一種抗口腔致齲菌的多肽Pm4及製備方法
2023-10-23 00:30:17 1
專利名稱：一種抗口腔致齲菌的多肽Pm4及製備方法
技術領域：
本發明屬於醫藥生物技術領域，涉及Fmoc化學合成多肽，即一種抗口腔致齲菌的多肽Pm4及製備方法，該多肽具有抗口腔致齲菌能力，尤其是鏈球菌屬的細菌。
背景技術：
雖然投入了大量的人力、物力，齲病(dental caries)仍然是世界性非傳染性的三大疾病之一。齲病是在口腔內外環境中多種因素影響下，牙齒硬組織發生的一種慢性進行性破壞的細菌感染性疾病。變異鏈球菌和遠緣鏈球菌是主要的致齲菌。1946年，McClure 和Hewitt證實青黴素可以抑制大鼠齲病的發生，主要機理是抑制細菌細胞壁合成、抑制或幹擾細菌的核酸和蛋白質的代謝與合成途徑來達到抗菌的目的。然而這些傳統抗生素容易誘使細菌發生突變而產生抗菌素的耐藥性。因此，國內外學者一直致力於開發新型的抗菌素，而多肽是一段具有抗菌活性的短的胺基酸。魚類具有強有力的天然免疫系統，從而能夠應對大量的病原微生物。我們在之前已經證明了 α 螺旋線性陽離子多肽 Pleurocidin (GWGSFi7KKAAHVGKHVGKAALTHYL-NH2)具有抗致齲菌、真菌的能力，並對變異鏈球菌生物膜有一定的抑制作用。但是pleurocidin的長度為25個胺基酸，過長的胺基酸提高了合成成本和對細菌生物膜的滲透能力，因此開發出新的短肽就更為必要。
發明內容
本發明的目的在於提供一種抗口腔致齲菌的多肽Pm4及製備方法，以克服天然抗菌肽長度過長，合成成本相對較高的問題。本發明採用的技術方案是一種抗口腔致齲菌的多肽Pm4，其製備方法是通過對天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，對口腔常見致齲菌有一定的抗菌、殺菌能力，在確定活性中心的基礎上，對其進行胺基酸的刪除和替換形成新型的具有殺菌能力的抗菌多肽；所述新型抗菌多肽Pm4，序列為GWGKFFKKFFKVGK。其製備方法中所述口腔常見致齲菌為變異鏈球菌。其製備方法中所述口腔常見致齲菌為遠緣鏈球菌。其製備方法中所述口腔常見致齲菌為血鏈球菌。多肽使細菌細胞膜表面失去原有性狀，變得粗糙甚至有出現孔隙，通過在細菌表面形成離子通道，引起細菌內容物的流出，從而導致了細菌的死亡。抗口腔致齲菌的多肽Riil製備方法是，其特徵在於通過保持、改進α螺旋特性， 對天然多肽pleurocidin活性中心胺基酸進行刪除和替換，通過直接化學Fmoc合成的方法，構建有抗菌能力的多肽。本發明的特點是發現併合成了新型的抗菌短肽。該多肽通過在細菌表面形成離子通道的原理來引起細菌的崩解、死亡。提高了合成成本和利用效率，從而更好的用於齲病的預防和治療。本發明通過對天然多肽pleurocidin活性中心的刪除和替換，構成了新的抗菌多肽。該多肽對口腔中的變異鏈球菌、血鏈球菌、遠緣鏈球菌都有一定的抗菌能力。多肽對細菌的最小抑菌濃度範圍為8-32Pg/ml，最小殺菌濃度範圍為8-64Pg/ml之間。多肽比天然多肽的長度更小，而抑菌、抗菌能力相當。本發明的多肽的抗菌原理為多肽使細菌表面失去原有性狀，變得粗糙甚至有出現孔隙；在細菌表面形成離子通道，引起細菌內容物的流出，從而導致了細菌的崩解、死亡；從而具有抗口腔致齲菌的能力。
以下結合附圖和實施例對本發明做進一步的詳細描述
圖1是本發明中的多肽Riill和RI114的α螺線結構軟體推測圖； 圖2是多肽處理細菌的電鏡照片； 圖3是多肽處理2個小時的結果； 圖4是多肽處理2個小時的結果。
