快速檢測尿液中糞腸球菌的螢光定量pcr試劑盒的製作方法

2023-10-30 21:37:07

專利名稱：快速檢測尿液中糞腸球菌的螢光定量pcr試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種泌尿道感染性疾病病原體基因檢測技術，尤其涉及一種快速
檢測尿液中糞腸球菌(^^erococ^/aeca乃's， ￡ /aeca7^s)的螢光定量PCR (聚 合酶鏈式反應)試劑盒，適用於糞腸球菌定性定量檢測。
背景技術：
泌尿道感染是一種常見的細菌性感染疾病。在我國的醫院感染中，泌尿道感 染僅次於肺部感染，位於第2位。糞腸球菌是泌尿道感染分離率最高的革蘭氏陽 性菌病原菌。糞腸球菌是重要的醫院感染病原菌，多與尿路器械操作、留置導尿、 尿路結構異常有關。臨床表現為尿頻、尿急、尿痛、尿渾濁；嚴重病人有發熱、 寒戰、噁心、嘔吐、腹痛甚至可以發展為敗血症等。
糞腸球菌導致的泌尿道感染一般起病較急，應及時治療，否則可反覆發作， 遷延不愈而轉為慢性感染。
近年來發展起來的螢光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR， FQ-PCR) 技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析(Nellemann C, Vinggaard AM， Dalgaard M, et al. Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology [J]. Toxicology, 2001， 163:29—38)、 病原體的定性(McGoldrick A， Lowings JP， Ibata G， et al. A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe (TaqMan) [J]. J. Virol. Methods,1998， 72:125—135.; Bhudevi B， Weinstock D. Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus [J]. Vet. Microbiol.， 2001， 83:1-10.)和定量檢測(Desire N， Dehee A， Schneider V， et al. Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load bya TaqMan Real-Time PCR Assay [J]. J. Clin. Microbiol, 2001, 39: 1303-1310. ; Martell M， Gomez J， Esteban JI， et al. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA [J]. J. Clin, Microbiol, 1999， 37:327-332. ; Kearns AM， Turner AJL， Eltringham GJA， et al. Rapid Detection and Quantification of CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J]. J. Clin. Virol， 2002,24:131-134; Florence KP， GlauciaPB， MireilleS， et al. Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry [J]. J. Virol. Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到廣泛應用，並且己經成為當前病毒核酸定量的 主要方法，國內目前已有關於C肝、B肝、支原體、愛滋病、結核定量檢測的試 劑盒上市。臨床檢測上傳統的培養法具有靈敏度低、特異性差、耗時費力、存在假陰性 等缺點；常規PCR法雖然有簡便、快速、靈敏的優勢，但是有不能對細菌數量進 行定量和PCR後處理產生汙染導致的假陽性等問題；因此亟待開發精確、靈敏、 快速、無汙染的臨床檢測方法。發明內容本發明的目的在於克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種快速檢測尿液 中糞腸球菌的螢光定量PCR試劑盒(簡稱本試劑盒)。 本發明的目的是這樣實現的 一、本試劑盒的結構本試劑盒包括a)螢光定量PCR反應液，b)標準陽性模板，c)陰性質控標 準品；螢光定量PCR反應液含有引物和螢光探針，引物分為正向引物和反向引物； 正向引物為5'-TTCAGCGATTTGACGGATTG -3'; 反向引物為5'-TGTGGCAACAGGGATCAAGA -3';標準陽性模板是從糞腸球菌細菌標準菌株(ATCC29212)中提取的糞腸球細 菌基因組DNA，糞腸球菌標準菌株先用無菌TE緩衝液配製成細菌懸液，經過平板 計數法及用定量接種環確定所配製的菌液濃度為108cFU/ml，經過鹼裂解提取細菌基因組DNA，再對其進行10倍的倍比稀釋。 具體地說
