鴨A型肝炎病毒檢測與基因a型和c型鑑別的多重螢光定量pcr方法及試劑盒的製作方法

2023-10-18 07:19:49 2

鴨A型肝炎病毒檢測與基因a型和c型鑑別的多重螢光定量pcr方法及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鴨A型肝炎病毒檢測與基因A型和C型鑑別的多重螢光定量PCR方法及試劑盒，屬於生物檢測【技術領域】。本發明針對於DHAV3D區域設計一對保守擴增引物（SEQIDNO:1和2）和一條保守探針（SEQIDNO:5），用於檢測不同基因型的鴨A型肝炎病毒；針對於DHAV5』UTR設計一對特異性引物（SEQIDNO:3和4）和兩條特異性探針（SEQIDNO:6和7），用於鑑別檢測DHAV-A和DHAV-C。本發明具有良好的特異性、重複性和敏感性，操作方便、簡單、快速，可用於科研及臨床中DHAV的感染以及DHAV-A和DHAV-C鑑別診斷，也可用於DHAV病原流行病學調查。
【專利說明】鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的多重螢光定 量PCR方法及試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物檢測【技術領域】，涉及一種鴨A型肝炎病毒檢測與基因A型鴨甲型 肝炎病毒和基因C型鴨A型肝炎病毒鑑別的多重螢光定量PCR方法及試劑盒。

【背景技術】
[0002] 鴨病毒性肝炎是危害養鴨業的一種重要傳染病，其主要致病因子是小RNA病毒科 禽肝病毒屬的鴨A型肝炎病毒（duck h印atitis A virus, DHAV)。根據全基因組序列分析， 鴨A型肝炎病毒又可分為3個獨立的基因型，基因A型鴨A型肝炎病毒（DHAV-A)、基因 B型 鴨A型肝炎病毒（DHAV-B)和基因 C型鴨A型肝炎病毒（DHAV-C);根據血清學中和試驗，這 3個基因型，由於並無血清交叉，故分別對應3個不同的血清型，血清1型鴨A型肝炎病毒 (DHAV-1)、血清2型鴨A型肝炎病毒（DHAV-2)、血清3型鴨A型肝炎病毒（DHAV- 3)。DHAV-A 代表傳統的流行毒株，全球範圍內廣泛流行，也是我國鴨肝炎病毒的主要流行毒株。DHAV-B 代表臺灣新型病毒株，DHAV-C代表近年來我國和韓國等國家和地區新出現的流行毒株。該 3個基因型病毒所引起的疾病在臨床症狀、病理變化上較為相似，給鑑別診斷帶來很大的困 難。特別是DHAV-C在我國諸多地區的暴發和流行，由於目前還沒有開發出相關的DHAV-C 疫苗和抗體投入到實際生產中，所以對於DHAV-C的快速準確檢測對於鴨病毒性肝炎的預 防與控制具有重要意義。
[0003] 關於DHAV的分子快速檢測方法，目前國內外報導較多的主要是針對DHAV-A進行 檢測，對DHAV-C以及與DHAV-A進行鑑別檢測方法並不多見，尤其是實時螢光定量PCR方 法鑑別檢測DHAV-C與DHAV-A鮮有報導。實時螢光定量PCR技術憑藉其操作簡便、結果直 觀、敏感性高、特異性強、重複性好及病原定量等優勢，近年來在動物疫病檢測中得以廣泛 應用。因此建立該多重螢光定量PCR方法，不僅為確定鴨病毒性肝炎致病因素提供了一種 鑑別檢測方法，同時也為DHAV-A與DHAV-C的流行病學調查提供了一種重要技術手段。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的在於提供一種鴨A型肝炎病毒檢測與基因A型和C型鑑別的多重熒 光定量PCR方法，該方法利用TaqMan探針技術，不僅能夠實現DHAV的快速檢測，還能夠快 速準確對DHAV-A和DHAV-C的核酸進行定量檢測。
[000S]本發明的目的還在於提供一種鴨A型肝炎病毒檢測與基因A型和C型鑑別的試劑 盒。
[0006]本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0007]、&一種鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的多重螢光定量PCR方法，包括 樣品核酸的提取、cDNA模板的製備和多重螢光定量PCR擴增步驟，所述的多重螢光定量PCR 擴增步驟中採用了以下引物：
[0008] DHAV PF ：5, -AGGYATTGAGGCWTGYAA-3J (SEQ ID N0:1),
[0009] DHAV PR：5, -GAGGTTYGCYAACARATTG-3J (SEQ ID NO:2)；
[0010] DHAV-A-C PF：5, -GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3, (SEQ ID NO:3),
