炭疽毒素受體ATR－Fc融合蛋白的製作方法
2023-10-31 02:57:32 2
專利名稱：炭疽毒素受體ATR－Fc融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白，屬於醫學生物工程領域。
背景技術：
炭疽熱是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，美國疾病控制與預防中心(CDC)將炭疽、鼠疫、天花等列為等級最高的傳染性疾病，這類傳染性疾病具有傳播速度快、死亡率高、易引發公眾恐慌和社會混亂等特點，需要特別對待和嚴密監測。炭疽桿菌有以下特點(1)繁殖速度快，炭疽孢子存活時間長，在自然條件下可以存活36年；(2)傳染性強，室外施放含炭疽菌的氣溶膠，即便在室內也有感染炭疽熱的可能；(3)吸入性炭疽熱死亡率極高，至今仍沒有有效的方法治療。(4)作為生物武器具有很強的殺傷能力。1993年美國國會技術評估部門(OTA)估計，在美國首都華盛頓的上風口施放100kg的氣溶膠化的炭疽孢子，將會造成13萬～300萬人死亡，其致死性殺傷效果相當於甚至超過1顆氫彈的威力。由於炭疽桿菌的這些特點，80年前有的國家就開始了以炭疽作為生物武器的研究，「911」事件後美國又出現炭疽菌襲擊，研究抵禦生物恐怖襲擊的新方法已成為美國政府優先資助的項目，並且引起各國政府的高度重視。
人體感染炭疽桿菌後，炭疽桿菌能在人體內增殖並產生致命的毒素。大多數的炭疽熱致死病例是由炭疽毒素不可逆的毒性作用導致的。炭疽毒素包括(1)保護抗原(PA)，它可與哺乳動物細胞膜上的炭疽毒素受體(ATR)結合，並介導致死毒素(LeTx)和水腫因子(EF)進入宿主細胞內；(2)水腫因子(EF)，它是一種腺苷酸環化酶，通過提高感染部位細胞內的環腺苷酸(cAMP)濃度而引起水腫，並可抑制噬菌作用；(3)致死因子(LF)，它是一種高度特異性的鋅依賴性蛋白酶，可改變巨噬細胞產生的細胞因子並誘導巨噬細胞裂解。保護抗原是炭疽毒素的核心成分，它能在細胞水平上促進炭疽感染進展。在沒有保護抗原的情況下，炭疽桿菌產生的水腫因子和致死因子對人體是無害的，只有保護抗原與細胞表面的炭疽毒素受體結合形成保護抗原-受體(PA-ATR)複合物，炭疽致死毒素和水腫因子在PA-ATR複合物的介導下才能進入細胞質內並產生毒性。因此，保護抗原在炭疽感染中起著舉足輕重的作用，保護抗原自然而然成為研製預防和治療炭疽熱新藥的有效靶標。
抗體類藥物的研究、開發和生產已成為生物製藥行業中最重要和最為活躍的領域。
抗炭疽毒素抗體是預防和治療炭疽感染最直接和最有效的手段之一，有許多抗保護抗原抗體(anti-PA antibodies)在細胞保護實驗和動物實驗中表現出明顯的保護作用，並且在治療中有明顯療效，由於具有Fc段，抗體不僅能結合炭疽毒素PA，並且可以由抗體Fc介導的生物學效應如抗體依賴性細胞介導的細胞毒效應(ADCC)、補體依賴性細胞毒效應(CDC)或免疫調理作用而殺死炭疽孢子，起到治療的作用。但是，不是所有的anti-PA抗體都有細胞保護作用，相反，如果anti-PA抗體不是封閉PA與其受體ATR結合部位，不僅不能保護細胞，反而能強化致死毒素對巨噬細胞的殺傷作用。PA的可溶性受體ATR能夠結合PA並阻止致死毒素對細胞產生殺傷作用，但是，由於可溶性受體半衰期短，而且沒有抗體分子的Fc段介導的對病原體產生殺傷作用的功能。
目前國內外還沒有研製ATR-Fc融合蛋白的報導。
發明內容
本發明的主要目的在於提供一種安全、有效的炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受體(ATR)與人Fc的二聚體融合蛋白，單鏈ATR-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，共459個胺基酸殘基；其中前27個胺基酸為ATR的信號肽。所以成熟的單鏈ATR-Fc有432aa，二聚體為864aa。
編碼炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白單鏈的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的鹼基序列。