a) 螢光定量PCR反應液
螢光定量PCR反應液是由正向引物和反向引物，SYBR PremixEx Taq (內含 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+, SYBR* Green I)和無菌雙蒸水組成 在本發明的一個具體方案中，螢光定量反應液由10Mmol/L正向引物和反向的引物 各O. 5W， SYBR* Premix Ex Taq (2X)麵，無菌雙蒸水8l4組成，反應液總 體積19W。其中引物為所示的核苷酸序列。
b) 標準陽性模板
標準陽性模板為從糞腸球菌標準菌株(ATCC29212)提取的細菌基因組DNA。 挑取糞腸球菌標準菌株(ATCC29212)菌落，溶於2ml的無菌TE緩衝液中配成細 菌懸液，經平板計數法以及用定量接種環確定所配製的菌液濃度為l08CFU/ml， 取200 經過鹼裂解提取細菌基因組DNA，再連續10倍稀釋成梯度濃度的細菌 基因組DNA溶液，分別對應於細菌濃度為10° 108CFU/ml, -20。C保存備用，以 其中的103 108CFU/ml濃度的DNA溶液做為陽性模板。
c) 陰性質控標準品
陰性質控標準品為無菌雙蒸水。
本試劑盒的工作原理
在本發明提供的快速定量檢測糞腸球菌螢光定量PCR試劑盒中，有一種螢光 染料SYBR Green I (包含於試劑SYBR PremixEx Taq中，後者為市售商品試劑)， 這是一種結合於小溝中的雙鏈DNA結合染料，與雙鏈DNA結合後，其螢光大大增 強，在PCR反應體系中，加入過量SYBR Green I螢光染料，染料分子特異性地 摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發射任何螢光信 號，因此其螢光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據螢光信號檢測出PCR 體系存在的雙鏈DNA數量，從而保證螢光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
對糞腸球菌的定量可通過與標準品的循環域值(Ct， Threshold Cycle)相比 較得出。Ct值是PCR過程中，螢光量的積累超過基底螢光量的循環個數，Ct值 與起始模數呈一定比例關係，Ct值越小，起始模板數越多，相反，Ct值越大， 起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值製成標準曲線，再根據待測樣 品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。
5在本發明提供的檢測糞腸球菌螢光定量PCR試劑盒中，針對糞腸球菌檢測中 的特殊性，對不同的耙片段進行反應體系，如引物濃度、退火溫度等的優化，並 將FQ-PCR技術(螢光定量PCR技術)和定量檢測系統相結合，將其用於糞腸球菌 定量檢測。通過優化方案，反覆實驗，建立了檢測糞腸球菌螢光定量PCR方法， 並研製出檢測糞腸球菌螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應體 系中檢出1000CFU/ml，可以滿足快速診斷糞腸球菌的要求。二、本試劑盒的使用方法本試劑盒的使用方法包括下列步驟a) 將標準陽性模板從-2(TC冰箱取出，平衡至室溫待用；b) 取無菌收集的中段尿液lml於EP管，400 g離心5min，取上清600 P 1 轉至另一EP管，5000 g離心15min，棄去400 u 1上清液，餘下200 ul用於提 取細菌組DNA;c) 對200 u 1尿沉渣加入等體積的含2%SDS的100腿ol/LNaOH進行100。C金 屬浴10分鐘以裂解細菌，獲取游離DNA用於螢光定量PCR反應；d) 分別取等量的a)步中的標準陽性模板和b)步中的尿液標本中的細菌組 DNA加入到螢光定量PCR反應液(內含正向引物和反向引物，SYBR PremixEx Taq 和無菌雙蒸水)中，用螢光定量PCR儀進行檢測；e) 通過比較待測樣品和標準品的循環域值Ct值，對待測樣品的起始拷貝數 進行定量。本發明與現有技術相比具有以下優點和積極效果1、 定量準確；2、 檢測速度快，加上樣品DNA的提取製備，共僅需2小時；3、 特異性好，靈敏度高；4、 步驟簡單，可重複性高；5、 可同時進行高通量的樣品檢測。在本發明中提供的快速定量檢測尿液中螢光定量PCR試劑盒不僅可對尿液 中糞腸球菌菌進行定量檢測，並可替代一直沿用的傳統的培養法的診斷方法。
具體實施方式
下面結合具體實施實例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍，下列實施例中未註明具體實 驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992， 分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗 指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照製造廠商所建議的條件。 實施例l:本試劑盒的組成與配製
