nisin-rbLF-N融合基因以及表達該融合基因的畢赤酵母工程菌的製作方法

2023-10-20 04:12:12 2

專利名稱：nisin-rbLF-N融合基因以及表達該融合基因的畢赤酵母工程菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種高效表達重組nisin-rbLF-N融合 基因的畢赤酵母工程菌、其構建方法及誘導培養方法。
背景技術：
乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種高效、無毒的天然防腐劑，也是唯一一種可作為防 腐劑應用於食品的細菌素。Nisin又稱乳酸鏈球菌肽，是由乳酸鏈球菌產生的一種多肽物 質，它能有效抑殺嗜熱脂肪芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭 菌、乳酸菌等各種革蘭氏陽性菌的營養細胞和芽孢。加入食品中，可大大地降低食品的滅菌 溫度、縮短食品滅菌時間，使食品保持原有營養成份、風味、色澤，同時還可節約大量能源。 可廣泛應用於肉製品、乳製品、植物蛋白食品、罐裝食品、果汁飲料及經熱處理密閉包裝食 品的防腐保鮮，同時也可應用於化妝品和醫療保健品等領域。乳鐵蛋白肽(LFcin)是乳鐵蛋白在酸性環境下經胃蛋白酶作用N端釋放的一段多 肽，廣泛存在於動物的乳汁、體液、淚液、唾液、血漿、中性粒細胞及多種組織中。具有抗菌、 抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、調節機體免疫、促進骨細胞生長等多種生物功能，在眾多的功 能中，抗菌功能是最引人注目的，而對真核細胞幾乎沒有毒性。且牛乳鐵蛋白氨基末端多肽 (rbLF-N)的抗菌活性較其它的乳鐵蛋白肽活性高具有很好的應用前景。Nisin應用前景廣闊，但也存在局限性，如不能夠抑制G-菌、酵母菌以及黴菌，在 中性及鹼性環境中溶解度低、不穩定而且抗菌效果大大降低等，因此擴大nisin抗菌譜的 研究不僅具有理論價值，而且具有十分重要的應用價值。本發明針對乳鏈菌肽(nisin)抑菌譜窄的缺點，選擇抗菌譜較廣且具有較強抗性 的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，構建融合基因nisin-rbLF-N，並在畢赤酵母 GS115宿主中進行表達，獲得具有較廣抗菌譜的融合蛋白。

發明內容
本發明的目的是提供一種能在畢赤酵母中高效表達的重組nisin-rbLF-N融合基 因。本發明的另一目的是提供一種含有所述重組nisin-rbLF-N融合基因的表達載 體。本發明的再一目的是提供能夠高效表達重組nisin-rbLF-N融合基因的畢赤酵母 工程菌及其構建方法。本發明的進一步目的是提供所述畢赤酵母工程菌的誘導培養方法。為了實現本發明目的，本發明提供一種融合基因，其含有編碼乳酸鏈球菌素的 nisin基因和編碼牛乳鐵蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。前述的融合基因為Nisin-rbLF-N，其具有Seq ID No. 1所示的核苷酸序列或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋白質的核苷酸序列。本發明還提供含有上述融合基因的載體。優選地，其出發載體為PPIC9K。本發明還提供含有上述載體的工程菌。優選地，所述工程菌為畢赤酵母。更優選 地，其為畢赤酵母GS115。本發明另外提供構建上述畢赤酵母GS115工程菌的方法。根據密碼子的簡併性，設計併合成適於在BL21中表達的nisin基因，並在5』端和 3』端設計EcoR I和BamH I酶切位點，將優化後的nisin基因克隆於pMD19_T載體。根據 目的序列分別設計引物。在上遊引物設計酶切位點BamH I (下劃線標記)和保護鹼基。上遊引物Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3』 ；下遊引物Rl :5，-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3，。根據牛乳鐵蛋白cDNA序列，設計引物。在上遊引物設計與nisin互補配對的序列 (下劃線標記)，下遊引物設計酶切位點EcoR I (下劃線標記)、終止密碼子和保護鹼基。上遊引物F2 :5，-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3 ；下遊引物R2 5，-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3，。