[0011] DHAV-A-C PR：5, -CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3, (SEQ ID NO:4)；
[0012] 所述的多重螢光定量PCR擴增步驟還採用了如下螢光標記的探針：
[0013] DHAV 螢光探針 PB0 :5' -R0X-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3,（SEQ ID N0:5),
[0014] DHAV-A 螢光探針 PB1 :5, -J0E-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3，（SEQ ID NO:6),
[0015] DHAV-C 螢光探針 PB3 :5' -FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3,（SEQ ID NO:7)；
[0016] 其中，DHAV PF、DHAV PR和DHAV螢光探針PBO為針對於DHAV3D區域設計的一 對保守擴增引物和一條保守探針，用於檢測不同基因型的鴨A型肝炎病毒；DHAV-A-C PF、 DHAV-A-C PR和DHAV-A螢光探針PB1、DHAV-C螢光探針PB3為針對於DHAV 5' UTR設計的 一對特異性引物和兩條特異性探針，用於鑑別檢測DHAV-A和DHAV-C。
[0017] 上述引物與探針序列中，W代表鹼基A或Τ, Y代表鹼基C或T, R代表鹼基A或G。
[0018] 所述的cDNA模板的製備的反應體系和反應條件優選如下：
[0019] 反應體系：RNA5.0yL,隨機引物（20μΜ)、Oligod⑴（2〇μΜ)各 0.5yL, dNTPs(10_0uM)l_0uL，Rnase Inhibitor0.5yL,反轉錄酶 M-MLV(TAKARA)0.5yL, 5XM-MLV Buffer2. 0μ L〇
[0020] 反應條件：42°C保溫lh，70°C作用10min。
[0021] 所述的多重螢光定量PCR擴增的的反應體系和反應條件優選如下：
[0022] 反應體系：2 X QuantiFast Multiplex PCR Master Mix (Qiagen) 12· 5 μ L，2 對引 物混合液3· 0 μ L (各10 μ Μ)，混合螢光探針2. 0 μ L (DHAV-C螢光探針PB30. 5 μ L、DHAV-A熒 光探針PB11. 0 μ L、DHAV螢光探針PB01. 5 μ L)，cDNA檢測模板為5. 0 μ L，餘下補足DEPC-H20 至50 μ L體系。
[0023] 反應條件：92°C預變性2min，進行循環階段，94°C變性10s，60°C退火30s，退火過 程中收集螢光，40個循環。
[0024] 一種鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的試劑盒，包含檢測DHAV通用引 物、DHAV-A與DHAV-C檢測引物及TaqMan螢光探針。
[0025] 所述的檢測DHAV通用引物為：
[0026] DHAV PF :5' -AGG；IATTGAGGClTG；IAA-3,（SEQ ID N0:1)，
[0027] DHAV PR：5, -GAGGTTYGCYAACARATTG-3J (SEQ ID NO:2)；
[0028] 所述的DHAV-A與DHAV-C檢測引物為：
[0029] DHAV-A-C PF :5' -GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3'（SEQ ID NO:3)，
[0030] DHAV-A-C PR :5' -CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3,（SEQ ID NO:4);
[0031] 所述的TaqMan螢光探針為：
[0032] DHAV 螢光探針 ΡΒ0 :5, -R0X-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3,（SEQ ID N0:5)，
[0033] DHAV-A 螢光探針 PB1 :5, -JOE-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3'（SEQ ID NO:6)，
[0034] DHAV-C 螢光探針 PB3 :5, -FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3'（SEQ ID NO:7)〇
[0035]所述的試劑盒還包含陽性標準品，陽性標準品優選通過包括如下步驟的方法製備 得到：以DHAV基因組腿為模板，反轉錄後用檢測DHAV通用引物進行PCR擴增，以擴增產 物為模板用T 7RNA聚合酶進行體外轉錄得到cRNA，即是陽性標準品。
