中，可引起免疫反應產生的抗原的片段，其可經由結構預測或是選取蛋白質片段觀察免疫動物的免疫反應而得該片段。肌肉倍増蛋白質在序列上與其它TGF-P家族成員具高相似度，包括三個部分
(I)N端疏水區域，作為蛋白分泌釋出的信號；(2)具高度保守性的蛋白切割位置RXRR(序列辨識編號2) ； (3)半胱氨酸豐富的C端活性區域(Sharma等人』 1999, Journal ofcellular physiology 180;1_9)。許多報告證實,脊椎動物的肌肉倍增蛋白質的胺基酸序列在C端活性區域具有高度保守性(McPherron等人，1997, Nature 387 ;83_90)。目前針對肌肉倍增蛋白質的研究中(Whittemore等人,2003, Biochemical and BiophysicalResearchCommunications 300 ;965_971),發現一對肌肉倍增蛋白質具高度專一性的單克隆抗體JA16，分析與肌肉倍増蛋白質結合位置，發現其結合位置是位於小鼠肌肉倍増蛋白質C端的15個胺基酸DFGLDCDH1STESRC(SEQ ID No : I)，可知該C端區域為抗原性片段，故優選地，該肌肉倍増蛋白質的抗原性片段為肌肉倍増蛋白質的C端區域；更佳地，該肌肉倍增蛋白質的C端區域具有如SEQ ID NO :1所不的序列。另ー方面，由於抗原性片段為小片段胜肽，若直接將此小片段的抗原免疫動物時，免疫反應可能不令人滿意，優選地，建構含有多個重複數的線性重複排列抗原(Lineararrayepitopes, LAE),以提高免疫反應。此外,亦可利用細菌毒素以幫助輸送抗原,將已去除毒素活性的毒素作為運載系統，利用該毒素的特性，提升整體的免疫效果。優選地，根據本發明的線性重複排列抗原與綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A, PE)區域Ia融合。綠膿桿菌外毒素的分子量為66kDa，含有613個胺基酸，其蛋白結構主要有三個區域，其中的區域Ia(胺基酸1-252)為受體結合區，負責和哺乳動物細胞膜上的a 2-巨型球蛋白/低密度脂蛋白細胞受體(a 2-macroglobulin/low density lipoprotein receptor,LDLR)結合後，再經由細胞內吞作用(Receptor-mediatedendocytosis)進入細胞的內膜體中，利用綠膿桿菌外毒素已證實能有效增強誘導免疫反應(Donnelly等人，1993, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 ;3530_3534)。在本發明的一個優選的具體實施例中，該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質或其片段的抗體生物包埋於豐年蝦體中。豐年蝦經常作為飼料而容易施予至魚體中。優選地，該豐年蝦為豐年蝦幼蟲；更優選地，該豐年蝦幼蟲被冷凍乾燥為粉末。在本發明的另一優選的具體實施例中，該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白質或其片段的抗體表達於微生物中，該微生物可直接添加於飼料成分中，例如包埋於豐年蝦體中。優選地，該微生物的培養液被冷凍乾燥為粉末。另一方面，該微生物優選為大腸桿菌。 在本發明的一個優選的具體實施例中，與對照組比較，以免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白功能可有效降低飼料轉換率超過約5% ;更優選地為從約8%至約40%。茲以下列實施例來詳細說明本發明，但並不意味本發明僅局限於這些實施例所揭示的內容。實施例實施例I :免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白抗原製備對照組及實驗組共48隻點帶石斑魚，重量平均70± 10g、長度平均五到六時，實驗過程約五個月。設計的抗原主要是由使用引物I (SEQ ID NO 3)及引物2(SEQ ID NO 4)擴增spare基因。建立35L發酵培養製程，將含有抗原性片段的大腸桿菌BL21(DE3)菌株培養於50L發酵槽。將4管5mL經LB/氨苄青黴素(Ampicillin)培養基於37°C培養隔夜，並將培養菌株分別接種至0. 2L的LB/氨苄青黴素培養液中，共1L，於37°C振蕩培養至00_約0. 3，再加A 35L的培養液中培養，每隔I小時取樣測定其OD6tltl監測其生長曲線變化情形。進一步依其生長曲線變化選出適當的時間點，加入最終濃度0. ImMIPTG以誘導大腸桿菌大量表達融合蛋白，並於37°C振蕩培養3小時後離心收集菌體。