以合成的pMD19-T/niSin質粒為模板，用引物Fl、Rl進行PCR擴增nisin基因 為179bp，純化回收PCR產物；以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進行PCR擴增 rbLF-N基因為181bp，純化回收PCR產物；以純化回收後的nisin基因和rbLF_N基因為模 板，用引物Fl、R2進行PCR擴增nisin-rbLF-N融合基因約為340bp。將上述合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到載體pPIC9K中，將該載體轉入畢赤 酵母GS115中，然後進行重組克隆的篩選，獲得重組畢赤酵母GS115工程菌，冷凍保存。為了獲得Nisin-rbLF-N重組蛋白的高效表達，所述赤酵母GSl 15工程菌在如下條 件下誘導培養1)將重組酵母凍存菌種接於YPD平板上活化，28°C培養2d，至長出單菌落；2)挑取一活化的單菌落於200mL BMGY液體培養基中，於30°C，250rpm培養，直至 培養基的OD6tltl達到2. 0 6. 0 ；3) 6000rpm離心5min收集菌體，用無菌水洗滌菌體1 2次；4)將菌體轉移至200mL BMMY誘導培養基中，於28 30°C，200rpm誘導培養1 2d。優選地，誘導培養溫度為28°C，誘導培養時間間為2d。本發明選用的pPIC9K質粒是表達融合蛋白的畢赤酵母GSl 15高效表達載體，選擇 該載體的主要原因是①PPIC9K含有乙醇氧化酶AOXl的調控序列，當其轉化入受體菌株 中，能與受體染色體上相應的序列AOXl發生同源重組，從而使整個載體連同外源基因被插 入到受體染色體上，外源基因可在AOXl啟動子控制下穩定地表達②質粒pPIC9K攜帶有野 生型HIS4基因，於是通過基因的互補作用，野生型HIS4基因就可作為His+重組子的篩選 標記。所以重組菌株可以在不含組氨酸的MD培養基中生長。本發明將上述pPIC9K/niSin-rbLF-N原核表達載體轉入畢赤酵母，然後進行重組 克隆的篩選，從而獲得重組畢赤酵母工程菌，其出發菌株優選為GS115。本發明針對Msin抑菌譜窄的缺點，選擇對抗菌譜較廣且具有較強抗性的rbLF-N 為材料，構建nisin-rbLF-N融合基因，並在真核表達系統中表達，獲得具有G+菌和G-菌抗 性的融合蛋白。其優點在於
(1)本發明針對乳鏈菌肽(Msin)抑菌譜窄的缺點，選擇對抗菌譜較廣且具有較 強抗性的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，通過特異引物的設計用PCR技術成功 獲得融合蛋白基因nisin-rbLF-N，並能夠由畢赤酵母GSl 15高效表達。(2)使用pPIC9K作為表達載體，pPIC9K含有乙醇氧化酶AOXl的調控序列，當其轉 化入受體菌株中，能與受體染色體上相應的序列AOXl發生同源重組，從而使整個載體連同 外源基因被插入到受體染色體上，外源基因可在AOXl啟動子控制下穩定地表達。同時質粒 PPIC9K攜帶有野生型HIS4基因，於是通過基因的互補作用，野生型HIS4基因就可作為His+ 重組子的篩選標記。所以重組菌株可以在不含組氨酸的MD培養基中生長。(3)本發明將融合基因nisin-rbLF-N克隆到原核表達載體pPIC9K中，轉化畢赤 酵母GS115進行誘導表達，重組菌經誘導後可表達出可觀的融合蛋白，融合蛋白的大小為 IOkDa左右。在信號肽的作用下，融合蛋白nisin-rbLF-N可順利地分泌到培養基的上清 中。去糖基化後的融合蛋白經過複合蛋白酶酶解後具有抑乾酪乳桿菌(G+菌)和大腸桿菌 (G-菌)的作用。


圖1為本發明以合成的pMD19-T/niSin質粒為模板，用引物Fl、Rl進行PCR擴增 的nisin基因片段和以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進行PCR擴增的rbLF_N 基因片段；其中1為擴增目的片段nisin ；2為陰性對照；3為擴增目的片段rbLF_N ；4為陰 性對照；5 為 DL2000Marker。圖2為本發明以純化回收後的nisin基因片段和rbLF-N基因片段為模板，用引物 Fl、R2進行PCR擴增nisin-rbLF-N融合基因片段；其中1為nisin-rbLF-N的PCR產物；2 為 DL2000Markero圖3為本發明重組質粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的酶切鑑定電泳圖，其中，1為 DL2000Marker ；2為目的基因nisin-rbLF-N PCR產物對照；3為重組質粒雙酶切產物；4為 重組表達質粒 pPIC9K/nisin-rbLF-N。