[0036]所述的試劑盒還包含反轉錄試劑和螢光定量PCR試劑。
[0037]本發明可用於科研及臨床中DHAV的感染以及DHAV-A和DHAV-C鑑別診斷，也可用 於DHAV病原流行病學調查。
[0038] 本發明的優點：
[0039] (1)本發明使用兩對特異性引物和三條高特異性的TaqMan螢光探針，減少了多對 引物之間的幹擾，具有很高的準確性，特異性良好，假陽性率極低。
[00401 (2)本發明可檢測低至72c0pieS的核酸量，說明檢測靈敏度較高。
[0041] ⑶本發明對其他病毒，鴨瘟疫苗毒（DPV CVCC AV1222株）、新城疫疫苗毒（NDV HB1株）、禽流感疫苗毒（AIV H9)、禽呼腸孤病毒（ARV)、傳染性支氣管炎疫苗毒（IBV H120 株）的檢測結果皆為陰性，具有良好的特異性。
[0042] (4)本發明在一次反應中，不僅可檢測出是否是DHAV，以及對病毒含量進行定量 分析，而且還可同時鑑別出DHAV-A和DHAV-C，本發明操作方便、快捷，對臨床樣本中鴨肝炎 病毒鑑別診斷具有重要價值。
[0043] ⑶整個擴增和檢測過程均在同一個封閉管內進行，有效避免了氣溶膠汙染而造 成的假陽性。操作簡單、自動化，與常規PCR方法相比，大大提高了檢測時間和效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖1是本發明對DHAV進行定量標準曲線的繪製，擴增效率為99. 〇%，標準曲線相 關係數r2 = 1.0,表明誤差小，可信度高。
[0045]圖2是本發明敏感性試驗結果，1-5分別是7· 2X103、7. 2X102、7. 2X10、7. 2、 7· 2Χ10、ορ?^/μ L的標準品的擴散曲線，根據擴散曲線可以看出最低檢測靈敏度為72 拷貝RNA量。
[0046] 圖3是本發明對基因 A型DHAV檢測特異性試驗結果，曲線1為DHAV通用探針擴增 曲線，曲線2為DHAV-A特異性探針擴增曲線，曲線3為其他病毒（DPV、NDV、AIV、ARV、IBV) 及陰性對照擴增曲線。
[0047] 圖4是本發明對基因 C型DHAV檢測特異性試驗結果，曲線1為DHAV通用探針擴增 曲線，曲線2為DHAV-C特異性探針擴增曲線，曲線3為其他病毒（DPV、NDV、AIV、ARV、IBV) 及陰性對照擴增曲線。
[0048] 圖5是本發明對基因 C型和A型DHAV混合樣本檢測特異性試驗結果，曲線i為 DHAV通用探針擴增曲線，曲線2為DHAV-A擴增曲線，曲線3為DHAV-C擴增曲線，曲線4為 其他病毒（DPV、NDV、AIV、ARV、IBV)及陰性對照擴增曲線。

【具體實施方式】
[0049] 以下實施例用於進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。若未特別指 明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0050] 實施例1鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的多重螢光定量PCR方法的 建立
[0051] (1)引物探針設計
[0052] 從GenBank資料庫下載所有目前已知的不同基因型DHAV全基因組序列，利用 BioEdit軟體進行同源性排序分析比較，確定在DHAV3D區域作為檢測DHAV通用引物與探 針的設計區域；分別選擇DHAV-A與DHAV-C的5'UTR序列中保守區，作為DHAV-A與DHAV-C 檢測引物與探針的設計區域，最後利用Beacon Designer?· 0生物軟體對以上區域設計出符 合螢光定量PCR要求的多組引物與探針，先進行BLAST理論分析其特異性，然後進一步通過 實驗篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針。其中引物、探針序 列如下：
[0053] DHAV PF：5, -AGGYATTGAGGCWTGYAA-3^ (SEQ ID N0:1),
[0054] DHAV PR：5, -GAGGTTYGCYAACARATTG-3^ (SEQ ID NO:2)；
[0055] DHAV-A-C PF :5' -GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3'（SEQ ID N0:3)，
[0056] DHAV-A-C PR:5' -CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3'（SEQ ID N0:4);
[0057] DHAV 螢光探針 PBO :5' -R0X-AATTCCMCAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3'（SEQ ID N0:5)，