具體實施例方式一種抗口腔致齲菌的多肽Pm4，其製備方法是通過對天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，對口腔常見致齲菌有一定的抗菌、殺菌能力，在確定活性中心的基礎上， 對其進行胺基酸的刪除和替換形成新型的具有殺菌能力的抗菌多肽；所述新型抗菌多肽 Pm4，序列為 GWGKFi7KKFi7KVGK15其製備方法中所述口腔常見致齲菌為變異鏈球菌。其製備方法中所述口腔常見致齲菌為遠緣鏈球菌。其製備方法中所述口腔常見致齲菌為血鏈球菌。多肽使細菌細胞膜表面失去原有性狀，變得粗糙甚至有出現孔隙，通過在細菌表面形成離子通道，引起細菌內容物的流出，從而導致了細菌的死亡。抗口腔致齲菌的多肽製備方法是，其特徵在於通過保持、改進α螺旋特性，對天然多肽pleurocidin活性中心胺基酸進行刪除和替換，通過直接化學Fmoc合成的方法，構建有抗菌能力的多肽。實施例
圖1是多肽Riill和RI114的α螺線結構軟體推測圖。圖2是多肽處理細菌的電鏡照片。Α，正常變異鏈球菌；B，Riill處理過後的變異鏈球菌；C，Pml4處理過後的變異鏈球菌；D，正常血鏈球菌；E，Pmll處理過後的變異鏈球菌； F，Riil4處理過後的變異鏈球菌。可以看見多肽處理過後的細菌表面發生變化，出現多孔狀或是細菌崩解，皺縮的現象。1.多肽的設計合成 1. 1多肽的設計
多肽採用截取pleurocidin活性中心的方法，刪除、替換胺基酸的方法設計。設計後多肽的物理性質如表1。α螺線結構的參數見表1，示意圖見圖2。表 ιPml Pm4_ GWGRFFKKWWRVGKRVGK GWGKFFKKFFKVGK縣性 0 321 0406疏水!§,H> Oj 56 0 744淨電荷ζ 7 5PmSOWGKFFKKFFKFSK0.4460.7555PmllMFKFFKKFFKKWK0 578CL95S6PmMPKFPKKrFKKW0 5680.9335 1. 2 Fmoc方法合成多肽。常規Fmoc固相合成方法合成多肽。該合成方法已經較為成熟，產品質量可靠，合成產物經過HPLC純化。多肽純度均需要大於>90%。2.多肽體外抗口腔主要致齲菌活性測試 2. 1細菌菌株和培養條件
菌株變異鏈球 lif {Streptococcus mutans) UA 159 ；血鏈球 lif {Streptococcus sanguinis) ATCC 10556 ；遠緣鏈球菌(份re^iococc^s sobrinus) ACTT 6715(購自四川大學華西口腔醫院中心實驗室)。培養條件37度恆溫，BHI培養基中厭氧培養。2. 2最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定
根據美國CLSI標準，使用兩倍稀釋法來進行MIC和MBC的檢測。細菌在BHI培養基中過夜培養後，稀釋到IO6 CFU/ml備用。多肽使用兩倍稀釋法稀釋後放入200μ 7孔的96孔板中。加入備用的菌液，挑戰多肽最終濃度為0. 125 μδ/πι1到256 Pg/ml。三蒸水作為陰性對照加入其他孔中。整個96孔板放入37° C厭氧恆溫箱中靜止培養16至M小時。直接觀察培養基的渾濁度和用分光光度計(600nm)來確定MIC值。在澄清的孔中取出ΙΟΟμΙ 細菌培養液，鋪板、37° C過夜培養。不能觀察到菌落生長的多肽濃度為最小殺菌濃度。每個實驗重複3次。2. 3多肽處理致齲菌後電鏡觀察