我們採用人工合成的方法，成功地得到了與設計相符的編碼炭疽毒素受體ATR胞外區1-227aa的基因。cDNA人工合成具有許多優點，如基因的來源不受材料限制；可以從基因水平上進行優化以提高表達水平；可以對幾個基因進行剪裁或組合等。但是，在利用重疊延伸PCR法組裝基因過程中，由於寡核苷酸片段的反覆退火與連接，可能引入錯誤。因此，儘量減少PCR的次數，或者合成的基因長度較短如400bp以下，會有利於寡核苷酸片段的正確組裝。本文合成的加上酶切位點和剪切供體序列的ATR基因長度大於700bp，如果從第一個寡核苷酸片段順序組裝到第18個片段，PCR次數過多，容易出現錯誤。我們採取的策略是先組裝成兩個長度在300-400bp的大片段，再通過兩個大片段的互補鹼基的重疊延伸，得到全長基因，PCR次數減少了1倍，減少了鹼基錯配或缺失的機率。
合成的寡核苷酸片段的長度對全基因的正確組裝也有很大影響。一方面，長度太短，
會增加寡核苷酸片段的數目和PCR的次數，導致發生錯誤的機率增加；另一方面，長度太長又會使合成中出現錯誤的機率增加，合成成本和難度極大增加。因此，合成的寡核苷酸片段的長度要綜合考慮合成和組裝過程中的各種因素，國外報導50-70個核苷酸長度比較適宜，合成時我們選擇了50-60個寡核苷酸的長度，即可保證組裝基因的質量，又大大降低了寡核苷酸合成的成本。此外，採用高保真的Taq酶，可以極大限度地減少PCR重疊延伸過程中的錯誤，是獲得正確的全基因的關鍵。我們在PCR過程中，採用了TaKaRa公司的最新產品PyrobestTMDNA Polymerase，該酶與TaKaRa TaqTM相比，保真性能提高了10倍。
將全長為681bp的編碼炭疽毒素受體(ATR)N端1-227胺基酸的基因分成長約50-60鹼基的18個寡核苷酸片段，相鄰片段重疊部分為20-22個鹼基，利用重疊延伸PCR和引物PCR法，將合成的片段組裝與擴增，得到了含有ATR1-227的全部編碼區和Hind III、BamH I位點在內的DNA片段。回收的基因片段經BamH I/Hind III雙酶切連接到pUC19質粒中，挑選陽性克隆進行酶切鑑定和雙向序列測定，獲得了全序列正確的克隆。BamHI/Hind III雙酶切質粒pUC19/ATR和pcDNA3.1/CD40-Fc，用ATR基因替換CD40基因得到表達ATR-Fc融合蛋白的真核表達載體pcDNA3.1/ATR-Fc。
將編碼炭疽毒素受體(ATR)N端1-227胺基酸的基因和編碼Fc段的基因連接，插入到pcDNA3.1的Hind III和Not I位點得到表達ATR-Fc融合蛋白的真核表達載體pcDNA3.1/ATR-Fc，並用脂質體方法將該載體轉染至CHO-K1細胞中，用G418篩選並獲得ATR-Fc表達水平為10-15μg/(106cells·d)的基因工程CHO細胞系ATR-Fc-1D5。採用蛋白A純化重組蛋白，並用ELISA法鑑定ATR-Fc與PA的親和性，表明ATR-Fc可與PA特異性結合。
本發明還獲得了表達水平較高的表達ATR-Fc的基因工程CHO細胞系ATR-Fc-1D5(已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，登記入冊編號為CGMCCNo.1399，保存的細胞株名稱為ATR-Fc融合蛋白CHO工程細胞株，地址北京市海澱區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所，100080；電話010-62542758；傳真010-62537796；電子郵件[email protected])，該細胞系的表達水平約10-15μg/(106cells.d)，並且連續傳代培養1年，表達水平沒有變化。
本發明的炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白用於製備治療炭疽感染的藥物的應用。
ELISA證實ATR-Fc可既能夠與PA高親和力結合，又能特異性封閉PA與其細胞受體結合區域，並且在細胞保護實驗中顯示，ATR-Fc可明顯抑制炭疽毒素對細胞的殺傷作用，該融合蛋白值得進一步研究並開發成防治炭疽感染的抗體類藥物。
本發明的優點是這種融合蛋白可與抗原高親和力結合，相當於抗體的Fab片段，而Fc段又提供了抗體的生物學活性，它有以下特點(1)無抗原性，兩段蛋白均來自人體；(2)親和力高，一般配體和受體的親和力都較高(Kd～10-10M)；(3)不用擔心病毒或菌株等抗原的突變，抗體只是針對抗原的一個表位，一旦該抗原的表位突變，抗體可能失去與抗原的親和力，而如果抗原突變導致抗原與受體不結合，則這種抗原(即病原體)便失去了致病能力，如果抗原的突變不會影響其與受體的結合，則受體-Fc融合蛋白同樣可以將抗原捕獲並清除；(4)也具有抗體的ADDC效應和CDC效應；(5)半衰期長，與人源抗體相近(10～20天左右)。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明做進一步說明，不以任何方式限制本發明的實施。凡是依照本發明公開的內容進行的任何本領域的等同替換，均屬於本發明的保護範圍。