[0058] DHAV-A 螢光探針 PB1 :5' -JOE-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3'（SEQ ID NO:6),
[0059] DHAV-C 螢光探針 PB3 :5, -FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3,（SEQ ID NO:7)〇
[0060] 上述引物與探針序列中，w代表鹼基A或T，Y代表鹼基C或T，R代表鹼基A或G。
[0061] 其中，引物對DHAV PF、DHAV PR和DHAV螢光探針ΡΒ0針對於DHAV3D區域設計，用 於檢測不同基因型的鴨A型肝炎病毒；引物對DHAV-A-C PF、DHAV-A-C PR和DHAV-A螢光探 針PB1、DHAV-C螢光探針PB3針對於DHAV5 ' UTR設計，用於鑑別檢測DHAV-A和DHAV-C。 [0062] (2)病毒核酸RNA的提取
[0063] 1)分離培養的病毒：將雞胚或鴨胚培養得到的胚尿囊液，加入5倍體積Trizol 液，充分混勻；室溫放置5分鐘，然後以每lmL Trizol液加入0. 2mL的比例加入氯仿，蓋緊 離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；取上層水相於一新的離心管，按每lmL Trizol液加 0· 5mL異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置1〇分鐘，I2000g離心10分鐘；棄去上清液，按每 lmL Trizol液加入至少lmL的比例加入75%乙醇，混勻，4°C下7500g離心5分鐘；小心棄 去上清液，然後室溫乾燥5-10分鐘，注意不要乾燥過分，否則會降低RNA的溶解度；然後將 RNA溶於水中，放置10分鐘。
[0064] 2)組織病料：將採集的肝組織約50?lOOtng於研磨罐中，在液氮中研磨組織成細 粉後，加入Trizol試劑2mL，充分勻漿，室溫放置1〇分鐘。吸入到1. 5mL離心管中，12000rpm 離心10min，取上清。加入氯仿0· 2mL，劇烈震蕩15s，4°C放置10min, 12000rpm離心15min， 取上清。氯仿的主要作用是將酚從溶液中萃取出來。離心後溶液分為三相，即上層的水相， 下層的有機相以及中間的變性蛋白，小心吸取上層水相，絕不能有中層蛋白混入。加入異丙 醇0· 5mL，震蕩混勻，4°C放置10min，12000rpm離心lOmin，棄上清。加入50%的異丙醇可以 導致核酸沉澱，lmL75%乙醇洗滌沉澱，並 8〇〇〇rpm離心5min (若管壁仍有殘留液體，繼續離 心，吸取殘留液體）。乙醇洗滌的目的是去除沉澱中殘留的鹽分。沉澱空氣乾燥5min，溶解 -----------〇/ 丄丄 於 5〇 μ L DEPC-H20, _7〇°C保存備用。
[0065] (3) cDNA模板的製備
[0066]取上述製備的腿5· 0 μ L，加入pCR反應管中，再分別加隨機引物（2〇 μ M)、〇lig〇 d ⑴（20 μ Μ)各 0· 5 μ L, dNTPs (1〇· 〇 μ M) L 〇 μ L，Rnase Inhibit〇r〇. 5 μ L，反轉錄酶 M-MLV (TAKARA) 0. 5 u U 5 XM-MLV Buffer2· 〇 μ L。將反應混合物混合均勻後，瞬離。反應條 件為42C保溫lh，7〇C作用lOmin，滅活反轉錄酶，將製備的反轉錄模板於4。〇保存備用。
[0067] (4)多重螢光定量PCR反應
[0068] 螢光定量PCR的反應體系為（總反應體系為50 μ L) :2XQUantiFast Multiplex PCR Master Mi^Qiagen) 12. 5 μ L，4 條引物混合液 2· 0 μ L(1〇 μ M)，混合螢光探針 3. Ο μ L(DHAV_C 滅光探針 PB3 0· 5 μ L、DHAV-A 焚光探針 PB1 1· Ο μ L、DHAV 螢光探針 PBO 1.5μ^)，（Λ=檢測模板為4^L，餘下補足兕兕―1!2〇至5〇1^體系。反應在 ABI St^〇ne Plus 滅光定量 PCR 儀上進行，第一步：92f, 2min，lcycle ;第二步：94t：, 10s, 6(TC，30s (收 集螢光信號），40cycles。
[0069] (5)結果判定
[0070]結果分析條件設定：點擊分析界面，取3?10或3?15個循環的螢光信號確定基 線（baseLine)。閾值（threshold)設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品及陰性樣 本的擴增曲線（無規則的噪音線）的最高點，不出現Ct值並且與陽性對照的指數期相交為 準。