圖4為本發明用特異引物Fl和R2從pGEM_T easy/nisin-rbLF-N質粒中擴增到 長度約為 340bp 的融合基因；其中，1 為 DL2000Marker ；2 為 pGEM_T easy/nisin-rbLF-N 質 粒的PCR產物。圖5為本發明重組質粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N和載體pPIC9K純化回收後的 目的基因，經EcoR I和Not I雙酶切鑑定電泳圖，其中，1為DL2000Marker ;2為目的基因 nisin-rbLF-N的PCR產物對照；3為重組質粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N ；4為重組質粒 pGEM-T easy/nisin-rbLF-N 雙酶切產物；5 為重組表達質粒 pPIC9K/nisin-rbLF_N ；6 為重 組質粒 pPIC9K/nisin-rbLF-N 雙酶切產物；7 為 DL2000Marker。圖6為本發明酵母轉化子PCR檢測結果電泳圖；其中，1為DL2000Marker ；2為陽 性對照；3 13為重組酵母菌株PCR產物；14為陰性對照。圖7為本發明不同天數誘導的重組酵母菌株上清中蛋白表達SDS-PAGE電泳圖，其 中，1為小分子量蛋白Marker ；2 6分別代表菌株誘導1、2、3、4、5天的蛋白表達量。圖8為本發明nisin-rbLF-N融合蛋白對乾酪乳桿菌(G+菌)的抑菌活性圖，其中 1為處理後的表達上清液去糖基化並酶切後的上清液100 μ L ；2為陽性對照乳酸鏈球菌
5素10 μ L ;3為陰性對照未處理的表達上清液100 μ L ；4為陰性對照處理後的空載體的酵 母發酵液100 μ L。圖9為本發明nisin-rbLF-N融合蛋白對大腸桿菌(G_菌)的抑菌活性圖，其中 1和2為處理後的表達上清液去糖基化並酶切後的上清液100 μ L ；3為陰性對照未處理 的表達上清液100 μ L ;4為陰性對照處理後的空載體的酵母發酵液100 μ L0
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1 nisin基因及牛乳鐵蛋白基因引物的設計與合成根據nisin基因序列及蛋白序列，使目的基因獲得穩定表達，用適於在BL21中表 達的密碼子代替那些不適合於在其中表達的密碼子優化nisin基因，並在5』端和3』端設 計EcoR I和BamH I酶切位點。優化後的nisin基因序列合成並克隆於pMD19_T載體。根 據目的序列分別設計引物。在上遊引物設計酶切位點BamH I (下劃線標記)和保護鹼基。上遊引物Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3』 ；下遊引物Rl :5，-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3，。根據牛乳鐵蛋白cDNA序列，設計引物。在上遊引物設計與nisin互補配對的序列 (下劃線標記)，下遊引物設計酶切位點EcoR I (下劃線標記)、終止密碼子和保護鹼基。上遊引物F2:5， -GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3』 ；下遊引物R2:5，-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3』。實施例2 重組質粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的構建與鑑定以合成的pMD19-T/niSin質粒為模板，用引物Fl、Rl進行PCR擴增nisin基因為 179bp，純化回收PCR產物(圖1)；以牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2進行PCR擴 增rbLF-N基因為181bp，純化回收PCR產物(圖1)；以純化回收後的nisin基因和rbLF_N 基因為模板，用引物F1、R2進行PCR擴增ηi sin-rbLF-N融合基因約為340bp，純化回收PCR 產物(圖2)後與pGEM-T easy載體連接，並轉化E. cili DH5 α，用PCR及EcoR I和BamH I雙酶切鑑定陽性克隆。實施例3 nisin-rbLF-N基因克隆載體的構建根據表達載體基因序列和目的基因序列分別設計引物，在上遊引物設計酶切位點 EcoR I (下劃線標記)和保護鹼基，下遊引物設計酶切位點Not I (下劃線標記)、終止密碼 子和保護鹼基。