融合蛋白的表達情況則經由SDS-PAGE及西式印跡法(western blotting)確認，以確認優選的35L發酵條件。製備豐年蝦生物包埋口服疫苗豐年蝦的孵化稱取4克的豐年蝦乾燥卵，置於250mL燒杯中，加入150mL淡水浸泡約半小時。以網篩過濾豐年蝦耐久卵並以適量淡水衝洗乾淨。將豐年蝦耐久卵加入5升孵化液中，均勻散布。將打氣石置入並開始打氣，調節進氣體積約為每分鐘500立方釐米(維持溶氧大於2ppm)。打開照明設備，室溫及水溫保持在26至28°C之間。24小時後關掉打氣並將照明移至容器底部，將豐年蝦幼蟲利用趨旋光性誘引至容器底部，靜置5分鐘，此時未孵化卵及孵化的空卵殼會漂浮至水面，利用虹吸管原理或其它可吸水的器具將上浮卵殼吸除。將孵化的一齡幼蟲以網篩(孔徑120微米ym)輕柔過濾，以海水輕輕衝洗後更換2升新的孵化液。輕柔攪拌孵化液使豐年蝦幼蟲均勻散布，吸取一毫升孵化液滴入I毫升方格計數盤中，為避免幼蟲的擾動，可以放置在50°C加熱盤上加熱十分鐘殺死幼蟲，方便計數。計數時將計數盤置於解剖顯微鏡下，放大倍率設為60 100倍觀察。此計數盤上有劃線1000小格，計算方式可隨機選取10X 10小格(0. I毫升幼蟲數)計算幼蟲只數，以同樣方法重複計算盤上其它位置數量後取平均數，再乘以10倍即為每毫升幼蟲數，或是可以將盤上所有幼蟲全部計數亦可。根據計算結果，調整豐年蝦密度至每毫升約為500隻。將打氣石置入並開始打氣，調節進氣體積約為每分鐘300至400立方釐米(維持溶氧大於2ppm)。室溫及水溫保持在26 28°C之間，培養12至18小時後，豐年蝦將會進行第一次脫殼而長成ニ齡幼蟲，此時即可以進行生物包埋步驟。生物包埋將大腸桿菌以IOOOXg離心沉降。倒除多餘的培養基，並用等量的PBS將菌體重新懸浮，洗去菌體上多餘培養基。再以1000Xg離心一次，用適量的PBS重新懸浮菌體，製備成濃度為I X 101(lCfu/mL的菌液。殺菌方法為加熱殺菌法，將菌液置於65°C水浴槽中加熱10分鐘，殺菌完畢後置於冰上10分鐘。將豐年蝦ニ齡幼蟲分裝為所需要的體積，接著將準備好的菌液加入其中，使大腸桿菌終濃度約為lX101(lCfu/mL，適度打氣2小吋。
包埋結果確認採樣前先將打氣關掉，吸取2毫升豐年蝦包埋液至小網篩上並以大量清水衝洗。將豐年蝦幼蟲吸出移入離心管中。將微量離心管置於-20度冰箱10分鐘將豐年蝦幼蟲凍死後取出，倒在九釐米培養皿中並加入少許無菌水將豐年蝦幼蟲均勻散布，接著以微量吸管吸取500隻ニ齡幼蟲至微量離心管中，以3000rpm離心使幼蟲集中在離心管底部並將離心管中的水分吸除，再吸取IOOy L無菌水加入離心管中。以微量研磨棒將豐年蝦幼蟲於微量離心管中小心並仔細磨碎。並進行SDS-PAGE及西式印跡法分析。含豐年蝦飼料的製作將已經濾食或未濾食的ニ齡豐年蝦的水分儘量去除，利用冷凍乾燥機將其凍幹成粉末，豐年蝦粉末與一般粉碎飼料以i : 1000比例進行混合再重新制粒。飼料製作將菌液濃縮，利用冷凍乾燥機將其凍幹成粉末，菌粉與一般粉碎飼料進行混合，混合比例為Ig飼料混3. 3 X IO9Cfu大腸桿菌粉，再重新制粒。動物實驗實驗動物共分為四組實驗組PEIa-抗原性片段組，對照組分別為餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料三組，共80隻點帶石斑魚，重量平均約52. 36克、長度平均五到六吋，實驗過程約四個月。每個星期一、ニ、三餵食含抗原飼料，四、五、六餵食一般飼料，星期日禁食，另外在免疫前以及免疫後每ニ個星期，搜集魚血液，血液經過靜置20 40分鐘後凝固，利用離心法處理後取其血液上清液以進行酵素免疫分析，測驗血液中對抗內生性蛋白抗體的カ價。酵素免疫分析法利用抗原抗體專ー性結合的原理，首先將Iy g(100ii USPARC-His重組蛋白片段與附著緩衝液混合均勻，並加入96孔Nunc-Immuno 盤(NUNC )底部於4°C靜置隔夜，使蛋白結合至底盤，以PBST洗滌3次後，加入100 u L、含有5%脫脂牛奶的TBST溶液中於室溫下反應I小時，再以PBST洗滌至少3次，將以PBST稀釋的待測血清作為ー級抗體，加入後於室溫靜置約2 3小吋，以PBST洗滌至少3次，接著加入ニ級抗體的老鼠抗石斑魚血清100 u L靜置室溫下I小時，以PBST洗滌至少3次，最後加入100 u L後方接有鹼性磷酸酶的羊抗鼠血清作為三級抗體，於室溫靜置I小時後以PBST洗滌，最後每孔各加入50 y L受質溶液p-硝基苯磷酸鹽(p-Nitrophenyl Phosphate)錠於室溫下靜置30分鐘(視呈色情況而定)，再以酵素細胞分析儀中讀取OD4tl5的吸光值。