[0071]結果判定：檢測樣本Ct值< 35. 0,且曲線有明顯的指數增長期，測定結果有效，可 直接報告樣本陽性；檢測樣本35. 0 < Ct值< 38. 0時，需重複一次，如果Ct值仍小於38. 0， 且曲線有明顯的指數増長期，可報告樣本陽性，否則報告樣本陰性；檢測不到樣本Ct值或 Ct值彡38.0,報告樣本陰性。
[0072] (6)陽性標準品的構建
[0073]陽性標準品的構建有兩個目的，一是加入反應體系中，檢驗擴增體系是否有效，二 是用於模板中鴨A型肝炎病毒拷貝數準確定量。故以DHAV-C基因組RNA為模板，按照上述 方法進行反轉錄，用鴨A型肝炎病毒檢測通用引物DHAV PF/PR按常規方法進行PCR擴增， 將擴增的產物回收、純化，連接到pEASY-Tl載體上，轉化，提取質粒DNA，進行酶切線性化， 膠回收純化後，然後對純化產物用T7RNA聚合酶進行體外轉錄，合成 CRNA，將合成產物進行 DNA消化以及酚/氯仿/異戊醇純化後，再用分光光度計測濃度，按照公式，計算出拷貝數。 用構建的標準品10倍系列稀釋，建立標準曲線，用以對待檢樣本進行定量。
[0074] (7)待檢樣本的定量
[0075] 通過比較待檢樣本和標準品的閾值循環數對待檢標本的起始拷貝數進行定量。
[0076] 本發明的引物與探針特徵表現：本反應體系共設計了兩個引物組對，分別針對鴨 A型肝炎病毒基因組的兩個區域，非結構蛋白3D和5' UTR序列保守區，所以對於任何基因 型鴨A型肝炎病毒，這兩對引物均可以擴增出靶基因片段。另外還設計了不同螢光標記的 TaqMan探針，其中DHAV螢光探針PB0序列位於3D區，高度保守，對於不同基因型鴨肝炎病 毒均可以識別；DHAV-A螢光探針PB1和DHAV-C螢光探針PB3位於5'UTR序列保守區，分別 識別A型和C型鴨A型肝炎病毒。因此要對檢測體系中的鴨A型肝炎病毒進行定量，只需 設置一種類型的標準品，即位於3D區的靶基因片段。
[0077] 因此，在實際定量檢測中，將已知拷貝數的標準品，進行10倍梯度稀釋，與待檢測 樣品進行同步檢測，根據標準品繪製的標準曲線方程，就可以推算出待檢樣品中鴨甲型肝 炎病毒的相對拷貝數。對DHAV進行定量標準曲線的繪製，擴增效率為99. 0%，標準曲線相 關係數R2 = 1，表明誤差小，可信度高（圖1)。
[0078] (8)敏感性檢測
[0079] 將已建立的標準品（7_2乂108(：叩1的/4 1)，進行10倍梯度稀釋，選擇7.2\103、 7· 2X l〇2、7. 2X 10、7. 2、7. 2X 10-Yopies/p L 的標準品進行檢測，其 Ct 值分別為 33. 71、 34. 58、36· 62、38· 45、39. 23,陰性水對照無 Ct值。根據擴增曲線可得出，本方法最低可檢測 到72拷貝數的目標RNA量（圖2)。
[0080] (9)特異性檢驗
[0081] 分別提取DHAV-A雞胚尿囊液病毒、DHAV-C鴨胚尿囊液病毒及DHAV-A雞胚尿囊液 和DHAV-C鴨胚尿囊液混合物，以及其他病毒（NDV、AIV、ARV、IBV)的RNA，進行逆轉錄，制 備cDNA模板，另外提取DPV的核酸DNA,以建立的多重螢光PCR方法進行獲得的cDNA模板 和DNA進行檢測。檢測結果為，對DHAV-A進行檢測，僅DHAV通用探針（曲線1)和DHAV-A 特異性探針（曲線2)呈現明顯的擴增曲線，其他病毒及陰性對照無擴增曲線（曲線3)(圖 3);對DHAV-C進行檢測，僅DHAV通用探針（曲線1)和DHAV-C特異性探針（曲線2)呈現 明顯的擴增曲線，其他病毒及陰性對照無擴增曲線（曲線3)(圖4);對DHAV-A和DHAV-C的 混合樣本進行檢測，DHAV通用探針（曲線1)和DHAV-A(曲線2)、DHAV-C特異性探針（曲 線3)均呈現出明顯的擴增曲線，其他病毒及陰性對照無擴增曲線（曲線4)(圖5)。結果表 明，該方法可鑑別檢測DHAV-A與DHAV-C，與其他病毒DPV、NDV、AIV、ARV、IBV無交叉反應。 [0082] 基於上述構建的方法，本發明還提供了一種鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C 型鑑別的試劑盒，該試劑盒包含檢測DHAV通用引物、DHAV-A與DHAV-C檢測引物及TaqMan 螢光探針。
[0083] 其中，檢測DHAV通用引物為：
[0084] DHAV PF：5, -AGGYATTGAGGCWTGYAA-3, (SEQ ID N0:1),
[0085] DHAV PR：5, -GAGGTTYGCYAACARATTG-3J (SEQ ID NO:2)；
[0086] DHAV-A 與 DHAV-C 檢測引物為：