F3 :5， -CGGAATTCATGAGCACCAAAGAT-3』R3 :5， -TTGCGGCCGCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3『以重組的pGEM-T easy/nisin-rbLF-N質粒為模板，F3和R3為引物進行PCR反應， PCR採用25 μ L反應體系。將nisin-rbLF-N基因的PCR回收產物通過連接酶連接到pGEM-Teasy克隆載體 上。連接反應採用10 μ L體系，連接後，將連接產物通過熱激反應立即轉化大腸桿菌DH5 α。
挑取平板上的白色菌落(轉化子)，接種於加Amf的LB液體培養基中培養，37°C，150rpm振蕩培養12h。取1 μ L菌液進行PCR擴增驗證。挑取陽性菌落小量提取質粒。(圖 3和圖4)實施例4 nisin-rbLF-N基因表達載體的構建上述克隆載體構建好後，同時用EcoR I和Not I對重組質粒pGEM_T/ nisin-rbLF-N和酵母分泌型表達質粒pPIC9K進行雙酶切，酶切採用20 μ L體系。之後將回 收的pPIC9K載體片段與nisin-rbLF-N基因片段進行體外連接，連接反應採用20 μ L體系。 (圖5)實施例5畢赤酵母菌株GS115的轉化1、活化巴斯德畢赤酵母菌株GS115取200μ L於-80°C凍存的GSl 15菌株接入2mL新鮮的YPD培養基中，28 °C搖床 200rpm過夜培養後，於新鮮的YPD平板上劃線，28 °C培養2天至出現單菌落。2、製備GS115感受態細胞a)挑取一個單菌落接種於5mLYPD培養基中，28°C搖床180rpm過夜培養，取出2mL 接種於200mL YPD培養基中擴大培養至OD6tltl = 1. 3-1. 5，其餘可用20%的甘油進行菌種保藏。b)於4°C，1500 X g離心5min收集菌體細胞，並用200mL冰預冷無菌水重懸菌體細胞。c)於4°C，1500 X g離心5min收集菌體細胞，再用IOOmL冰預冷無菌水重懸菌體細胞。d)於4°C，1500Xg離心5min收集菌體細胞，再用8mL冰預冷的無菌的lmol/L山 梨醇重懸菌體細胞。e)於4°C，1500 X g離心5min收集菌體細胞，再用2mL冰預冷的無菌的lmol/L山 梨醇重懸菌體細胞。置於冰上備用。也可將此感受態細胞分裝80 μ L於1. 5mL微離心管中 凍存備用，但其轉化效率將明顯下降。3、重組表達載體的線性化通過對nisin-rbLF-N基因和pPIC9K載體的酶切位點分析，採用SacI酶切線性化 重組質粒pPIC9K/nisin-rbLF-N(37°C，5h)。凝膠回收純化。4、畢赤酵母感受態細胞的電轉化在Bio-Rad Gene Pulse電轉儀上進行電轉化反應。電轉化條件為電壓1500V， 電容25 μ F，電阻200 Ω，轉化時間隨DNA樣品的不同而變化，並由儀器自動給出，通常在 3. 5-4. Os範圍內。(圖6)實施例6 nisin-rbLF-N基因在畢赤酵母GSl 15中的誘導表達1、將重組酵母凍存菌種接於YPD平板上活化，28°C培養2d，至長出單菌落。2、挑取一活化的單菌落於200mL BMGY液體培養基中，於30°C，250rpm搖床培養，
至培養基OD6tltl達到2. 0 6. 0。3、6000rpm離心5min收集菌體，用無菌超純水洗滌菌體1 2次。4、將菌體轉移至200mL BMMY誘導培養基中，於30°C，200rpm搖床培養。5、每隔24h從BMMY培養基中取出ImL菌液於1. 5mL離心管中，同時補加甲醇至終 濃度為1% (v/v)，於8000rpm離心5min，取上清液，存於-20°C，待測。
實施例7 nisin-rbLF-N融合蛋白的鑑定收集到的上清液經SDS-PAGE電泳，nisin-rbLF-N基因全長324bp，其編碼的融合 蛋白由108個胺基酸構成，其N端23個胺基酸是前導肽，預計所編碼的融合蛋白約為10KD。 (圖7)實施例8去糖基化和酶裂解融合蛋白nisin-rbLF-N取80μ L凍幹溶解後的上清液於小離心管中，加入90μ L變性緩衝液(0. 5% SDS， 1 %巰基乙醇)，煮沸IOmin後加入10 μ L GT反應緩衝液(50mmPBS緩衝液，PH7. 5), 10 μ L 的10%NP-40，100U(0. 2yL)的PNGaseF，37°C水浴過夜。向去糖基化後的表達上清液中加 入0. 15w/v %胃蛋白酶，37°C酶解6h後於80°C滅酶活lOmin，6000 X g離心20min，取上清用 於活性檢測。