圖1為18段寡核苷酸連接組裝成完整ATR基因的過程示意圖。
圖2為ATR基因的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。
圖3為ATR-Fc融合蛋白真核表達載體pcDNA3.1/ATR-Fc。
圖4為重組質粒pcDNA3.1/ATR-Fc酶切鑑定圖譜。條帶1為Hind III/Not I雙酶切結果，條帶2為DNAMarker，條帶3為Hind III/BamH I雙酶切結果。
圖5為將編碼ATR-Fc融合蛋白的基因用Hind III和Not I雙酶切插入pcDNA3.1真核表達載體中全基因測序結果。
圖6單鏈ATR-Fc融合蛋白的基因序列和蛋白質序列。
圖7為表達ATR-Fc融合蛋白的基因重組CHO細胞克隆ATR-Fe-1D5。
圖8為直接ELISA篩選表達ATR-Fc融合蛋白的陽性重組CHO細胞克隆。
圖9為表達產物ATR-Fc的SDS-PAGE分析。條帶1非還原SDS-PAGE；條帶2蛋白質marker；條帶3，4還原SDS-PAGE。
圖10為ELISA定性檢測ATR-Fc與炭疽毒素保護抗原的親和性。(1)PA+mouseanti-PA MAb+HRP-labeled goat anti-mouse IgG Fc；(2)PA+ATR-Fc+HRP-labeled goatanti-human IgG Fc；(3)PA+Enbrel+HRP-labeled goat anti-human IgG Fc；(4)CHO-K1supernatant+HRP-labeled goat anti-human IgG Fc；(5)mouse anti-PA MAb+HRP-labeledgoat anti-mouse IgG Fc。
圖11為ATR-Fc保護小鼠巨噬細胞J774A.1細胞不受炭疽致死毒素的攻擊具體實施方式
以下實施例按照參照分子克隆實驗手冊進行；涉及的材料及其來源如下大腸桿菌DH5α(道普公司)、pUC19質粒(本室保存)、pcDNA3.1真核表達載體(Invitrogen公司)、源自基因組(含有內含子)的編碼人免疫球蛋白IgG1 Fc段(鉸鏈區、CH2區和CH3區)的基因(美國RD Systems公司，載體名為pIG1，產品編號為pIg vectors，MBV-002-10)。
限制性內切酶Nhe I、BamH I、Not I、Hind III等購自NEB公司，T4 DNA連接酶及高保真Taq酶Pyrobest購自寶生物工程有限公司。質粒提取、PCR產物回收及酶切產物回收試劑盒均購自Promega公司。DNA Marker購白天為時代公司。
實施例1.ATR基因合成的設計Bradley等2001年發現的炭疽毒素受體ATR，實質就是人腫瘤內皮標誌物蛋白(tumor endothelial marker 8，TEM8)的胞外區(1-315胺基酸)，其中1-27位胺基酸為信號肽，而實驗表明可溶性受體ATR41-227具有明顯的中和炭疽毒素PA的作用，因而本文合成的基因為編碼ATR1-227的序列，將全長681bp ATR1-227基因分成18個片段，每個片段長約50-60鹼基，相鄰片段重疊部分為20-22個鹼基，具體的設計見表1。寡核苷酸片段的合成和基因序列的測定由上海博亞生物技術公司完成。
表1
實施例2.寡核苷酸片段的連接和組裝採用重疊延伸PCR技術，按如下方法將寡核苷酸片段連接成一完整ATR基因(見圖1)①將ATR基因片段1→2、3→4、5→6、7→8、9→10、11→12、13→14、15→16、17→18重疊延伸形成核苷酸片段(1-2)、(3-4)、(5-6)、(7-8)、(9-10)、(11-12)、(13-14)、(15-16)和(17-18)，PCR反應體系為2μL dNTP(2.5mmol/L)、0.125μL Pyrobest聚合酶、2.5μL 10×Buffer、寡核苷酸片段2×5μL(5μmol/L)、純淨水10.375μL，總反應體系為25μL。