[0087] DHAV-A-C PF :5' -GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3,（SEQ ID N0:3)，
[0088] DHAV-A-C PR :5' -CCTCAGGMCTAGTCTGGA-3,（SEQ ID N0:4);
[0089] TaqMan突光探針為：
[0090] DHAV 螢光探針 PBO :5'-R〇X-MTTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3,（SEQ ID N0:5)，
[0091] DHAV-A 螢光探針 PB1 :5, -J0E-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3,（SEQ ID NO:6)，
[0092] DHAV-C 螢光探針 PB3 :5,-FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3,（SEQ ID NO:7)〇
[0093]該試劑盒還包含陽性標準品，陽性標準品優選通過包括如下步驟的方法製備得 至IJ :以DHAV基因組RNA為彳吳板，反轉錄後用檢測DHAV通用引物進行PCR擴增，以擴增產物 為模板用T7RNA聚合酶進行體外轉錄得到 cRNA即是陽性標準品。
[0094]該試劑盒還包含反轉錄試劑和螢光定量PCR試劑。
[0095] 實施例2檢測基因 A型鴨A肝病毒感染
[0096] (1)檢測樣本
[0097]所選擇的檢測樣品有A型鴨A肝病毒感染病死鴨肝組織（S1)，健康鴨肝組織 (S2)，A型鴨A肝病毒雞胚組織毒（S3)、健康雞胚組織（S4)，A型鴨A肝病毒雞胚致弱尿囊 液病毒（S5)，陽性標準品（P)。
[0098] ⑵病毒RNA的提取
[00"]病毒RNA的提取方法參照上述方法，對於組織病毒均採用液氮法研磨，以防止研 磨過程中產生的熱量，造成病毒RNA的降解。研磨後的組織勻漿液核酸提取方法同雞胚尿 囊液病毒，均為傳統Trizol法提取 RNA。
[0100] ⑶反轉錄及多重螢光定量PCR檢測
[0101] 先將隨機引物（20μΜ)、Oligod(T) (20μΜ)各 0· 5μ L, dNTPs(2. 5μΜ)4· Ομ L， Rnase InhibitorO. 5μ L，反轉錄酶 M-MLV(TAKARA)0· 5μ L，5XM-MLV Buffer2. Ομ L,根據 檢測樣本的數量配成大體系，然後再平均分裝到〇· 5mL PCR反應管中，再依次加入上述製備 的RNA4.0uL，將反應混合物混合均勻後，瞬離。反應條件為 42?C保溫^，了代作用⑴^， 滅活反轉錄酶，將製備的反轉錄模板於4-C保存備用。此操作過程既可在PCR儀上操作，也 可在普通水浴鍋上進行。
[0102] 反轉錄結束後，進行多重螢光定量PCR檢測，操作方法為：根據單反應體系 (2XQuantiFast Multiplex PCR Master 1^叉你3區611)12_5 4 1^混合引物2 4 1^(1〇4]^)，混 合天光探針3 μ L (DHAV-C焚光探針PB3 0· 5 μ L、DHAV-A焚光探針PB1 1. 0 μ L、DHAV焚光 探針ΡΒ0 1_ 5 μ L))以及檢測樣本的數量，配製大體系，然後再平均分配到螢光PCR檢測專 用管中，再依次加入4_0yL cDNA模板。反應條件為：第一步：92。(：，21^11，1(^(^1{5;第二步： 94°C，lOsec，6(TC，30sec (收集螢光信號），40cycles。
[0103] (4)檢測結果
[01 04]結果表明，樣本s 1、S3、S5和陽性標準品，均可檢測到明顯的ct值，動力學擴增曲 線良好；而陰性對照、樣本S2、S4未檢測到Ct值，說明本方法可實現對a型鴨A肝病毒組織 和尿囊病毒有效檢測（表1)。
[0105] 表 1
[0106]

【權利要求】
1. 一種鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的多重螢光定量PCR方法，包括樣 品核酸的提取、cDNA模板的製備和多重螢光定量PCR擴增步驟，其特徵在於：所述的多重熒 光定量PCR擴增步驟中採用了以下引物： DHAV PF ：5, -AGGYATTGAGGCWTGYAA-3,, DHAV PR：5, -GAGGTTYGCYAACARATTG-3,； DHAV-A-C PF :5' -GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3'， DHAV-A-C PR:5' -CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3'。