a、 螢光定量PCR反應液正向引物和反向引物各0.5 W (1O她ol/L)， SYBR PremixEx Taq (內含TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+， SYBR* Green I) 10W (2X)，無菌雙蒸水8Pl。
b、 標準陽性模板為從糞腸球菌標準菌株(ATCC29212)提取的細菌基因組 DNA，對應的細菌濃度為10° 108CFU/ml。
c、 陰性質控標準品為無菌雙蒸水。 實施實例2:用本試劑盒檢測尿液中糞腸球菌
a、 取無菌收集中段尿液l ml於EP管，400 g離心5 min，取上清600 ul 轉至另一EP管，5000 g離心15min，棄去400 u 1上清液，對餘下200 " 1溶液 對200 P 1尿沉渣加入等體積的含2%SDS的lOOmraol/LNaOH進行IO(TC金屬浴10 min，以裂解細菌獲取游離DNA， 4°C， 7000g離心5min，取1 u 1上清液用於熒 光定量PCR反應。
b、 將陽性標準模板(試劑b)解凍，回復室溫。
c、 分別取螢光定量PCR反應液(試劑a)各19ul，取第a)步所得DNA、第 b)步的陽性標準模板和無菌雙蒸水(陰性對照)各lPl，分別加入不同的PCR 反應管，在螢光定量檢測儀上同步做PCR檢測。擴增條件為94'C預變性10s; 然後94'C 5 s， 60°C 45 s共40個循環。把螢光檢測的程序設置在每個循環的 第二步結束時進行，檢測波長為520nm。反應結束後對產物做瑢鏈曲線分析，條 件如下94 °C 0 s， 20 °C/s; 65 °C 15 s， 20 °C/s; 20 °C 0 s， 0. 1 °C/s。
循環結束後，運用儀器自帶軟體，讀取待檢樣品拷貝數。結果為標準陽性
模板108CFU/ml、 107CFU/ml、 106CFU/ml、 105CFU/ml、 104CFU/ml、 103CFU/ml、 的Ct值分別為16.85、 19.77、 23.58、 27.77、 33.29、 >36，陰性對照為0;熔 鏈曲線分析顯示Tm=79. 98°C。
回歸曲線方程是Y"4.088X+48.78，相關係數『=-0.99，標準差為0. 303。反覆重複試驗3次，得到Ct值和Tm值進行統計學分析屍> 0. 05，數據差 異無顯著性，說明不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重複性。從上述實例可以說明，螢光定量PCR方法定量重複性好，定量準確，而且， 螢光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2小時就能完成，而傳統的細菌培養 法約需3天左右才能完成，因此，使用該試劑盒可以大大縮短檢測時間。該試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程， 一次可檢測1 377 個(由定量檢測儀的型號決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。按上述方法對100多例臨床標本進行了檢測，並與常規培養方法的結果進行 對比，驗證本方法的效果優於培養方法，檢出率高，操作簡單，省時省力。相關 實驗結果己寫成論文，將發表於有關的學術期刊。
權利要求
1、一種快速檢測尿液中糞腸球菌的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於由螢光定量PCR反應液、標準陽性模板、陰性質控標準品組成；螢光定量PCR反應液含有正向引物、反向引物和SYBR Green I螢光染料；正向引物為5′-TTCAGCGATTTGACGGATTG-3′；反向引物為5′-TGTGGCAACAGGGATCAAGA-3′；標準陽性模板是從糞腸球菌細菌標準菌株中提取的糞腸球菌細菌組DNA；所述的PCR即聚合酶鏈式反應。
2、 根據權利要求1所述的PCR試劑盒，其特徵是螢光定量PCR反應液是由正向引物、反向引物，SYBR PremixEx Taq和無菌雙 蒸水組成；所述的SYBR PremixEx T叫內含TaKaRa Ex TaqTM HS， dNTP Mixture, Mg2+ 和SYBR Green I。
3、 根據權利要求1所述的PCR試劑盒，其特徵是標準陽性模板從糞腸球菌細菌標準菌株中提取的糞腸球菌細菌組DNA。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測尿液中糞腸球菌的螢光定量PCR試劑盒，涉及一種泌尿道感染病原體基因檢測技術，適用於尿液中糞腸球菌定性定量檢測。本發明由螢光定量PCR反應液、標準陽性模板、陰性質控標準品組成；螢光定量PCR反應液含有正向引物、反向引物和螢光染料。本發明定量準確；檢測速度快；特異性好，靈敏度高；步驟簡單，可重複性高；可同時進行高通量的樣品檢測；不僅可對尿液中糞腸球菌菌進行定量檢測，並可替代一直沿用的傳統的培養法的診斷方法。
文檔編號C12Q1/68GK101629208SQ20081023679
公開日2010年1月20日 申請日期2008年12月12日 優先權日2008年12月12日
發明者豔 李, 湯永飛, 明 汪 申請人:武漢大學