一種種子活力快速檢測方法
2023-10-23 00:10:42
專利名稱：一種種子活力快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及種子檢測技術，特別涉及一種種子活力快速檢測方法。
背景技術：
種子活力是種子質量的重要指標，高活力種子具有明顯的生長優勢和生產潛力。農業生產中，種子活力測定是保證田間出苗率和生產潛力的必要手段，是保障農業豐產豐收的關鍵環節。
傳統種子活力檢測主要是測量發芽率(亦稱發芽勢)，如高滲發芽法，或檢測種子的抗逆性，如冷凍發芽法。高滲發芽法的原理是種子在高滲溶液中的發芽能力與其活力呈顯著正相關，據此來檢測種子活力。冷凍發芽法能夠較準確的反映出種子活力和田間表現，但對於休眠的種子不能檢測其潛在的活性；同時這兩種方法都存在耗時費力的缺陷，如用高滲發芽法測量種子活力需要7天左右的時間。近年來發展起來的同功酶譜分析法以及種子還原力分析法，雖然能快速、準確的檢測出包括休眠種子的活性，但是這兩種方法都需要破壞種子。同期出現的電導率分析法和X射線自顯影技術，雖然能夠快速無損的檢測種子活力，但是由於檢測指標單一，也不能很好的反映種子活力。
專利號為00117133.X的發明專利「水稻種子的鑑定方法」中公開了一種通過測量水稻種子吸水後的超微弱發光強度來鑑定水稻種子的新與舊、真與偽的方法。但這種鑑定水稻種子的測量時間較長，所需時間約1小時左右；而且測量的是水稻種子吸水後所發出的超微弱光，這種超微弱光的發光機制本身就很不清楚，是否與水稻種子活力有關還有待研究。另外，由於種子含水量的不同會很大程度上影響這種超微弱發光，因此這種方法從原理上講測量準確性較差、靈敏度也較低、容易造成假象。同時這種方法只是針對水稻這種單一品種，應用範圍極其有限，不能推廣應用到其它種子活力的檢測。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中存在的缺點，提供一種測量需要樣品量少、適用範圍廣、無損、快速、簡單、靈敏、準確的種子活力的檢測方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現一種種子活力快速檢測方法，其特徵在於同一溫度及黑暗條件下，測量待測種子吸脹初期的種子浸出液在化學發光探針試劑介導下的化學發光強度的平均值，比較其大小，從而實現待測種子活力大小的檢測。
測量種子吸脹初期的種子浸出液在化學發光試劑介導下化學發光強度的平均值具體可包括下述步驟(1)將待測種子用升汞溶液浸泡然後用蒸餾水或純淨水清洗。
(2)將清洗後的種子放入透光容器，置於暗箱中。
(3)用CaCl2的水溶液對所述種子浸種一段時間。
(4)然後將化學發光探針試劑加入所述種子浸泡液中，測量種子浸泡液的化學發光強度。
所述種子指的是具有煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的所有種子(例如糧食類作物種子如玉米、水稻、大豆、經濟類作物種子棉花、菸草、蔬菜水果類種子如西瓜、花卉類種子蝴蝶蘭等)。
所述化學發光探針試劑可採用魯米諾、光澤精、海螢螢光素類似物(CLA)或其衍生物(MCLA、FCLA)；優選海螢螢光素類似物或其衍生物；更優選海螢螢光素衍生物。海螢螢光素類似物(CLA)或其衍生物(MCLA、FCLA)只與超氧陰離子(·O2-)或者單線態氧(1O2)發生特異性的化學發光反應，不與生物機體內的過氧化氫(H2O2)或者羥自由基(OH)發生反應，而且1O2產生的機會和量都很小，並且1O2的壽命很短。有效降低酶、1O2，·OH等幹擾物質的影響，而且海螢螢光素衍生物的化學發光效率更高。
測量種子的化學發光強度可採用自製或市售的單光子計數測量裝置，比如日本「HAMAMATSU」公司製造的單光子計數儀、美國「EGG」公司製造的單光子計數儀。
所述步驟(1)中種子用升汞溶液浸泡，指的是用1～10‰的升汞溶液浸泡種子1～10min。
所述步驟(3)中用CaCl2的水溶液對所述種子浸種一段時間，指的是用體積為100μL～1L濃度為1～10mM的CaCl2的水溶液對所述種子浸種1～30min。
所述步驟(4)中將化學發光探針試劑加入所述種子浸泡液中，指的是加入最終濃度為100μM～10mM的化學發光探針試劑，其優選濃度為1～2mM；此優選濃度有較好的靈敏度，又經濟節約。
所述步驟(4)中種子浸泡液的化學發光強度測量，指的是測量30s～10min種子的化學發光強度，此優選時間段的化學發光強度特異性最明顯。
所述步驟(4)中種子浸泡液的化學發光強度測量，指的是在20～32℃下測量種子化學發光強度，此優選測量溫度下測量的化學發光強度的準確性較高。