結果豐年蝦組首先抽取石斑魚血液，分離出血清之後利用酵素 免疫分析法，檢測餵飼含有肌肉抑制素抗原性片段的重組融合蛋白後，各時期的石斑魚血清對於抗重組石斑魚肌肉倍增蛋白質C端抗原活性區域的抗體效價。抗體效價於免疫後第十周開始被偵測到，持續上升至第二十二周，其中PEIa-抗原性片段組的抗體效價較三組對照組餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料為高，抗體效價達到超過400。(如圖I)計算二十四周內的動物實驗期間的總飼料消耗量、體重變化(如圖2)以及飼料轉換率，統計發現PEIa-抗原性片段組與其它三組對照組於二十四周內消耗總飼料量大約相等，PEIa-抗原性片段組平均飼料轉換率為I. 46，餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料分別為2. 67，2. 58以及2. 81，即餵飼肌肉倍增蛋白質抗原性片段的實驗組，在上市前的養成過程可花費較少的飼料得到肉質較豐腴的石斑魚(如表I所示)。表I :
對照豐年豐年蝦豐年蝦及 組蝦及PEIaPEIa-抗原性片段
FCR 2.672.582.811.46實施例2 :免疫抑制肌肉倍增蛋白質製備表達肌肉倍增蛋白質抗原性片段重組蛋白的大腸桿菌建立35L發酵培養製程，將含有抗原性片段的大腸桿菌BL21(DE3)菌株培養於50L發酵槽。將4管5mL經LB/氨苄青黴素(Ampicillin)培養基於37°C培養隔夜，並將培養菌株分別接種至0. 2L的LB/氨苄青黴素培養液中，共1L，於37°C振蕩培養至00_約0. 3，再加A 35L的培養液中培養，每隔I小時取樣測定其OD6tltl監測其生長曲線變化情形。進一步依其生長曲線變化選出適當的時間點，加入最終濃度0. ImMIPTG以誘導大腸桿菌大量表達融合蛋白，並於37°C振蕩培養3小時後離心收集菌體。融合蛋白的表達情況則經由SDS-PAGE及西式印跡法(western blotting)確認，以確認優選的35L發酵條件。製備豐年蝦生物包埋口服疫苗豐年蝦的孵化稱取4克的豐年蝦乾燥卵，置於250mL燒杯中，加入150mL淡水浸泡約半小時。以網篩過濾豐年蝦耐久卵並以適量淡水衝洗乾淨。將豐年蝦耐久卵加入5升孵化液中，均勻散布。將打氣石置入並開始打氣，調節進氣體積約為每分鐘500立方釐米(維持溶氧大於2ppm)。打開照明設備，室溫及水溫保持在26至28°C之間。24小時後關掉打氣並將照明移至容器底部，將豐年蝦幼蟲利用趨旋光性誘引至容器底部，靜置5分鐘，此時未孵化卵及孵化的空卵殼會漂浮至水面，利用虹吸管原理或其它可吸水的器具將上浮卵殼吸除。將孵化的ー齡幼蟲以網篩(孔徑120微米ym)輕柔過濾，以海水輕輕衝洗後更換2公升新的孵化液。輕柔攪拌孵化液使豐年蝦幼蟲均勻散布，吸取一毫升孵化液滴入I毫升方格計數盤中，為避免幼蟲的擾動，可以放置在50°C加熱盤上加熱十分鐘殺死幼蟲，方便計數。計數時將計數盤置於解剖顯微鏡下，放大倍率設為60 100倍觀察。此計數盤上有劃線1000小格，計算方式可隨機選取10X 10小格(0. I毫升幼蟲數)計算幼蟲只數，以同樣方法重複計算盤上其它位置數量後取平均數，再乘以10倍即為每毫升幼蟲數，或是可以將盤上所有幼蟲全部計數亦可。根據計算結果，調整豐年蝦密度至每毫升約為500隻。將打氣石置入並開始打氣，調節進氣體積約為每分鐘300至400立方釐米(維持溶氧大於2ppm)。室溫及水溫保持在26 28°C之間，培養12至18小時後，豐年蝦將會進行第一次脫殼而長成ニ齡幼蟲，此時即可以進行生物包埋步驟。生物包埋將大腸桿菌以IOOOXg離心沉降。倒除多餘的培養基，並用等量的PBS將菌體重新懸浮，洗去菌體上多餘培養基。再以1000Xg離心一次，用適量的PBS重新懸浮菌體，製備成濃度為I X 101(lCfu/mL的菌液。殺菌方法為加熱殺菌法，將菌液置於65°C水浴槽中加熱10分鐘，殺菌完畢後置於冰上10分鐘。將豐年蝦ニ齡幼蟲分裝為所需要的體積，接著將準備好的菌液加入其中，使大腸桿菌終濃度約為lX101(lCfu/mL，適度打氣2小吋。 包埋結果確認採樣前先將打氣關掉，吸取2毫升豐年蝦包埋液至小網篩上並以大量清水衝洗。將豐年蝦幼蟲吸出移入離心管中。將微量離心管置於-20度冰箱10分鐘將豐年蝦幼蟲凍死後取出，倒在九釐米培養皿中並加入少許無菌水將豐年蝦幼蟲均勻散布，接著以微量吸管吸取500隻ニ齡幼蟲至微量離心管中，以3000rpm離心使幼蟲集中在離心管底部並將離心管中的水分吸除，再吸取IOOy L無菌水加入離心管中。以微量研磨棒將豐年蝦幼蟲於微量離心管中小心並仔細磨碎。並進行SDS-PAGE及西式印跡法分析。