使用掃描電鏡來觀察多肽對細菌膜表面的影響。S. mutans UA 159，S. sanguinis 10556在新鮮培養基中厭氧條件下生長到對數期。在室溫下，多肽處理細菌懸液(100 μ ) M小時後離心(4500 rpm)收集菌液沉澱。細菌沉澱使用PBS清洗2次，使用2. 5%的戊二醛固定並使用乙腈梯度脫水(50%, 70%, 80%和90%處理20分鐘，100%處理20分鐘2 次)。然後使用乾燥機(ES-2030, Hitachi,日本)冷凍乾燥，噴金(Ion Sputter E-1045， Hitachi,日本)。未經過處理的細菌作為陰性對照，其他步驟類似。噴金後的標本使用冷場發射電鏡觀察(S-4800，Hitachi,日本)。2. 4殺菌曲線的測定
為了檢測多肽的短時間殺菌能力，我們進行了時間殺死曲線的實驗。變異鏈球菌、遠緣鏈球菌和血鏈球菌在BHI培養基中生長到對數期，然後稀釋至105CFU/ml。在厭氧的培養條件下，使用檢測時間殺死曲線的方法對該多肽的殺菌能力進行評價。使用的濃度是各個多肽8倍的MIC值。具體實驗步驟如下在使用多肽處理變異鏈球菌之後，在每一個時間點(0、2、5、10、20、30、60、120分鐘)吸出10μ1的細菌懸液放入490μ1培養基中稀釋，使多
肽的濃度降至殺菌濃度之下，並保持在冰上使其停止生長。震蕩之後根據不同的細菌濃度， 20-500μ1稀釋後菌液鋪板，37度厭氧培養之後計數。
3.實驗結果證明，其有益效果如下
3. 1 MIC和MBC檢測值顯示，這幾種多肽都對口腔致齲菌有一定的抗菌能力，見表2。
權利要求
1.一種抗口腔致齲菌的多肽Pm4，其製備方法是通過對天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，對口腔常見致齲菌有一定的抗菌、殺菌能力，在確定活性中心的基礎上，對其進行胺基酸的刪除和替換形成新型的具有殺菌能力的抗菌多肽；所述新型抗菌多肽Pm4， 序列為 GWGKFi7KKFi7KVGK15
2.根據權利要求1所述的抗口腔致齲菌的多肽Pm4，其製備方法中所述口腔常見致齲菌為變異鏈球菌。
3.根據權利要求1所述的抗口腔致齲菌的多肽Pm4，其製備方法中所述口腔常見致齲菌為遠緣鏈球菌。
4.根據權利要求1所述的抗口腔致齲菌的多肽Pm4，其製備方法中所述口腔常見致齲菌為血鏈球菌。
5.根據權利要求1所述的抗口腔致齲菌的多肽Pm4，其特徵是多肽使細菌細胞膜表面失去原有性狀，變得粗糙甚至有出現孔隙，通過在細菌表面形成離子通道，引起細菌內容物的流出，從而導致了細菌的死亡。
6.根據權利要求1所述的抗口腔致齲菌的多肽Pm4製備方法是，其特徵在於通過保持、改進α螺旋特性，對天然多肽pleurocidin活性中心胺基酸進行刪除和替換，通過直接化學Fmoc合成的方法，構建有抗菌能力的多肽。
全文摘要
本發明屬於醫藥生物技術領域，涉及Fmoc化學合成多肽，即一種抗口腔致齲菌的多肽Pm4及製備方法，其製備方法是通過對天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，對口腔常見致齲菌有一定的抗菌、殺菌能力，在確定活性中心的基礎上，對其進行胺基酸的刪除和替換形成新型的具有殺菌能力的抗菌多肽；所述新型抗菌多肽Pm4，序列為GWGKFFKKFFKVGK；其製備方法中所述口腔常見致齲菌為變異鏈球菌；其製備方法中所述口腔常見致齲菌為遠緣鏈球菌；其製備方法中所述口腔常見致齲菌為血鏈球菌。它克服天然抗菌肽長度過長，合成成本相對較高的問題。
文檔編號C07K7/08GK102417536SQ201110381230
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月26日 優先權日2011年11月26日
發明者倪龍興, 陶睿 申請人:倪龍興