本發明的原理種子細胞膜上存在著NADPH氧化酶，因為NADPH氧化酶能直接被鈣離子激活，催化NADPH與氧氣反應產生超氧陰離子，超氧陰離子在自發或超氧化物歧化酶的作用下歧化為過氧化氫，而過氧化氫又能激活細胞膜上的鈣離子通道，從而實現NADPH氧化酶活性的自循環放大，在短時間內NADPH氧化酶就被激活。因此在含有鈣裡的水溶液浸泡後的種子中，由NADPH氧化酶催化NADPH產生超氧陰離子並釋放到細胞外，在這個過程中這種酶能充當NADPH的天然傳感器 而NADPH是種子活力的一個重要檢測指標，因此超氧陰離子的含量可以作為替代還原氫NADPH的一個檢測種子活力的重要指標。因此這種反映種子的活性氧含量的化學發光的強度可作為檢測種子活力的指標，從而實現種子活力的快速無損檢測。
同一品種但新舊程度不同的種子，種子活力不同，其化學發光探針試劑介導的化學發光強度不同，即活力不同的同品種種子的經有鈣離子的溶液浸泡後化學發光強度的平均值不同，依據這一特異性可判斷種子的新舊；種子愈新，活力越高，種子種還原氫和NADPH氧化酶的活性也就越高，因此由NADPH氧化酶催化產生的超氧陰離子的就越多，其經鈣離子激活後化學發光探針試劑介導的化學發光強度越大。
化學發光強度平均值Iavr=1t0tptdt]]>，pt為化學發光強度(單位為計速率即cps)，t為時間。
本發明與現有技術相比，具有如下優點及有益效果1、本發明利用了吸脹初期種子在化學發光探針試劑介導下化學發光的明顯特異性，簡便、快速、早期、定量地測定種子活力；與同樣是檢測種子內還原氫含量來檢測種子活力的TTC檢測過程要30min左右相比，本發明檢測過程僅需30s～5min，可以實現快速檢測。
2、本發明所使用的化學發光測定法，靈敏度很高；而且由於本方法所選用的化學發光探針試劑只發生特異性的化學發光反應，所以測量的準確性也很高。
3、測量種子產生的超氧陰離子介導的MCLA化學發光是用種子的浸出液，從而消除了種子中其他的發光物質的影響；同時無需破壞種子，徹底實現了無損傷種子活力檢測。
4、種子含水量不同也會對超氧陰離子介導的MCLA化學發光有嚴重影響，本發明測量體系建立在種子的浸出液基礎上，從而使測量不用嚴格考察種子含水量差異，從而簡化操作，並且極為精確。
5、本發明所利用的測量裝置簡單，投資較少，實現容易，操作簡便。
6、本發明種子用量極少。
7、本發明種子活力檢測適用範圍廣泛，可以檢測多種品種的種子活力。
圖1是收穫年份不同的水稻種子在以海螢螢光素衍生物MCLA為化學發光試劑介導下的化學發光強度比較。
圖2是收穫年份不同的玉米種子在以海螢螢光素衍生物MCLA為化學發光試劑介導下的化學發光強度比較。
圖3是2006年8月份收穫的大豆種子經過不同時間的高溫高溼處理後，在以海螢螢光素衍生物MCLA為化學發光試劑介導下的化學發光強度比較。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式和檢測種子的種類不限於此。
實施例1首先選取所要檢測的收穫年份不同、大小一致、種皮完好的水稻種子，將這些種子分別用1‰升汞溶液浸泡2min，然後用蒸餾水清洗3次；將清洗後的完整種子置於容積為4mL的透光比色皿中，並置於暗箱中；用2mL濃度為3mM的CaCl2溶浸種10min；然後加入海螢螢光素衍生物(MCLA)並使其終濃度為1mM，再用單光子計數儀測量其化學發光強度2分鐘；測量溫度為30(±2)℃；得到圖1中收穫年份不同的水稻種子在以海螢螢光素衍生物MCLA為化學發光試劑介導下的化學發光平均強度。從圖1可知01年、02年、04年、05年和06年收穫的水稻種子，其化學發光強度明顯不同，化學發光強度隨貯存時間的延長而下降；06年收穫的水稻種子其化學發光強度最大，01年收穫的水稻種子其化學發光強度最小。
據此可知水稻種子化學發光強度與種子新舊成明顯的正相關，新收穫的水稻種子其化學發光強度高，水稻種子化學發光強度隨種子貯存時間而降低；水稻種子化學發光強度的大小可以用來判定種子新舊、種子活力的大小。
實施例2首先選取所要檢測的收穫年份不同、大小一致、種皮完好的玉米種子，將這些種子分別用2‰升汞溶液浸泡3min，然後用蒸餾水清洗3次；將清洗後的完整種子置於容積為5mL的透光比色皿中，並置於暗箱中；用3mL濃度為3mM的CaCl2溶浸種10min；然後加入海螢螢光素衍生物(MCLA)並使其終濃度為1mM，再用自製的單光子計數儀測量其化學發光強度2分鐘；測量溫度為30(±2)℃；得到圖2中收穫年份不同的玉米種子在以海螢螢光素衍生物MCLA為化學發光試劑介導下的化學發光平均強度。從圖2可知01年、02年、04年、05年和06年收穫的玉米種子，其化學發光強度明顯不同，化學發光強度隨貯存時間的延長而下降；06年收穫的玉米種子其化學發光強度最大，01年收穫的玉米種子其化學發光強度最小。
據此可知玉米種子化學發光強度與種子新舊成明顯的正相關，新收穫的玉米種子其化學發光強度高，玉米種子化學發光強度隨種子貯存時間而降低；玉米種子化學發光強度的大小可以用來判定種子新舊、種子活力的大小。