PCR反應條件94℃，預變性2min→[94℃，30s→57℃，30s→72℃，50s]×20循環→72℃，5min→4℃，5min；②將步驟①得到的PCR產物按(1-2)→(3-4)、(5-6)→(7-8)、(11-12)→(13-14)、(15-16)→(17-18)連接，反應體系為12.5μL(1-2)PCR產物+12.5μL(3-4)PCR產物，補加0.125μL Pyrobest聚合酶，餘此類推，PCR反應條件同步驟①；③將步驟②得到的PCR產物按(1-4)→(5-8)、(11-14)→(15-18)連接，反應體系為12.5μL(1-4)PCR產物+12.5μL(5-8)PCR產物，補加0.125μL Pyrobest聚合酶，餘此類推，PCR反應條件同步驟①；④將步驟③得到的PCR產物(1-8)與(9-10)連接，反應體系為12.5/μL(1-8)PCR產物+12.5μL(9-10)PCR產物，補加0.125μL Pyrobest聚合酶，PCR反應條件同步驟①；⑤將步驟④得到的PCR產物(1-10)與(11-18)連接，反應體系為12.5μL(1-10)PCR產物+12.5μL(11-18)PCR產物，補加0.125μL Pyrobest聚合酶，PCR反應條件同步驟①。
得到ATR的全基因。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析最終的PCR產物，證實獲得的基因大小約700bp(圖2)，與預計的ATR基因大小一致。
實施例3.ATR cDNA的克隆用ATR上遊引物(5』端)和下遊引物(3』端)PCR擴增1.4中得到的ATR全基因，PCR反應體系為8μL dNTP(2.5mmol/L)、0.5μL Pyrobest聚合酶、10μL ATR(1-18)模板、10μL 10×Buffer、2μL ATR上遊引物(10μmol/L)、2μL ATR下遊引物(10μmol/L)、67.5μL水，總反應體系為100μL，PCR反應條件94℃，2min(預變性)→[94℃，30s→58℃，30s→72℃，1min]×25循環→72℃，5min→4℃，5min。用0.8％-1％低熔點瓊脂糖膠回收PCR產物(Promega，Agarose LMP)。
ATR上遊引物5』-CTAAAGCTT ATGGCCACGGCGGAGCGGAG-3』，下劃線為Hind III酶切位點，方框中為Kozak序列；
ATR下遊引物5』-CGCGGATCC TCAGCTGCTAGAATTTCGATGCAG-3』，下劃線為BamH I酶切位點，陰影斜體字為Fc段鉸鏈區前的剪切供體序列。
將回收的PCR擴增的ATR基因經Hind III和BamH I酶切後，用T4連接酶與用同樣限制性內切酶酶切過的pUC19質粒連接，轉化大腸桿菌DH5α，塗布於含有X-gal和氨苄青黴素的平板上，培養過夜，挑取白色菌落接種培養，提取質粒，酶切鑑定，由上海博亞生物技術公司進行序列測定，得到的序列與設計的基因序列完全一致。
實施例4.ATR-Fc融合蛋白真核表達載體pcDNA3.1/ATR-Fc的構建將pIG1(RD Systems公司，產品編號為MBV-002-10)載體和pcDNA3.1載體(美國Invitrogen公司)分別用BamH I和Not I雙酶切，經低熔點膠電泳回收pIG1中大小約1500bp的Fc基因片段，在T4連接酶作用下將Fc和pcDNA3.1兩段DNA連接成pcDNA3.1/Fc載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑出的克隆經搖瓶培養，提取質粒行BamH I+Xho I雙酶切鑑定。將插入了Fc片段的含pcDNA3.1/Fc質粒的菌株搖瓶培養提質粒。
將測序正確的pUC19/ATR質粒(含ATR1-227基因)用Hind III和BamH I雙酶切，經低熔點膠電泳回收，同時將pcDNA3.1/Fc質粒用Hind III和Bam H雙酶切經試劑盒回收，在T4連接酶作用下將上述兩段DNA連接成pcDNA3.1/ATR-Fc表達載體(圖3)，轉化大腸桿菌DH5α，挑出的克隆經搖瓶培養，提取質粒行Hind III+BamH I和Hind III+Not I雙酶切鑑定。並進行ATR-Fc基因全序列測定。測序正確的重組質粒命名為pcDNA3.1/ATR-Fc。
結果表明(圖4)，用Hind III和BamH I雙酶切時，可見大小為700bp和包含Fc段1500bp的pcDNA3.1載體(約6.9kb)的片段，分別與ATR基因和載體+Fc基因大小一致，而用Hind III+Not I雙酶切，可見大小為2.2kb和5.4kb的條帶，分別與ATR-Fc基因和pcDNA3.1載體的大小一致，表明目的基因ATR-Fc正確插入了pcDNA3.1真核表達載體中。
實施例5.ATR-Fc基因的全序列測定。