實施例9融合蛋白nisin-rbLF-N抗菌活性的初步檢測對酵母轉化子進行甲醇誘導表達，誘導4天，5000rpm條件下離心5min後分離菌體 和上清液，將IOml上清液置於凍幹機中進行凍幹後溶於3ml無菌水中，-20°C保存。取去糖 基化並酶切後的上清液，採用瓊脂擴散法檢測抗菌活性，測試菌株為乾酪乳桿菌(G+菌)和 大腸桿菌(G-菌)。抑菌活性檢測表明，nisin-rbLF-N融合蛋白具有革蘭氏陽性菌抗性和 革蘭氏陰性菌抗性。對照中，未誘導的以及轉入空載體的酵母發酵液中均未出現透明圈。表 明編碼融合蛋白nisin-rbLF-N的基因已成功整合於宿主基因組中，並開始表達目的蛋白。 (圖8和圖9)雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
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權利要求
一種融合基因，其含有編碼乳酸鏈球菌素的nisin基因和編碼牛乳鐵蛋白氨基末端多肽的rbLF N基因。
2.如權利要求1所述的融合基因，其具有SeqID No. 1所示的核苷酸序列或該序列經 替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋白質的核苷酸序列。
3.含有權利要求1或2所述融合基因的載體。
4.如權利要求3所述的載體，其特徵在於，其出發載體為PPIC9K。
5.含有權利要求3或4所述載體的工程菌。
6.如權利要求5所述的工程菌，其特徵在於，其為畢赤酵母。
7.如權利要求6所述的工程菌，其特徵在於，其為畢赤酵母GS115。
8.構建權利要求7所述工程菌的方法，其特徵在於，包括如下步驟1)根據密碼子的簡併性，設計併合成適於在BL21中表達的nisin基因，將優化後的 nisin基因克隆於pMD19-T載體，以合成的pMD19-T/niSin質粒為模板，用引物F1、R1進行 PCR擴增nisin基因，純化回收PCR產物；以從牛肉中提取的總DNA為模板，用引物F2、R2 進行PCR擴增rbLF-N基因，純化回收PCR產物；以純化回收後的nisin基因和rbLF_N基因 為模板，用引物Fl、R2進行PCR擴增nisin-rbLF-N融合基因，純化回收PCR產物；其中，Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3，；Rl :5』 -TTTGCTCACATGAATGCTGC-3』 ；F2 5' -GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3'；R2 :5』 -CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3』 ；2)將步驟1)中合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到載體pPIC9K中；3)將步驟2)的含有nisin-rbLF-N融合基因的pPIC9K載體轉入畢赤酵母GSl15中，然 後進行重組克隆的篩選，獲得重組畢赤酵母GS115工程菌，冷凍保存。
9.權利要求7所述工程菌的誘導培養方法，包括如下步驟1)將重組酵母凍存菌種接於YPD平板上活化，28°C培養2d，至長出單菌落；2)挑取一活化的單菌落於200mLBMGY液體培養基中，於30°C，250rpm培養，直至培養 基的OD6tltl達到2. 0 6. 0 ；3)6000rpm離心5min收集菌體，用無菌水洗滌菌體1 2次；4)將菌體轉移至200mLBMMY誘導培養基中，於28 30°C，200rpm誘導培養1 2d。
10.如權利要求9所述的誘導培養方法，其特徵在於，步驟4)的誘導培養溫度為28°C， 誘導培養時間為2d。
全文摘要
本發明提供了一種Nisin-rbLF-N融合基因、含有該基因序列的表達載體，以及能夠高效表達Nisin-rbLF-N融合基因的重組畢赤酵母菌；另外，本發明還提供了所述重組畢赤酵母菌的誘導培養方法。本發明通過PCR方法，將融合基因Nisin-rbLF-N克隆到真核表達載體pPIC9K中，轉化畢赤酵母GS115後進行誘導表達，能夠表達出可觀的融合蛋白。去糖基化後的融合蛋白經過複合蛋白酶酶解，具有抑乾酪乳桿菌(G+菌)和大腸桿菌(G-菌)的作用。
文檔編號C12N15/62GK101974546SQ201010258798
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者王海峰, 田文瑩, 田洪濤, 羅雲波, 袁曉宇, 許文濤, 黃崑崙 申請人:中國農業大學