動物實驗實驗動物共分為四組實驗組PEIa-抗原性片段組，對照組分別為餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料三組，共40隻點帶石斑魚，重量平均約157g、長度平均五到六吋，實驗過程約四個月。每個星期一、ニ、三餵食含抗原飼料，四、五、六餵食一般飼料，星期日禁食，另外在免疫前以及免疫後每ニ個星期，搜集魚血液，血液經過靜置20 40分鐘後凝固，利用離心法處理後取其血液上清液以進行酵素免疫分析，測驗血液中對抗內生性蛋白抗體的カ價。含豐年蝦飼料的製作將已經濾食或未濾食的ニ齡豐年蝦的水分儘量去除，利用冷凍乾燥機將其凍幹成粉末，豐年蝦粉末與一般粉碎飼料以i : 1000比例進行混合再重新制粒。飼料製作將菌液濃縮，利用冷凍乾燥機將其凍幹成粉末，菌粉與一般粉碎飼料進行混合，混核比例為Ig飼料混3. 3 X IO9Cfu大腸桿菌粉，再重新制粒。結果豐年蝦組首先抽取石斑魚血液，分離出血清之後利用酵素免疫分析法，檢測餵飼含有肌肉抑制素抗原性片段的重組融合蛋白後，各時期的石斑魚血清對於抗重組石斑魚肌肉倍增蛋白質C端抗原活性區域的抗體效價。抗體效價於免疫後第十周開始被偵測到，持續上升至第十六周，其中PEIa-抗原性片段組的抗體效價較三組對照組餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料為高，抗體效價達到大約920。(如圖3)計算四個月的動物實驗期間的總飼料消耗量以及飼料轉換率，統計發現PEIa-抗原性片段組與其它三組對照組於四個月內消耗總飼料量大約相等，PEIa-抗原性片段組平均飼料轉換率為I. 35，餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料分別為I. 72,1. 76以及I. 82，即餵飼肌肉倍增蛋白質抗原性片段的實驗組，在上市前的養成過程可花費較少的飼料得到肉質較豐腴的石斑魚(如表2所示)。表2:
權利要求
1.一種脊椎動物用飼料組合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體。
2.根據權利要求I的飼料組合物，其中該脊椎動物為魚。
3.根據權利要求I的飼料組合物，進一步包含肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質的片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段的抗體。
4.根據權利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體、肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質的片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段的抗體生物包埋於豐年蝦體中。
5.根據權利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體、肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質的片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段的抗體表達於微生物中。
6.根據權利要求5的飼料組合物，其中該微生物為大腸桿菌。
7.根據權利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白質的片段融合至綠膿桿菌外毒素區域la。
8.根據權利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白質的片段為抗原性片段。
9.根據權利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白質的片段位於融合蛋白上。
10.根據權利要求I或3的飼料組合物，其中該富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白質的片段線性重複排列於該融合蛋白中。
全文摘要
本發明提供一種脊椎動物用飼料組合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗體。
文檔編號A23K1/18GK102793079SQ20111040805
公開日2012年11月28日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年5月27日
發明者陳宗嶽, 黃意菱 申請人:陳宗嶽