2. 根據權利要求1所述的鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的多重螢光定量 PCR方法，其特徵在於：所述的多重螢光定量PCR擴增步驟採用了如下螢光標記的探針： DHAV 螢光探針 PBO :5' -R0X-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3'， DHAV-A 螢光探針 PB1 :5' -J0E-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3'， DHAV-C 螢光探針 PB3 :5' -FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3'。
3. 根據權利要求1所述的鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的多重螢光定量 PCR方法，其特徵在於：所述的cDNA模板的製備的反應體系和反應條件如下： 反應體系：RNA 5· Ο μ L，隨機引物、Oligod(T)各 0· 5 μ L，dNTPs 1. Ο μ L，Rnase Inhibitor 0.5yL，反轉錄酶 M-MLV 0.5yL，5 XM-MLV Buffer 2.0yL; 反應條件：42°C保溫lh，70°C作用lOmin。
4. 根據權利要求1所述的鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的多重螢光定量 PCR方法，其特徵在於：所述的多重螢光定量PCR擴增的的反應體系和反應條件如下： 反應體系：2XQuantiFast Multiplex PCR Master Mix 12.5以1^，權利要求1中的2對 引物混合液3. 0 μ L，DHAV-C螢光探針PB3 0. 5 μ L、DHAV-A螢光探針PB1 1. 0 μ L、DHAV熒 光探針PBO 1. 5 μ L，cDNA檢測模板為5. 0 μ L，餘下補足DEPC-H20至50 μ L體系； 反應條件：92°C預變性2min，進行循環階段，94°C變性10s，6(TC退火30s，退火過程中 收集螢光，40個循環。
5. -種鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的試劑盒，其特徵在於：包含檢測 DHAV通用引物、DHAV-A與DHAV-C檢測引物及TaqMan螢光探針； 所述的檢測DHAV通用引物為： DHAV PF ：5, -AGGYATTGAGGCWTGYAA-3,, DHAV PR：5, -GAGGTTYGCYAACARATTG-3,； 所述的DHAV-A與DHAV-C檢測引物為： DHAV-A-C PF :5' -GTGCTGAAATATTGCAAGCC-3'， DHAV-A-C PR :5' -CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3' ； 所述的TaqMan突光探針為： DHAV 螢光探針 PBO :5' -R0X-AATTCCAACAGCACAGCCWGAY-BHQ1-3'， DHAV-A 螢光探針 PB1 :5' -J0E-ACACYCACCTAYAACCTTGGTAGTC-BHQ2-3'， DHAV-C 螢光探針 PB3 :5' -FAM-TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC-BHQ2-3'。
6. 根據權利要求5所述的鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的試劑盒，其特 徵在於：包含陽性標準品。
7. 根據權利要求6所述的鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的試劑盒，其 特徵在於：所述的陽性標準品通過包括如下步驟的方法製備得到：以DHAV基因組RNA為模 板，反轉錄後用檢測DHAV通用引物進行PCR擴增，以擴增產物為模板用T7 RNA聚合酶進行 體外轉錄得到cRNA即是陽性標準品。
8. 根據權利要求5所述的鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的試劑盒，其特 徵在於：包含反轉錄試劑。
9. 根據權利要求5所述的鴨A型肝炎病毒檢測與基因 A型和C型鑑別的試劑盒，其特 徵在於：包含突光定量PCR試劑。
【文檔編號】C12R1/93GK104232798SQ201410510691
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】孫慶歌, 薛霜, 賴 志, 肖愛芳, 馬慧慧, 朱薇, 廖園園, 祝春花, 漆世華, 謝紅玲, 馮釗 申請人:武漢中博生物股份有限公司