由於ATR-Fc基因長2.2kb，測定結果表明，插入pcDNA3.1載體Hind III和Not I位點之間的ATR-Fc基因與預期的完全一致(圖5)。在圖5中，第11-692鹼基為編碼ATR1-227的基因片段，而第693-2193為編碼人免疫球蛋白IgG1的Fc段(Hinge區+CH2區+CH3區)的基因。由於單鏈Fc為232個胺基酸殘基，編碼該段蛋白的基因大小應為696bp，而在pcDNA3.1/ATR-Fc載體中，Fc基因來自基因組，含有四個內含子(陰影部分)，因此基因長度約為1500bp。連接ATR和Fc的酶切位點BamH I位於第一個內含子內部，會通過RNA的拼接作用而去除，不影響蛋白質的翻譯。在BamH I前面有一段剪切供體序列「 」，有利於在轉錄時ATR基因和Fc段基因在mRNA水平的正確拼接。
編碼完整的ATR-Fc融合蛋白單鏈分子的基因序列及單鏈ATR-Fc胺基酸序列如圖6所示。圖6中1-227aa(陰影部分)為ATR段，其中1-27aa為ATR的信號肽，228-459aa為Fc段，成熟的單鏈ATR-Fc(不含信號肽)分子應由432個胺基酸殘基組成。根據N-糖基化位點胺基酸序列特徵Asn-X-Ser/Thr，推測該蛋白ATR部分存在兩個可能的糖基化位點(見圖6)，而Fc部分在CH2區有一個糖基化位點，因此推測用CHO細胞表達的ATR-Fc融合蛋白，其單鏈的分子量應在60-65kDa，而完整的ATR-Fc分子的分子量約120-130kDa。我們將構建的pcDNA3.1/ATR-Fc表達載體轉染CHO細胞後，得到的目的蛋白與預測的一致。
實施例6.重組質粒轉染CHO-K1細胞及篩選陽性克隆轉染採用Invitrogen公司生產的LipofectamineTM2000陽離子脂質體轉染試劑盒，按照試劑盒說明書操作。轉染的CHO-K1細胞培養於5％CO2、37℃溫箱。轉染12h後，換含10％加強型小牛血清(Hyclone)的DMEM/F12培養基(Hyclone)。48h後，採用750μg/mL G418(Sigma)篩選培養基加壓篩選，每2-3d換液一次，加壓約12d後，將抗性細胞克隆用0.25％的胰酶消化，用有限稀釋法在96孔微孔細胞培養板(NUNC公司)中進行單克隆化培養，即用含10％小牛血清和300μg/mL G418的DMEM/F12培養基將細胞稀釋至10個/mL，在每個微孔中接種200μL培養基(平均每個孔中含有約2個細胞)，2周後出現細胞克隆。換無血清培養基繼續培養3d，收集培養上清以直接競爭ELISA挑選陽性克隆，即將無血清培養上清直接包被NUNCTM酶聯板4℃過夜，3％BSA封閉後加入HRP標記山羊抗人IgG(H+L)，孵育後加入TMB試劑顯色，450nm測OD值。以無血清培養基為陰性對照。
真核表達載體pcDNA3.1/ATR-Fc用LipofectamineTM2000陽離子脂質體轉染CHO-K1細胞後，經過12d G418的加壓篩選，出現分散的細胞抗性克隆。將抗性克隆消化下，培養基稀釋細胞接種到96孔微孔細胞培養板中，接種密度為2個細胞/孔，進行單克隆培養。培養2周後出現由一個細胞擴增形成的細胞集落(圖7)，一般一個微孔中形成單個細胞克隆的機率為30％-50％。將單個細胞克隆的微孔換成無血清培養基培養3d後，收集培養上清用直接ELISA篩選陽性克隆，表達水平較高的細胞克隆出現的機率約為20％-30％(圖8)。
實施例7.rCHO工程細胞的擴大培養選擇表達水平最高的基因重組CHO工程細胞系ATR-Fc-1D5於1000mL轉瓶中用含2％小牛血清的DMEM/F12培養基培養，待細胞長滿瓶壁時，換為無血清培養基，隔天收液，可連續收液3-4次。
選擇表達水平較高的單克隆細胞系ATR-Fc-1D5用1000mL轉瓶擴大培養，每2d收集無血清培養上清。收集的上清用蛋白A親和層析柱(Pharmacia)分離純化，用pH2.5的甘氨酸-HCl緩衝液洗脫，有一明顯的洗脫峰，收集做SDS-PAGE和ELISA分析。1000mL的上清經純化後可以得到蛋白濃度約0.9mg/mL的收集液30mL，即該細胞在轉瓶中的表達水平約27mg/L，細胞的表達水平約10-15μg/(106cells·d)。
實施例8.表達蛋白的純化及SDS-PAGE分析利用蛋白A對IgG的特異性吸附作用，採用nProtein A Sepharose 4 Fast Flow分離介質(Amersham Biosciences)進行親和層析，純化表達蛋白。操作方法參見產品說明。結合的蛋白用pH2.5、0.1mol/L甘氨酸-HCl緩衝液洗脫，並用2mol/L的Tris-HCl緩衝液將洗脫液pH調至7。純化後，以紫外分光光度計測定A260和A280吸光度推算蛋白濃度，蛋白定量公式為蛋白含量(mg/mL)＝1.45×A260-0.74×A280。以SDS-PAGE測定蛋白的純度、分子量。