實施例3首先選取2006年8月收穫的大小一致、種皮完好的大豆種子，用高溫(42℃)、高溼(相對溼度為100％)處理(目的是使種子活力降低)不同時間，將處理後的種子分別用3‰升汞溶液浸泡1min，然後用蒸餾水清洗3次；將清洗後的完整種子置於容積為5mL的透光比色皿中，並置於暗箱中；用3mL濃度為3mM的CaCl2溶浸種5min；然後加入海螢螢光素衍生物(MCLA)並使其終濃度為1mM，再用自製的單光子計數儀測量其化學發光強度2分鐘；測量溫度為30(±2)℃；得到圖3中高溫高溼處理不同時間的的大豆種子在以海螢螢光素衍生物MCLA為化學發光試劑介導下的化學發光平均強度。從圖3可知同一年份收穫的大豆種子經不同時間的高溫高溼處理後，其化學發光強度明顯不同，化學發光強度隨處理時間的延長而下降；48h的高溫高溼處理，其化學發光強度與未處理的相比，已下降到極顯著水平(P＜0.01)，圖中用**表示高溫高溼處理48h及48h以上後與未處理相比(高溫高溼處理0時間的)，化學發光強度下降的極顯著差異；144h的高溫高溼處理，化學發光強度幾乎完全消失。
據此可知同一年份收穫的大豆種子化學發光強度隨高溫高溼處理時間而降低；大豆種子化學發光強度的大小可以用來判定高溫高溼處理後種子活力的大小。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種種子活力快速檢測方法，其特徵在於同一溫度及黑暗條件下，測量待測種子吸脹初期的種子浸出液在化學發光探針試劑介導下的化學發光強度的平均值，比較其大小，從而實現待測種子活力大小的檢測。
2.根據權利要求1所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於測量種子吸脹初期的種子浸出液在化學發光試劑介導下化學發光強度的平均值包括下述步驟(1)將待測種子用升汞溶液浸泡然後用蒸餾水或純淨水清洗；(2)將清洗後的種子放入透光容器，置於暗箱中；(3)用CaCl2的水溶液對所述種子浸種一段時間；(4)然後將化學發光探針試劑加入所述種子浸泡液中，測量種子浸泡液的化學發光強度。
3.根據權利要求1或2所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於所述種子是指具有煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的種子。
4.根據權利要求3所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於所述種子是糧食類作物種子、經濟類作物種子、花卉類種子、蔬菜水果類種子。
5.根據權利要求1或2所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於所述化學發光探針試劑為魯米諾、光澤精、海螢螢光素類似物或其衍生物。
6.根據權利要求2所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於所述步驟(1)中種子用升汞溶液浸泡，指的是用1～10％的升汞溶液浸泡種子1～10min。
7.根據權利要求2所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於所述步驟(3)中用CaCl2的水溶液對所述種子浸種一段時間，指的是用體積為100μL～1L濃度為1～10mM的CaCl2的水溶液對所述種子浸種1～30min。
8.根據權利要求2所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於所述步驟(4)中所述化學發光探針試劑加入所述種子浸泡液中，指的是加入最終濃度為100μM～10mM的化學發光探針試劑。
9.根據權利要求2所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於所述步驟(4)中種子浸泡液的化學發光強度測量時間是30s～10min。
10.根據權利要求2所述的種子活力快速檢測方法，其特徵在於所述步驟(4)中種子浸泡液的化學發光強度測量溫度是20～32℃。
全文摘要
本發明提供一種種子活力快速檢測方法，主要是在同一條件下，測量待測種子吸脹初期的種子浸出液在化學發光探針試劑介導下的化學發光強度的平均值，比較其大小，從而實現待測種子活力大小的檢測。本發明檢測種子活力需要樣品量少、適用範圍廣；檢測的是種子浸出液的化學發光，有效的排除了種子中別的發光物質以及種子含水量對化學發光的影響，可以方便快捷的實現種子活力的無損、準確、高靈敏檢測。
文檔編號G01N21/76GK101084707SQ20071002892
公開日2007年12月12日 申請日期2007年7月2日 優先權日2007年7月2日
發明者邢達, 劉學俊, 張玲瑞 申請人:華南師範大學