如果ATR-Fc融合蛋白能夠在CHO細胞中正確表達，表達的蛋白預計應是同源二聚體抗體樣分子，即ATR-Fc單鏈在Hinge區通過鏈間二硫鍵連接成二聚體。單鏈ATR-Fc分子共有227aa+232aa＝459個胺基酸殘基，其中前27個胺基酸為ATR的信號肽，胞外分泌到細胞培養上清中時被切除，所以實際的單鏈ATR-Fc有432aa，二聚體為864aa。由於ATR和Fc段都有糖基化位點，因此單鏈ATR-Fc的分子量預期在60-65kD。親和層析純化得到的ATR-Fc融合蛋白，分別在還原和非還原條件下進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色。在非還原條件下，在120-130kD處有一條蛋白帶，而在還原條件下，在60-65kD處有一條明顯的蛋白帶，並且沒有其他的蛋白帶(圖9)。由於還原條件下所有二硫鍵包括鏈間二硫鍵都被打斷，測得的分子量為單鏈ATR-Fc分子，而非還原條件下不同肽鏈仍通過二硫鍵連接，在非還原條件下的分子量正好是還原條件下分子量的兩倍，表明我們獲得的ATR-Fc融合蛋白為同源二聚體抗體樣分子，與預期的結果相符。
實施例9.ELISA定性檢測產物與炭疽毒素保護抗原(PA)的特異性結合以基因重組PA(自製)包被NUNCTM酶聯板，3％BSA封閉後加入ATR-Fc融合蛋白，孵育後充分洗滌，再加入HRP標記山羊抗人IgG(H+L)酶標多抗，孵育後加入TMB試劑顯色，450nm測OD值。以anti-PA鼠源單克隆抗體(自製)為陽性對照，HRP酶標二抗為山羊抗小鼠IgG Fc多抗，以基因重組腫瘤壞死因子受體(TNFαR)-Fc和人IgG1的Fc段連接而成的TNFαR-Fc融合蛋白(Enbrel，自製，文章待發表)作為對照。在未包被PA的微孔中直接包被未轉染的CHO-K1細胞培養上清為陰性對照，同時，還直接包被anti-PA鼠源單克隆抗體為陽性對照。
用ELISA方法初步確定了表達的ATR-Fc與炭疽毒素保護抗原PA具有特異性結合的能力(圖10)。該蛋白與PA的結合能力，與anti-PA單克隆抗體相似，表明與人IgG Fc融合後，不僅不影響ATR與其配體PA的結合，甚至ATR-Fc與PA結合的親和力比可溶性受體sATR與PA的親和力還高1個數量級，這個結果與其他受體-Fc融合蛋白相似，例如TNFαR-Fc融合蛋白(Enbrel)與TNFc的親和力比sTNFαR高50-1000倍，更高的親和力更有利於結合和中和炭疽毒素。非常有趣和令人意外的是，本來作為陰性對照的重組TNFαR-Fc融合蛋白，ELISA結果卻表明該融合蛋白與PA有中等強度的結合能力(圖10)。我們正在測定Enbrel與PA的親和力，以及驗正Enbrel在炭疽毒素PA+LF細胞致死實驗中能否起到中和毒素和保護細胞的作用。如果證明TNFαR-Fc融合蛋白可與PA結合，那麼可以斷定TNFαR是炭疽毒素PA的第三種細胞受體，並且Enbrel可能在防治炭疽感染中有一定的作用。
實施例10.ATR-Fc融合蛋白在炭疽致死毒素殺傷小鼠巨噬細胞J774A.1實驗中保護細胞的作用在96孔細胞培養板(NUNC公司)中預先用100μl含10％胎牛血清(Hyclone公司)的MEM培養基(Hyelone公司)培養J774A.11小鼠巨噬細胞(ATCC No.TIB-67)，細胞密度為1×105cells/孔，基因重組炭疽毒素保護抗原(PA)100ng/ml(來源軍事醫學科學院微生物流行病研究所，參見文獻Xu J(許俊傑)，Dong D(董單)，Chen W(陳薇)，et al.Expression，purification and characterization of the recombinant anthrax protectiveantigen.Chin.J.Biotechnol.2004，20(5)，652-655)和基因重組炭疽毒素致死因子(LF)100ng/ml(來源軍事醫學科學院微生物流行病研究所，參見文獻Guo Q，Xu J，Dong D，Fu L，Chen W.Expression and characterization of the recombinant anthrax lethal factor.Acta.Microbiol.Sinica.2004，44(6)，749-751)與溶解於含10％胎牛血清(Hyclone公司)MEM培養基(Hyclone公司)中不同濃度的基因重組ATR-Fc融合蛋白在37℃條件下孵育30分鐘，取100μl上述溶液加到有J774A.11小鼠巨噬細胞生長的96孔細胞培養板中，在37℃條件下孵育3小時，棄去培養上清，每孔加入100μl含0.5mg/ml MTT(Sigma公司)的pH7.0的磷酸緩衝液，在37℃條件下孵育30分鐘，之後棄去上清，每孔加入100μl酸化異丙醇溶液(0.5％SDS(w/v)，25mM HCl溶於90％的異丙醇中)。在振蕩器上振蕩搖勻，用酶聯儀(BioRad公司)在570nm波長下測定OD值。觀察每個孔中活細胞比率。實驗表明(圖11)ATR-Fc濃度在37.5μg/ml的濃度下便可以充分保護J774A.1細胞免受炭疽致死毒素的致命攻擊，說明ATR-Fc可以用於預防和治療炭疽感染。
序列表110中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所120炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白130
1602170PatentIn version 3.22101211459212PRT213人工合成4001Met Ala Thr Ala Glu Arg Arg Ala Leu Gly Ile Gly Phe Gln Trp Leu1 5 10 15Ser Leu Ala Thr Leu Val Leu Ile Cys Ala Gly Gln Gly Gly Arg Arg20 25 30Glu Asp Gly Gly Pro Ala Cys Tyr Gly Gly Phe Asp Leu Tyr Phe Ile
35 40 45Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Leu His His Trp Asn Glu Ile Tyr Tyr50 55 60Phe Val Glu Gln Leu Ala His Lys Phe Ile Ser Pro Gln Leu Arg Met65 70 75 80Ser Phe Ile Val Phe Ser Thr Arg Gly Thr Thr Leu Met Lys Leu Thr85 90 95Glu Asp Arg Glu Gln Ile Arg Gln Gly Leu Glu Glu Leu Gln Lys Val100 105 110Leu Pro Gly Gly Asp Thr Tyr Met His Glu Gly Phe Glu Arg Ala Ser115 120 125Glu Gln Ile Tyr Tyr Glu Asn Arg Gln Gly Tyr Arg Thr Ala Ser Val130 135 140Ile Ile Ala Leu Thr Asp Gly Glu Leu His Glu Asp Leu Phe Phe Tyr145 150 155 160Ser Glu Arg Glu Ala Asn Arg Ser Arg Asp Leu Gly Ala Ile Val Tyr165 170 175Cys Val Gly Val Lys Asp Phe Asn Glu Thr Gln Leu Ala Arg Ile Ala180 185 190Asp Ser Lys Asp His Val Phe Pro Val Asn Asp Gly Phe Gln Ala Leu195 200 205
Gln Gly Ile Ile His Ser Ile Leu Lys Lys Ser Cys Ile Glu Ile Leu210 215 220Ala Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro225 230 235 240Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro245 250 255Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr260 265 270Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn275 280 285Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg290 295 300Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val305 310 315 320Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser325 330 335Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys340 345 350Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe370 375 380Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu385 390 395 400Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe405 410 415Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly420 425 430Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr435 440 445Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 45521022111380212DNA213人工合成4002atggccacgg cggagcggag agccctcggc atcggcttcc agtggctctc tttggccact 60ctggtgctca tctgcgccgg gcaaggggga cgcagggagg atgggggtcc agcctgctac120ggcggatttg acctgtactt cattttggac aaatcaggaa gtgtgctgca ccactggaat180
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權利要求
1.一種炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受體(ATR)與人Fc的二聚體融合蛋白，單鏈ATR-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，共459個胺基酸殘基；其中前27個胺基酸為ATR的信號肽；成熟的單鏈ATR-Fc有432個胺基酸殘基，二聚體為864個胺基酸殘基。
2.編碼炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白單鏈的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的鹼基序列。
3.權利要求1所述的炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白用於製備治療炭疽病毒感染的藥物的應用。
4.含有權利要求2所述的編碼炭疽毒素受體ATR-Fc融合蛋白的基因的表達載體。
5.根據權利要求4所述的表達載體，其特徵在於該載體為真核表達載體。
6.含有權利要求4或5所述的表達載體的細胞系。
7.根據權利要求6所述的細胞系，其特徵在於，所述細胞為CHO細胞。
8.權利要求7所述的細胞系用於製備治療炭疽病毒感染的藥物的應用。
9.表達ATR-Fc融合蛋白的基因工程CHO細胞株ATR-Fc-1D5，編號為CGMCCNo.1399。
10.權利要求9所述的表達ATR-Fc融合蛋白的基因工程CHO細胞株用於製備治療炭疽病毒感染的藥物的應用。
全文摘要
本發明公開了一種炭疽毒素受體ATR－Fc融合蛋白，是炭疽毒素PA的受體(ATR)與人Fc的二聚體融合蛋白，單鏈ATR－Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，共459個胺基酸殘基；其中前27個胺基酸為ATR的信號肽。ATR－Fc融合蛋白可用於製備治療炭疽病毒感染的藥物。本發明的優點在於這種融合蛋白可與抗原高親和力結合，相當於抗體的Fab片段，而Fc段又提供了抗體的生物學活性，它有以下特點(1)無抗原性，兩段蛋白均來自人體；(2)親和力高；(3)不用擔心病毒或菌株等抗原的突變；(4)也具有抗體的ADDC效應和CDC效應；(5)半衰期長，與人源抗體相近(10～20天左右)。
文檔編號A61K39/395GK1724570SQ20051008423
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月18日 優先權日2005年7月18日
發明者胡顯文, 高麗華, 陳惠鵬, 師明磊, 陳薇, 許俊傑 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所